CN108387733A - 一种基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒、制备及使用方法。所述试剂盒包括：抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段；本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的mALB诊断试剂盒的制备方法，该方法包括：抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备；最后还公开了该试剂盒的使用方法；本发明试剂盒具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，其应用于糖尿病肾病早期肾损伤的评价、高血压患者肾功能损伤的评价，可以提高对肾损伤疾病预测以及评价的准确率，具有极大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测mALB的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
尿微量白蛋白(microalbuminuria，mALB)是一种小分子蛋白，人体正常状态下95％的 mALB在近曲小管被重吸收。如果肾小球滤过的功能受损，尿中mALB的量超过肾小管重吸收的能力时，尿液中mALB含量就会升高。因此mALB在诊断早期或轻微肾脏损害方面具有重要的提示作用。
尿微量白蛋白检测可作为全身性或局部炎症反应的肾功能指标，如尿路感染等原因引起的肾脏早期病变、急性胰腺炎并发症的预测指标；服用对肾功能有影响的药物者也可检测尿微量白蛋白，便于早期观察肾功能情况及早采取措施。尿常规检测蛋白阴性的糖尿病、高血压、泌尿系疾病等患者引发的早期肾损伤，因临床表现不明显，难以早期发现。当临床上出现大量蛋白尿时，肾脏损伤往往已经比较严重甚至无法逆转。因此检测尿微量白蛋白可早期诊断肾损伤并及时治疗，对防止病情的进一步发展和改善预后有重要的临床意义。
目前，检测mALB的检测方法较多，如放射免疫法、酶联免疫吸附试验法、免疫透射比浊法等。放射免疫法被认为是检测mALB的金标准，这种方法应用最早，灵敏度和准确性较好，但缺点是使用的仪器较贵，且存在放射性污染问题，在临床应用上具有局限性。酶联免疫吸附试验法虽然成本较低，但是操作繁琐，影响因素较多，结果的可靠性较差。
为解决上述问题，如果能利用尿微量白蛋白的抗体，以双分子荧光互补技术为平台，研发出一种针对糖尿病肾病早期肾损伤的评价、高血压患者肾功能损伤的评价的尿微量白蛋白快速检测试剂。具有操作简单、线性范围宽、特异性好、免清洗、准确度高等优点，便于临床检测使用，可以提高对肾损伤疾病预测以及评价的准确率，会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测mALB的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于双分子荧光互补技术的人尿微量白蛋白检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗mALB抗体偶联荧光蛋白N端片段；
2)抗mALB抗体偶联荧光蛋白C端片段；
在上述技术方案中，所述抗mALB抗体为针对mALB不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
在上述方案中，所述抗mALB抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中，荧光蛋白N端片段与抗mALB抗体的质量比为1∶1-10。
在上述方案中，所述抗mALB抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中，荧光蛋白C端片段与抗mALB抗体的质量比为1∶1-10。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒。其主要组成包括：
1)抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒原理示意图，其中，1-抗mALB抗体，2-连接剂，3-荧光蛋白N端片段，4-待测物(mALB)，5-抗mALB 抗体，6-荧光蛋白C端片段，7-连接剂。
图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
抗mALB抗体偶联荧光蛋白N端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN 为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗mALB抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例2
抗mALB抗体偶联荧光蛋白C端片段，以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中，用0.05mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/LpH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗mALB抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPC蛋白和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
2)抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的mALB标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μl抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
回收率试验：用已知量mALB标准品加入到正常人的尿液标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算mALB的回收率。检测结果如下：
| 样本编号 | 加入mALB浓度(μg/ml) | 测量mALB的浓度(μg/ml) | 回收率(％) |
| 1 | 5 | 5.08 | 101.6 |
| 2 | 10 | 9.7 | 97 |
| 3 | 50 | 50.9 | 101.8 |
| 4 | 100 | 101.2 | 101.2 |
3.精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差CV值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.1μg/ml。
5.抗干扰性
检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到mALB阳性尿液标本中，使尿液中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到mALB阳性尿液标本中，使尿液中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到mALB阳性尿液标本中，使尿液中胆红素的含量分别为25 μg/ml、50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的mALB阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在98.5％-102.0％之间。表明基于双分子荧光互补技术的mALB试剂在检测尿液样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示，与杭州康特mALB试剂盒的相关性为：y＝0.997x+1.006，R2＝0.997。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒、制备及使用方法，其特征在于：
1)试剂盒主要组成：抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段；
2)使用方法：在试剂盒的反应孔中加入样本、抗mALB抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗mALB抗体偶联的荧光蛋白C端片段，混合反应5-60分钟；
3)检测方法：激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
2.一种基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)抗mALB抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备；
2)抗mALB抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。
3.根据权利要求1所述的mALB抗体为针对mALB不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗mALB抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中，荧光蛋白N端片段与mALB抗体的质量比为1∶1-10。
6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的mALB检测试剂盒制备的方法，其特征在于，所述的抗mALB抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中，荧光蛋白C端片段与抗mALB抗体的质量比为1∶1-10。
7.根据权利要求1所述的反应孔，包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CLIFF I. STAINS, ET AL.: "A General Approach for Receptor and Antibody-Targeted Detection of Native Proteins Utilizing Split-Luciferase Reassembly", 《ACS CHEMICAL BIOLOGY》 * |
| 王红等: "应用单克隆抗体ELISA法检测尿中微量白蛋白", 《上海医学检验杂志》 * |
| 黄欣媛等: "蛋白片段互补分析技术研究进展", 《中国生物工程杂志》 * |
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