KR101682347B1 - 심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 - Google Patents

심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따르면, 9G 구아닌 DNA칩 유형의 바이오칩을 이용하여 항체-유전자 결합체, 항원 및 표지물질-2차항체 결합체의 복합체를 측정하는 단백질 분석방법 및 표준농도-감도 그래프를 사용하여, 심질환 바이오마커 단백질의 이상상태 및 정상상태를 구분할 수 있게 해주는 피코그램 농도수준에서 다종의 심질환 바이오마커 단백질(cTnI, NT proBNP 및 BNP)을 동시에 신속하게 검출하고 이들의 농도를 정량적으로 분석하는 방법이 제공되며, 이에 의해 심질환의 진단 뿐만 아니라 심질환의 진행과정 및 치료과정을 모니터링하고 완치 판단을 가능하게 해주는 방법이 제공된다.

Description

심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩 {Biochip for the detection and determination of the concentration of cardiac biomakers, and method for the detection and determination of cardiac biomakers using the same}
본 발명은 심질환 바이오마커를 함유하는 표준샘플의 농도-감도 그래프를 이용하여 심질환 바이오마커들의 농도를 신속하고 정량적으로 측청함으로써 심질환을 진단하는 방법 및 심질환의 진행 및 치료상태를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 심질환 바이오마커의 농도에 따라 측정수단의 민감도가 비례하여 측정될 수 있는 바이오칩을 사용하여, 심질환 바이오마커를 함유하는 표준샘플의 농도-감도 그래프를 작성하고, 상기 동일한 유형의 바이오칩을 사용하여 피험자의 혈액샘플에서 심질환 바이오마커들를 검출하고, 상기 표준샘플 농도-감도 그래프와 비교하여 이들의 농도를 정량적으로 결정하고, 이에 의해 심질환을 진단하는 방법 및 심질환의 진행 및 치료상태를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
사람 주먹만한 크기의 심장은 그 기능이 저하되면 인체에 미치는 영향이 대단히 큰데, 혈액순환의 저하뿐만 아니라 심근경색, 고혈압, 심부전, 부정맥, 심근증 등 치사율이 높은 질병에 걸리기 쉽기 때문이다. 세계보건기구 (WHO)의 통계에 따르면 심혈관계질환은 전 세계적으로 사망률 29.2%로서 1위를 차지하고 있으며, 우리나라에서도 지난 30년간 심혈관계질환의 발병률 및 유병률이 매우 가파르게 높아지고 있으며 암, 뇌혈관질환에 이어 사망률이 높다 (참고, 통계청, 2006).
심혈관 질환은 국내 혈관질환에 의한 사망자의 1/3 수준을 차지하고 있으며 40-50대의 급성사망 원인의 중요 원인으로 꼽히고 있다. 특히 평소 건강을 자부하는 중년이 돌연사하는 경우 80%가 급성 심근경색(AMI)이다. 또 연령 증가에 따라 조기발견 되지 않으면 사망률이 급증하는 것으로 알려져 있고 동시에 정기적인 검진이 필수적인 질병으로 알려져 있다. 이 질병은 주로 심혈관계의 막힘 현상에 의해 초래되기 때문에 초기에 증상을 판단하여 적절한 처치를 하지 못하면 대부분 사망에 이르게 된다. 또 이 질병에 의한 사망자의 대부분이 사회 경제적으로 중추적인 역할을 하는 40-50대이기 때문에 이 질병을 조기에 진단하고 적절한 조치를 할 수 있게 하는 진단기술 및 제품의 개발은 국가경제의 활력증진 및 국민보건향상에 필수적이라 할 수 있다.
미국 심장학회(ACC/AHA) 가이드 라인을 보면 첫째, 20분 이상의 흉통, 둘째, 심전도의 변화, 셋째, 심질환 마커 (Cardiac marker) 농도의 증가 등과 같은 3가지 조건 중에서 최소 2개 이상이 해당 될 경우 급성심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI)로 진단하고 있다.
급성심근경색 (AMI)은 증상이 나타난 후 한 시간 이내에 사망하는 환자가 전체 사망자의 절반 이상이기 때문에 신속한 진단과 치료가 중요하다. 그러나, X-ray나 심전도 등의 기본검사, 심장초음파 등의 정밀검사들은 시간과 장비가 요구되고, AMI 환자의 약 20% 이상은 심전도의 변화를 나타내지 않아서 흉통과 심전도는 AMI 진단에 대한 기준으로써 다소 미흡하기 때문에, 급성심근경색의 주요 진단기준으로서 심질환 바이오마커 (Cardiac Bio-Markers)의 중요성이 더욱 강조되고 있으며, 때문에 신속한 혈액진단 방법의 개발이 요구되어 왔다.
현재 상용화되어 널리 쓰이고 있는 심근경색 진단기기는 혈액 속의 바이오마커를 형광전이(fluorescence resonance transfer, FRET) 기술을 이용하여 진단하고 있는데, 각각의 마커당 15분이 소요되며, 한 번에 하나의 마커에 대해서만 검출할 수 밖에 없으며, 검출 한계도 대부분 1∼10ng/mL 수준이다.
심질환 마커의 급격한 농도변화를 신속히 그리고 적시에 진단 및 판단하는 것은 급성심근경색(AMI)에 대해서는 매우 필요하다. 특히 가슴에 가벼운 통증이 있는 경우에 자가진단, 병원방문, 신속처리 등에 필요할 뿐만 아니라, 진단 및 치료과정에서 심질환 마커의 농도를 완치수준까지 검출하여 치료과정이 완료되었음을 확인할 수 있는 방법으로서도 매우 유용하다.
심질환 마커로서는 심혈관 질환을 반영하는 바이오마커인 Cardiac troponin I(cTnI)와 급성 호흡곤란의 감별 진단, 심부전의 진단 및 예후판정 등에 유용한 바이오마커로 B-type natriuretic peptide(BNP) 혹은 Nterminal proBNP(NT proBNP)가 많이 활용되고 있다.
cTnI은 정상치와 이상치를 구분하는 수치가 250pg/ml, NT proBNP는 80pg/ml, BNP는 100-400pg/ml 수준 (참고문헌: American Heart Association Circulation, 2002; 105: 2328-2331. Biosite Package Insert., en.wikipedia.org/wiki/Troponin) 으로 알려져 있어 수백 pg/ml부터 수십 pg/ml 수준까지 바이오마커를 정량적으로 분석하는 것이 매우 중요하다.
심질환 바이오마커 단백질의 분석에 지금까지 널리 사용되고 있는 ELISA plate 또는 NC membrane 등의 기술은 주로 고체기질 위에 항체 단백질을 화학결합 혹은 물리흡착으로 고정시킨 다음, 단백질 농도를 측정하는 검출방식을 사용하고 있다. 화학결합에 의한 고정기술에서는 고정화 후 시간이 경과함에 따라서 고정화된 단백질의 활성이 감소하므로 높은 민감도 확보가 어렵고, 물리흡착에 의한 고정기술에서는 고정화되는 단백질의 방향성 제어와 고정화 후 단백질 활성 유지가 어려워 민감도 및 재현성 확보가 어렵다. 또한 고체 기질 상에 고정화된 단백질은 시간이 경과할수록 고정화된 단백질의 변성, 비특이 결합들이 발생하게 되어 다종의 심질환 바이오마커를 이상상태 및 정상상태로 구분할 수 있게 해주는 수백 pg/ml부터 수십 pg/ml 의 농도수준에서의 정밀한 분석에는 매우 어려운 문제점들이 있다.
