KR102396381B1 - 9g 기술 및 dna 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트 - Google Patents

9g 기술 및 dna 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 9G 기술 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트에 관한 것으로, 표적물질과의 결합 특이도를 높이고, 검출 신호를 증폭시켜, 검출의 민감도, 정확성 및 재현성을 크게 향상시키는 효과가 있다.

Description

9G 기술 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트{IN VITRO DIAGNOSTIC KIT USING 9G TECHNOLOGY AND CONJUGATES INCLUDING DNA FRAGMANT}
9G 기술 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외 진단키트에 관한 것이다.
체외진단 기기는 체외진단 검사에 사용되는 의료기기로서 사용되는 시약을 포함한 기기를 말하며, 체외에서 검사가 이루어지기 때문에 인체에 직접적으로 삽입하는 의료기기들 보다 신체적인 부담이 적다.
체외진단 기술 중 면역측정법은 혈액, 뇨, 체액 등의 인체에서 유래한 물질을 이용해 체외에서 표적물질을 신속하게 측정하여 질병을 진단하는 기술이며, 임상적인 의사 결정에 중요한 역할을 하며 환자의 치료에 필수적인 요소가 되고 있다.
면역 측정법 중 가장 대표적인 것은 효소면역분석법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay)이며 면역학적 검정에 대한 효율성이 검정된 방법으로서, 경제적이고 간단하게 면역학적 검정을 수행할 수 있어 현재까지 인간 및 동물의 질병 진단에 기본적으로 사용되고 있다.
일반적으로 효소면역분석법은 효소가 표지된 항체와 이 효소 반응을 통해 발색이 되는 기질을 사용하여 하나의 분석물질(analyte) 또는 표적물질(target substance)을 검출하는 과정을 포함하며 간단한 과정을 거쳐 질병의 진단이 가능하다는 장점이 있으나, 효소가 결합된 항체와의 2차 반응이 필요하기 때문에 시간이 걸리고 2차 반응에 사용되는 항체 생산 비용으로 금전적인 면에서도 부담이 된다는 문제점이 있었다. 또한, 1차 반응 및 2차 반응에서 일부의 반응이 진행되지 않을 수 있기 때문에 진단의 민감도(sensitivity) 측면에서도 문제점이 있다.
상기 효소면역분석법(ELISA)의 문제점을 극복하기 위하여 개발된 것이 형광면역측정법(FLISA: fluorescence-linked immunosorbent assay)이다. 형광면역 측정법은 표적물질에 결합하는 항체에 형광을 결합시켜 항원-항체 반응이 일어난 정도에 따라 형광의 감도를 측정하는 검사 방식으로, 이차 항체에 형광 물질을 화학결합으로 부착시킨 것을 검출용으로 사용하였다. 처음에는 ELISA의 표지자로서 효소를 이용하였으나, 이후의 검출 기술개발에 따라 현재에는 형광물질이 보편적으로 사용되고 있다. 이러한 형광물질로는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열, 잔텐(xanthene)계열, 시아닌(cyanine)계열 형광물질을 포함한 다양한 형광분자가 사용되고 있다.
효소면역분석법(ELISA)는 주로 amine기와 aldehyde기의 반응을 이용한 화학적 결합방식과 단백질을 물리적으로 흡착시키는 방식 등이 사용되고 있다. 화학결합방식의 경우 고정화 후 시간이 경과함에 따라서 고정화된 단백질의 활성이 감소하여 높은 민감도 확보가 어렵다. 물리 흡착 방식의 경우 고정화되는 단백질의 방향성 제어와 고정화 후 단백질 활성 유지가 어려워 민감도 및 재현성 확보가 힘들기 때문에 미량의 정량분석이 필요한 단백질 분석 제품에 적용이 어렵다. 따라서 이러한 문제점의 영향이 비교적 적은 고농도 타깃을 분석하는 용도의 제품이 주로 개발되었다.
또한, 고체 기질 상에 고정화된 단백질은 시간이 경과할수록 고정화 단백질의 변성, 비특이 결합들이 발생하게 되어 미량의 단백질 변화를 반복적으로 재현성 있게 판독하기에는 많은 한계가 존재한다.
Figure 112021100459613-pat00001
효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 형광면역측정법(FLISA: fluorescence-linked immunosorbent assay)은 고체 기질 상에 단백질을 직접 고정화 시키는 방식으로 고정화된 단백질은 시간이 경과할수록 단백질의 변성이 발생하여 항원-항체간 반응이외의 단백질간 비특이 결합들이 발생하는 문제가 있다. 그리고 미량 단백질(~100pg/ml) 측정 시에는 결과에 비특이 감도가 포함되면 10~1000 pg/ml 등으로 높은 혹은 낮은 농도로 잘못된 결과를 나타나는 경우가 발생한다. 이러한 이유로 ELISA, FLISA에 기반한 측정법은 대부분 비특이에 의해 농도의 영향이 받지 않는 고농도 수준의 단백질 분석에는 적합하지만 매우 낮은 농도 분석에서는 비특이에 의한 실제 감도를 분석하기 어려운 한계가 있기 때문에 재현성과 반복성이 높은 분석기술 확보가 어려운 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1029343호 (2011.04.13. 공고) 대한민국 등록특허 제10-2046556호 (2019.11.13. 공고)
본 발명의 목적은, 종래 기술의 효소면역분석법(ELISA) 및 형광면역분석법 등에서 고체 기질 위에 단백질을 직접 고정화함으로써 발생하는 비특이 반응을 제거하고 결합 특이도를 높이기 위함이다.
