CN103901203A

CN103901203A - 一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN103901203A
Application number: CN201410143487.9A
Authority: CN
Inventors: 徐顺澍; 李永红; 叶兴旺; 周超; 王秀伟; 李庆春
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Jiangsu Hao Bo biomedical Limited by Share Ltd
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2014-04-11
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-04-11
Also published as: CN103901203B

Abstract

本发明涉及一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，其试剂盒包括如下试剂：降钙素原系列标准品；磁分离试剂：偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；第一试剂：含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液。本发明通过采用偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液、含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液、含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液制成的试剂盒，使得灵敏度达到0.008ng/mL，且准确性好、精密度高，样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽。

Description

一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

降钙素原(PCT)来自定位于第11号染色体上(11p15,4)的单拷贝基因，该基因由280个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体(Preprocalcitonin)，包括N端84个氨基酸、活性降钙素和降钙蛋白三部分。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉nPro-CT端单一序列，生成116氨基酸的PCT，分子量约为13kD，PCT和降钙素具有一个相同的32个氨基酸的序列(60～91位)。

PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞）表达，经酶切分解为（未成熟）降钙素、羧基端肽和氨基端肽。健康人血中仅含有少量的PCT。细菌感染后PCT会明显升高。动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT。脓毒血症患者体内的PCT只含有114个氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro。PCT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标，也是急性重症胰腺炎及其主要并发症的可靠指标，与传统的炎症反应指标比较具有更高的特异性和敏感性。

目前用于检测降钙素原(PCT)的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。

磁分离化学发光免疫分析法综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术—悬浮磁微粒载体技术、化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求。

现有技术，如公开号为CN103592445A、公开日为2014-2-19的发明专利公开了一种检测降钙素原的试剂盒，包括：抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物。但是该专利中的试剂盒的灵敏度仍然较低（0.018ng/ml），试剂盒特异性也较差、检测范围较窄。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒。

本发明所要解决的另一技术问题是提供上述试剂盒的制备方法。

本发明所要解决的再一技术问题是提供采用上述试剂盒进行检测的检测方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，包括如下试剂：

降钙素原系列标准品；

磁分离试剂：偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液，所述的偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2～1.0mg/ml；

第一试剂：含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液，所述的含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2～2.5μg/ml；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液，所述的含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2～1μg/ml。

优选地，所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5～2μm，每克磁微粒表面的羧基含量不低于0.4毫摩尔。

优选地，第一试剂中，所述的抗降钙素原单克隆抗体与所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔比为1：18～22。

优选地，第二试剂中，所述的抗降钙素原单克隆抗体与所述的碱性磷酸酶的摩尔比为1:1～2。

优选地，所述的碱性磷酸酶的纯度大于95%，比活性大于1000U/mg，浓度大于5mg/ml。

优选地，第一试剂和第二试剂中的抗降钙素原单克隆抗体的纯度均大于95%，浓度均大于1mg/ml。

上述降钙素原的化学发光定量检测试剂盒的制备方法：

磁分离试剂的制备方法为：将所述的磁微粒用0.04～0.06mol/L、pH4.5～5的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8～12mg/ml；然后加入所述的链霉亲和素，在15～40℃下混悬30～60分钟，其中所述的磁微粒与所述的链霉亲和素的质量比为25～50:1；然后再加入新鲜配置的8～12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15～40℃下混悬2～12h，其中所述的2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述的碳二亚胺水溶液的体积比为10～20:1；磁分离，去上清，用含质量比为0.09～1.1%的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.009～0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述的偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2～1.0mg/ml，即得所述的磁分离试剂；

第一试剂的制备方法为：将所述的抗降钙素原单克隆抗体用0.01～0.03mol/L、pH为7～7.5的PBS缓冲液，在2～8℃下透析过夜，配置成抗降钙素原单克隆抗体溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配置成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液，其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的物质的量浓度为8～12mM；将所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液加入到所述的抗降钙素原单克隆抗体溶液中，混合均匀，在15～40℃下放置20～40分钟；加入0.9～1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15～40℃下放置8～12分钟，然后用含质量比为2.5～3.2%的牛血清白蛋白、pH为7～7.5、物质的量浓度为0.04～0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2～2.5μg/ml，即得所述的第一试剂；

