KR20200102886A - 항-cyfra21-1 자가항체-항원 결합체 및 cyfra21-1 항원 마커의 검출방법 및 이들 마커의 비율을 이용한 폐암 진단키트 - Google Patents

항-cyfra21-1 자가항체-항원 결합체 및 cyfra21-1 항원 마커의 검출방법 및 이들 마커의 비율을 이용한 폐암 진단키트 Download PDF

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Abstract

암이 발생하게 되면 대부분의 암 관련 항원(종양표지자)의 혈액내 양적 변화가 암 병기0~3기 까지는 매우 작게 나타나며 4기 단계가 되어서야 양적 차이가 나타나기 때문에 양적 변화가 미세한 항원만을 이용한 검사만으로는 낮은 특이도 및 민감도 (89% 특이도, 43% 민감도) 때문에 정상과 암을 구분하기 쉽지 않다. 특히 암 초기 단계인 0~1기에서는 정상과 암을 구분하지 못하는 실정이다.
반면 암 관련 항원에 특이적으로 반응하는 자가항체는 암 병기 초기 (0~1기)에서 그 양적 증가가 가장 크게 나타나며 정상일 때 보다 5~10배 이상 증가폭을 나타낸다.
본 발명은 생물학적 시료에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용한 폐암 진단방법에 관한 것으로 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원을 검출하는 폐암 진단용 키트 및 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 정상과 암환자의 혈액내의 자가항체-항원 결합체와 항원의 비율을 이용하여 0~1기의 암을 진단하는 방법이다. 본 발명은 정상과 폐암환자의 혈액내의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 0~1기의 폐암을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세계최초로 혈액, 혈장과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 90%의 특이도와 76%의 민감도로 0~1기 폐암의 발병 여부를 진단하는 진단키트와 사용방법을 제공하며 1~4기의 전체 폐암에 대해서는 60%의 민감도로 진단하는 키트와 사용방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법은 비교적 채취가 용이한 혈액을 검체로 하기 때문에 기존의 생검이나 CT 등의 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 0~1기 폐암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 폐암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원 마커의 검출방법 및 이들 마커의 비율을 이용한 폐암 진단키트 {A method for detection of CYFRA21-1 Autoantibody-Antigen complex , CYFRA21-1 antigen and Lung Cancer diagnosis kit by using ratio of these markers}
본 발명은 생물학적 시료에서의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 검출방법에 관한 것이며, 또한 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 0~1기를 포함하는 폐암을 진단하는 진단용 키트와 진단방법에 관한 것이다.
폐암은 국제적으로 연간 100만명이 사망하는 것으로 알려져 있다. 지난 수십년 간 진단 및 치료 기술이 개발됐지만 특별한 자각증상이 없고 대부분 진행 암 또는 다른 부위에 전이된 상태에서 발견돼 폐암 환자의 완치율은 30% 이하로 예후가 매우 좋지 않다.
이러한 폐암이지만 조기 진단이 되면 생존율을 80% 이상 획기적으로 증가시킬 수 있으나, 현재 폐암 진단을 위해서는 이미징 방법(X-ray, CT, MRI 등)에 의존도가 높은 편으로 생화학적 지표로 사용될 수 있는 물질은 발견된 예가 적다.
현재 폐암 진단을 위해 바이오 마커라는 이름으로 제시된 물질들이 존재하지만, 여전히 충분한 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)을 나타내지 못하고 있다.
따라서 대내외적으로 급속도로 증가하고 있는 폐암의 유병률과 관련하여 선진국을 중심으로 폐암 바이오 마커 및 진단 키트의 개발 원천기술 확보는 반드시 필요하며 폐암을 조기 (0~1기)에 발견할 수 있는 새로운 폐암 진단 방법 개발이 시급한 실정이다.