본 발명의 다른 목적은, 신호 증폭을 통하여 극미량의 표적물질을 검출할 수 있는 민감도, 정확성 및 재현성이 높은 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 체외진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DNA 프로브가 고정된 고체기질; 및 상기 DNA 프로브에 결합할 수 있는 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트; 를 포함하는, 체외진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고체기질에는 이민캘릭스아렌 유도체와 아미노캘릭스아렌 유도체 중 하나 이상이 이민결합을 통해 부착된 것 일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112021100459613-pat00002
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 , -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의되고,
[화학식 2]
Figure 112021100459613-pat00003
상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA 프로브는 연속적인 구아닌(guanine) 염기를 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 DNA 단편의 결합체를 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 나노입자를 더 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 DNA 단편의 결합체; 및 항체와 나노입자의 결합체; 를 더 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 나노입자의 결합체(제1결합체); 및 항체와 나노입자의 결합체(제2결합체); 를 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항체와 나노입자의 결합체는 항체에 부착된 DNA 단편과 나노입자에 부착된 DNA 단편 간의 상보적인 결합으로 형성되는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노입자는 형광물질을 함유하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제1결합체와 제2결합체 중 어느 하나 또는 둘에 포함된 나노입자는 형광물질을 함유하는 것 일 수 있다.
본 발명에 따르면, 9G 기술 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트를 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 고체기질과 컨쥬게이트 간에 DNA-DNA 결합을 도입함으로써, 종래 기술에서 발생한 비특이 반응을 제거하고 결합 특이도를 높이는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 나노입자 또는 형광 나노입자 표면에 다수의 항체 및 유전자의 생체표지자를 결합시켜 검출 신호를 증폭시킴으로써 민감도, 정확성 및 재현성을 높여 피코그램(picogram) 수준의 극미량의 표적물질을 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 프로브가 고정된 고체기질(9G 기술) 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 포함하는 체외진단 키트의 작동원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체-DNA 결합체 제조방법의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 항체-형광 결합체 제조방법의 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체-DNA-나노입자 결합체 제조방법의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 한 쌍의 항체-DNA-나노입자 결합체(제1결합체 및 제2결합체) 제조방법의 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 다수 쌍의 항체-DNA-나노입자 결합체를 포함한 체외진단 키트의 작동원리를 나타낸 모식도이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소면역분석법(ELISA)을 이용한 검출방법의 모식도이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소면역분석법(ELISA)의 Troponin T의 측정 농도범위를 나타낸 것이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 컨쥬게이트(항체-DNA 결합체 및 항체-형광 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 모식도이다.
도 8b은 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 컨쥬게이트(항체-DNA 결합체 및 항체-형광 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 Troponin T 측정 농도범위를 나타낸 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 2차 컨쥬게이트(항체-DNA 결합체 및 항체-DNA-나노입자 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 모식도이다.
도 9b은 본 발명의 일 실시예에 따른 2차 컨쥬게이트(항체-DNA 결합체 및 항체-DNA-나노입자 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 Troponin T 측정 농도범위를 나타낸 것이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차 컨쥬게이트(항체-DNA-나노입자 결합체 및 항체-DNA-나노입자 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 모식도이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차 컨쥬게이트(항체-DNA-나노입자 결합체 및 항체-DNA-나노입자 결합체)를 이용한 형광면역분석법의 Troponin T 측정 농도범위를 나타낸 것이다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명은 종래 기술의 ELISA, FLISA 법에 기반한 측정법에서 저농도 단백질 분석시에 나타나는 비특이 문제를 해결하기 위해 고체 기질 위에 항체 단백질을 직접 고정화하는 방식 대신 유전자를 고정화한 DNA 고체기질과 여기에 항체-DNA가 결합된 항체-DNA 결합체가 DNA-DNA 반응으로 결합하는 방식을 개발한 것이다. 이러한 유전자를 고정한 DNA 고체기질의 예로는 9G 기술(고체 기질 위에 9 guanine(s)을 포함한 DNA 프로브를 고정함)을 적용한 바이오 칩(이하, 9G DNA 기질) 등을 사용할 수 있다.
이와 같이, DNA 단분자층으로 이루어진 9G DNA 기질은 표면이 친수성이기 때문에 다른 단백질과 비특이 결합이 없으며 고체 기질의 DNA와 결합하는 항체도 유전자가 결합된 항체-DNA 결합체이므로 단백질에 의한 비특이가 없어 저농도 단백질 분석이 가능하다.
그러나 여전히 시료 속에 존재하는 매우 낮은 농도의 생체 표지(biomarker) 물질을 정확하게 재현성이 확보된 분석시스템으로서 확립하기에는 단백질 비특이 문제 이외에도 여전히 해결해야 할 부분이 있다.
