CN107807240A - 一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括:样本稀释液、包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒、标记有吖啶酯的降钙素原单克隆抗体、降钙素原系列标准品溶液、化学发光激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系。与现有技术相比,本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断领域,具体是用化学发光法检测人血清中降钙素原的试剂盒及其制备方法。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量为13kDa的糖蛋白,是血清降钙素(CT)的前体物,在人体内半衰期约为20-24小时,稳定性好。降钙素原是人11号染色体上降钙素Ⅰ基因(CALCI)的表达产物。该基因为单拷贝基因,由2800个碱基对组成,含有6个外显子和5个内含子,基因全长分子量约为7600。在正常生理情况下,该基因转录后在甲状腺滤泡旁粗面内质网内翻译成降钙素前体(proprocalcitonin)。降钙素前体包含有N端84个氨基酸,活性降钙素(CT,32)肽和钙抑肽(katacalcin,21肽)三部分,分别由2肽(-Lys-Arg-)及4肽(-Gly-Lys-Lys-Arg-)连接。该前体在内源性多肽酶的作用下剪切成为含有116个氨基酸的降钙素前肽物质,降钙素原不具有激素活性。
当出现严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时,PCT在血浆中的含量会升高,但自身性免疫疾病、过敏和病毒感染时PCT不会升高,局部细菌感染、轻微感染和慢性炎症也不会导致PCT的含量升高。近几年的临床证据显示,PCT作为炎症的临床指标,在与其他炎症指示因子如CRP、IL-6、IL-8、白细胞计数等表现出了更高的特异性和灵敏性,特别是在全身性细菌感染诊断的辅助方面越来越显示出独到之处,因PCT不仅与系统性细菌感染程度呈正相关,而且它的上升或下降直接反应病情的恶化和好转的趋势,但在局部感染时PCT不升高或轻度的升高,另PCT还可以作为术后抗生素指导应用的指标。
目前用于检测降钙素原( PCT )的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低,线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术,具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便,自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。
发明内容
本发明提供了一种具有较高灵敏度和特异性的降钙素原的检测试剂盒。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种降钙素原的化学发光检测试剂盒及制备方法,该试剂盒包括样本稀释液、包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒、标记有化学发光标记物的降钙素原单克隆抗体、激发液A、激发液B、白介素6校准品溶液以及清洗液。
所述化学发光标记物为吖啶酯,如:NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
所述样本稀释液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液,内含1%牛血清白蛋白、0.1%TritonX-100和0.3%防腐剂Proclin。
所述磁珠的表面修饰基团可以为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基,磁珠粒径可为1.5~3μm。
所述降钙素原单克隆抗体是待检降钙素原的特异性单克隆抗体。
所述的吖啶酯与抗体的摩尔比为5~10:1,优选摩尔比为7.4:1。
所述的磁微粒可直接与降钙素原抗体偶联,也可将磁微粒与链霉亲和素偶联,同时采用生物素标记降钙素原抗体。
所述的降钙素原的化学发光检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)制备样品稀释缓冲液:所述样本稀释液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液,内含1%牛血清白蛋白、0.1%TritonX-100和0.3% Proclin。
2)制备包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒:将羧基化的磁微粒溶液磁分离后去上清,用 MES缓冲液重悬,加入EDC溶液,在垂直旋转仪上活化,将活化后的磁微粒与降钙素原抗体放置在垂直旋转仪上偶联,磁分离去上清,洗涤3次,再加入含1%BSA的缓冲液进行封闭,最后将磁微粒悬液置于2-8℃保存。
3)制备吖啶酯标记的降钙素原单克隆抗体:取降钙素原单克隆抗体10μg,加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为60μL,再加入1μL吖啶酯母液,震荡混匀,室温避光反应30min,反应后加入40μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液,混匀,室温避光反应30min。反应后将产物移至透析袋,透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液,2-8℃避光透析,每间隔2h换一次PBS,至少更换3次,最后一次透析过夜,以去除未标记的吖啶酯。将标记物取出,按实际体积加入10%牛血清白蛋白至其终浓度为0.1%,加入等体积甘油,混匀,-20℃避光保存。
4)制备降钙素原抗原标准品溶液:用含有1%BSA、0.1%TritonX-100、0.3%Proclin、pH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释降钙素原纯品至浓度为 0ng/mL、0.04ng/mL、0.4ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL降钙素原抗原标准品溶液。
5)制备激发液:激发液包括激发液A和激发液B。其中激发液A为H2O2和HNO3的混合液,其中H2O2质量分数为0.05-5%,HNO3浓度为0.05-2.5 mol/L;激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液,其中Triton X-100的浓度为0.05-2.0 mol/L,NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
6)制备清洗液:清洗液是含有表面活性剂TritionX-100和生物防腐剂Proclin的磷酸盐缓冲液。
所述的吖啶酯溶于DMSO或DMF中,且所配制溶液的最终浓度为1-10mmol/L,优选浓度为6.5 mmol/L。
本发明所述降钙素原检测试剂盒采用的原理是双抗体夹心法,具体是通过磁微粒偶联单克隆抗体与样本中的抗原特异性结合,再与吖啶酯标记的单克隆看题结合形成复合物,最后利用吖啶酯所产生的光子检测被测物浓度。
本发明具有以下优点:
以磁分离化学发光技术为检测手段,同时采用吖啶酯标记技术进行检测以建立一种检测降钙素原的直接化学发光试剂盒。吖啶酯具有分子量小、对结合反应的空间位阻作用少、背景发光低、信噪比高、无需酶的参与、发光效率高、标记稳定、可提高系统整体灵敏度的明显优势。
本发明对样本前处理要求低,样本在提取、稀释等处理后即可用于检测,并可实现大批量自动化检测。