폐암의 진단 병법으로는 1) 이미징 방법(X-ray, CT, MRI) : 현재 폐암 진단을 위해서는 이미징 방법에 의존도가 높은 편이나 폐암을 조기 진단하기에는 민감도 및 특이도가 좋지 못하다. 2) 조직검사 : 조직검사 방법으로는 가래 세포검사, 기관지 내시경검사, 세침 흡인 검사, 종 격동 내시경 검사 등이 있으며 생검 조직을 필요로 하는 병리학적, 세포학적 검출 방법으로 침습적이며, 반복 측정하기 어렵다는 단점이 있다 1)
3) 종양표지자 검사 : 악성 종양을 진단하는 비 침습적인 진단방법, 예후를 예측하고, 치료 효과를 판정하는 데에 좋은 인자로 널리 이용되고 있다. 이중 CYFRA21-1은 cytokeratin 19의 분절로 1993년 폐암 표지자로 제시된 이후 그 유용성에 관한 연구가 계속해서 진행되고 있으며, 많은 연구에서 비소세포성 폐암의 표지자로서 가치를 인정받고 있다[4, 5]. 그러나 대부분의 종양표지자는 농도가 일정 이상이 되면 암, 그렇지 않으면 정상으로 판단하는 기준치(cut off)를 이용하기 때문에 정상과 암환자를 구분하는 정확도에 있어서는 한계점을 가지고 있다.
정상 기준치 수치를 넘어섰다고 해도 암이라고 확신할 수 없으며 정상 기준치 이하라고 암이 아니라고 할 수도 없음. 때문에 암을 확진하기 위해서는 조직검사 등의 정밀검사가 필요하다.
종양표지자 검사는 항원 검출 방법을 기본으로 이루어져 있으며 종양표지자 대한 연구는 지속적으로 연구되어 왔으나 종양표지자 검사만으로는 혈액내 종양표지자의 양적 변화가 암 병기 0~3기 까지는 매우 작게 나타나며 4기 수준에서 양적 차이가 나타나기 때문에 양적 변화가 미세한 종양표지자인 항원만을 이용한 검사만으로는 89% 특이도 및 43% 민감도로 낮게 나타나기 때문에 정상과 암을 구분하기 쉽지 않으며 특히 암 0 ~1 기 단계에서는 정상과 암의 구분이 매우 어렵다.
따라서 정상과 암을 구분하기 위해서는 정상과 암이 발생한 경우에 혈액 내 마커의 양적 변화가 매우 크게 나타나는 새로운 마커 및 이를 이용한 새로운 검출 방법이 필요하게 되었다.
항원에 특이적으로 반응하는 자가항체는 암이 발생하게 되면 양적 증가가 나타나는데 암 병기 초기 (0~1기)에서는 면역체계가 활발하기 때문에 자가항체의 양적 증가가 가장 크게 나타나며 정상일 때 보다 5~10배 이상 증가폭을 나타낸다.
본 발명은 정상 대비 암인 경우에 혈액 내 양적 증가가 매우 크게 나타나는 자가항체를 측정하여 항원과의 양적 비율을 이용하여 정상과 암을 구분하는 방법이다.
폐암이 발생되면 혈액내에서 양적 증가를 나타내는 암 관련 단백질인 CYFRA21-1 항원과 이 CYFRA21-1 항원에 특이적으로 반응하는 항-CYFRA21-1 자가항체의 양적 증가가 나타나게 되는데 항-CYFRA21-1 자가항체는 항원과 결합한 형태인 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체로 존재한다.
본 발명은 암 0~1기에서 양적 증가가 거의 없는 CYFRA21-1 항원과 양적 증가 폭이 매우 큰 항-CYFRA21-1 자가항체와 결합한 항원 결합체의 양을 정확하게 검출하여 이들의 양적 비율을 이용하여 정상과 암을 조기에 발견할 수 있는 방법을 제공한다. (도1)
정상과 암을 암 0~1기 단계에서 구분하기 위해서는 생물학적 시료내의 항원 및 자가항체의 양적 변화를 정확하게 측정해야 하는데 이것은 시료내의 어떠한 간섭현상 및 비특이적인 반응이 없어야 한다.
본 발명에서 기 알려진 방법으로(등록특허 10-0883763, 10-1682347) 제조된 유전자가 고정화된 유리섬유를 이용하여 간섭현상 및 비특이적인 반응이 없는 폐암 진단용 키트를 제조하였고 이의 사용방법을 제공한다.
본 발명은 9G DNA 기술(Chemical Communications 2011, 47, 7104)에 기반한 DAGON 기술(Chemical Communications 2011, 47, 7616)이 적용된 플랫폼을 이용하여 비침습적인 방법인 혈액을 이용한 측정을 통하여 폐암을 0~1기에서 발견하여 생존율을 높이고 삶의 질을 높이고자 하는데 목적이 있다.