때문에, 지금까지 알려진 심질환 마커 진단 기술 및 제품들은 대부분 심질환 표지마커들을 하나씩 진단하는 것들이며, 또한 1ng/ml 이상에서는 정량적인 농도분석이 가능하지만 그 이하의 농도변화를 확인하는 것은 어려웠다.
급성심근경색(AMI)의 경우 빠른 진단과 치료가 필요한데, 심질환 바이오마커 단백질의 농도를 바이오칩을 사용하여 측정하고 측정된 농도수치를 근거로 심질환의 진행상황 및 치료상태를 판단하기 위해서는, 시료 내에 수십 pg 내지 수백 pg의 극미량으로 함유된 여러 가지 심질환 바이오마커 단백질들을 동시에 신속하고 정밀하게 검출할 수 있는 기술의 개발은 매우 중요한 의미를 갖는다.
한편, 심질환 바이오마커 단백질의 검출 및 농도 측정을 위한 하나의 방법 또는 수단으로서 단백질칩과 같은 바이오칩의 사용이 많이 시도되고 있다. 하지만, 표지 단백질 분석을 위한 단백질 칩 기반기술은 주로 다양한 분자인식 기술을 이용해 좁은 공간에 다수의 단백질을 칩 표면에 고정하는 방식이 주류를 이뤘으며 대부분 연구용으로 사용돼왔다. 특히 대다수의 표지 단백질의 분석이 결합용 항체와 분석에 필요한 물질이 부착된 이차항체 사이에 항체-항원-항체의 샌드위치 형태로 결합된 상태에서 이루어져 재현성 있는 분석이 쉽지 않았다.
본 발명의 발명자들은 대한민국 특허출원 10-2005-0096322호에서 아미노캘릭스아렌 유도체 및 연속된 구아닌-부착된 유전자를 사용하여 신속하고 고감도로 목적하는 유전자를 검출할 수 유전자칩을 개시하였으며, 대한민국 특허출원 10-2008-0093800호에서는 아미노캘릭스아민 유도체 및 연속된 구아닌-부착된 유전자를 사용하여 상온 교잡반응이 가능한 유전자칩을 개시하고 있다.
본 발명의 발명자들에 의해 발표된 논문 (Chem. Commun., 2011, 47, 7716-7718)에는 상술한 문헌에서 개시된 유전차칩을 사용하여 피코그램 수준에서 바이오마커를 검출할 수 있는 기술을 개시하고 있다. 상기 기술은 다수의 결합용 항체와 이차항체 등을 각각의 표지 단백질과 용액 상에서 신속하게 결합한 뒤 각각의 단백질이 칩 안의 정해진 위치에 유전자-유전자 결합을 이용해 고정되는 것으로서, 기존의 단백질 칩 기반기술에서 나타나던 문제를 대부분 해결하고 있다. 하지만, 상기 논문은 심질환 바이오마커가 아니라 피코그램 수준으로 존재하는 일반적인 바이오마커들을 동시에 검출하는 것은 언급하고 있지만, 이러한 바이오마커 단백질들의 농도를 정량적으로 분석하지는 못하고 있다.
따라서, 여러 가지 심질환 바이오마커들을 동시에 신속하게 검출하고 아울러 이들의 농도를 피코그램 수준에서 정량적으로 결정할 수 있는 방법을 개발함으로써, 심질환의 진행과정 및/또는 치료과정에서 바이오마커의 농도 변화를 확인하고, 이를 통해 심질환의 진행상황 및/또는 치료상태를 모니터링할 수 있는 효과적인 수단에 대해 많은 필요성이 있어 왔다.
한국특허출원 10-2008-0093800호
Chem. Commun., 2011, 47, 7716-7718
본 발명자들은 기질, 아미노캘력스아민 유도체 및 9G-유전자로 된 유전자칩 (이후 9G DNA Chip으로도 칭함)을 개발하고, 여기에 항체-유전자 결합체, 항원 및 표지물질-항체 결합체를 사용하여 신호의 감도를 증폭시키는 방법을 사용하여 항원으로서 CRP 등의 바이오마커 단백질을 피코그램 수준에서도 검출할 수 있음을 발표한 바 있으나, 심질환 바이오마커의 이상상태 및 정상상태로 구분할 수 있게 해주는 수백 pg/ml부터 수십 pg/ml의 수준에서 이들의 농도를 정량적으로 분석 또는 결정할 수 있는 방법은 아직 개발되지 못하였다.
본 발명자들은 상술한 유전자칩을 사용하여 항원 단백질의 검출 및 농도결정에 대해 더욱 연구한 결과, 항체-유전자 결합체, 항원 및 표지물질-항체 결합체들이 복합체를 형성하여 상기 유전자칩에 정량적으로 결합하는 것을 발견하였는데, 이러한 발견을 근거로 심질환 바이오마커를 함유하는 표준샘플의 농도-감도 그래프를 작성할 수 있었으며, 상기 동일한 유형의 바이오칩을 사용하여 피험자의 혈액샘플에서 심질환 바이오마커들를 검출하여 심질환을 신속하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 표준샘플 농도-감도 그래프와 비교하여 이들의 농도를 피코그램 수준에서도 정량적으로 결정함으로써 심질환의 진행 및 치료상태를 모니터링할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따르면, 심질환 바이오마커 단백질의 이상상태 및 정상상태를 구분할 수 있게 해주는 피코그램 농도수준에서 다종의 심질환 바이오마커 단백질들을 동시에 신속하게 검출하고 이들의 농도를 동시에 정량적으로 분석할 수 있으며, 이에 의해 심질환의 진단 뿐만 아니라 심질환의 진행과정 및 치료과정을 모니터링하고 완치 판단을 가능하게 해줄 수 있다.
도 1은 항체-유전자 및 항체-형광체 합성에 대한 모식도이다.
도 2는 항체-유전자 및 항체-형광체 합성에서 얻어진 물질에 대한 나노드롭(Nanodrop) 측정 값이다.
도 3은 단백질 검출용 바이오칩의 형태 및 제조방법 모식도이다.
도 4는 단백질 검출방법 및 실험과정을 나타내고 있다.
도 5는 표준샘플을 사용하여 측정한 결과 및 감도 대비 농도 그래프를 나타내고 있다.
도 6은 최적의 내부표준스팟 감도 결과 및 내부표준스팟 감도 대비 단백질 농도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 내부표준스팟이 적용된 단백질 검출용 바이오 칩 및 내부표준스팟(IS : Internal Standard) 과 단백질 검출 스팟(PD : Protein Detection)의 위치가 나타나있다.
도 8은 내부표준스팟으로 게인(gain)을 조절하여 얻어진 3가지 심질환 바이오마커 단백질 (cTnI, NT proBNP, BNP)의 실제농도 및 측정 농도 결과이다.
도 9는 혈액샘플 내의 3가지 심질환 바이오마커 단백질 (cTnI, NT proBNP, BNP)을 1/2 에서 1/32 까지 희석한 농도에서 측정된 결과이다.
하기 단계 (1)~(3)를 포함하는, 심질환 바이오마커 단백질의 정량적 분석 방법을 제공하는 것이다:
(1) 바이오칩을 이용하여 항원(antigen)인 심질환 바이오마커 단백질들의 표준농도-감도 그래프를 작성하고,
(2) 피험자의 혈액샘플을 바이오칩으로 분석하여 혈액에 포함된 심질환 바이오마커 단백질들의 측정감도를 수득하고,
(3) 전술한 측정감도를 전술한 표준농도-감도 그래프와 비교하여 심질환 바이오마커 단백질들의 환산 농도를 결정하고,
(4) 상기 수득된 심질환 바이오마커 단백질들의 환산 농도로부터 심질환 진행상태 또는 치료상태를 결정함.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 전술한 바이오칩은 심질환 바이오마커들을 피코그램 수준에서 검출할 수 있을 뿐만 아니라 피코그램 수준에서 농도를 정량적으로 분석할 수 있는 바이오칩에서 선택될 수 있다. 이러한 유형의 바이오칩으로서, 예를들면, 하기 (a)~(d)를 포함하는 바이오칩을 언급할 수 있다:
(a) 고체 기질,
(b) 고체기질에의 부착수단 및 연속된 구아닌 염기의 인식 부위를 갖는 아미노캘릭스아렌 유도체,
(c) 연속된 구아닌 염기 및 목적 염기(서열)을 갖는 고정화 유전자, 및
(d) 상기 고정화 유전자에 상보 결합가능한 유전자 및 항체를 결합시킨 항체-유전자 결합체를 포함하는 바이오칩.