综上,本发明试剂盒操作简单方便,具有发光值稳定、灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1:试剂盒的组建及制备
1)试剂盒组建
组建一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其含有下列组分:
样本稀释液;
包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒;
标记有化学发光标记物的降钙素原单克隆抗体;
激发液A、激发液B;
降钙素原校准品溶液,浓度分别为;0ng/mL、0.04ng/mL、0.4ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL;
清洗液。
2)样本稀释液的制备
具体为pH为7.4的磷酸盐缓冲液,内含1%牛血清白蛋白、0.1%TritonX-100和0.3%防腐剂Proclin。
3)制备包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒混悬液
将羧基化的磁微粒溶液磁分离后去上清,用 MES缓冲液重悬,加入EDC溶液,在垂直旋转仪上活化,将活化后的磁微粒与降钙素原抗体放置在垂直旋转仪上偶联,磁分离去上清,洗涤3次,再加入含1%BSA的缓冲液进行封闭,最后将磁微粒悬液置于2-8℃保存。
4)制备吖啶酯标记的降钙素原单克隆抗体
降钙素原单克隆抗体10μg,加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为60μL,再加入1μL吖啶酯母液,震荡混匀,室温避光反应30min,反应后加入40μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液,混匀,室温避光反应30min。反应后将产物移至透析袋,透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液,2-8℃避光透析,每间隔2h换一次PBS,至少更换3次,最后一次透析过夜,以去除未标记的吖啶酯。将标记物取出,按实际体积加入10%牛血清白蛋白至其终浓度为0.1%,加入等体积甘油,混匀,-20℃避光保存。
5)激发液A和激发液B的制备
激发液A为H2O2和HNO3的混合液,其中H2O2质量分数为0.05-5%,HNO3浓度为0.05-2.5mol/L;
激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液,其中Triton X-100的浓度为0.05-2.0 mol/L,NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
6)降钙素原校准品溶液的制备
用含有1%BSA、0.1%TritonX-100、0.3%防腐剂Proclin、pH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释降钙素原纯品至浓度为0ng/mL、0.04ng/mL、0.4ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL。
7)清洗液的制备
清洗液为含有表面活性剂1%TritionX-100和生物防腐剂0.3%Proclin的pH7.4的磷酸盐缓冲液。
实施例2:实际样本中降钙素原的检测
本发明降钙素原定量检测试剂盒的使用操作程序如下:
试剂盒的检测
1)将待测样本50μL、磁微粒混悬液150μL、吖啶酯标记物150μL,依次加入反应管,振荡混匀,37℃孵育15 min。
2)分离,清洗5次。
3)将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
4)加入100μL化学发光激发液A,1 s后加入100 μL化学发光激发液B,测量其相对发光强度,样本中降钙素原的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例3:试剂盒的性能指标
1)试剂盒的灵敏度
用试剂盒中0 ng/mL校准品作为待测样本,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值(相对发光值),计算其平均值(M)和标准差(SD),得出 M+2SD 所对应RLU值,根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,将 M+2SD 的RLU 值带入上述方程中,求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法,重复3次实验,最后求出本试剂盒对降钙素原的分析灵敏度为0.02 ng/mL。
2) 精密度测定
用降钙素原试剂盒测试浓度为4 ng/mL和50 ng/mL的样本,每个浓度重复测试10次,计算试剂盒精密度,结果表明该试剂盒CV均小于5%。
3)稳定性
取降钙素原检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验,2-8℃放置分别按时间1,3,5,7,9,11,12,13,14,15个月进行检测;开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示降钙素原检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为30天。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括样本稀释液、包被有降钙素原单克隆抗体的磁性微粒、标记有化学发光标记物的降钙素原单克隆抗体、激发液A、激发液B、降钙素原校准品溶液以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的降钙素原化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述化学发光标记物为吖啶酯,如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
3.根据权利要求1所述的一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述的吖啶酯标记的是降钙素原单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述的磁性微粒可直接与降钙素原抗体偶联,或将磁微粒与链霉亲和素偶联,同时采用生物素标记降钙素原抗体。
5.根据权利要求1所述的一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述的校准品是以含有1% BSA、0.1%TritonX-100 和0.3% Proclin 的pH为7.4的磷酸盐缓冲液为基质,加入降钙素原纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
6.根据权利要求1所述的一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述的化学发光激发液A 由H2O2 和HNO3的混合液组成,化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。
7.根据权利要求1所述的一种降钙素原的化学发光检测试剂盒,其特征在于,包括以下步骤:在反应杯中加入一定量的待测样本,再加入磁微粒混悬液液和吖啶酯标记物,混匀,37℃孵育,加入清洗液去掉上清,再加入化学发光激发液A和激发液B,测定相应的发光强度RLU/s。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180316 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |