CN105527419A - 遗传性血管水肿的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种遗传性血管水肿的检测试剂盒,所述试剂盒包括:包被抗人C1-INH抗体的载体、生物素标记的C1-INH校准品、链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。本发明提供的试剂盒及其应用,相比比色法灵敏度和特异性更高,临床上,操作更简单,对于多样本实验室,且操作时间更短,能用于全自动或半自动发光免疫分析仪。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域,具体地说,涉及一种遗传性血管水肿的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
遗传性血管水肿(hereditaryangioedema,HAE)是一种以反复发作的皮下和(或)黏膜下水肿为主要表现的罕见遗传性疾病。水肿为自发性或由某些因素诱发,具有局限性、非凹陷性、自限性的特点。常见受累部位包括颜面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。
典型的HAE是由补体C1酯酶抑制剂(C1inhibitor,C1-INH)基因突变导致的C1-INH量的减少和(或)功能缺乏所致。遗传性血管水肿是一种常染色体先行遗传病,发病率1/50000。
由于HAE发病率低,临床上易发生误诊、误治。该疾病的诊断除需要了解家族史和根据典型的临床表现外,主要依赖于实验室对C1-INH功能活性检测。近年来,国外较多推荐采用比色法对C1-INH的功能进行检测。但比色法的灵敏度和特异性较低,且操作较复杂,用时较长。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种遗传性血管水肿的检测试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明目的,本发明首先提供一种遗传性血管水肿的检测试剂盒,所述试剂盒包括:包被抗人C1-INH抗体的载体、生物素标记的C1-INH校准品、链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。
进一步地,所述载体为化学发光板或磁珠微粒。
进一步地,所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一种或多种。
作为优选,所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。
进一步地,所述鼠抗人C1-INH单克隆抗体的纯度不小于95%,浓度不小于1mg/mL。
作为优选,所述抗人C1-INH抗体浓度为5μg/mL。
本发明还提供了所述试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)包被抗人C1-INH抗体的载体的制备:
包被抗人C1INH抗体的96孔化学发光板:将包被用抗人C1-INH抗体加至碳酸盐缓冲液中混匀,加入微孔板内,每孔100μL,包被浓度1~5μg/mL,4℃过夜,用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板2遍后,再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液,室温静置2小时后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝箔袋真空包装,放2-8℃保存;
或包被抗人C1-INH抗体的磁珠微粒:将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化,室温混匀2~5小时候,用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次,并将该溶液进行悬浮,浓度为0.1mg/mL~2.5mg/mL;然后,每毫升悬液中加入抗人C1-INH抗体10μg,于20~40℃混匀孵育3~10小时;用等体积的0.01MPBS2%~5%BSApH7.0~7.4缓冲液于20~40℃孵育2~8小时;最后,用2%BSA0.01~0.1MTris-HClpH7.5~pH9.0缓冲液清洗三次,并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0.1~1.0mg/mL,即得;
(2)生物素标记的C1-INH校准品的制备:将C1-INH用0.1mol/L,pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L,pH8.6的硼酸缓冲液稀释到1mg/mL,并用0.1mol/L,pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L,pH8.6的硼酸缓冲液,对蛋白质充分透析;用1mLDMSO溶解NHSB1mg;向1mLC1-INH溶液(即含蛋白质1mg)加入120μlNHSB溶液(即含NHSB120μg);在室温下持续搅拌,保温2-4小时;加入9.6μL1mol/LNH4Cl(每25μgNHSB加1μl),在室温下搅拌10分钟;在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素;将样品上1mL的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1mL/管,蛋白质在1-3mL之间洗下;最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA.将结合产物置4℃,避光保存;
