CN105467114A

CN105467114A - 一种曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒

Info

Publication number: CN105467114A
Application number: CN201510788468.6A
Authority: CN
Inventors: 秦枫; 马竹凤; 王静; 张伟; 柳乐; 徐娟; 李庆春
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2015-11-17
Publication date: 2016-04-06

Abstract

本发明公开了一种曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，包括生物素化抗Trastuzumab抗体或Trastuzumab、校准品、质控品、AP-抗人IgG抗体或AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。通过上述方式，本发明采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

Description

一种曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒

技术领域

本发明涉及磁微粒化学发光免疫诊断技术领域，特别是涉及一种曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒。

背景技术

乳腺癌是一种常见的上皮细胞癌。在我国女性癌症患者中，乳腺癌患病率占第二位。人类表皮生长因子受体-2（HER-2）是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因。约有25％～30％的乳腺癌患者HER-2有基因改变，促使肿瘤细胞HER-2增加。Slamon等人证明有淋巴结转移者若 HER-2 过表达，复发时间明显缩短，生存时间明显减少；HER-2阳性的乳腺癌病人的平均生存期为3年，而HER-2阴性的乳腺癌患者平均生存期为6～7年，首先提出HER-2高表达与乳腺癌不良预后有关。HER-2在乳腺癌中的高表达往往预示着雌激素受体（ER）阴性、易有淋巴结转移和肿瘤分化差，预后不佳。随着对HER-2研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。

HER-2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，由胞外结构域（ECD）､跨膜结构域和细胞内结构域（ICD）三部分组成。当HER-2以单体跨膜存在时无活性，而细胞外结构域与配体结合，HER-2形成二聚体产生活化信号，激活受体细胞内部分的酪氨酸激酶，完成传递细胞调节信号的过程。

治疗性单克隆抗体药物经历了三十多年的发展，已经成为生物医药的最重要组成部分之一，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是重组DNA人单克隆抗体，适用于HER-2过度表达的乳腺癌患者。曲妥珠单抗选择性作用于HER-2分子，抑制癌细胞的增生，具有高度亲和力，高度靶向性，并且只对癌细胞起作用，对正常细胞的杀伤较小，是当代乳腺癌靶向治疗的代表性药物。

研究表明，曲妥珠单抗治疗乳腺癌的作用机理主要是通过与HER-2受体特异性结合，影响生长信号的传递；促进HER-2受体蛋白的内在化降解；通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADDC作用）聚集免疫细胞攻击并杀死肿瘤细胞；另外，它还可以下调血管内皮生长因子（VEGF）和其它血管生长因子活性。HER-2 不但可作为反映恶性肿瘤恶性生物学特性的指标，而且为治疗肿瘤提出了新的理念：抗HER-2单抗药物可以靶向抑制乳腺癌细胞中HER-2的过表达。

虽然曲妥珠单抗可以靶向性地治疗乳腺癌，但在治疗性抗体（药物）的治疗期间，可能会产生针对治疗性抗体本身的免疫应答，患者体内通常在治疗过程中产生针对治疗抗体（药物）本身的抗体，称之为抗药物抗体（ADA）。而这些抗药物抗体会降低甚至中和治疗性抗体的作用。因此，在曲妥珠单抗治疗乳腺癌患者的过程中，如果能即时同时监测ADA的含量以及曲妥珠单抗在患者体内的含量，提供有关患者针对特定治疗药物的治疗反应的信息，及时调整治疗方法，根据病人的用药情况进行个性化治疗，从而实现伴随诊断，更有利于乳腺癌的治疗。

目前对于ADA的检测方法已有报道，主要为酶联免疫吸附法，但该方法存在着不足之处。

ELISA检测ADA，简便易行，特异性高，可为临床对肿瘤单抗药物的使用提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种ELISA检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：