第二试剂的制备方法为：将抗降钙素原单克隆抗体加入到浓度为8～12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25分钟，加入0.09～0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～5分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗降钙素原单克隆抗体，2～8℃保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4～5mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置25～35分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2～8℃保存备用；将活化后的抗降钙素原单克隆抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8℃下静置12～24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2～8℃保存备用；将所述的连接物浓溶液用含质量比为0.4～0.6%的牛血清白蛋白、pH为7.8～8.0、物质的量浓度为0.09～0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2～1μg/ml，即得所述的第二试剂；

降钙素原系列校准品的制备方法为：将降钙素原纯品用pH7～7.5、0.04～0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释到多个浓度后分别冻干，即得所述的降钙素原系列校准品。

上述降钙素原的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，包括依次进行的以下步骤：

步骤1：在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在36～38℃下温育14～16分钟，其中所述的待测样本原液、所述的第一试剂和所述的第二试剂的体积比为1:0.9～1.1：0.9～1.1；

步骤2：然后向步骤1温育后的体系中加入磁分离试剂，混匀，在36～38℃下温育4～6分钟，所述的待测样本原液与所述的磁分离试剂的体积比为1:0.9～1.1；

步骤3：添加磁场，使步骤2温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，经清洗液多次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；

步骤4：添加磁场，使步骤3混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，然后加入发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明通过采用偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液、含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液、含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液制成的试剂盒，使得灵敏度达到0.008ng/mL，并且该试剂盒与PCT有类似结构的物质的交叉反应率均小于0.04%，准确性好、精密度高，样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽，检测范围为0～100ng/ml。

附图说明

附图1为A,B点连点拟合曲线；

附图2为实施例1制备得到的试剂盒的相关性评价；

附图3为测试校准品标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。

实施例1：试剂盒的制备

（一）磁分离试剂的制备：

材料与仪器：

1、磁微粒：表面含羧基（COOH）活性集团，每克磁微粒（干重）羧基含量为0.4毫摩尔，具有超顺磁性，直径为1μm。

2、链霉亲和素购自Sigma公司。

3、2-吗啉乙磺酸（MES）、碳二亚胺（EDC）、三羟甲基氨基甲烷（TRIS）和其他试剂均为化学纯。

4、分析天平

操作步骤：

1、取100mg磁微粒，磁分离去上清，用0.05mol/L、PH4.7的MES缓冲液10ml重悬；

2、加入3mg链霉亲和素，室温混悬50min；

3、加入0.7ml新鲜配制的10mg/ml的EDC水溶液，室温混悬8h；

4、磁分离，去上清，用含质量比1%的牛血清白蛋白、PH7.4、0.01mol/L的TRIS缓冲液重悬到0.4mg/ml，完成磁分离试剂的制备。

（二）第一试剂的制备：

材料与仪器：

1、抗PCT单克隆抗体，由Hytest LTD制备，纯度为95%，浓度为1mg/ml，以磷酸盐缓冲液保存；

2、偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯（BNHS）购自THERMO公司，二甲基亚砜（DMSO），PBS等试剂达到化学纯；

3、分析天平

操作步骤：

1、将抗PCT单克隆抗体用0.02mol/L、pH7.4的PBS缓冲液在4℃下透析过夜，中间换液一次；

2、将BNHS平衡至室温（20℃），用万分之一分析天平（最大称量200g）称取1.5mg BNHS溶于326μL DMSO中，配制成10mM的BNHS（现用现配）；

3、按照抗PCT抗体与BNHS摩尔比为1:20的比例在步骤1所得的溶液中加入步骤2所得的溶液，混合均匀，室温放置反应30分钟；

4、向步骤3中加入1M的TRIS缓冲液至终浓度为10mM，终止反应，室温放置反应10min，即获得生物素标记的抗体浓溶液，将该溶液用含3%牛血清白蛋白、PH7.4、0.05mol/L的TRIS缓冲液稀释到1.5μg/ml，完成第一试剂的制备。

（三）第二试剂的制备：

材料与仪器：

2、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）纯度为95%，比活性为1000U/mg，浓度为5mg/ml；

3、偶联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC），2-亚胺基硫烷盐酸盐（2-IT）购自THERMO公司，TRIS等化学试剂达到化学纯；

4、G-25凝胶柱和Supperdex200凝胶纯化柱为GE公司产品；

5、分析天平。

操作步骤：

1、取1mg抗PCT单克隆抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-IT溶液3μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

2、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液15μl，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，4℃保存备用；