낮은 농도를 정확하게 검출하기 위해서는 분석 표지자로 사용되는 형광표지자가 안정하고 강한 신호를 나타내어야 하는데, 단일 형광분자는 형광신호 강도 및 형광 반감기 등으로 인한 측정방법에 한계가 있으며 이러한 단점을 극복할 수 있는 새로운 신호 증폭에 대한 기술 개발이 요구되고 있다.
분석 신호를 증폭하여 검출 민감도를 증가시킬 수 있는 신호증폭 기술을 위하여, 본 발명자들은 극미량의 단백질을 매우 정확하게 측정하고 분석할 수 있는 나노입자를 포함한 컨쥬게이트를 개발하였다.
한편, 형광 나노입자는 수십 마이크로미터 크기를 가지는 일반적인 형광체와 달리 1 마이크로미터 이하의 크기를 가지며, 이에 따른 표면적/부피비의 증가로 인해 나노 스케일에서 발생하는 다양한 효과로 인해 단일 형광체와 다른 물성을 나타내게 된다. 형광 나노입자는 기존의 다른 형광물질에 비하여 우수한 열적, 화학적 안정성, 광안정성 및 높은 형광세기 등의 특징을 가진다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 형광면역진단키트의 형광신호를 증폭시켜서 피코그램 수준의 극미량의 시료를 사용하더라도 효과적으로 표적물질을 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 단일 형광분자의 단점을 보완할 수 있는 형광 나노입자(nanoparticles)를 매개체로 하여 항체와 유전자 등의 생체표지자를 형광 나노입자와 결합시킨 컨쥬게이트와 9G 기술을 이용하는 체외진단 키트를 개발하였다.
고체기질 (9G 기술)
고체기질은 DNA 프로브가 고정된 것이고, 고체기질에 DNA 프로브를 고정하기 위한 물질과 방법이 9G 기술에 해당하는 것이다.
상기 고체기질에는 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민노캘릭스아렌 유도체 중 하나 이상이 이민결합을 통해 부착된 것 일 수 있다. 이는 등록특허 제10-0748082호, 등록특허 제10-0785655호, 등록특허 제10-0786577호, 등록특허 제10-0883763호에 기술되어 있고, 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
상기 아미노캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1로 표시되며, 이민캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 2로 표시된다.
[화학식 1]
Figure 112021100459613-pat00004
상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5 , -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의된다.
[화학식 2]
Figure 112021100459613-pat00005
상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의된다.
상기 DNA 프로브는 연속적인 구아닌(guanine) 염기를 포함하고, 이 연속적인 구아닌 염기가 상기 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체 중 하나 이상이 부착된 고체기질에 결합할 수 있다.
상기 아미노캘릭스아렌 유도체 또는 이민캘릭스아렌 유도체는 DNA 분자의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민에 대하여 분자인식특성(molecular recognition properties)을 나타내고, 특히 구아닌에 대하여 가장 강한 분자인식력을 가진다. 따라서, 아미노캘릭스아렌 유도체와 이민캘릭스아렌 유도체 중 하나 이상이 부착된 고체기질에 연속적인 구아닌(guanine) 염기를 포함한 DNA 프로브가 결합할 수 있다.
상기 연속적인 구아닌 염기는 7 내지 20 mer 길이인 것이 바람직하고, 9 mer 길이인 것이 가장 바람직하다.
상기 고체기질은 금, 유리, 실리콘웨이퍼 또는 수정결정 중에서 선택될 수 있다.
상기 고체기질에 연속적인 구아닌 염기를 포함한 DNA 프로브가 결합하여 DNA 단분자층을 형성한다.
도 1을 참조하면, DNA 프로브에 포함된 연속적인 구아닌이 아미노캘릭스아렌 유도체, 이민캘릭스아렌 유도체가 부착된 고체기질에 결합되고, 고체기질에 결합되지 않은 DNA 프로브는 표적물질과 결합한 컨쥬게이트에 포함된 DNA 단편과 상보적인 결합을 한다.
컨쥬게이트
본 발명의 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트(conjugate, 접합체, 결합체)는 전술한 DNA 프로브에 결합할 수 있는 DNA 단편을 포함한다.
상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 DNA 단편의 결합체를 포함하는 것 일 수 있다.
상기 항체는 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 표적물질은 검출하고자 하는 특정 단백질, 자가항체(autoantibody), 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer), 합텐(hapten;DNP) 등의 생체분자를 모두 포함하는 것으로, 나아가 상기 기재 사항에 특히 제한되는 것은 아니다.
상기 DNA 단편은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 일 수 있다. 또한, 상기 DNA 단편은 합성된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 일 수 있다.
항체와 DNA 단편의 결합체는, 도 2를 참조하면, NH2-DNA 단편과 sulfo-SMCC가 화학 결합으로 제조된 SMCC-DNA 단편에 항체-SH를 결합하여 항체-DNA 결합체를 형성한다. SMCC-DNA 단편의 DNA 단편은 30~40 mer 크기의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이 때, 항체는 정제, 감지, 측정 목적으로 표적물질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린인 것이 바람직하다.
