CN108226521A - 一种基于双分子荧光互补技术的h-fabp检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

一种基于双分子荧光互补技术的h-fabp检测试剂盒、制备及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的H‑FABP诊断试剂盒。所述试剂盒包括：抗H‑FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗H‑FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的H‑FABP诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗H‑FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗H‑FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，应用于早期诊断急性心肌梗死，能够对心肌梗死能做出及时的高度准确的评判，具有极大的市场价值。

Description

一种基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒、制备及 使用方法
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测H-FABP的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种心肌缺血的高敏早期标志物，缺血性发作30 分钟后即可检。脂肪酸结合蛋白(FABPs)在活性脂肪酸代谢的组织中大量存在，如心脏和肝脏，它们的主要功能促进细胞内的长链脂肪酸运输。现已确定九个不同类型的FABP，其中，H-FABP是最广泛的，因为它大量存在于心肌细胞。其低分子量和细胞质的位置相结合，使H-FABP成为急性冠脉综合症(尤其是胸痛发作6小时内)的一个高敏的早期标志物，缺血性发作30分钟后即可检测。这可能是因为在心肌缺血和心肌坏死以后，它迅速从细胞质进入血液循环。H-FABP在6-8小时左右达到浓度峰值，然后在24-30小时左右恢复至正常水平。如此迅速恢复至正常水平得益于高肾清除率，这意味着H-FABP不仅能够用作AMI早期标志物，还是理想的心肌梗死复发诊断标志物。尽管H-FABP的释放特点与肌红蛋白相似，但其心肌特异性是肌红蛋白的15-20倍；因此H-FABP是更有效的心肌损伤标志物。此外， H-FABP的正常血清/血清值比肌红蛋白低，从而降低假阳性比率。
目前，检测H-FABP的方法主要有酶联免疫吸附试验，免疫层析法和化学发光免疫分析法。但这些检测方法均存在一些缺点，酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低；免疫层析法存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点；化学发光免疫分析法存在非均相反应、检测时间长、批内批间变异大的缺点。
为解决上述问题，如果能利用H-FABP的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对心肌梗死疾病诊断的H-FABP快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、灵敏度高、免清洗、精密度高等优点；将其应用于早期心肌梗死和心肌梗死复发的监测，能做出及时的高度准确的评判，具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测H-FABP的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于双分子荧光互补技术H-FABP检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白N端片段；
2)抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白C端片段；
在上述技术方案中，所述抗H-FABP抗体为针对H-FABP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
在上述方案中，所述抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗H-FABP抗体的质量比为1∶1-10。
在上述方案中，所述抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗H-FABP抗体的质量比为1∶1-10。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒。其主要组成包括：
1)抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗 H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗H-FABP抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(H-FABP)，5-抗H-FABP 抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。
图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗H-FABP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例2
抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段 YFPC为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗H-FABP抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗 H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的H-FABP标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
回收率试验：用已知量H-FABP标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算H-FABP的回收率。检测结果如下：
样本编号 加入H-FABP浓度(ng/ml) 测量H-FABP的浓度(ng/ml) 回收率(％)
1 2.5 2.54 101.6
2 8 8.12 101.5
3 20 19.81 99.05
4 40 41.5 103.7
3.精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度0.1ng/ml。
5.抗干扰性
检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到H-FABP阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到H-FABP阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0 mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到H-FABP阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为25μg/ml、50μg/ml。对加入了血红蛋白、类风湿因子和胆红素的H-FABP阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在99.3％-101.3％之间。表明基于双分子荧光互补技术的H-FABP试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示，与日本百奥灵公司H-FABP试剂盒的相关性为：y＝1.009x+0.225，R2＝0.998。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段；
2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗H-FABP抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
2.一种基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；
2)抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。
3.根据权利要求1所述的抗H-FABP抗体为针对H-FABP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与H-FABP抗体的质量比为1∶1-10。
6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的H-FABP检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗H-FABP抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与H-FABP抗体的质量比为1∶1-10。
7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。
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