본 발명의 목적은 생체 시료내의 CYFRA21-1 항원 및 이와 결합된 형태의 항-CYFRA21-1 자가항체-항체 결합체를 측정 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 항-CYFRA21-1 자가항체-항체 결합체 및 CYFRA21-1 항원 측정을 위한, 형광면역측정법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 인간의 생물학적 시료에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CFYRA21-1 항원의 유무 및 비율을 검정하는, 하기의 단계들을 포함하는 면역측정법을 제공한다:
(a) 항체조성물 A를 이용하여 CYFRA21-1 항원의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (CYFRA21-1 항원)과 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체를 형성된다. (도2)
(b) 항체조성물 B를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-인간 IgG 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체)와 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체가 형성된다. (도3)
(c) 상기에서 형성된 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체 및 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체 비율을 이용하여 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계.
본 발명은 정상과 폐암환자의 혈액, 혈장과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 91.7%의 특이도와 1기 76%, 2기 80%, 3기 77%, 4기 50%의 민감도로 1~4기 폐암의 발병 여부를 진단할 수 있으며 진단하는 키트와 사용방법을 제공한다.
특히 자가항체가 급격히 증가하는 시기인 암 병기 0~1기에서 76 % 민감도 수준으로 폐암의 진단 효과가 높게 나타나기 때문에 폐암 초기단계인 0~1기에서 폐암 진단에 매우 효과적이다.
본 발명은 생물학적 시료내의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원 마커의 증감을 정확하게 검출할 수 있도록 항체에 유전자가 결합된 형태의 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자” 를 사용하였으며 용액상에서 항원-항체-유전자 복합체가 형성된 후 유전자가 고정된 고체 기질과 항원-항체-유전자 복합체가 고정되기 때문에 생물학적 시료내의 어떠한 간섭현상이나 비 특이적인 반응 없이 고정될 수 있어 혈액 내 마커의 양적 변화를 정확하게 측정할 수 있는 방법이다.
이하 본 발명은 하기 도면과 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 정상인과 암환자를 대상으로 본 발명의 자가항체-항원 결합체 및 항원 측정법을 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체와 CYFRA21-1 항원에 대한 비율을 나타낸 결과이다.
도 2는 생체시료 내의 “CYFRA21-1 항원”에 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자” 및 “항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5” 가 결합한 형태인 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자-CYFRA21-1 항원-항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5” 복합체를 나타낸 것이다.
도 3은 생체시료 내의 “항-CYFRA21-1 자가항체-항원”에 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자” 및 “항-인간 IgG 항체-Cy5” 가 결합한 형태인 “항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자-항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체-항-인간 IgG 항체-Cy5” 복합체를 나타낸 것이다.
도 4는 9G DNA 멤버레인상에서 CYFRA21-1 항원 검출 형태를 나타낸 것이다.
도 5는 9G DNA 멤버레인상에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출 형태를 나타낸 것이다.
도 6은 정상 대비 암이 발생하게 되면 대부분의 암 관련 항원 (종양표지자)의 혈액내 양적 변화가 0 ~ 3기 까지는 매우 작게 나타나며 4기 단계가 되어서야 양적 차이가 나타나기 때문에 양적 변화가 미세한 항원 검사만으로는 일반적으로 정상과 암을 구분하기 쉽지 않다.
반면 암 관련 항원에 특이적으로 반응하는 자가항체인 경우에는 암 병기 초기 (0~1기)에서 그 양적 증가가 가장 크게 나타나며 정상일 때 보다 5~10배 이상 증가폭을 나타낸다.
도 7은 항원 검사만으로는 정상과 암환자를 구분하기 어렵다는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 자가항체-항원 결합체 및 항원 검사, 즉 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 검출 / CYFRA21-1 항원 검출의 비율을 이용하여 정상과 암환자를 구분하는 방법을 나타낸 것이다.
도 9는 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자와 항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 로 구성된 항체조성물 A 및 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자와 항-인간 IgG 항체-Cy5 로 구성된 항체조성물 B를 나타낸 그림이다.
도 10은 9G DNA 멤버레인상에서의 CYFRA21-1 항원에 대한 검출 모식도이다.
도 11은 9G DNA 멤버레인상에서의 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체에 대한 검출 모식도이다.
도 12는 제조된 폐암 진단용 9G DNA 멤버레인의 형태이다.