도 8a를 참조하면, 항체-DNA 결합체와 항체-형광 결합체(도 3과 같이 제조)를 쌍으로 하여 (1차)컨쥬게이트로 사용하여 표적물질을 검출할 수 있다. 이 경우, 항체-DNA 결합체와 항체-형광 결합체는 하나의 표적물질의 서로 다른 부위에 특이적으로 반응하여 작용할 수 있다. 상기 항체-DNA 결합체와 항체-형광 결합체에서 각 항체는 표적 물질에 특이적인 항체로서, 항체-DNA 결합체와 항체-형광 결합체를 쌍으로 하여 표적물질을 선별적으로 반응하여 검출할 수 있다.
상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 나노입자를 더 포함할 수 있다.
상기 나노입자는 마이크로스피어(Microspere)로서 라텍스 비드 또는 라텍스 입자인 것이 바람직하다. 라텍스 비드는 콜로이드 크기의 구면 입자로 폴리스티렌과 같은 무정형 폴리머로부터 형성될 수 있다. 폴리스티렌 체인이 구슬에 배열하는 방식 때문에 표면은 특성이 매우 소수성이어서 단백질과 같은 물질의 흡착에 이상적인 물질이다.
상기 나노입자 표면에는 각종 분자와 단백질을 비드 표면에 결합하기 위해 다양한 표면 변형을 사용할 수 있다. 나노입자 표면은 아민기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 또는 알데히드기(-COH) 중 어느 하나의 작용기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 4에 나타낸 나노입자는 입자 표면에 카르복실기 그룹을 포함한 카복실 라텍스로서 폴리스티렌 마이크로스피어로 구성된다. 또한, 아민 라텍스는 폴리스티렌 마이크로스피어로 구성되며 입자 표면에는 아민 그룹을 포함하고 있다. 이러한 입자 표면의 작용기들은 유전자, 항원, 항체의 구성 요소와 공동 결합을 위해 사용될 수 있다. 라텍스 비드의 크기는 지름이 20 ~ 1000 nm 인 것을 사용할 수 있으며, 지름이 100 ~ 500 nm 인 것이 바람직하다.
상기 나노입자는 형광물질을 함유한 형광 라텍스 비드일 수 있다. 형광 나노입자에는 다양한 형광 염료가 입자 내부에 함유된 것 일 수 있다. 형광 파장은 (Ex/Em): Blue(365/415), Yellow-green(505/515), Nile red (535/575), Orange (540/560), Red-orange (565/580), Red(580/605), Crimson (625/645), Dark red (660/680), Infrared (715/755) 등의 다양한 형광을 이용할 수 있다.
상기 나노입자에는 15,000 ~ 40,000 개의 DNA 단편이 결합할 수 있다.
도 4를 참조하면, 나노입자 표면의 카르복실기에 NH2-DNA 단편이 결합하여 나노입자-DNA 결합체를 형성할 수 있다.
상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 DNA 단편의 결합체; 및 항체와 나노입자의 결합체; 를 포함할 수 있다.
항체와 DNA 단편의 결합체는 전술한 바와 중복되므로 생략한다.
항체와 나노입자의 결합체는 항체에 부착된 DNA 단편과 나노입자에 부착된 DNA 단편 간의 상보적인 결합으로 형성될 수 있다. 도 4를 참조하면, 나노입자에 DNA 단편을 결합시키고, 이를 항체와 DNA 단편의 결합체(항체-DNA 결합체)와 DNA-DNA 결합시켜 항체와 나노입자의 결합체(항체-DNA-나노입자 결합체)를 제조한다.
상기 항체와 DNA 단편의 결합체(항체-DNA 결합체)와 항체와 나노입자의 결합체(항체-DNA-나노입자 결합체)는 하나의 표적물질의 서로 다른 부위에 특이적으로 반응하여 작용할 수 있다. 상기 항체-DNA 결합체와 항체-DNA-나노입자 결합체에서 각 항체는 표적 물질에 특이적인 항체이고, 상기 항체-DNA 결합체와 항체-DNA-나노입자 결합체에 포함된 각 DNA 단편은 서로 다른 특이적인 염기서열을 포함하여, 항체-DNA 결합체와 항체-DNA-나노입자 결합체를 쌍으로 하여 표적물질을 선별적으로 반응하여 검출할 수 있다.
도 9a를 참조하면, 항체-DNA 결합체와 항체-나노입자 결합체를 쌍으로 하여 (2차)컨쥬게이트로 사용하여 표적물질을 검출할 수 있다. 이 때, 나노입자는 형광물질을 포함하여 신호를 발생할 수 있고, 나노입자에는 15,000 ~ 40,000 개의 DNA 단편이 결합할 수 있으므로, 형광 신호가 증폭될 수 있다.
상기 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트는 항체와 나노입자의 결합체(제1결합체); 및 항체와 나노입자의 결합체(제2결합체); 를 포함할 수 있다.
상기 제1결합체와 제2결합체는 하나의 표적물질의 서로 다른 부위에 특이적으로 반응하여 작용할 수 있다.
또한, 상기 제1결합체 및 제2결합체와 같이 쌍(pair)으로 이루어진 컨쥬게이트가 하나 이상으로 포함될 수 있다.
도 6을 참조하면, 서로 다른 특이적인 염기서열을 포함하는 나노입자 컨쥬게이트가 하나 이상의 쌍으로 포함되고, 각 쌍의 나노입자 컨쥬게이트는 사용되는 항체와 반응하는 표적물질을 선별적으로 반응하여 검출할 수 있다.
항체와 나노입자의 결합체는 항체에 부착된 DNA 단편과 나노입자에 부착된 DNA 단편 간의 상보적인 결합으로 형성될 수 있다. 따라서, 항체와 나노입자의 결합체는 도 4와 같이 항체-DNA-나노입자 결합체의 형태일 수 있다.
상기 제1결합체와 제2결합체는 서로 상이한 DNA 단편을 포함할 수 있다. 제1결합체와 제2결합체의 DNA 단편은 서로 상이하여, 캡쳐항체에 부착된 결합체가 DNA 프로브가 고정된 고체기질에 결합하는 것이 바람직하다.
상기 제1결합체와 제2결합체 중 어느 하나 또는 둘에 포함된 나노입자는 형광물질을 함유할 수 있다.
도 5를 참조하면, DNA 단편 간의 결합으로 연결된 항체-나노입자 결합체(항체-DNA-나노입자 결합체)를 한 쌍(제1결합체와 제2결합체)으로 하여 고감도의 컨쥬게이트로 사용할 수 있다. 한 쌍의 항체-나노입자 결합체 중 하나의 나노입자는 형광물질(제1결합체와 제2결합체 중 어느 하나)을 함유할 수 있다. 또한, 한 쌍의 항체-나노입자 결합체(제1결합체 및 제2결합체)에 포함된 두 개의 나노입자 모두가 형광물질을 함유할 수도 있다.
도 10a를 참조하면, 항체-나노입자 결합체(항체-DNA-나노입자 결합체)를 쌍으로 하여 (3차)컨쥬게이트로 사용하여 표적물질을 검출할 수 있다. 이 때, 감지항체(detection antibody)에 부착된 나노입자는 형광물질을 포함하여 신호를 발생할 수 있고, 한 쌍의 나노입자 각각에는 15,000 ~ 40,000 개의 DNA 단편이 결합할 수 있으므로, 신호가 증폭될 수 있다. 이 경우, 15,000 ~ 40,000 개의 DNA 단편이 결합할 수 있는 나노입자가 두 개이므로, 상기 (2차)컨쥬게이트에 비해 신호가 더욱 크게 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (1차) 컨쥬게이트(도 8a)는 종래 ELISA에 비해 검출민감도가 10배 이상 증가하고, (2차) 컨쥬게이트(도 9a)는 종래 ELISA에 비해 검출민감도가 60배 이상 증가하며, (3차) 컨쥬게이트(도 10a)는 종래 ELISA에 비해 검출민감도가 100배 이상 증가한다.
본 발명에 따른 체외 진단키트는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 장치와 물질을 더 포함할 수 있다. 또한, 형광면역분석법을 이용한 측방유동방식(lateral flow)이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 체외 진단키트의 일 예로써, 도 5를 참조하면, 적어도 2개 이상의 검출라인(Test Line)을 포함하는 진단 스트립 및 진단 스트립을 수용하는 진단 키트 몸체를 포함하며, 상기 진단 스트립은, 표적물질을 포함한 검체가 주입되는 샘플 패드, 상기 샘플 패드에 연결되는 형태로 제1고감도 면역접합체가 특이적으로 결합하는 제1프로브 유전자가 고정된 제1검출라인 및 제2고감도 면역접합체가 특이적으로 결합하는 제2프로브 유전자가 고정된 제2검출라인을 포함하고, 제2검출라인은 상기 제1검출라인으로부터 이격된 위치에 고정된 유리섬유 검출막을 포함한다.
여기서, 상기 유리섬유 검출막에는 상기 샘플패드 측을 기준으로 상기 제1검출 라인, 상기 제2검출라인이 순차적으로 형성한다.
그리고 상기 진단 스트립은, 상기 검출막에 순차적으로 연결되는 형태로 상기 지지체 부에 부착되며, 상기 검출막을 거친 잔존 검체가 흡수되는 흡수 패드를 더 포함할 수 있다.
다양한 표적물질에 적용 가능한 광범위 체외 진단 키트 내 진단 스트립에 검체 내 동일 표적물질과 특이적으로 결합하는 2개 이상의 검출라인(DNA 프로브)을 마련하여 저농도 검체를 이용해 체외 진단을 수행하더라도 검체 내 표적물질의 정량화가 높은 신뢰도를 갖추어 수행될 수 있다.
체외 진단 키트 내 진단 스트립에 검체 내 동일 표적물질과 특이적으로 결합하는 2개 이상의 검출 라인을 마련하여 정확한 정량화가 가능한 검체의 농도 범위를 저농도에서 고농도까지 광범위하게 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 체외 진단키트는 임신 진단, 심혈관 질환 진단, 염증 진단, 암 진단 등과 같은 다양한 진단에 광범위하게 적용될 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
하기 제조예, 비교예, 실시예 및 도면에서 '1차 컨쥬게이트'는 항체-DNA 결합체와 항체-형광 결합체의 조합을 의미하고, '2차 컨쥬게이트'는 항체-DNA 결합체와 항체-DNA-나노입자 결합체의 조합을 의미하고, '3차 컨쥬게이트'는 항체-DNA-나노입자 결합체와 항체-DNA-나노입자 결합체의 조합을 의미한다.
<재료>
이하 제조예 및 실시예의 컨쥬게이트에 사용된 재료와 DNA 서열을 표 1과 표 2로 나타내었다.
Figure 112021100459613-pat00006
Figure 112021100459613-pat00007
<제조예 1> 항체-DNA 결합체
항체-DNA 결합체는, 아래와 같이 (1단계) NH2-DNA에서 SMCC-DNA을 제조, (2단계) 항체에 -SH 작용기의 도입, (3단계) SMCC-DNA와 항체-SH의 반응으로 항체-DNA 결합체를 형성시켜 제조한다. 제1항체-DNA 결합체와 제2항체-DNA 결합체는 DNA 단편(표 2 참조)이 서로 상이한 것을 제외하고는 아래와 같이 동일하게 제조하였다.
<제조예 1.1> SMCC-DNA 제조
Figure 112021100459613-pat00008
NH2-DNA 100ul(35 nmol)와 sulfo-SMCC (10mg/ml) 10ul를 1.5ml tube 에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 Sephadex LH20 column 정제를 통하여 반응하지 않고 남은 sulfo-SMCC 를 제거하고 SMCC-DNA 만 얻어낸 후 농도를 확인하였다.
<제조예 1.2> 항체-SH 제조
Figure 112021100459613-pat00009
항체 100 ul (0.5mg) 와 2-iminothiolane powder 1 mg 을 tube에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 후 Sephadex LH20 column으로 항체-SH 와 반응 후 남은 iminothiolane 을 분리하고, Column을 통하여 얻어진 항체-SH 의 농도를 확인하였다.
<제조예 1.3> 항체-DNA 결합체 제조
Figure 112021100459613-pat00010
제조예 1.1 에서 준비한 SMCC-DNA단편을 투입한 tube 에 1 X PBS 100 ul 를 넣고 vortex 혼합 후 제조예 1.2에서 준비한 항체-SH 를 1:1 비율로 넣어주었다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, Sephadex LH20 column으로 정제하여 항체-DNA 결합체를 수득하였다.
<제조예 2> 항체-DNA-나노입자 결합체
항체-DNA-나노입자 결합체는, 아래와 같이 (1단계) 나노입자-DNA 결합체를 제조하고, (2단계) 나노입자-DNA 결합체에 제조예 1에서 제조된 항체-DNA 결합체를 반응시켜 제조하였다.
<제조예 2.1> 나노입자-DNA 결합체의 제조
Figure 112021100459613-pat00011
2% 나노입자 100 ul 와 NH2-DNA(20nmole, 50ul)를 tube 에 넣고 MES buffer 200ul 를 첨가하였다. EDC (200mg/ml) 50ul 를 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 13000rpm에서 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 나노입자-DNA 결합체를 pellet 형태로 수득하였다.
<제조예 2.2> 항체-DNA-나노입자 결합체의 제조
Figure 112021100459613-pat00012
제조예 2.1의 나노입자-DNA결합체를 1XPBS 1ml에 분산시키고 vortex 한 후, 제조예 1에서 제조된 항체-DNA 결합체(항체-DNA 결합체와 나노입자-DNA 결합체의 DNA 단편은 상보적 서열을 가짐)를 투입하고, 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
<제조예 2.3> 항체-DNA-형광나노입자 결합체의 제조
나노입자로 형광 라텍스를 사용한 것과 DNA 단편의 서열(표 2)이 다른 것을 제외하고는 상기 제조예 2.1 내지 제조예 2.2와 동일하게 수행하였다.
<실시예 1> 1차 컨쥬게이트
제조예 1에서 제조된 항체-DNA 결합체와 도 3과 같이 제조된 항체-형광 결합체를 1:1로 혼합하여 사용하였다.
<실시예 2> 2차 컨쥬게이트
제조예 1에서 제조된 항체-DNA 결합체와 제조예 2.3에서 제조된 항체-DNA-형광나노입자 결합체를 1:1로 혼합하여 사용하였다.
<실시예 3> 3차 컨쥬게이트
제조예 2.2에서 제조된 항체-DNA-나노입자 결합체와 제조예 2.3에서 제조된 항체-DNA-형광나노입자 결합체를 1:1로 혼합하여 사용하였다.
<비교예 1> ELISA(효소면역측정법)에 의한 troponin T 검출
항체-효소 컨쥬게이트를 이용한 ELISA (효소면역측정법)방법으로 혈액 샘플 내 Troponin T를 검출하였다. 도 7a에 나타낸 ELISA 방법과 같이 수행하였다.
Troponin T 캡쳐항체(capture antibody) 코팅
1) Troponin T 캡쳐항체(capture antibody)를 carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6)를 이용하여(1-10 μg/mL) 농도로 준비한 뒤 PVC microtiter plate 에 분주하였다. 2) Plate 덮개를 덮고 4 ℃에서 12시간 동안 배양하였다. 3) 코팅 용액을 제거하고 200 μL PBS 로 2회 세척하였다. 4) Plate를 털어내어 남은 세척용액을 제거하였다. 5) 남아있는 용액은 paper towel 로 주의하여 제거하였다.
