CN108267594A - 一种基于双分子荧光互补技术的st2检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents
一种基于双分子荧光互补技术的st2检测试剂盒、制备及使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法。所述试剂盒包括：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的ST2诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于预测急性心肌梗死(AMI)患者预后不良心血管事件发生和评估冠状动脉病变程度的能力效果的监测，提高临床医生对AMI患者或AMI高危人群的临床评价和危险分层准确率，具有极大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内ST2的含量，属于疾 病诊断检测领域。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2，ST2)是IL-1受体超家 族成员，最先由Tominaga在1989年发现，长期以来被认为是一个孤儿受体与炎症和免疫性 疾病相关，到2005年发现了它的特异性配体IL-33，于是对ST2的研究扩展到一个新的领域。 人ST2的基因位于染色体2q12，约40KD，表达于肥大细胞、巨噬细胞、激活的辅助性T细 胞2(Th2)、心肌细胞和心肌成纤维细胞。
ST2基因有4种转录产物，其中2个最重要的亚型是跨模型ST2(ST2L)和可溶性ST2(sST2)，是由启动子选择性剪切和3′端加工形成的。ST2L包括一个胞外结构域是由3个 连续的免疫球蛋白模体组成、一个跨膜结构域和一个Toll/IL-1受体(TIR)胞内结构域；与ST2L相比，sST2缺失跨膜及胞内结构域，仅由一个含9个氨基酸的C末端序列组成，可 以分泌到细胞外；而ST2V缺失第3个免疫球蛋白模体，并在C末端选择性剪接形成一个特 殊的疏水区；ST2LV是选择性剪切掉了ST2L的跨膜结构域而形成。
ST2基因在心肌细胞和心肌成纤维细胞遭受机械张力时均会上调表达，sST2作为IL-33 的诱骗受体，与IL-33结合后阻断IL-33与ST2L的结合，减弱其下游通路激活所起的心脏保 护作用，进而加重心肌重塑和心功能障碍，并与增加心衰、心肌梗死、心血管性死亡等不良 心血管事件的发生。
目前，检测ST2的方法主要有酶联免疫吸附试验，免疫层析法和化学发光免疫分析法。 酶联免疫吸附试验法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化， 具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，目前主要 应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目；免疫层析法具有操作简单，检测速 度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点。化学发 光免疫分析法具有操作简单，检测速度快、高通量检测等优点，但也存在非均相反应、检测 时间长、批内批间变异大的缺点。
为解决上述问题，如果能利用ST2的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种 针对血栓性疾病诊断和溶栓治疗效果监测的ST2快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比， 具有操作方便、灵敏度高、免清洗、精密度高等优点；将其应用于血栓性疾病和溶栓治疗效 果的监测，可以提高血栓性疾病诊断和溶栓治疗效果监测的准确率，则会受到市场的广泛欢 迎和具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测ST2的检测试剂盒、 其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于双分子荧光互补技术ST2检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段；
2)抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段；
在上述技术方案中，所述抗ST2抗体为针对ST2不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
在上述方案中，所述抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与 抗ST2抗体的质量比为1∶1-10。
在上述方案中，所述抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与 抗ST2抗体的质量比为1∶1-10。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒。其主 要组成包括：
1)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体 偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒原理示意图；附 图标记说明：1-抗ST2抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(ST2)，5-抗ST2抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。
图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及其使用方 法进行详细说明。
实施例1
抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/mL。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗ST2抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPN 蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μL 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例2
抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC 为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/mL。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗ST2抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/mL抗体，将活化的YFPC 蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μL 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体 偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的ST2标准品溶液。 在反应孔中分别加入20μL标准品、加入50μL抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入 50μL抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔， 测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
回收率试验：用已知量ST2标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加 入的理论值进行比较，计算ST2的回收率。检测结果如下：
| 样本编号 | 加入ST2浓度(ng/mL) | 测量ST2的浓度(ng/mL) | 回收率(％) |
| 1 | 20 | 21.6 | 95.9 |
| 2 | 60 | 58.2 | 102.1 |
| 3 | 120 | 123.5 | 100.6 |
| 4 | 180 | 178.9 | 99.6 |
3.精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测 量结果，计算平均偏差CV值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量 点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵 敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为5.0ng/mL。
5.抗干扰性
检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、 高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到ST2阳性血 清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。将甘油三酯溶液分别取 适量加入到ST2阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。 将胆红素溶液分别取适量加入到ST2阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25 μg/mL、50μg/mL。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的ST2阻性标本进行测定。将理 论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在99.7％-104.0％之间。表明基于双分子荧光互 补技术的ST2试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示，与Critical Diagnostics ST2试剂盒的相关性为：y＝0.986x-0.121，R2＝0.998。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器 要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉 本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖 在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段；
2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗ST2抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗ST2抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
2.一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；
2)抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。
3.根据权利要求1所述的抗ST2抗体为针对ST2不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗ST2抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与ST2抗体的质量比为1∶1-10。
6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的ST2检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗ST2抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与ST2抗体的质量比为1∶1-10。
7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。
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