CN105277682A

CN105277682A - 一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN105277682A
Application number: CN201510788470.3A
Authority: CN
Inventors: 秦枫; 马竹凤; 王静; 张伟; 柳乐; 徐娟; 李庆春
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明公开了一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，包括生物素化单抗药物、校准品、质控品、酶结合物、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。通过上述方式，本发明采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

Description

一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断领域，特别是涉及一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒。

背景技术

治疗性单克隆抗体药物经历了三十多年的发展，已经成为生物医药的最重要组成部分之一，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。

TNF-α（tumornecrosisfactor,TNF）是由激活的单核-巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，与机体免疫反应、急性期反应及炎症反应关系密切。靶向TNF-α的治疗性单抗药物是目前用于自身免疫性疾病最成功的一类生物药物，可用于治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病及强直性脊柱炎。目前，TNF-α单抗药物包括英夫利昔单抗（Infliximab）、阿达木单抗（Adalimumab）、依那西普（Etanercept）、赛妥珠单抗（CertolizumabPegol）和戈利木单抗（Golimumab）。

英夫利昔单抗为抗TNF-α的人鼠嵌合单克隆抗体，能与TNF-α的可溶形式及跨膜形式高度结合，抑制TNF-α与p55/p75受体的结合，从而使TNF-α失去活性。阿达木单抗为特异性结合TNF-α的人源性抗体，通过阻止TNF-α与其细胞表面受体相结合，发挥抗炎作用。依那西普是利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达系统产生的人肿瘤坏死因子受体p75Fc融合蛋白，由人肿瘤坏死因子受体2（TNFR2/p75）的胞外配体结合部位与人IgG1的Fc片段连接组成。组成依那西普的Fc包括CH2、CH3及连接部位，但不包括IgG1的CH1部分。赛妥珠单抗分子量约91千道尔顿，是一种由对TNF-α特异性的重组人源化抗体Fab'片段，结合至一个约40kDa聚乙二醇（PEG2MAL40K）制备而成。戈利木单抗是一种全人源抗TNF-α的单克隆抗体。这些抗体药物都能结合游离的以及膜结合的TNF-α，抑制其与受体结合，阻断其生物效应，但是不同形式的抗体通过不同的机制发挥作用。

然而，在使用这些抗体药物的过程中，患者可能会针对这些药物本身产生免疫应答，生成抗药抗体（Anti-drugantibodies，ADA），降低或者中和了治疗效果。

一般检测ADA方法主要为酶联免疫吸附法，简便易行，特异性高，可为临床对单抗药物的使用提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：

（1）检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果。

（2）ELISA方法检测范围和灵敏度都较低。

（3）ELISA方法的检测时间较长，完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。

（4）ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，具有时间短、灵敏度高、结果偏差小、可重复等优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，包括生物素化单抗药物、抗单抗药物抗体校准品、抗单抗药物抗体质控品、酶结合物、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化单抗药物为偶联有生物素的单抗药物，所述酶结合物为AP标记的单抗药物，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化单抗药物为生物素与单抗药物表面的-NH₂基团反应得到。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

在本发明一个较佳实施例中，所述抗单抗药物抗体校准品是由抗单抗药物抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗单抗药物抗体质控品是由抗单抗药物抗体配制而成。

在本发明一个较佳实施例中，所述化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

本发明的有益效果是：本发明的抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒的检测原理图；

图2是本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，包括生物素化单抗药物、抗单抗药物抗体校准品、抗单抗药物抗体质控品、酶结合物、磁微粒试剂和清洗液。所述生物素化单抗药物为偶联有生物素的单抗药物。所述酶结合物为AP标记的单抗药物，是将碱性磷酸酶AP与单抗药物偶联。所述磁微粒试剂为表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。所述清洗液可以是清洗浓缩液，在使用时进行配制。其中ADA指抗药物抗体Anti-DrugAntibody。

所述生物素化单抗药物为生物素与单抗药物表面的-NH₂基团反应得到。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。所述抗单抗药物抗体校准品是由抗单抗药物抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗单抗药物抗体质控品是由抗单抗药物抗体配制而成。所述化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，主要成分为金刚烷（AMPPD），在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现ADA免疫含量检测的，其检测原理如图1所示：将含抗药抗体的样本与磁微粒试剂（M）、生物素化单抗药物（R1）混合，得到样本-M-R1复合物，进行洗涤，再加入酶结合物（R2），得到样本-M-R1-R2复合物，进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

实施例二：

本发明试剂盒的性能评估：

1、本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒

（1）样本比对

阴、阳性符合率：本发明试剂盒对200例临床血清检测抗TNF-α单抗药物抗体的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对，结果见下表。结果表明，本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒阴性符合率99%（99/100），阳性符合率99%（99/100），说明本试剂盒临床符合率高。

（2）灵敏度：本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒LOD为5ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图2。

（4）准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清按照1：9（体积比）添加到两份基础血清中，计算其浓度。血清加样回收率在85%-115%之间。

添加回收实验（加样回收率=添加后样本值/（0.1*样本A+0.9样本B）*100%。

（5）精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在15%以内。

（6）稳定性：将本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、HAMA检测结果显示，添加物质对本发明抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒检测结果没有影响。

本发明的有益效果是：

一、本发明完成所有流程得到结果的时间为50min，相比ELISA法大大缩短了反应时间；

二、本发明采用碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD系统，相比ELISA法检测系统的灵敏度高10倍；

三、本发明为全自动封闭操作系统，可靠性高，稳定性好，检测结果重复性好；

四、本发明从稀释、加样、孵育、清洗以及检测步骤实现了全自动化，避免了人为操作带来的结果偏差。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，其特征在于，包括生物素化单抗药物、抗单抗药物抗体校准品、抗单抗药物抗体质控品、酶结合物、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化单抗药物为偶联有生物素的单抗药物，所述酶结合物为AP标记的单抗药物，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

2.根据权利要求1所述的抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，其特征在于，所述生物素化单抗药物为生物素与单抗药物表面的-NH₂基团反应得到。

3.根据权利要求1所述的抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

4.根据权利要求1所述的抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗单抗药物抗体校准品是由抗单抗药物抗体配制而成，用于得到校准曲线，所述抗单抗药物抗体质控品是由抗单抗药物抗体配制而成。

5.根据权利要求1所述的抗TNF-α单抗药物抗体检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。