（1）检测试剂在检测过程中为开放方式，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果；

（2）ELISA方法检测范围和灵敏度都较低。

（3）ELISA方法的检测时间较长，完成一个测试所需的总时间一般在2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。

（4）ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，包括生物素化抗Trastuzumab抗体、Trastuzumab校准品、Trastuzumab质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化抗Trastuzumab抗体为偶联有生物素的抗Trastuzumab抗体，所述AP-抗人IgG抗体为AP标记的抗人IgG抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化抗Trastuzumab抗体是生物素与抗Trastuzumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。

所述Trastuzumab校准品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述Trastuzumab质控品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成。

在本发明一个较佳实施例中，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

在本发明一个较佳实施例中，所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

提供一种抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，包括生物素化Trastuzumab、抗Trastuzumab抗体校准品、抗Trastuzumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化Trastuzumab为偶联有生物素的Trastuzumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化Trastuzumab是生物素与Trastuzumab分子表面的-NH₂基团反应得到。

在本发明一个较佳实施例中，所述抗Trastuzumab抗体校准品是由抗Trastuzumab抗体配制而成，用于得到校准曲线；所述抗Trastuzumab抗体质控品是由抗Trastuzumab抗体配制而成。

本发明的有益效果是：本发明的曲妥珠单抗试剂盒及其抗药抗体试剂盒，采用全自动磁微粒化学发光检测方法，选取碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD体系，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒的检测原理图；

图2是本发明抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒的检测原理图；

图3是本发明单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒与国外知名公司同类产品样本比对图；

图4是本发明单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图；

图5是本发明抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒的实际检测浓度与理论浓度的线性回归图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，包括生物素化抗Trastuzumab抗体、Trastuzumab校准品、Trastuzumab质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。所述生物素化抗Trastuzumab抗体为偶联有生物素的抗Trastuzumab抗体。所述AP-抗人IgG抗体为AP标记的抗人IgG抗体，是将碱性磷酸酶AP与抗人IgG抗体偶联。所述磁微粒试剂为表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。所述清洗液可以是清洗浓缩液，在使用时进行配制。

所述生物素化抗Trastuzumab抗体是生物素与抗Trastuzumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。所述Trastuzumab校准品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述Trastuzumab质控品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，主要成分为金刚烷（AMPPD），在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现抗药抗体的免疫含量检测的，其检测原理如图1所示：将单抗药物样本Trastuzumab与磁微粒试剂M、生物素化抗Trastuzumab抗体R1混合，得到样本-M-R1复合物，进行洗涤，再加入酶结合物AP-抗人IgG抗体R2，得到样本-M-R1-R2复合物，进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

实施例二：

提供一种抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，包括生物素化Trastuzumab、抗Trastuzumab抗体校准品、抗Trastuzumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液。所述生物素化Trastuzumab为偶联有生物素的Trastuzumab。所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，是将碱性磷酸酶AP与抗ADA（Anti-Trastuzumab）抗体偶联。所述磁微粒试剂为表面有亲和素SA基团的纳米磁微粒悬浮液。所述清洗液可以是清洗浓缩液，在使用时进行配制。其中ADA 指抗药物抗体Anti-Drug Antibody，这里特指Anti-Trastuzumab。

所述生物素化Trastuzumab是生物素与Trastuzumab分子表面的-NH₂基团反应得到。所述抗Trastuzumab抗体校准品是由抗Trastuzumab抗体配制而成，用于得到校准曲线；所述抗Trastuzumab抗体质控品是由抗Trastuzumab抗体配制而成。所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD，主要成分为金刚烷（AMPPD），在碱性磷酸酶的催化下释放光子。

所述检测试剂盒是基于磁微粒化学发光检测原理来实现ADA免疫含量检测的，其检测原理如图2所示：将抗药物抗体Anti-Trastuzumab样本与磁微粒试剂M、生物素化Trastuzumab R1混合，得到样本-M-R1复合物，进行洗涤，再加入酶结合物AP-抗ADA抗体R2，得到样本-M-R1-R2复合物，进行洗涤，再加入化学发光底物，测定发光结果。