3、将活化的抗PCT单克隆抗体与活化的ALP混合，4℃条件下静置18h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4℃保存备用。

4、将连接物浓溶液用含0.5%牛血清白蛋白、PH8.0、0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5μg/ml，完成试剂2的制备。

（四）降钙素原系列校准品的制备：

材料与仪器：

1、PCT纯品为PCT重组抗原，由Hytest LTD制备，纯度为99%，浓度为1mg/ml，以三羟甲基氨基甲烷缓冲液保存。

2、三羟甲基氨基甲烷（TRIS）和其他试剂均为化学纯。

3、分析天平。

4、冻干机为SIM INTERNATIONAL GROUP公司产品。

操作步骤：

1、称取适量的PCT纯品，用PH7.4、0.05mol/L的TRIS缓冲液分别稀释到0、0.08、0.4、2、10、60和100ng/ml；

2、使用冻干机将上述校准品冻干。

实施例2：检测的实施和检测效果的评价

材料与仪器：

1、由实施例1制备得到的试剂盒；

2、发光底物、清洗液由苏州浩欧博生物医药有限公司生产。

检测方法：

下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。

1、在检测管中加入50μl待测样本（血清或血浆）原液，然后加入50μl第一试剂，再加入50μl第二试剂，混匀，37±1℃条件下温育15min；

2、加入50μl磁分离试剂，混匀，37±1℃条件下温育5min；

3、使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入300μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；重复此操作，共操作5次；

4、将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入150μl的发光底物，去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值（RLU）。

（一）灵敏度评价

检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于0.02ng/mL

（1）A点发光值，结果参见表1

表1

A点发光均值X=1190

SD=122

X+2SD=1434

（2）B点发光值，结果参见表2

表2

PCT-STD-B(RLU)
	3888
3641

B点发光均值X=3765

（3）A,B点连点拟合曲线参见附图1

（4）灵敏度=0.008ng/mL

（二）精密度评价

（1）分析内精密度

将实施例1中制备的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定，结果参见表3，得出批内变异系数为2.50%～5.22%。

表3

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			0.4	10	5.22
10	10	2.50
			60	10	5.06

（2）分析间精密度

将实施例1中制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，统计分析间变异系数为4.5%～7.22%，结果见表4。

表4

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			0.4	30	7.22
10	30	4.50
			60	30	7.06

（三）准确度评价

在2例混合血清样本中添加不同量人PCT标准品，形成3个浓度水平的血清添加样本，添加物体积小于总体积的10%。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法血清基质回收率在90-110%之间。数据参见表5。

R = \frac{C \times (V_{0} + V) - C_{0} \times V_{0}}{V \times C_{S}} \times 100 %

R：回收率；

V：加入标准溶液的体积；

V0：人源样品的体积；

C：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；

C0：人源样品的检测浓度；

Cs：标准溶液的浓度。

表5

（四）试剂盒特异性评价

对实施例1的试剂盒特异性检验是选取与PCT有类似结构的抗钙素原（Human katacalcin）、降钙素（Human calcitonin）、降钙素基因相关肽b（Human alpha-CGRPb）、降钙素基因相关肽（Human beta-CGRP）,配制成大于生理浓度的样本，以本方法进行测定，并计算交叉反应率。结果见表6，本法与Human katacalcin、Human calcitonin、Human alpha-CGRPb、Human beta-CGRP的交叉反应率均小于0.04%

表6

注：a)Calcitonin Gene-Related Peptide

（五）相关性评价

用实施例1制备得的试剂盒和Roche公司的Elecsys BRAHMS PCT电化学发光法试剂盒对202份人血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2，以本发明方法的测的血清PCT浓度为横坐标，以Roche试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y=0.998x-0.145，相关系数为：0.9945。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

（六）热稳定性评价

对实施例1的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。

经过大量的实验证明，本发明提供的试剂盒方法学指标如下：

1、检测范围：0～100ng/mL。

2、灵敏度：最低检测限不高于0.02ng/mL。

3、精密度：小于10%。

4、准确性：平均回收率在95%～105%。

5、特异性：与抗钙素原（Human katacalcin）、降钙素（Humancalcitonin）、降钙素基因相关肽b（Human alpha-CGRPb）、降钙素基因相关肽（Human beta-CGRP）的交叉反应率小于0.04%。

6、稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，试剂盒效期可达12个月。

7、相关性：与Roche公司的Elecsys BRAHMS PCT电化学发光法试剂盒对202份人血清样品同时进行检测。其检测结果见附图2，以本发明方法的测的血清PCT浓度为横坐标，以Roche试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y=0.998x-0.145，相关系数为：0.9945。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1. 一种降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：

降钙素原系列标准品；

磁分离试剂：偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液，所述的偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2~1.0mg/ml；

第一试剂：含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液，所述的含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2~2.5μg/ml；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体溶液，所述的含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2~1μg/ml。

2. 根据权利要求1所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2μm，每克磁微粒表面的羧基含量不低于0.4毫摩尔。

3. 根据权利要求1所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：第一试剂中，所述的抗降钙素原单克隆抗体与所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔比为1：18~22。

4. 根据权利要求1所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：第二试剂中，所述的抗降钙素原单克隆抗体与所述的碱性磷酸酶的摩尔比为1:1~2。

5. 根据权利要求1所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：所述的碱性磷酸酶的纯度大于95%，比活性大于1000 U/mg，浓度大于5mg/ml。

6. 根据权利要求1所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于：第一试剂和第二试剂中的抗降钙素原单克隆抗体的纯度均大于95%，浓度均大于1mg/ml。

7. 根据权利要求1至6中任一项所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

磁分离试剂的制备方法为：将所述的磁微粒用0.04~0.06mol/L、pH4.5~5 的2-吗啉乙磺酸缓冲液重悬，重悬后磁微粒的浓度为8~12mg/ml；然后加入所述的链霉亲和素，在15~40℃下混悬30~60分钟，其中所述的磁微粒与所述的链霉亲和素的质量比为25~50:1；然后再加入新鲜配置的8~12mg/ml的碳二亚胺水溶液，在15~40℃下混悬2~12h，其中所述的2-吗啉乙磺酸缓冲液与所述的碳二亚胺水溶液的体积比为10~20:1；磁分离，去上清，用含质量比为0.09~1.1%的牛血清白蛋白、pH为7~7.5、物质的量浓度为0.009~0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液重悬到所述的偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度为0.2~1.0mg/ml，即得所述的磁分离试剂；

第一试剂的制备方法为：将所述的抗降钙素原单克隆抗体用0.01~0.03mol/L、 pH为7~7.5的PBS缓冲液，在2~8℃下透析过夜，配置成抗降钙素原单克隆抗体溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶于二甲基亚砜中配置成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液，其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的物质的量浓度为8~12mM；将所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯溶液加入到所述的抗降钙素原单克隆抗体溶液中，混合均匀，在15~40℃下放置20~40分钟；加入0.9~1.1M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，终止反应，在15~40℃下放置8~12分钟，然后用含质量比为2.5~3.2%的牛血清白蛋白、pH 为7~7.5、物质的量浓度为0.04~0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2~2.5μg/ml，即得所述的第一试剂；

第二试剂的制备方法为：将抗降钙素原单克隆抗体加入到浓度为8~12mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15~40℃下静置18~25分钟，加入0.09~0.11mol/L的甘氨酸溶液，在15~40℃下静置4~5分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗降钙素原单克隆抗体，2~8℃保存备用；将碱性磷酸酶溶液加入到4~5mg/ml的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15~40℃下静置25~35分钟，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2~8℃保存备用；将活化后的抗降钙素原单克隆抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在2-8℃下静置12~24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2~8℃保存备用；将所述的连接物浓溶液用含质量比为0.4~0.6%的牛血清白蛋白、pH为7.8~8.0、物质的量浓度为0.09~0.11mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的抗降钙素原单克隆抗体的浓度为0.2~1μg/ml，即得所述的第二试剂；

降钙素原系列校准品的制备方法为：将降钙素原纯品用pH7~7.5、0.04~0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液分别稀释到多个浓度后分别冻干，即得所述的降钙素原系列校准品。

8. 根据权利要求1至6中任一项所述的降钙素原的化学发光定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括依次进行的以下步骤：

步骤1：在检测管中加入待测样本原液，然后依次加入第一试剂和第二试剂，混匀，在36~38℃下温育14~16分钟，其中所述的待测样本原液、所述的第一试剂和所述的第二试剂的体积比为1:0.9~1.1：0.9~1.1；

步骤2：然后向步骤1温育后的体系中加入磁分离试剂，混匀，在36~38℃下温育4~6分钟，所述的待测样本原液与所述的磁分离试剂的体积比为1:0.9~1.1；