상기 바이오칩에 있어서, 측정하고자 하는 샘플은 "심질환 바이오마커 단백질 항원" (이후 성분 (e)로 칭함) 에 더하여 "표지물질-항체 결합체" (이후 성분 (f)로 칭함)가 측정 전 또는 측정시에 첨가되며, 전술한 성분 (d)는 상기 언급한 바처럼 바이오칩에 처음부터 포함되어 있거나, 측정하고자 하는 샘플의 첨가 전후에 별도로 첨가될 수 있다.
또, 상기 기재된 바이오칩에 있어서, 전술한 아미노캘릭스아렌 유도체는 전술한 부착수단과 고체기질 표면 사이의 화학적 또는 물리적 결합에 의해 고체기질에 부착되어 있고, 전술한 고정화 유전자는 연속된 구아닌 염기에 의해 전술한 고정화 유전자의 연속된 구아닌 염기의 인식부위에 부착되어 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 전술한 표준농도-감도 그래프를 작성하기 위한 단계 (1)은 하기를 포함할 수 있다:
(1a) 항원인 심질환 바이오마커 단백질 1종 이상을 각각 소정농도로 함유하는 용액 및 이를 정해진 비율로 희석한 용액(들)을 각각 제조함으로써 표준용액을 준비하고,
(1b) 전술한 표준용액들을 바이오칩으로 분석하여 표준감도를 수득하고,
(1c) 전술한 표준농도 및 수득된 표준감도로부터 표준농도-감도 그래프를 작성함.
본 발명의 하나의 변법에 따르면, 전술한 표준농도-감도 그래프는 표준농도의 수치 및 표준감도의 수치를 결합한 그래프 형태로서, 이 대신에 표준농도의 수치 및 표준감도의 이미지를 결합한 테이블 형태 (표준농도-감도 스팟)를 작성하여 사용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 성분 (d)는 바이오칩의 제조 시에 미리 첨가될 수도 있지만, 성분 (d)를 포함하는 바이오칩에 성분 (e) 및 (f)를 포함하는 샘플과 함께 또는 별도로 첨가되어, 성분 (d)를 포함하는 바이오칩으로 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 전술한 심질환 바이오마커 단백질 항원은 cTnI, NT proBNP 및 BNP 중의 1종 이상, 바람직하게는 3종 모두이고, 전술한 항체는 상기 항원의 항체에서 선택될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 연속된 구아닌 염기는 구아닌(G) 염기가 7개 이상, 바람직하게는 9개가 연속적으로 결합되어 형성될 수 있다. 또, 목적 염기(서열)은 길이가 특별히 한정되지 않으며, 필요에 따라 13mer 이하, 14~17mer, 18~21mer 또는 22mer 이상에서 선택될 수있다.
상기 고체기질은 금, 은, 백금과 같은 금속, 유리, 유리섬유 쉬트, 실리콘웨이퍼, 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 기질의 표면은 예를들면 아민기, 실록산기 등으로 개질될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 아미노 캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 아미노캘릭스아렌 유도체에서 선택될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112014028150061-pat00001
[화학식 2]
Figure 112014028150061-pat00002

[상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내며.
Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
바람직하게는, 화학식 1에서 R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = R6 = R7 = R8 및 R'1 = R'2 = R'3 = R'4 = R'5 = R'6 = R'7 = R'8 (단 R1≠R'1)이고, 화학식 2에서 R1 = R'1 = R3 = R'3 = R5 = R'5 = R7 = R'7 이고, R2 = R'2 = R4 = R'4 = R6 = R'6 = R8 = R'8 이며, R1≠R2 이다.
상기 화학식 1 및 2에서 치환기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 고체기질에의 부착수단으로서 고체기질의 표면과 또는 표면에 부착된 관능기와 이온결합, 공유결합, 배위결합 등을 통해 화학식 1 및 2의 화합물을 부착시키는 역할을 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 고체기질이 금일 경우에는 화학식 1 또는 2에서 Y1, Y2, Y3 및 Y4 중의 하나 이상은 티올기에서 선택될 수 있다. 고체기질이 아민 작용기가 부착되어 있는 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택되는 경우, Y1, Y2, Y3 및 Y4 중의 하나 이상이 알데히드기에서 선택될 수 있고, 이에 의해 전술한 기질과 화학식 1 또는 2의 화합물의 연결은 이민기 또는 이를 환원시킨 아민기를 통해 달성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 전술한 표지물질은 형광체, 효소, 방사능 물질, 미세입자 및 색소로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은, 상술한 방법을 사용한 항원 단백질의 정량분석 방법으로서, 항원 단백질을 도 10에 기재된 마커단백질로 구성된 군에서 하나 이상, 바람직하게는 3~10종을 선택하여, 이들을 동시에 정량적으로 분석하는 항원 단백질의 정량분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 cTnI, NT proBNP, BNP 등을 포함하는 심질환 마커 단백질의 농도를 1,000pg/ml 에서 25 pg/ml 사이에서 동시에 정량적으로 분석하여 치료과정 모니터링 혹은 조기진단에 사용하거나, 이런 목적에 사용될 수 있는 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 더 이상의 목적은, 단백질 농도분석에 필수적인 내부표준으로서 표준농도-감도 그래프 또는 표준농도-감도 테이블을 제조하는 방법 및 이를 위한 혼합 유전자 고정화 신기술, 및 상기의 내부표준을 적용한 단백질 농도 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라서 내부표준으로서 표준농도-감도 그래프 또는 표준농도-감도 테이블을 작성하고, 이를 이용하여 상기 바이오칩을 사용하여 검출된 바이오마커의 측정감도로부터 농도를 정량적으로 결정하고, 이렇게 결정된 바이오마커의 실측 농도를 이용하여 해당 질환의 진행 및 치료상태를 모니터링하는 방법에 응용할 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
구체적으로는, 본 발명의 바이오칩은 하기의 구성을 가질 수 있다:
(a) 금, 은, 백금과 같은 금속, 유리, 실리콘웨이퍼, 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 고체 기질;
(b) 상기 고체 기질에 부착되어 있고, 고체 기질에의 부착 부위 및 연속된 구아닌 염기의 인식 부위를 갖는 아미노캘릭스아렌 유도체, 여기서 전술한 연속된 구아닌 염기는 구체적으로는 5개 이상, 바람직하게는 7개 이상, 특별하게는 9개 이상 연속된 구아닌 염기를 의미함;
(c) 상기 아미노캘릭스아렌 유도체에 부착되어 있고, 연속된 구아닌 염기 및 목적 염기(서열)을 갖는 연결 유전자, 여기서 연결 유전자는 연속된 구아닌 염기의 를 통해 전술한 아미노캘릭스아렌 유도체에 부착되어 있음; 및
(d) 상기 연결 유전자에 상보 결합되어 있는 항체-유전자 결합체, 여기서 전술한 항체-유전자 결합체는 전술한 목적 염기(서열)과 상보적인 염기(서열) 및 전술한 항체 단백질(결합용 항체)가 결합되어 있음.
본 발명에 따른 바이오칩을 사용하면, (d) 항체-유전자 결합체, (e) 항원 및 (f) 표지물질-부착된 2차 항체들이 유전자-유전자 결합되어 형성된 결합체들을 검출할 수 있다. 구체적으로, 상기 (a)~(d)를 포함하는 바이오칩에, (e)항원 및 (f) 표지물질-부착된 2차 항체의 혼합물을 첨가하면, (d) 항체-유전자 결합체에 (e) 항원이 부착되고, 이 (e) 항원에 (f) 표지물질-부착된 2차 항체가 부착되어, 전술한 (d) 항체-유전자 결합체, (e) 항원 및 (f) 표지물질-부착된 2차 항체의 결합체가 형성될 수 있다.
한편, 본 발명에서 연속된 구아닌염기를 인식하는 아미노 캘릭스아렌 유도체(Amino Calixarene derivatives), 이것을 고체기질에 부착시킨 바이오칩은 "9G 유전자칩"이라 하며, 상온에서 10분 이내에 80% 이상의 교잡반응이 가능한 유전자 칩 기술이다 (참고문헌 : Chem. Commun. , 2011년 , 47 / 7101-7103). 이러한 상온교잡 유전자칩에 관련된 기술은 본원 발명자에 의한 한국특허출원 10-2008-0093800호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 혼입되어 있다.
연속된 구아닌 염기가 7 개 이상 부착된 유전자를 다중분자인식에 의해 고정화하여 제조되는 바이오 칩으로 연속된 구아닌 염기와 부착된 특정염기의 길이는 용도에 따라서 13mer 이하인 유전자, 14-17mer인 유전자, 18-21mer인 유전자, 그리고 22mer 이상인 유전자로 설계하여 사용할 수 있다.
본 발명에서는 항체-유전자 결합체를 사용하여 바이오마커 단백질과 항체의 반응을 활성이 유지되는 용액상에서 진행한 후 이를 9G 유전자 칩 상에서 항체-유전자 결합체를 교잡반응하여 결과를 확인함으로써 기존의 심질환관련 단백질 고정화 방식에서 발생하였던 활성유지, 방향성 문제 및 비특이 결합 문제를 해결하여 심질환 바이오마커 단백질을 피코그램 수준에서, 구체적으로는 1~1000pg/ml, 더욱 구체적으로는 5~800pg/ml, 바람직하게는 10~600 pg/ml, 특히 바람직하게는 25~400 pg/ml의 농도까지 검출할 수 있었다 (도 8 내지 도 9 참조).
본 발명에 따르면, 피코그램 수준 이상의 농도에서도 희석방식을 사용하여 측정하거나 표준농도-감도 범위를 확장하여 환산 농도를 결정할 수 있으므로, 상기 농도범위의 상한은 크게 중요하지 않으며, 심질환 바이오마커 단백질을 나노그램 수준 또는 그 이상으로 함유하는 경우에도 본 발명을 적용할 수 있다. 또, 본 발명에서 실험한 25pg/ml 이하의 농도, 더나가서 상술한 5pg/ml 이하의 농도에서도 스캐너의 게인(gain)을 조절하거나 표지물질의 종류를 달리하여 측정하는 것이 가능하므로, 상기 농도 범위의 하한도 본 발명의 방법에 따르면 충분히 극복될 수 있다.
이를 위해 50-60 종 이상의 탐침 유전자를 설계하여 유전자 칩 상에 고정화한 후 형광이 부착된 상보적인 유전자를 사용하여 칩 상에서 발현되는 형광을 분석하여 그 중 특이도와 민감도가 가장 높은 탐침 유전자를 선정하여 심질환 바이오마커 단백질 중 cTnI, NT proBNP, 그리고 BNP의 농도를 각각 혹은 동시에 하나의 칩 상에서 동시에 검출이 가능하도록 유전자가 고정화되어 있는 바이오 칩을 제작하였다 (도 3 참조).
그럼 다음 유전자 칩 상에 고정화되어 있는 유전자와 상보적인 염기를 가지는 유전자를 사용하여 항체-유전자 결합체를 실시예 1과 같이 제조한 후 정제하였으며, 본 발명에 최적화된 항체-유전자 결합체 제조를 위한 단백질 당 유전자 결합 개수를 확인하기 위하여 정제된 유전자-단백질 결합체를 Nanodrop을 사용하여 단백질 당 결합된 유전자의 개수를 확인하여 고정화된 유전자와 교잡반응하기에 최적인 결합 개수를 선정하였다. 또한 바이오마커 단백질 검출을 위해 표시물질이 부착된 2차 단백질의 결합체를 제조를 실시예 2와 같이 제조하여 정제한 후 Nanodrop을 사용하여 2차 단백질에 결합된 표시물질의 개수를 확인하여 정량분석이 가능하도록 하였다. 이때 사용가능한 표시 물질은 형광체, 효소, 방사능 물질, 미세입자 및 색소 등이 될 수 있으나 본 발명에서는 형광체를 사용하였다.
본 발명에서는 일정 비율의 유전자 혼합고정화 기술을 이용한 표준스팟을 이용한 내부표준을 바이오 칩에 적용하여 검출된 바이오마커 단백질의 감도를 단백질의 양으로 변환하여 분석하는 정량분석용 표준농도-감도 그래프를 작성할 수 있는 기술을 제공하였다 (도 5 내지 도 6 참조).
내부표준은 2개 혹은 그 이상의 유전자를 혼합 및 고정화하여 발현되는 감도를 0%부터 100% 사이에서 검출이 가능하도록 표준스팟을 제조하는 기술로서, 예를들면 표준농도를 갖는 표준용액을 사용하여 측정된 표준감도를 수치화하여 그래프화하거나 이미지화하여 테이블로 만든 표준농도-감도 그래프 또는 표준농도-감도 테이블 등에 의해 구현될 수 있는데, 심질환관련 바이오마커 단백질을 분석하기 위하여 사용되는 다양한 검출용 장비를 표준화하고 동시에 심질환 진단을 위한 바이오 칩의 유통 및 보관, 그리고 사용 상 나타날 수 있는 문제를 검증할 수 있는 시스템을 제공할 수 있다. 또한 검출용 장비 사용 시 발생할 수 있는 장비의 문제를 조기에 확인하여 정확한 분석 결과를 제공할 수 있다.
심질환 바이오마커인 cTnI, NT proBNP, BNP 각각에 대해, 예를들어 400pg/ml, 200pg/ml, 100pg/ml, 50pg/ml 및 25pg/ml의 농도를 갖는 표준용액을 제조하고, 이들 표준용액을 특별히 제조된 심질환 바이오마커 단백질 분석용 바이오 칩(도 7 참조)으로써 측정하여 측정감도를 수득하고, 상기 표준용액의 농도 및 측정감도로부터 표준농도-감도 그래프 및/또는 테이블을 작성하였다. 다음으로 검출기의 게인(gain)을 조절하여 검출된 바이오마커 단백질의 감도를 단백질의 양으로 변환하여 실제 농도와 검출 농도를 비교하여 그 일치성을 확인하였다. 결론적으로, 본 발명에서 사용된 심질환 바이오마커 단백질 분석용 바이오칩과 본 발명에 따라 작성된 내부표준 (표준 농도-감도 그래프)에 의한 농도분석 기술의 정확성을 확인하였다.(도 8 참조)
또한 심질환 바이오마커인 cTnI, NT proBNP, BNP를 동시에 검출이 가능함을 확인하기 위하여 혈액샘플내 cTnI, NT proBNP, BNP 3가지 단백질을 1/2 에서 1/32 까지 희석하여 측정하여 희석된 비율에 따라서 나타나는 수치가 정확한 비율로 분석됨을 확인할 수 있었다.