实施例三：

本试剂盒的性能评估：

1、本发明单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒

（1）样本比对

本发明试剂盒对200例临床血清检测Trastuzumab的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对。结果表明，本发明Trastuzumab试剂盒检测浓度值与国外知名公司同类产品检测浓度值具有良好的相关性，结果如图3。

（2）灵敏度：本发明Trastuzumab检测试剂盒LOD为5ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用本发明Trastuzumab试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图4。

（4）准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清一共三份血清（样本A），按照1：9体积比分别添加到两份基础血清中（样本B），混匀后形成六份新样本，分别检测并计算其浓度。血清加样回收率在85%-115%之间。

添加回收实验：加样回收率=添加后样本值/（0.1*样本A+0.9样本B）*100%。

（5）精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在15%以内。

（6）稳定性：将本发明Trastuzumab试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明Trastuzumab试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示，添加物质对本发明Trastuzumab试剂盒检测结果没有影响。

2、抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒

（1）样本比对

阴、阳性符合率：本发明试剂盒对200例临床血清检测Anti-Trastuzumab的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对，结果见下表。结果表明，本发明Anti-Trastuzumab试剂盒阴性符合率99%（99/100），阳性符合率98%（98/100）说明本试剂盒临床符合率高。

（2）灵敏度：本发明Anti-Trastuzumab试剂盒LOD为5ng/mL，而酶联免疫法的灵敏度为30ng/mL。

（3）线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用Anti-Trastuzumab试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图5。

（6）稳定性：将本发明Anti-Trastuzumab试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明Anti-Trastuzumab试剂盒稳定好，符合临床要求。

（7）特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂、RF、HAMA检测结果显示，添加物质对本发明Anti-Trastuzumab试剂盒检测结果没有影响。

一、采用这些试剂盒完成所有流程得到结果的时间为50min，相比ELISA法大大缩短了反应时间；

二、本发明采用碱性磷酸酶AP-金刚烷AMPPD系统，相比ELISA检测系统的灵敏度高10倍；

三、本发明为全自动封闭操作系统，可靠性高，稳定性好，检测结果重复性好；

四、本发明从稀释、加样、孵育、清洗以及检测步骤实现了全自动化，避免了人为操作带来的结果偏差。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，其特征在于，包括生物素化抗Trastuzumab抗体、Trastuzumab校准品、Trastuzumab质控品、AP-抗人IgG抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化抗Trastuzumab抗体为偶联有生物素的抗Trastuzumab抗体，所述AP-抗人IgG抗体为AP标记的抗人IgG抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

2.根据权利要求1所述的单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗Trastuzumab抗体是生物素与抗Trastuzumab抗体分子表面的-NH₂基团反应得到。

3.根据权利要求1所述的单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述Trastuzumab校准品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成，用于得到校准曲线；所述Trastuzumab质控品是由含有Trastuzumab的人血清配制而成。

4.根据权利要求1所述的单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

5.根据权利要求1所述的单抗药物曲妥珠单抗Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。

6.一种抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，其特征在于，包括生物素化Trastuzumab、抗Trastuzumab抗体校准品、抗Trastuzumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化Trastuzumab为偶联有生物素的Trastuzumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。

7.根据权利要求6所述的抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述生物素化Trastuzumab是生物素与Trastuzumab分子表面的-NH₂基团反应得到。

8.根据权利要求6所述的抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述抗Trastuzumab抗体校准品是由抗Trastuzumab抗体配制而成，用于得到校准曲线；所述抗Trastuzumab抗体质控品是由抗Trastuzumab抗体配制而成。

9.根据权利要求6所述的抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述磁微粒试剂中磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。

10.根据权利要求6所述的抗药抗体Anti-Trastuzumab试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物中包括3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐AMPPD。