KR20200095144A

KR20200095144A - 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법

Info

Publication number: KR20200095144A
Application number: KR1020190012873A
Authority: KR
Inventors: 박승경; 파한; 지샨
Original assignee: 한국기술교육대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2020-08-10
Also published as: KR102200143B1

Abstract

초기 증폭 단백질 바이오마커를 검출할 수 있도록 신호 증폭에 의한 비색 분석의 민감도와 신속성을 높이기 위해 디자인된 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법이 개시된다. 표적단백질 검출용 바이오프로브는, 금나노입자; 상기 금나노입자에 결합되고, 단백질 또는 금속 이온에 높은 친화성을 갖는 항체; 및 상기 금나노입자에 결합되고, 광학 리포터로 태그된 표지된 니켈에 대해 높은 친화성을 갖는 6X히스택을 포함한다. 디자인된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 물만 사용하는 환경 친화적 절차를 통해 합성되므로 친환경성을 가지고 있다. 또한 6X히스택 나노입자 프로브는 간단한 검출(3단계)로 설계되었으므로 간단성을 가지고 있다. 또한 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 2시간 이내에 제조되므로 신속성을 가지고 있다. 또한 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브의 민감도는 27.7pg/ml의 LOD를 요구하는 CRP 단백질 검출에서 입증되어 민감성을 가지고 있다.

Description

표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법{BIO-PROBE FOR DETECTING TARGET PROTEIN, MANUFACTURING METHOD THEREOF, ANALYZING APPARATUS HAVING THE SAME AND ANALYZING METHOD THEREOF}

본 발명은 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신호 증폭에 의한 비색 분석(colorimetric assay)의 민감도와 신속성을 높이기 위해 디자인된 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법에 관한 것이다.

바이오마커(biomarker)는 생물학적 또는 의학적 검체내에 존재하는 일종의 생체분자로서, 이들의 구조나 농도의 변화를 정성적 및/또는 정량적으로 탐지함으로써 질병의 상태를 진단하고, 약물의 치료효과 및 다른 질병과의 연관성을 종합적으로 판단하게 해주는 표식자 역할을 수행한다. 질병의 조기진단을 위해서는 발병 초기단계에서 나타나는 바이오마커를 정량적으로 분석하는 기술이 필수적이다. 이는, 질병의 모니터링을 위해 현재 사용되는 기술은 민감도, 검역속도, 및 비용 등의 한계성 때문에 질병의 조기진단에 대한 기술적 요구에 적절히 대응하지 못하고 있기 때문이다.

바이오마커를 정량적으로 분석하기 위해서, 효소면역항체법(ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)법, 웨스턴 블랏팅법 및 질량분석기(Mass spectrometry)를 이용한 방법이 보편적으로 사용된다. ELISA는 단백질 검출을 위한 표준 방법이다. C-반응성 단백질(CRP)은 또한 ELISA에 의해 검출된다. C 반응성 단백(CRP)은 5개의 원형 서브 구조가 집합하여 이루어진 단백질이다. 혈청 내에 존재하고 간에서 생성되며, 감염이나 염증성 반응에서 혈액 내 증가를 관찰할 수 있고, 특히, 심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)에서 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다

ELISA는 10 단계 이상의 여러 단계가 필요하므로 탐지 시간은 3 내지 6 시간까지 소요된다. ELISA는 2-3세트의 항체가 필요하므로 비용이 많이 든다. CRP ELISA의 검출한계(limited of detection, 이하, LOD)는 200pg/ml이다.

100~200pg/ml 범위의 LOD를 갖는 증폭된 신호로 단백질 검출을 위해 자기 나노입자, 양자점, 탄소 도트 기반 프로브가 도입되었으나, 시간이 오래 걸리고(12-24Hrs), 고온(180-300oC)이 요구되며, 독성 시약이다.

단백질을 검출하는 다른 기술에는 매트릭스 레이저이온화 비행시간차 질량분석(Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF), 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 등이 있다. 이러한 기술의 감도는 200pg/ml이다. 하지만, 이러한 검출 기술을 채용하는 검출기기는 값이 비싸고 무거우며, 숙련된 인원 및 시간(8-24 시간)이 많이 걸리는 프로토콜을 필요로 한다.

특히, 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography; HPLC)가 있다. 이 방법은 감도가 높지만 추출, 카트리지, 면역친화성 칼럼 등의 세척, 분석 등의 프로세스를 거쳐야 하므로 그 검출과정이 복잡하여 전문가가 필요하고 분석에 장시간이 소요될 뿐만 아니라 비용이 높다는 단점이 있다.