(3)链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂的制备:将链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶用2%BSA,0.01MTris-HClpH7.4的缓冲液配制为0.5ug~1ug/mL。
本发明还进一步提供了前述试剂盒的应用:
当包被抗人C1INH抗体的的载体为96孔化学发光板时,应用方法具体为:
1)将浓度分别为0U/mL、0.125U/mL、0.375U/mL、0.65U/mL、1.0U/mL、1.25U/mL、1.6U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入到微孔板中,然后将50μL患者血清加入微孔中,然后加入50μL生物标记的C1-INH,室温或37℃孵育15min~45min;
2)孵育结束后,洗板5次;
3)加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂,室温或37℃孵育15min~30min;
4)孵育结束后,洗板5次;
5)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL,5min后读数;
6)建立校准品曲线,将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线,计算出样本中的C1-INH的含量。
当包被抗人C1INH抗体的的载体为磁珠微粒时,应用方法具体为:
1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂,加入50μL校准品;在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂,然后加入25μL血清样本,再加入25μL生物素标记的C1-INH校准品,37℃孵育5~15min;
2)将孵育后的检测管在磁场中分离,去除上清液,经洗液多次清洗后,取出磁场,震荡使磁珠微粒充分混悬;
3)向步骤2中的检测管中加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂,37℃孵育5~15min;
4)将孵育后的检测管在磁场中分离,去除上清液,经洗液多次清洗后,取出磁场,震荡使磁珠微粒充分混悬;
5)添加磁场,使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离,去除上清液,然后加入发光底物A和底物B,取出磁场,充分混匀厚茧检测5min内相对发光强度值。
本发明的有益效果在于:
本发明提供了一种化学发光免疫分析法用于C1-INH的检测,达到对遗传性血管水肿疾病的诊断。相比比色法,化学发光免疫分析法,灵敏度和特异性更高,临床上,操作更简单,对于多样本实验室,相比比色法,操作时间更短,能用于全自动或半自动发光免疫分析仪。
附图说明
图1为0浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线(化学发光板为包被载体试剂盒)。
图2为0浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线(磁珠微粒为包被载体试剂盒)。
图3为试剂盒校准品曲线(化学发光板为包被载体试剂盒)。
图4为试剂盒校准品曲线(磁珠微粒为包被载体试剂盒)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1包被抗人C1-INH抗体载体为96孔化学发光板检测试剂盒的制备
(一)化学发光板的制备:
鼠抗人C1-INH单克隆抗体由北京新华联协和药业有限责任公司制备;。将鼠抗人C1-INH用50mM碳酸盐缓冲液Na2CO31.59g/L和NaHCO32.93g/L稀释到2.5μg/ml,加至对应发光板内,每孔100μL,4℃孵育过夜,用含Tween20的磷酸缓冲液洗涤发光板3遍后,再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液(NaCl8.0g/L、KCl2.0g/L、Na2HPO42.87g/L、KH2PO40.2g/L、Tween200.5ml/L、5%BSA),室温静置2h后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝袋真空包装,完成变应原包被的预包被发光板的制备。
(二)生物素标记C1-INH校准品的制备
将C1-INH用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)稀释到1mg/ml,并用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6),对蛋白质充分透析;用1mlDMSO溶解NHSB1mg;向1mlC1-INH溶液(即含蛋白质1mg)加入120μLNHSB溶液(即含NHSB120μg);在室温下持续搅拌,保温2-4小时;加入9.6μL1mol/LNH4Cl(每25μgNHSB加1μL),在室温下搅拌10分钟;在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素;将样品上1ml的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1ml/管,蛋白质在1-3ml之间洗下;最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA.将结合产物置4℃,避光保存。