도 13은 9G DNA 멤버레인을 검출과 판독하는 과정을 나타내고 있다.
도 14는 원자력 병원 임상샘플 정상 200 검체 및 폐암 1~4기 50 검체에 대한 결과이다.
<실시예 1> CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체 제조 및 정제
CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합에 사용한 물질은 아래의 표 1에 기재되어 있으며, 사용한 타겟 유전자(TD)의 염기서열은 표 2에 기재되어 있다
표1
Figure pat00001
표2
Figure pat00002
CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체의 제조는 표1의 물질을 사용하여 기 알려진 방법에 따라 제조 및 정제하여 CYFRA21-1 1차 항체-유전자 결합체 2mg/ml 농도 80 ㎕를 얻었다. (등록특허 10-1682347, 실시예1, 도1 참조)
<실시예 2> 형광 표지물질이 부착된 항체 결합체 제조 및 정제
> 형광 표지물질이 부착된 항체 결합체 제조에 사용한 물질은 아래의 표3에 기재되어 있다.
표3
Figure pat00003
CYFRA21-1 항원 검출용인 표지물질(Cy5)이 부착된 CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 결합체 및 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 검출용인 표지물질(Cy5)이 부착된 항-인간 IgG-Cy5 결합체를 제조는 기 알려진 방법에 따라 제조하여 CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 2.5mg/ml 농도 70 ㎕ 와 및 항-인간 IgG-Cy5 3mg/ml 농도 60 ㎕를 얻었다. (등록특허 10-1682347, 실시예2, 도2 참조)
표4
Figure pat00004
표 4는 실시예1, 2에서 제조하여 얻어진 물질이 기재되어 있다.
<실시예 3> 폐암 진단용 항체조성물 제조
항체조성물 A 및 B를 제조하기 위해 사용되는 항체의 농도를 모두 300 ㎕/ml 로 희석하여 사용했으며 사용물질은 표 5에 기재되어 있다.
표5
Figure pat00005
5ml tube에 각각의 구성 물질을 사용량에 따라 첨가하여 혼합하였다.
<실시예 4> 폐암 진단용 올리고 유전자 고정화 및 9G DNA 멤버레인 제조
표6 탐침 유전자 염기서열
Figure pat00006
폐암 진단용 올리고 유전자 고정화 및 9G DNA membrane 제조에 사용한 물질은 표 6에 기재되어 있으며 기 알려진 방법에 따라 도 9와 같이 9G DNA 멤버레인을 제조하였다. (특허 10-0883763 실시예2, 3 참조)
<실시예 5> CYFRA21-1 항원 단백질 및 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출
CYFRA21-1 항원 단백질 및 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 검출방법은 (도4, 도5) 및 실험과정은 각각 도10, 도11에 도식적으로 설명되어 있다.
1) 혈액샘플 및 사용물질 준비
정상인과 암환자의 혈액샘플은 정상 200 검체, 폐암 1~4기 50 검체를 이용하였으며 원자력 병원 (KOREA CANCER CENTER HOSPITAL)에서 (IRB # KIRAMS 2018-10-006, 2018-06-016) 샘플을 이용하였다. 암환자 샘플은 조직검사로 폐암이 확진된 환자의 혈장샘플을 이용하였다. 정상인의 샘플은 건강검진에 참여한 정상인의 샘플을 이용하였다. 실험에 사용한 물질은 표7에 기재되어 있다.
표7
Figure pat00007
2) 샘플 혼합 및 인큐베이션
가. CYFRA21-1 항원 검출용
항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 표준물질 20 ㎕를 넣고 표7에서 준비한 항체조성물 A 100 ㎕를 혼합하여 11 분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
자가항체-항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 표준물질 20 ㎕를 넣고 표7에서 준비한 항체조성물 B 100 ㎕를 혼합하여 11 분 동안 상온에서 인큐베이션 하였다
2) 샘플 로딩 및 교잡반응
가. CYFRA21-1 항원 검출용
반응물 120 ㎕ 가 들어있는 항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 R buffer 60 ㎕를 첨가 후 샘플을 모두 취하여 180 ㎕를 항원-검출용 도 12의 9G DNA 멤버레인의 샘플포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 교잡반응 하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
반응물 120 ㎕ 가 들어있는 자가항체-항원 검출용 0.2ml 크기의 마이크로 튜브에 R buffer 60 ㎕를 첨가 후 샘플을 모두 취하여 180 ㎕를 자가항체-항원 검출용 도 12의 9G DNA 멤버레인 샘플포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 교잡반응 하였다.
3) 세척 및 스캔
가. CYFRA21-1 항원 검출용
W buffer 180 ㎕를 항원 검출용 9G DNA 멤버레인의 세척포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 세척 후 도 13에 나타난 것처럼 1D Scanner를 이용하여 판독하였다.
나. 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출용
W buffer 180 ㎕를 자가항체-항원 검출용 9G DNA 멤버레인의 세척포트에 로딩 후 11분 동안 상온에서 세척 후 도 13에 나타난 것처럼 1D Scanner를 이용하여 판독하였다.
4) 결과 분석
4.1) CYFRA21-1 항원 검출에 대한 형광감도 결과
항체조성물 A를 이용하여 정상인과 폐암환자의 혈액샘플에 대한 CYFRA21-1 항원 검출에 대한 형광감도를 확인하였으며 표8에 나타나 있다.
표8
Figure pat00008
CYFRA21-1 항원에 대한 형광감도의 평균값은 정상인 혈액샘플에서 26745로 나타나며 폐암환자 혈액샘플에서 19935로 나타나는 것을 확인하였다.
4.2) 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출에 대한 형광감도
항체조성물 B를 이용하여 정상인과 폐암환자의 혈액샘플에 대한 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 검출에 대한 형광감도를 확인하였으며 표9에 나타나 있다.
표9
Figure pat00009
CYFRA21-1 자가항체-항원에 대한 형광감도의 평균값은 정상인 혈액샘플에서 26862로 나타나며 폐암환자 혈액샘플에서 47167로 나타나는 것을 확인하였다.
4.3) 혈액샘플에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 / CYFRA21-1 항원 비율 확인
도 7에 나타난 것처럼 종양표지자 CYFRA21-1 항원 검사만으로는 정상과 암을 구분할 수 없다. 대부분의 암 관련 항원 (종양표지자)은 암이 발생하면 혈액내 양적증가가 나타나는데 암 병기 0 ~ 3기 까지의 양적 변화가 매우 작고 4기 단계가 되어서야 양적 변화의 차이가 나타나기 때문에 일반적으로 정상과 암의 구분이 쉽지 않으며 암 0 ~1 기인 경우에는 더더욱 구분할 수 없다.
항-CYFRA21-1 자가항체는 폐암에 대한 CYFRA21-1 항원이 있을 때 특이 반응하는 자가항체로 암 0 -1 기에서 그 양적 증가는 정상일 때 보다 5 - 10배 이상 증가하게 된다.
그렇기 때문에 정상과 암을 항-CYFRA21-1 자가항체와 CYFRA21-1 항원의 비율을 이용하여 정상 대비 일정 수치 (cut off) 이상이면 암으로 판정할 수 있다.
표10
Figure pat00010
형광 감도 결과는 표10에 나타나 있으며 암병기에 따른 분석결과는 도 14에 나타나있다. CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 / 항원의 비율 (B/A )이 각각 정상인 1.03 및 폐암환자 2.15로 확인되었다. B/A 비율 값의 Cut off 1.5를 기준으로 1.5 이하는 정상으로 판정되며 1.5 이상은 폐암으로 판정하였다. 200명의 정상인에 대해 91.7%의 특이도를 얻었으며 50명의 암환자를 대상으로 1기 76%, 2기 80%, 3기 77%, 4기 50%의 민감도를 얻었다.
자가항체가 급격히 증가하는 시기인 암 병기 0~1기에서는 76 % 민감도 수준으로 효과가 매우 크게 나타나서 폐암 조기 진단용 키트 개발에 효과가 있음을 증명하였다.
1. 9G 멤버레인 : 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화 되는 표면이 캘릭스아렌 유도체로 변성된 유리 섬유 멤버레인
2. 9G DNA 멤버레인 : 연속된 9개의 구아닌이 포함된 올리고 유전자가 고정화된 유리섬유 멤버레인
3. 항원 (Antigen, Ag): 면역반응을 일으켜 항체를 생산하게끔 만드는 물질, 일반적으로 체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체.
4. CYFRA21-1 항원: 폐암 관련 종양표지자
5. 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 : 항-CYFRA21-1 1차 항체에 유전자가 결합된 항체-유전자 결합체
6. 항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5 : 항-CYFRA21-1 2차 항체에 Cy5-dye (형광표지자)가 부착된 항체-형광표지자 결합체
7. 자가항체(Autoantibody, AAb) : 자기의 체성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미하며, 자가항체 또는 오토항체 라고도 한다.
8. 항-CYFRA-21-1 자가항체 (anti-CYFRA21-1 Autoantibody): 폐암 관련 단백질인 CYFRA21-1 항원에 특이적으로 반응하는 항체
9. 항-CYFRA-21-1 자가항체-항원 결합체 : 항-CYFRA-21-1 자가항체와 CYFRA21-1 항원이 결합된 형태
10. 항-인간 IgG 항체(anti-Human IgG) : 인간 항체에 특이적으로 반응하는 항체
항-인간 IgG 항체-Cy5 : 항-인간 IgG 항체에 Cy5-dye (형광표지자)가 부착된 항체-형광표지자 결합체

Claims (13)

  1. 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 형광 표지 된 항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5가 포함되어 있는 항체조성물 A 그리고 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자 및 형광 표지 된 항-인간 IgG 항체-Cy5 가 포함되어 있는 항체조성물 B
  2. 제1항에 있어서, 상기의 항체조성물 A, B 중 어느 한 항의 항체조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트
  3. 제1항에 있어서, 상기의 항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자와 같이 항체-유전자 결합체인 것을 특징으로 하는 면역측정법
  4. 인간의 생물학적 시료에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 유무 및 농도를 검정하는, 하기의 단계들을 포함하는 면역측정법:
    (a) 항체조성물 A를 이용하여 CYFRA21-1 항원의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (CYFRA21-1 항원)과 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체를 형성된다. (도2)
    (b) 항체조성물 B를 이용하여 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 유무 또는 농도를 검정하는 단계: 상기의 단계에서는 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자) 및 (항-인간 IgG 항체-Cy5) 가 생물학적 시료내의 (항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체)와 결합하여 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체가 형성된다. (도3)
    (c) 상기에서 형성된 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(항-CYFRA21-1 자가항체-항원):(항-인간 IgG 항체-Cy5) 복합체 및 (항-CYFRA21-1 1차 항체-유전자):(CYFRA21-1 항원):(항-CYFRA21-1 2차 항체-Cy5) 복합체 비율을 이용하여 생물학적 시료에서 정상과 폐암을 결정하는 단계
  5. 제4항에 있어 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 시료인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기의 항체조성물A 및 항체조성물B 와 생체 시료와의 접촉 후에 용액상에서 항원-항체 복합체를 형성한 후 고형 지지체에 고정되는 것을 특징으로 하는 면역측정법
  7. 상기 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 / CYFRA21-1 항원의 비율이 일정 수치(cut off)보다 높은 경우 폐암으로 선별하는 단계를 포함하는 폐암 진단을 위한 상기 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체 및 CYFRA21-1 항원의 측정 방법
  8. 제4항에 있어서, 상기의 항-CFYRA21-1 자가항체에 대한 특이적 항원은 CYFRA21-1 단백질인 것을 특징으로 하는 면역측정법.
  9. 제4항에 있어서, 상기의 항-CFYRA21-1 자가항체-항원 결합체를 검출할 수 있도록 표지된 것을 특징으로 하는 면역측정법.
  10. 제4항에 있어서 상기의 검출할 수 있는 표지는 발색효소, 형광물질, 형광비드, 방사성 동위원소 및 콜로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 표지된 접합체인 것을 특징으로 하는 진단용 키트
  11. 항-CFYRA21-1 자가항체-항원 결합체에 부가적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 면역복합체
  12. 제4,5,6.7항에 있어서, 상기의 항-CFYRA21-1 자가항체-항원 결합체는 인간의 자가항체-항원 결합체이고, 상기의 항-CFYRA21-1 자가항체-항원 결합체에 결합되는 분자는 항-인간 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 면역복합체
  13. 등록특허 10-1682347 청구항 1 및 8 의 바이오 칩을 이용하여 인간의 생물학적 시료에서 항-CYFRA21-1 자가항체-항원 결합체의 유무 또는 농도를 검정하는 면역측정법


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