이 결과는 본 발명이 심질환 바이오마커 단백질을 1종 혹은 3종을 pg/ml 수준까지 정량적으로 분석하여 심질환 치료과정을 모니터링하여 완치까지 알려줄 수 있는 바이오 칩 기술을 제공함을 보여주는 결과이다.
본 발명의 하나의 변법에 따르면, 혈액샘플로부터 수득된 측정감도의 수치가 표준농도-감도 그래프의 수치범위 밖이어서 직접적인 농도 환산이 어려운 경우에는, 외삽법 (extrapolateion)으로 환산농도를 추정할 수도 있지만, 혈액샘플을 일정 비율로, 예를들면 1/2 씩 희석하여 측정할 수 있다. 이러한 희석은 측정감도가 전술한 그래프의 수치범위 이내가 될 때까지 수행될 수 있으며, 예를들어 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32의 배율로 희석하여 희석된 샘플들에 대해 동시에 측정할 수도 있도록 바이오칩을 구성할 수 있다. 희석된 샘플에서 수득된 측정감도로부터 희석된 농도가 환산될 수 있으며, 희석비율을 역으로 곱해주면 원래 혈액샘플의 환산농도를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 심혈관 바이오마커 단백질의 환산농도는 급성심근경색(AMI)을 진단하거나 이의 진행상황 및 치료상황을 모니터링하는 데 이용될 수 있다. 급성심근경색(AMI)을 진단은 심혈관 바이오마커 단백질들 중의 하나이상의 환산농도가 정해진 수치를 초과한 경우에 심질환 발생의 판단이 내려질 수 있으며, 상기 환산농도의 정체 또는 감소에 의해 심질환의 완화 판단이 내려질 수 있다. 전술한 정해진 수치는 전문기관이나 전문가의 공식적인 견해에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오마커 단백질의 정량적 분석을 위한 방법론은 하기에 기재된 다른 원발장기질환의 바이오마커에 대해서도 적용할 수 있다:
- 폐암: CEA, SCC, NSE, SLX
- 간암: AFP, PIVKA-II
- 췌장암(담낭암, 담도암): CEA, CA 19-9, CA 50, DUPAN-2, Esterase 1, Span-1 Ag, SLX, NCC-ST-439
- 위암: CEA, CA 19-9, CA 72-4
- 대장암: CEA, CA 19-9, CA 72-4
- 전립선암: PAP, PSA, γ-Sm
- 유방암: CEA, CA 15-3, TPA, NCC-ST-439, BCA 225
- 자궁암: SCC Antigen, CA 125, CEA, TPA
- 난소암: CA 125, CEA, SCC, STN, CA 72-4, SLX
- 식도암: SCC, CEA
본 발명의 하나의 변법에 따르면, 항원 단백질을 상기 원발장기 또는 질환의 마커단백질들로 구성된 군에서 하나 이상, 구체적으로는 3~10개를 선택하여 본 발명의 항원 단백질의 정량적 분석 방법을 수행할 수 있으며, 이에 의해 상기 원발장기의 이상 또는 비정상 여부를 판단하거나 상기 질환을 진단할 수 있으며, 더나가서 이의 진행상황 및/또는 치료상황을 모니터링할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항체-유전자 결합 및 정제
항체-유전자 결합에 사용한 물질은 아래의 표 1에 기재되어 있으며, 사용한 타겟 유전자(TD)의 염기서열은 표 2에 기재되어 있다.
실시예 1에서 사용한 물질 분자량 농도
cTnI Ab(capture Antibody) 160,000g/mol 7.1mg/ml, 35ul
NT proBNP Ab(capture Antibody) 160,000g/mol 6mg/ml, 42ul
BNP Ab(capture Antibody) 160,000g/mol 6mg/ml, 41ul
2-iminothiolane 137g/mol 4mg/ml
TD06 9000g/mol 100pmol/ul
TD01 9000g/mol 100pmol/ul
TD10 9000g/mol 100pmol/ul
Sulfo-SMCC 436g/mol 80mg/ml
10 X PBS
500mM EDTA
타겟유전자 염기서열
TD06 5' - NH2-TTTTTTTTTCGGGCAGGCCATAGCGA
TD01 5'- NH2-TTTTTTTTTGCGCCTCCCCAAGTCGT
TD10 5' - NH2-TTTTTTTTTCCGCGCTCGCAAGGTAT
상기 타겟유전자 TD06, TD01, TD10 은 바이오니아사의 제품을 구입하여 사용하였으며, 각 타겟유전자의 5'-쪽에 아민기(-NH2)가 부착되어 있다.
실시예 1-1: 항체-유전자 결합체 (cTnI Ab-TD06)의 제조
cTnI Ab-TD06 의 합성은 도 1에 묘사된 바처럼 3단계로 이루어지며 다음과 같이 실시하였다.
가. (단계 1) TD06-SMCC 합성
1) 0.6ml 크기의 반응튜브에 TD06 유전자(농도 900ng/ul) 60ul 와 Sulfo-SMCC(농도 80mg/ml) 5ul 를 혼합하였다.
2) 10XPBS 10ul 를 1)의 혼합물에 넣었다.
3) 500mM EDTA 3ul를 2)의 혼합물에 넣었다.
4) 반응 혼합물을 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.
5) 반응 후 TD06-SMCC 는 bioWORLD 사의 Sephadex G-25 packed column (3ml size)을 사용하여 정제하였고 이동상은 1XPBS 를 사용하였다.
6) 정제한 TD06-SMCC 는 ND1000 UV/Vis spectrometer 를 이용하여 순도 및 농도를 측정하여 검증하였으며 도 2에 결과가 나타나있으며 TD06-SMCC(농도 202.4ng/ul) 200ul 를 얻었다.
나. (단계 2) cTnI Ab-SH의 합성
1) 0.6ml 크기의 반응튜브에 cTnI Ab (농도 7.1mg/ml)35ul 와 2-iminothiolane (농도4mg/ml) 2ul 를 혼합하였다.
2) 10XPBS 30ul 를 1) 의 혼합물에 넣었다.
3) 500mM EDTA 5ul 를 2) 의 혼합물에 넣었다.
4) 반응 혼합물을 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
5) 반응 후 cTnI Ab-SH 는 bioWORLD 사의 Sephadex G-25 packed column (3ml size)을 사용하여 정제하였고 이동상은 1XPBS 를 사용하였다.
6) 정제한 cTnI Ab-SH 는 ND1000 UV/Vis spectrometer 를 이용하여 순도 및 농도를 측정하여 검증하였으며 도2에 결과가 나타나있으며 cTnI Ab-SH (농도 1.10mg/ml) 190ul 를 얻었다.
다. (단계 3) cTnI Ab-TD06 의 합성결합체(성분 d)의 합성]
1) 0.6ml 크기의 반응튜브에 단계1에서 합성한 TD06-SMCC(농도 202.4ng/ul) 200ul 와 단계2에서 합성한 cTnI Ab-SH (농도 1.10mg/ml) 190ul 를 혼합하였다.
2) 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응한 후 4℃에서 1시간 동안 반응하였다.
3) 반응 후 cTnI Ab-TD06 은 3000 MWCO spin filter(Millipore)를 이용하여 정제하였다.
4) 정제한 cTnI Ab-TD06 는 ND1000 UV/Vis 스펙트로메터를 이용하여 순도 및 농도를 측정하여 검증하였으며 도2에 결과가 나타나있으며 cTnI Ab-TD06 (농도 2.05mg/ml) 80ul 를 얻었다.