(三)链霉亲和素偶联的辣根化酶试剂制备
链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶购自Sigma,用2%BSA0.01MTris-HClpH7.4的缓冲液配制为0.5μg~1μg/ml。
实施例2包被抗人C1-INH抗体载体为磁珠微粒检测试剂盒的制备
(一)磁珠微粒试剂的制备
将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化,室温混匀4小时,用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次,并将该溶液进行悬浮,浓度为1mg/ml;然后,每毫升悬液中加入抗人C1-INH抗体10μg,于37℃混匀孵育5小时;用等体积的0.01MPBS2%BSApH7.4缓冲液于37℃孵育4小时;最后,用2%BSA0.01MTtis-HClpH8.0缓冲液清洗三次。并用该溶液配制成磁珠微粒浓度01.0mg/ml,即得所述的包被抗人C1-INH抗体磁珠微粒试剂;
(二)生物素标记C1-INH校准品的制备
如实施例1。
(三)链霉亲和素偶联辣根过氧化酶试剂的制备
如实施例1。
实施例3分析性能评价
(一)最低检测极限
用含5%新生牛血清的PBS溶液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD。根据0浓度和相邻浓度校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出线性方程,求出对应的浓度值,即为最低检测限。
表1:0浓度的检测RLU值(化学发光板为载体的检测试剂盒)
零浓度化学发光值均值X=1823.55
SD=79.11
X+2SD=1981.77(y=3164.4X+1823.55)
B点发光值=2456.43
将零浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线,参见图1。
将0浓度点的X+2SD带入两点拟合曲线,最低检测限=0.05U/ml。
表2:0浓度的检测RLU值(磁珠微粒为载体的检测试剂盒)
零浓度化学发光值均值X=1619.3
SD=63.77
X+2SD=1746.84(y=4251.33X+1619.3)
B点发光值=2469.57
将零浓度点和邻近浓度点连点拟合曲线,参见图2。
将0浓度点的X+2SD带入两点拟合曲线,最低检测限=0.03U/ml。
(二)线性
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度,其中最低浓度样本须接近线性范围的下限。按试剂盒说明书进行操作,将每一浓度样本检测1次,使用最小二乘法(将每一浓度值和稀释比例)或双对数法(将每一浓度化学发光值和稀释比例取对数)进行直线拟合,计算线性相关系数r。
表3:线性相关系数r
参见图3和图4,可知以化学发光板为载体和以磁珠微粒为载体的试剂盒,线性范围均能达到临床检测的要求。
(四)精密度评价
(1)批内精密度
将实施例1和2制备的试剂盒一批,分别测定低、中、高三种不同浓度的血清,平行检测10次,得出的分析内变异系数为4.15%~8.83%。结果参见表4和5。
表4:化学发光板为包被载体
测定血清浓度(U/ml) | 测定次数 | 批内CV(%) |
0.35 | 10 | 7.92 |
0.7 | 10 | 6.87 |
1.2 | 10 | 4.15 |
表5:磁珠微粒为包被载体
测定血清浓度(U/ml) | 测定次数 | 批内CV(%) |
0.35 | 10 | 8.83 |
0.7 | 10 | 7.68 |
1.2 | 10 | 4.52 |
(2)批间精密度
将实施例1和2制备的试剂盒取三批,每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清,平行检测10次,每份血清得到30个浓度值,统计分析变硬系数为5.72%~8.45%。结果参见表6和7。
表6:化学发光板为包被载体
测定血清浓度(U/ml) | 测定次数 | 批内CV(%) |
0.35 | 30 | 6.89 |
0.7 | 30 | 7.85 |
1.2 | 30 | 5.72 |
表7:磁珠微粒为包被载体
测定血清浓度(U/ml) | 测定次数 | 批内CV(%) |
0.35 | 30 | 8.45 |
0.7 | 30 | 7.38 |
1.2 | 30 | 6.52 |
(五)稳定性评价
对实施例1和2的试剂盒分别在4℃和37℃放置,置于4℃试剂盒分别于1月、3月、6月、9月、12月和15月取样检测,置于37℃的试剂盒,分别于3天、6天和9天取样检测,结果表明试剂盒的最低检测限、线性、批内精密度、批间精密度等均在正常范围之内,试剂盒有效期可达12个月。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种遗传性血管水肿的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:包被抗人C1-INH抗体的载体、生物素标记的C1-INH校准品、链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述载体为化学发光板或磁珠微粒。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述鼠抗人C1-INH单克隆抗体的纯度不小于95%,浓度不小于1mg/mL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述抗人C1-INH抗体浓度为5μg/mL。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)包被抗人C1-INH抗体的载体的制备:
包被抗人C1INH抗体的96孔化学发光板:将包被用抗人C1-INH抗体加至碳酸盐缓冲液中混匀,加入微孔板内,每孔100μL,包被浓度1~5μg/mL,4℃过夜,用含Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤微孔板2遍后,再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液,室温静置2小时后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝箔袋真空包装,放2-8℃保存;
或包被抗人C1-INH抗体的磁珠微粒:将直径0.15μm的磁珠微粒用戊二醛活化,室温混匀2~5小时候,用0.01mol/LPBS缓冲液冲洗4次,并将该溶液进行悬浮,浓度为0.1mg/mL~2.5mg/mL;然后,每毫升悬液中加入抗人C1-INH抗体10μg,于20~40℃混匀孵育3~10小时;用等体积的0.01MPBS2%~5%BSApH7.0~7.4缓冲液于20~40℃孵育2~8小时;最后,用2%BSA0.01~0.1MTris-HClpH7.5~pH9.0缓冲液清洗三次,并用该溶液配制成磁珠微粒浓度0.1~1.0mg/mL,即得;
(2)生物素标记的C1-INH校准品的制备:将C1-INH用0.1mol/L,pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L,pH8.6的硼酸缓冲液稀释到1mg/mL,并用0.1mol/L,pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L,pH8.6的硼酸缓冲液,对蛋白质充分透析;用1mLDMSO溶解NHSB1mg;向1mLC1-INH溶液加入120μlNHSB溶液;在室温下持续搅拌,保温2-4小时;加入9.6μL1mol/LNH4Cl,在室温下搅拌10分钟;在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素;将样品上1mL的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1mL/管,蛋白质在1-3mL之间洗下;最后,样品加入叠氮钠及1.0g/LBSA.将结合产物置4℃,避光保存;
(3)链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂的制备:将链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶用2%BSA,0.01MTris-HClpH7.4的缓冲液配制为0.5ug~1ug/mL。
8.权利要求1-6任一项所述的试剂盒的应用,其特征在于,所述应用的具体方法为:
1)将浓度分别为0U/mL、0.125U/mL、0.375U/mL、0.65U/mL、1.0U/mL、1.25U/mL、1.6U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入到微孔板中,然后将50μL患者血清加入微孔中,然后加入50μL生物标记的C1-INH,室温或37℃孵育15min~45min;
2)孵育结束后,洗板5次;
3)加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂,室温或37℃孵育15min~30min;
4)孵育结束后,洗板5次;
5)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL,5min后读数;
6)建立校准品曲线,将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线,计算出样本中的C1-INH的含量;
或为:
1)在校准品检测管中加入50μL磁珠微粒试剂,加入50μL校准品;在样本检测管中加入50μL磁珠微粒试剂,然后加入25μL血清样本,再加入25μL生物素标记的C1-INH校准品,37℃孵育5~15min;
2)将孵育后的检测管在磁场中分离,去除上清液,经洗液多次清洗后,取出磁场,震荡使磁珠微粒充分混悬;
3)向步骤2中的检测管中加入100μL链霉亲和素偶联的辣根过氧化酶试剂,37℃孵育5~15min;
4)将孵育后的检测管在磁场中分离,去除上清液,经洗液多次清洗后,取出磁场,震荡使磁珠微粒充分混悬;
5)添加磁场,使步骤4)处理后的磁珠微粒在磁场中分离,去除上清液,然后加入发光底物A和底物B,取出磁场,充分混匀厚茧检测5min内相对发光强度值。
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