대한민국 등록특허 제10-1088885호 대한민국 공개특허 제10-2017-0017266호 대한민국 등록특허 제10-1612094호 대한민국 등록특허 제10-1928620호

이에 본 발명의 기술적 과제는 이러한 점에 착안한 것으로, 본 발명의 목적은 초기 증폭 단백질 바이오마커를 검출할 수 있도록 신호 증폭에 의한 비색 분석의 민감도와 신속성을 높이기 위해 디자인된 표적단백질 검출용 바이오프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 표적단백질 검출용 바이오프로브를 이용한 분석장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 표적단백질 검출용 바이오프로브를 이용한 분석방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 실현하기 위하여 일실시예에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브는, 금나노입자; 상기 금나노입자에 결합되고, 단백질 또는 금속 이온에 높은 친화성을 갖는 항체(antibody); 및 상기 금나노입자에 결합되고, 광학 리포터로 태그된 표지된 니켈에 대해 높은 친화성을 갖는 6X히스택를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 금나노입자의 평균 직경은 대략 15nm일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 금나노입자는 구연산염(citrate)으로 덮힐 수 있다.

일 실시예에서, 상기 항체는 단일클론항체를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 전체 신호 강도를 증가시키기 위해 단일 나노입자의 표면상에 복수의 6X히스택들이 결합될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)일 수 있다.

상기한 본 발명의 다른 목적을 실현하기 위하여 일실시예에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법은, (i) CRP-항체-금나노입자 접합체를 생성하는 단계; 및 (ii) 상기 CRP 단일클론항체-금나노입자 접합체에 6X히스택을 로딩하여 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 획득하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 단계(i)는, (i-1) 안티 CRP 단일클론항체(Anti-CRP mAb)와 금나노입자 용액(AuNP)의 혼합 용액을 교반하는 단계; (i-2) 단계(i-1)에서 획득된 결과물을 원심 분리하는 단계; 및 (i-3) 단계(i-2)에서 획득된 결과물에서 상층액을 제거하여 CRP-항체-금나노입자 접합체를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 안티 CRP 단일클론항체와 상기 금나노입자 용액은 농도는 10 : 1의 비율로 혼합될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 안티 CRP 단일클론항체의 농도는 30nM이고, 상기 금나노입자 용액의 농도는 3nM일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 혼합 용액은 실온에서 500rpm으로 20분 동안 교반될 수 있다.

일 실시예에서, 단계(i-2)의 원심 분리는 25분 동안 10,000rpm에서 이루어질 수 있다.

일 실시예에서, 단계(ii)는, (ii-1) 6X히스택을 첨가하는 단계; (ii-2) 단계(ii-1)에서 획득된 혼합물을 교반하는 단계; (ii-3) 단계(ii-2)에서 획득된 결과물을 원심 분리하는 단계; 및 (ii-4) 단계(ii-3)에서 획득된 결과물에서 상층액을 제거하여 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 단계(ii-1)에서 첨가되는 6X히스택의 농도는 대략 150nM일 수 있다.

일 실시예에서, 단계(ii-2)의 교반은 대략 180rpm에서 대략 15분간 이루어질 수 있다.

일 실시예에서, 단계(ii-3)의 원심 분리는 대략 4℃에서 20분 내지 25분 동안 대략 10,000rpm으로 이루어질 수 있다.

이러한 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법에 의하면, 디자인된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 물만 사용하는 환경 친화적 절차를 통해 합성되므로 친환경성을 가지고 있다. 또한 6X히스택 나노입자 프로브는 간단한 검출(3단계)로 설계되었으므로 간단성을 가지고 있다. 또한 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 2시간 이내에 제조되므로 신속성을 가지고 있다. 또한 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브의 민감도는 27.7pg/ml의 LOD(limited of detection)를 요구하는 CRP 단백질 검출에서 입증되어 민감성을 가지고 있다.

도 1는 본 발명의 일실시예에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브의 합성 가정을 개략적으로 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브 기반 CRP 검출을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 C-반응성 단백질(CRP) 검출 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 5은 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 C-반응성 단백질(CRP)의 검출 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 6a는 본 발명에 따라 C-반응성 단백질(CRP)의 검출을 설명하기 위한 표이고, 도 6b는 도 6a의 표를 CRP 농도 대 흡광도로 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

도 1는 본 발명의 일실시예에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법을 설명하기 위한 흐름도이다. 도 2는 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브의 합성 가정을 개략적으로 설명하기 위한 도면이다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 대략 30nM의 안티 CRP 단일클론항체(Anti-CRP mAb)와 대략 3nM의 금나노입자 용액(AuNP)을 혼합하여 혼합 용액을 형성한다(단계 S110). 여기서, 금나노입자는 구연산염(citrate)으로 덮히고 15nm의 평균 직경을 갖는다. 금나노입자는 Turkevich 방법을 통해 합성되었다.

이어, 안티 CRP 단일클론항체(Anti-CRP mAb)와 금나노입자 용액(AuNP)의 혼합 용액을 실온에서 대략 500rpm으로 대략 20분 동안 교반 처리한다(단계 S120).