블로킹 및 샘플 주입
1) 남아있는 protein-binding sites를 블로킹하기 위해 코팅된 well plate 에 200 μL 블로킹 버퍼(5% non-fat dry milk/PBS)를 각각의 well에 넣어주었다. 2) 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 3) 시료샘플 #1 ~ #7 번까지 100 μL 씩을 well plate 에 넣고 standards curve 를 위한 샘플 100 μL 씩 well plate 넣었다. 4) 37 ℃에서 90min 동안 인큐베이션 하였다(미지 시료는 항상 standard curve와 비교한다). 5) 샘플을 제거하고 200 μL PBS 로 3회 세척하였다.
이차항체 및 검출을 위한 인큐베이션
1) 희석된 이차항체 100 μL 씩 각각의 well 에 넣었다. 2) 이차항체가 표적단백질에 대해 캡쳐항체와 다른 부위에 결합하는지 확인하였다. 3) Plate 덮개를 덮고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 4) PBS 로 4회 세척과정을 실시하였다. 5) 브로킹 버퍼로 희석한 검출항체 100 μL 씩 well 에 넣었다. 6) Plate 덮개를 덮고 상온에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 7) PBS 로 4회 세척과정을 실시하였다.
검출
검출용 효소로 Horse radish peroxidase (HRP)을 사용하여, 검출항체-HRP 면역결합체의 흡광도를 측정하였다. 각 웰에 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액을 200ul 씩 넣고 상온에서 30분간 배양한 뒤 정지 용액(2M H2SO4) 200ul 을 넣고 450nm의 흡광도를 측정하였다.
도 7b는 상기 ELISA 방법으로 사람 혈액 샘플 내의 cardiac Troponin T 를 검출한 결과이다. 이를 참조하면, 측정된 cardiac troponin T 농도는 고농도 영역인 10ng/ml (10,000pg/ml) 이상부터 1000ng/ml 수준의 검출 범위로 나타냄을 알 수 있다.
<실험예 1> 1차 컨쥬게이트를 이용한 troponin T 검출
실시예 1에서 제조된 1차 컨쥬게이트를 이용하여 도 8a과 같이 검출방법으로 troponin T 검출하였다. 1) 혈액 plasma 샘플 #1~#7 까지 각각 10 ul를 microtube에 넣었다. 2) 1차 컨쥬게이트 용액 100 ul 를 넣고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 3) R buffer 60ul 를 넣고 측방유동 방식의 membrane strip 에 170ul 를 10분 동안 전개시켰다. 4) 세척용액 170 ul 를 넣고 10분 동안 세척하였다. 5) Membrane strip 전용 스캐너 (BMT 1D scanner)에서 스캔하여 검출하였다.
도 8b는 상기 1차 컨쥬게이트를 이용한 측방유동방식의 면역형광분석으로 사람 혈액 샘플 내의 cardiac Troponin T 를 검출한 결과이다. 이를 참조하면, 측정된 cardiac troponin T 농도는 고농도 영역인 90 pg/ml 부터 2400 pg/ml 검출 범위로 나타나내고 있으며 기존 항체-효소 결합체 방식의 ELISA 에 비하여 LOD 가 10배 이상 증가함을 확인하였다.
<실험예 2> 2차 컨쥬게이트를 이용한 troponin T 검출
실시예 2에서 준비된 2차 컨쥬게이트를 이용하여 도 9a과 같이 검출방법으로 troponin T 검출하였다.
1) 혈액 plasma 샘플 #1~#7 까지 각각 10 ul를 microtube에 넣었다. 2) 2차 컨쥬게이트 용액 100 ul 를 넣고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 3) R buffer 60ul 를 넣고 측방유동 방식의 membrane strip 에 170 ul를 10분 동안 전개시켰다. 3) 세척용액 170 ul를 넣고 10분 동안 세척하였다. 4) Membrane strip 전용 스캐너 (BMT 1D scanner)에서 스캔하여 검출하였다.
도 9b는 상기 2차 컨쥬게이트를 이용한 측방유동방식의 면역형광분석으로 사람 혈액 샘플 내의 cardiac Troponin T 를 검출한 결과이다. 이를 참조하면, 측정된 cardiac troponin T 농도는 저농도 영역인 1.487 pg/ml 부터 86.145 pg/ml 검출 범위로 나타내고 있으며 기존 항체-효소 결합체 방식의 ELISA 에 비하여 검출 LOD 가 60 배 이상 증가함을 확인하였다.
<실험예 3> 3차 컨쥬게이트를 이용한 troponin T 검출
실시예 3에서 준비된 3차 컨쥬게이트를 이용하여 도 10a과 같이 검출방법으로 troponin T 검출하였다. 1) 혈액 plasma 샘플 #1~#7 까지 각각 10 ul를 microtube에 넣었다. 2) 2차 컨쥬게이트 용액 100 ul 를 넣고 상온에서 10분 동안 배양하였다. 3) R buffer 60ul 를 넣고 측방유동 방식의 membrane strip 에 170 ul를 10분 동안 전개시켰다. 3) 세척용액 170 ul를 넣고 10분 동안 세척하였다. 4) Membrane strip 전용 스캐너 (BMT 1D scanner)에서 스캔하여 검출하였다.
도 10b는 상기 3차 컨쥬게이트를 이용한 측방유동방식의 면역형광분석으로 사람 혈액 샘플 내의 cardiac Troponin T 를 검출한 결과이다. 이를 참조하면, 측정된 cardiac troponin T 농도는 저농도 영역인 1.2 pg/ml 부터 80 pg/ml 검출 범위로 나타나내고 있으며 기존 항체-효소 결합체 방식의 ELISA 에 비하여 검출 LOD 가 100배 이상 증가함을 확인하였다.
지금까지 본 발명에 따른 9G 기술 및 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트를 이용한 체외진단 키트에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<서열목록의 설명>
서열번호 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1나노입자-DNA 결합체에 포함된 DNA 단편의 서열이다.
서열번호 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2나노입자-DNA 결합체에 포함된 DNA 단편의 서열이다.
서열번호 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1항체-DNA 결합체에 포함된 DNA 단편의 서열이다.
서열번호 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2항체-DNA 결합체에 포함된 DNA 단편의 서열이다.
<110> BioMetrix Technology INC <120> IN VITRO DIAGNOSTIC KIT USING 9G TECHNOLOGY AND CONJUGATES INCLUDING DNA FRAGMANT <130> LNP210156 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA fragment included in immunoconjugate for in vitro diagnosis <400> 1 tttatattta taccttgcga gcgcgg 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA fragment included in immunoconjugate for in vitro diagnosis <400> 2 tttatatttt ggccacactg tccatt 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA fragment included in immunoconjugate for in vitro diagnosis <400> 3 tttatatttc cgcgctcgca aggtat 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of DNA fragment included in immunoconjugate for in vitro diagnosis <400> 4 tttatattta atggacagtg tggcca 26

Claims (10)

  1. DNA 프로브가 고정된 고체기질; 및
    상기 DNA 프로브에 결합할 수 있는 DNA 단편을 포함한 컨쥬게이트; 를 포함하고,
    상기 컨쥬게이트는 항체와 나노입자의 결합체; 를 포함하며,
    상기 항체와 나노입자의 결합체는
    항체에 부착된 DNA 단편과 나노입자에 부착된 DNA 단편 간의 상보적인 결합으로 형성되는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고체기질에는
    화학식 1로 표시되는 아미노캘릭스아렌 유도체와 화학식 2로 표시되는 아미노캘릭스아렌 유도체 중 하나 이상이 이민결합을 통해 부착된 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트:
    [화학식 1]
    Figure 112021100459613-pat00013

    상기 식 중에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7, R'8은 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
    상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의되고,
    [화학식 2]
    Figure 112021100459613-pat00014

    상기 식 중에서, R1, R2, R3 및 R4 는 서로 독립적으로 -H, -CH3, -C2H5, -C3H7, -OCH3, -Cl, -C6H5, -OH, -OCH2CH3, -Br, -CF3, -OCH2C6H5, -OC6H5, -OC6H4CH3, -OC6H4C(CH3)3, -OC6H4CF3, -OC6H4Cl, -OCOCH3, -NHCOCH3, -CONHCH3, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH3 또는 -C2H5 를 나타내고,
    상기 Y1, Y2, Y3 및 Y4 는 서로 독립적으로 -H, -(CH2)n-CH=O, -(CH2)n-SH, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH=O, -(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH, -(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z, 및 -CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z 로 이루어진 군에서 선택되고, n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z 는 -SH, -CHO, -COOH 및 -NH2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기, 그리고 -C6H4- 와 -C6H5 는 페닐기로 정의된다.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 DNA 프로브는 연속적인 구아닌(guanine) 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는
    항체와 DNA 단편의 결합체; 및
    항체와 나노입자의 결합체; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는
    항체와 나노입자의 결합체(제1결합체); 및
    항체와 나노입자의 결합체(제2결합체); 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
  8. 삭제
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 나노입자는 형광물질을 함유하는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 제1결합체와 제2결합체 중 어느 하나 또는 둘에 포함된 나노입자는
    형광물질을 함유하는 것을 특징으로 하는,
    체외진단 키트.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
KR20140094035A (ko) * 2012-12-12 2014-07-30 고려대학교 산학협력단 Ｄｎａ 라벨 형광 자성 코어/쉘 나노입자를 이용하는 바이오액티브 물질의 검출방법
KR20150111015A (ko) * 2014-03-24 2015-10-05 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩
KR102046556B1 (ko) 2017-11-20 2019-11-19 주식회사 제트바이오텍 고농도 검체 내 표적물질 정량화가 가능한 광범위 체외 진단 키트

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
KR20140094035A (ko) * 2012-12-12 2014-07-30 고려대학교 산학협력단 Ｄｎａ 라벨 형광 자성 코어/쉘 나노입자를 이용하는 바이오액티브 물질의 검출방법
KR20150111015A (ko) * 2014-03-24 2015-10-05 (주)바이오메트릭스 테크놀로지 심질환 바이오마커의 표준농도-감도 테이블에 의한 심질환의 진행상태 및 치료상태를 모니터링하는 방법 및 이를 위한 바이오칩
KR102046556B1 (ko) 2017-11-20 2019-11-19 주식회사 제트바이오텍 고농도 검체 내 표적물질 정량화가 가능한 광범위 체외 진단 키트

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