실시예 1-2: 항체-유전자 결합체 (NT proBNP Ab-TD01)의 제조
NT proBNP Ab-TD01의 합성은 NT proBNP Ab (농도 6mg/ml) 42ul 를 사용하여 실시예1-1) 과 동일한 방법으로 합성하여 NT proBNP Ab-TD01 (농도 2.08mg/ml) 80ul 를 얻었으며 도2에 결과가 나타나있다.
실시예 1-3: 항체-유전자 결합체 (BNP Ab-TD10)의 제조
BNP Ab-TD10의 합성은 BNP Ab (농도 6mg/ml) 41ul 실시예1-1) 과 동일한 방법으로 합성하여 BNP Ab-TD06 (농도 2.39mg/ml) 60ul 를 얻었으며 도2에 결과가 나타나있다.
실시예 2: 표지물질-2차항체 결합체의 제조
항원검출신호의 증폭물질로서, 표지물질-2차항체 결합체를 제조하였다. 표지물질로서 형광물질 (Cy5)를 사용하였으며, 하기 표 3에 항체-형광 결합에 사용한 물질들을 기재한다.
실시예 5에서 사용한 물질 분자량 농도
cTnI AB (2차항체) 160,000g/mol 3.7mg/ml, 65ul
NT proBNP AB(2차항체) 160,000g/mol 8mg/ml, 30ul
BNP AB (2차항체) 160,000g/mol 7.6mg/ml, 33ul
Cy5-bis NHS ester(표지물질) 792g/mol 1pack in DMSO 20ul
10 X PBS - -
500mM EDTA - -
실시예 2-1: 표지물질-2차항체 결합체 (cTnI AB-Cy5)의 제조
cTnI AB-Cy5 의 합성은 도2 에 나타나있으며 사용한 물질은 표3에 나타나있다. Cy5-bis NHS ester 는 GE Healthcare Life Sciences 사의 Cy5-bis NHS ester 5pack 제품을 구입하여 사용하였다.
[ cTnI AB-Cy5 의 합성 ]
1) Cy5-bis NHS ester 1pack 에 DMSO 20ul 를 넣고 혼합한다.
2) cTnI AB (농도3.7mg/ml) 65ul 가 들어있는 cTnI AB 튜브에 1) 의 Cy5-bis NHS ester 5ul 를 넣었다.
3) 500mM EDTA 3ul 를 상기 2)에 넣고 혼합하였다.
4) 상기 3)의 혼합물을 상온에서 20 분 동안 반응시켰다.
5) 반응 후 cTnI AB-Cy5 는 bioWORLD 사의 Sephadex G-25 packed column (3ml size)을 사용하여 정제하였고 이동상은 1XPBS 를 사용하였다.
6) 정제한 cTnI AB-Cy5 는 ND1000 UV/Vis 스펙트로메터를 이용하여 순도 및 농도를 측정하여 검증하였으며 도2에 결과가 나타나있으며 cTnI AB-Cy5 (농도1.2mg/ml) 180ul를 얻었다.
실시예 2-2: 표지물질-2차항체 결합체 (NT proBNP AB-Cy5)의 제조
NT proBNP AB-Cy5 의 합성은 NT proBNP AB (농도 8mg/ml) 30ul 를 사용하여 실시예2-1) 와 동일한 방법으로 합성하여 NT proBNP AB-Cy5 (농도1.1mg/ml) 190ul를 얻었으며 도2에 결과가 나타나있다.
실시예 2-3: 표지물질-2차항체 결합체 (BNP AB-Cy5)의 제조
BNP AB-Cy5 의 합성은 BNP AB (농도 7.6mg/ml) 33ul 를 사용하여 실시예2-1) 와 동일한 방법으로 합성하여 BNP AB-Cy5 (농도1.4mg/ml) 150ul를 얻었으며 도2에 결과가 나타나있다.
실시예 3: 단백질 검출용 바이오칩 제조
문헌 [대한민국 특허 제10호 0786577 의 도 1 및 실시예11]에 기재된 방법에 따라, 9개의 연속된 구아닌 염기를 갖는 9G-올리고유전자 (9G-oligo DNA)를 아미노캘릭스아렌 단분자층 상에 고정화하여 9G-DNA칩을 제조하고, 이를 단백질 검출용 바이오칩으로 사용하였다 (도 3 참조).
본 실시예에서 사용된 9G-올리고유전자는 하기 표 4에 기재한다:
올리고
유전자		 염기서열(5' → 3') 농도
HC GGGGGGGGG CTTTATCAT CC ACT GTT CTC GGC ACG 100pmol/ul
PCP06 GGGGGGGGG CTTTATCAT TCG CTA TGG CCT GCC CG 100pmol/ul
PCP01 GGGGGGGGG CTTTATCAT ACG ACT TGG GGA GGC GC 100pmol/ul
PCP10 GGGGGGGGG CTTTATCAT ATA CCT TGC GAG CGC GG 100pmol/ul
실시예 4: 항원 단백질 cTnI, NT proBNP, BNP 의 검출
항원 단백질로서 심질환 바이오마커를 검출하는 방법 및 실험과정은 도 4에 도식적으로 설명되어 있다. 심질환 바이오마커 단백질로서 3가지 항원 단백질 cTnI, NP proBNP 및 BNP을 표준샘플로서 준비하여 사용하였다.
1) 항원 표준샘플 준비
항원표준샘플은 Hytest 사의 cTnI Ag (0.5mg/ml), NT proBNP Ag(0.9mg/ml), BNP Ag(3.5ng/ml) 을 구입하여 준비하였다.
항원 단백질 cTnI, NT proBNP 및 BNP을 농도 400pg/ml로 함유하는 표준샘플 1을 제조하고, 이를 1xPBS 용액으로써 1/2 씩 희석하여 농도 200pg/ml, 100pg/ml, 50pg/ml 및 25pg/ml로 함유하는 표준샘플 2~5를 하기 표 5에서처럼 준비하였다.
Protein 표준샘플1 표준샘플2 표준샘플3 표준샘플4 표준샘플5
cTnI 400pg/ml 200pg/ml 100pg/ml 50pg/ml 25pg/ml
NT proBNP 400pg/ml 200pg/ml 100pg/ml 50pg/ml 25pg/ml
BNP 400pg/ml 200pg/ml 100pg/ml 50pg/ml 25pg/ml
2) 항체(Antibody) 혼합물의 준비
가. 용량 1.5ml의 e-tube에, 항체-유전자 결합체 cTnI Ab-TD06(100ug/ml), NT proBNP Ab-TD01(100ug/ml), 및 BNP Ab-TD10(100ug/ml)을 각각 15ul씩 첨가하였다.
나. cTnI AB-Cy5(100ug/ml)와 NT proBNP AB-Cy5(100ug/ml), 그리고 BNP AB-Cy5(100ug/ml)를 60ul 씩 넣었다.
다. 1XPBS 375ul 를 넣어 600ul 의 항체 혼합물 (antibody mixture) 를 준비하였다.
3) 샘플 혼합, 적재 및 인큐베이션
가. 1.5ml 크기의 e-tube 에 상기 2)에서 준비한 항체 혼합물 100ul와 인큐베이션 버퍼 300ul 씩을 혼합하여 인큐베이션 혼합물을 준비하였다.
나. 표5 의 표준샘플(1~5) 20ul 와 상기 인큐베이션 혼합물 40ul 를 혼합한 후 칩 상에 로딩 후 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다
4) 세척, 건조 및 스캔
인큐베이션 후, 세척용액(4XSSC)에 넣고 2분씩 2회 세척한 후 원심분리기를 이용하여 3000rpm 에서 1분 동안 건조하였다. 건조된 바이오칩은 시판 스캐너 (Scanarray Gx Scanner, Perkin Elmer)를 사용하여 스캔하였다.
5) 결과 분석
도 5 및 표 6은 표준샘플에 대한 측정 결과를 보여준다. 하기 표 6에는 표준농도에 대해 측정된 표준감도가 정리되어 있으며, 도 6에는 표준농도 대 표준감도의 그래프 ("표준샘플 감도 대비 농도 그래프")가 도시되어 있다.
표준샘플 농도 400pg/ml 200pg/ml 100pg/ml 50pg/ml 25pg/ml
형광감도
(Gain 90)		 cTnI 65000 45000 28000 17000 10000
NT proBNP 65000 44000 28000 16000 10000
BNP 65000 45000 27000 16000 10000
피험자의 혈액샘플을 바이오칩으로 분석하고, 결과된 형광광도 수치를 도 6의 그래프와 비교하면, 피험자의 혈액샘플에 함유된 타겟 단백질의 농도를 분석할 수 있다.
한편, 이러한 표준 형광감도를 모든 스캔 장비에서 동일한 값으로 얻어낼 수 있게 도 5에서와 같은 내부 표준스팟 (표준농도-감도 테이블)을 제조하였으며, 단백질 농도 분석을 위하여 도 6의 게인 90 (Gain 90)에서 나타난 형광감도를 표준감도로 결정하였다.
실시예 5: 내부 표준스팟을 이용한 검출 방법
1) 내부 표준스팟을 이용한 검출용 바이오칩 제조
단백질 검출용 바이오칩을 이용하여 바이오마커의 농도를 모르는 테스트분석하는 경우, 측정된 감도를 내부 표준스팟의 감도와 비교분석하여 환산 농도를 결정할 수 있도록 내부 표준스팟 (표준농도-감도 그래프 또는 표준농도-감도테이블)를 제조하였으며, 내부표준스팟 고정화 및 교잡반응에 사용한 물질은 하기 표 7에 기재되어 있다.
올리고 유전자 염기서열(5'ㅰ 3') 농도
HC GGGGGGGGG CTTTATCAT CC ACT GTT CTC GGC ACG 100pmol/ul
NC GGGGGGGGG CTTTATTTT TAT AAA TAT AAT ATA ATT 100pmol/ul
HC TD-Cy5 Cy5-TTT TTT CGT GCC GAG AAC AGT GG 1pmol/ul
내부 표준스팟 감도는 실시예 4의 표준샘플 400pg/ml ~ 25pg/ml 농도에서 나타나는 모든 감도 65000~10000 수치를 나타낼 수 있도록 하기 표 8에서와 같이 혼합유전자를 사용하였으며, 표준스팟 1 (IS 1), 표준스팟 2 (IS 2), 표준스팟 3 (IS 3) 및 표준스팟 4 (IS 4)에 대하여 각각 HC 유전자의 비율이 각각 5%, 2.5%, 1%, 0.5% 가 되도록 NC 유전자와 혼합하였다. 하기 표 8은 내부표준스팟들의 표준농도를 나타내는 혼합유전자 비율 (HC : NC)을 보여준다.
내부표준스팟 혼합유전자 HC 유전자 비율 농도
HC 유전자 NC 유전자
IS 1 50ul 950ul 5% 10pmol/ul
IS 2 25ul 975ul 2.5% 10pmol/ul
IS 3 10ul 990ul 1% 10pmol/ul
IS 4 5ul 950ul 0.5% 10pmol/ul
표4에 기재된 PCP06, PCP01 및 PCP10 유전자와 표8에 기재된 IS1, IS2, IS3 및 IS4 혼합 유전자를 사용하여, 문헌 [대한민국 특허 제10-0786577호의 실시예 11]에 기재된 방법과 동일하게 수행하여 도 7에 묘사된 바이오칩을 제조하였다.
2) HC TD-Cy5 를 이용한 내부표준스팟 감도 결정
HC 유전자와 상보적인 염기서열을 갖는 HC TD-Cy5 는 4개의 내부표준스팟과 교잡반응 후에 나타난 형광감도가 65000~10000 수준의 모든 수치를 나타낼 수 있도록 도6의 gain 90 에서 나타난 감도를 농도 분석을 위한 내부표준스팟 감도로 결정하였으며 다음과 같이 실시하였다.
가. 표9의 HC TD-Cy5(1pmol/ul) 15ul 를 incubation buffer 100ml 와 혼합하여 0.15fmol/ul 농도의 HC TD-Cy5 가 혼합된 incubation mixture 를 준비하였다.
나. 1XPBS 30ul 와 가. 에서 준비한 incubation buffer 30ul 를 혼합하여 칩 상에 로딩 후 상온에서 2시간 동안 incubation 하였다.
다. incubation 후 세척용액(4XSSC)에 넣고 2분씩 2회 세척한 후 원심분리기를 이용하여 3000rpm 에서 1분 동안 건조하였다. 건조된 바이오칩은 Perkin Elmer 의 Scanarray Gx Scanner 에서 스캔 하여 도6 의 gain 90 에서 나타나는 감도를 얻었으며 단백질 분석을 위한 감도 대비 농도 그래프를 사용하여 단백질 농도 분석을 하였다.
3) 내부 표준스팟을 이용한 단백질 cTnI, NT proBNP, BNP 검출
가. 내부 표준스팟 감도를 이용하여, 스캐너 게인(획득치, gain)을 조절하여 cTnI, NT proBNP, BNP 표준샘플의 실제 농도와 본 발명에 따른 단백질 검출용 바이오칩에서 측정된 농도를 비교하였다. 상기 표 5에 기재된 표준샘플 1~5를 이용하여 실시예 4에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
나. cTnI의 표준샘플 1~5에서 나타난 감도를 내부표준스팟 (표준농도-감도 그래프)을 이용하여 농도로 환산한 결과가 도8 에 나타나 있으며, 실제 사용된 표준농도와 바이오칩으로 측정된 환산농도가 일치하는 결과를 수득하였다. 다른 심질환 바이오마커 NT proBNP 및 BNP에 대해서도, 표준샘플들의 표준농도와 측정감도에서 환산된 환산농도가 동일하게 일치하는 결과를 수득하였다.
실시예 8: 혈장샘플(serum)의 검출
심혈관 바이오마커의 함유농도는 모르지만 바이오칩으로 측정하여 감도가 65000 이상인 혈장샘플 (샘플 1)을 준비하고, 하기 표 9에 나타낸 바처럼 1/2에서 1/32 까지 1XPBS로써 희석된 샘플 (샘플 2 ~ 6)을 더욱 준비하였다.
샘플1 샘플2 샘플3 샘플4 샘플5 샘플6
혈장샘플 (No. 22) 1/2 희석 1/4희석 1/8 희석 1/16 희석 1/32 희석
1) 혈장샘플 30ul 와 1XPBS 30ul 를 혼합하여 1/2 희석하였다.
2) 1)의 희석샘플 30ul 와 1XPBS 30ul 를 혼합하여 1/4 희석하였다.
3) 2)의 희석샘플 30ul 와 1XPBS 30ul 를 혼합하여 1/8 희석하였다.
4) 3)의 희석샘플 30ul 와 1XPBS 30ul 를 혼합하여 1/16 희석하였다.
5) 4)의 희석샘플 30ul 와 1XPBS 30ul 를 혼합하여 1/23 희석하였다.
6) 표9의 혈장샘플을 이용하여 실시예4)와 동일한 방법으로 실시하여 결과를 얻었으며 도9에 분석 결과가 나타나있다.
농도분석 결과를 보면, 정확한 농도를 모르는 혈장샘플에 대하여, 포함된 심질환 바이오마커 단백질 항원인 cTnI 및 NT proBNP는 농도가 1/2 씩 희석된 샘플에서 정확하게 1/2씩 감소된 감도를 가지는 것을 확인하였으며, 400pgml의 높은 농도에서 25pg/ml 의 낮은 농도 까지 피코그램 수준의 농도범위에서 정량적인 농도 분석이 가능함을 확인하였다.
최초 혈장샘플 원액 (샘플 1)에서는 감도가 65000 이상이어서 농도가 400pg/ml 이상이어서 정확한 농도환산이 어렵지만, 이를 1/2 희석한 샘플에서 측정된 감도로부터 환산된 농도는 322pg/ml이어서, 원래의 혈장샘플의 농도는 644pg/ml 인 것으로 결정되었다.
본 발명은 단백질칩 제조분야 및 이를 이용한 진단 및 치료분야에서 산업적으로 이용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기 단계를 포함하는, 심질환 바이오마커 단백질의 정량적 분석 방법:
    (1) 바이오칩을 이용하여 항원(antigen)인 심질환 바이오마커 단백질들의 표준농도-감도 그래프를 작성하고,
    (2) 피험자의 혈액샘플을 바이오칩으로 분석하여 혈액에 포함된 심질환 바이오마커 단백질들의 측정감도를 수득하고,
    (3) 전술한 측정감도를 전술한 표준농도-감도 그래프와 비교하여 심질환 바이오마커 단백질들의 환산 농도를 결정하고,
    (4) 상기 수득된 심질환 바이오마커 단백질들의 환산 농도로부터 심질환 진행상태 또는 치료상태를 결정함;
    여기서, 전술한 심질환 바이오마커 단백질 항원은 cTnI, NT proBNP 및 BNP로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고,
    여기서, 전술한 바이오칩은 하기 성분 (a)~(d)를 포함하며:
    (a) 고체 기질,
    (b) 고체기질에의 부착수단 및 연속된 구아닌 염기의 인식 부위를 갖는 아미노캘릭스아렌 유도체,
    (c) 7개 이상 연속된 구아닌 염기 및 목적 염기(서열)을 갖는 고정화 유전자, 및
    (d) 상기 고정화 유전자에 상보 결합가능한 유전자 및 항체를 결합시킨 항체-유전자 결합체;
    여기서, "바이오칩으로 측정하고자 하는 샘플"에는 전술한 "심질환 바이오마커 단백질 항원" (성분 (e))에 더하여 "표지물질-항체 결합체" (성분 (f))가 측정 전 또는 측정시에 첨가되며,
    전술한 성분 (d)는 바이오칩에 처음부터 포함되어 있거나, 측정하고자 하는 샘플의 첨가 전후에 또는 첨가시에 별도로 첨가될 수 있으며,
    여기서, 전술한 아미노캘릭스아렌 유도체는 전술한 부착수단과 고체기질 표면 사이의 화학적 또는 물리적 결합에 의해 고체기질에 부착되어 있고, 전술한 고정화 유전자는 연속된 구아닌 염기에 의해 전술한 고정화 유전자의 연속된 구아닌 염기의 인식부위에 부착되어 있음.
  2. 제 1 항에 있어서, 전술한 단계 (1)은 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법:
    (1a) 항원인 심질환 바이오마커 단백질 1종 이상을 각각 소정농도로 함유하는 용액 및 이를 정해진 비율로 희석한 용액(들)을 각각 제조함으로써 표준용액을 준비하고,
    (1b) 전술한 표준용액들을 바이오칩으로 분석하여 표준감도를 수득하고,
    (1c) 전술한 표준농도 및 수득된 표준감도로부터 표준농도-감도 그래프를 작성함.
  3. 제 2 항에 있어서, 전술한 표준농도-감도 그래프는 표준농도의 수치 및 표준감도의 수치를 결합한 그래프 형태 대신에 표준농도의 수치 및 표준감도의 이미지를 결합한 테이블 형태 (표준농도-감도 스팟)를 갖는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오칩은 성분 (a), (b) 및 (c)를 포함하며, 상기 "바이오칩으로 측정하고자 하는 샘플"은 성분 (e)에 더하여 성분 (d) 및 성분 (f)의 혼합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 전술한 심질환 바이오마커 단백질 항원은 cTnI, NT proBNP 및 BNP로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 전술한 항체는 상기 항원의 항체인 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  6. 제 1 또는 5 항에 있어서, 전술한 심질환 바이오마커 단백질은 cTnI, NT proBNP 및 BNP를 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 목적 염기(서열)은 길이가 13mer 이하, 14~17mer, 18~21mer, 또는 22mer 이상인 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 고체기질은 금, 은, 백금과 같은 금속, 유리, 유리섬유쉬트, 실리콘웨이퍼, 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노 캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 아미노캘릭스아렌 유도체인 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112014028150061-pat00003

    [화학식 2]
    Figure 112014028150061-pat00004


    [상기식에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 ,-OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내며.
    Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 C6H5 는 페닐기로 정의됨)].
  10. 제 8 또는 9 항에 있어서, 전술한 고체기질은 금에서 선택되고, 고체기질에의 부착수단으로서 화학식 1 또는 2의 Y1, Y2, Y3 및 Y4 중의 하나 이상이 티올기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  11. 제 8 또는 9 항에 있어서, 전술한 고체기질은 아민 작용기가 부착되어 개질된 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정으로 이루어진 군에서 선택되고, 고체기질에의 부착수단으로서 화학식 1 또는 2의 Y1, Y2, Y3 및 Y4 중의 하나 이상이 알데히드기에서 선택되고, 이에 의해 전술한 (a) 및 (b)의 연결은 이민기 또는 이를 환원시킨 아민기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 전술한 표지물질은 형광체, 효소, 방사능 물질, 미세입자 및 색소로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심질환 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 전술한 단계 (2)에서 수득된 혈액샘플의 심질환 바이오마커 단백질의 측정감도가 단계 (1)에서 수득된 표준농도-감도 그래프의 범위보다 높으면, 피험자의 혈액샘플을 희석하여 측정감도를 수득하고, 수득된 측정감도 및 희석비율로부터 환산농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 심혈관 바이오마커 단백질의 정량분석 방법.
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 따른 방법으로 수득된 심혈관 바이오마커 단백질의 농도를 이용하여 급성심근경색(AMI)의 진행상황 및 치료상황을 모니터링하는 방법.
  16. 제 1 항에 기재된 방법을 사용한 항원 단백질의 정량분석 방법으로서, 항원 단백질을 하기에 기재된 원발장기 질환의 마커단백질로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 항원 단백질의 정량분석 방법:
    - 폐암: CEA, SCC, NSE, SLX
    - 간암: AFP, PIVKA-II
    - 췌장암(담낭암, 담도암): CEA, CA 19-9, CA 50, DUPAN-2, Esterase 1, Span-1 Ag, SLX, NCC-ST-439
    - 위암: CEA, CA 19-9, CA 72-4
    - 대장암: CEA, CA 19-9, CA 72-4
    - 전립선암: PAP, PSA, γ-Sm
    - 유방암: CEA, CA 15-3, TPA, NCC-ST-439, BCA 225
    - 자궁암: SCC Antigen, CA 125, CEA, TPA
    - 난소암: CA 125, CEA, SCC, STN, CA 72-4, SLX
    - 식도암: SCC, CEA
  17. 제 16 항에 있어서, 전술한 항원은 원발장기 질환의 마커단백질로 구성된 군에서 3~10종을 선택하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 항원 단백질의 정량분석 방법.
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