이어, 10,000rpm에서 대략 25분 동안 원심 분리 처리한다(단계 S130).

이어, 물에 뜨는 상청액(supernatant)을 제거한다(단계 S140). 이때 팔레트는 물에 녹았다.

CRP 단일클론항체-금나노입자에 6X히스택을 로딩하는 것은 다음 과정에 의해 이루어진다.

대략 150nM의 6X히스택을 상기 금나노입자 용액에 첨가한다(단계 S150). 6X히스택(His-tag)(또는 폴리히스티딘택(polyhistidine-tag)은 단백질 내 최소 6개 이상의 히스티딘(Histidine, His) 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프로 보통 단백질의 N말단이나 C말단에 있다. 이는 또한 헥사히스티딘택(Hexa histidine-tag), 히스택(His-tag), 히스6 택(His6 tag) 등으로도 알려져 있다. 6X히스택은 단백질을 검출하는데 사용할 수 있다. 이는 항-히스택 항체를 이용하거나 혹은 그 대신에 금속 이온을 가진 형광 프로브를 이용해 겔 염색(SDS-PAGE)을 통해서도 가능하다. 이런 것은 세포 이하 단위에서 위치 측정, ELISA, 웨스턴 블럿 또는 면역학적 분석방법들에서 유용하게 쓰일 수 있다. 6X히스택은 특정 표면에 있는 단백질을 부동화시키는데 성공적으로 이용할 수 있다. 이런 표면으로는 니켈이나 코발트로 코팅된 미량 정량판(microtiter plate)이나 단백질 어레이(protein array) 등이 있다.

단계 S150에 의한 혼합물을 대략 180rpm에서 대략 15분간 약하게 교반 처리한다(단계 S160).

이어, 10,000rpm으로 대략 4℃에서 대략 20분간 원심 분리 처리한다(단계 S170).

이어, 물에 뜨는 상청액을 제거한다(단계 S180). 이때 팔레트는 물에 녹았다.

이어, 기능화된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 획득하여 대략 4℃에서 보관한다(단계 S190).

도 3은 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브 기반 CRP 검출을 설명하기 위한 도면이다.

도 3을 참조하면, CRP를 기질(substrate)에 코팅하여 CRP가 코팅된 기질을 준비한다. 준비된 CRP가 코팅된 기질에 도 1 및 도 2에서 설명된 제조 방법으로 제조된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 주입하여, 6X히스택-금나노입자-안티 CRP-CRP 복합체를 구성한다.

이어, 식물성 단백질인 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP)를 투여하여 6X히스택-금나노입자-니켈-HRP 프로브-CRP-안티 CRP 복합체를 구성한다.

이어, 기질로서 형광 물질을 투여하면 6X히스택-금나노입자-프로브-CRP-안티 CRP 복합체는 노란색으로 발광한다.

도 4는 본 발명에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 C-반응성 단백질(CRP) 검출 과정을 설명하기 위한 도면이다.

도 4를 참조하면, 합성하여 보관중인 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 CRP가 코팅된 플레이트에 투여한다. 상기 CRP 코팅된 웰 플레이트에는 매트릭스 타입으로 구분된 복수의 웰들이 형성되고, 상기 웰들 각각에 CRP들이 코팅되어 있다.

이어, 발색 시험을 위한 트리메틸보론(Tri methyl boron, TMB) 기질(substrate)을 투여한다. MB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 일반적으로 HRP를 사용한 과산화수소 가수분해를 통해 생성된 산소 유리기의 결과로서 산화되면 청색을 나타내는 발색체이다. TMB는 HRP을 검출하는 데 가장 많이 사용되는 발색(chromagenic) 기질로 다양한 형태로 출시된다. TMB 기질 용액은 HRP 활성을 빠르게 감지하여 황산 또는 인산 정지액(stop solution)을 첨가하면 황색(최대파장이 450nm)으로 변하는 청색(최대 파장이 370nm 또는 652nm)을 생성한다. 반응은 HRP-결합에 첨가한 후 일반적으로 5분에서 30 분 사이에 완료된다.

이어, 정지액(stop solution)을 첨가한 후, 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 통해 반응 결과값을 읽고 그래프 분석(Graphical anaylsis)을 수행한다.

도 5은 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 C-반응성 단백질(CRP)의 검출 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.

도 5을 참조하면, 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate)(NaHCO3)과 같은 코팅 버퍼(즉, 완충용액)를 웰플레이트 상에 배열된 CRP에 코팅한다(단계 S210).

이어, 하룻밤 배양한다(단계 S212).

이어, 3%의 농도를 갖는 200ul의 BSA(Bovine Serum Albumin)로 웰플레이트를 블로킹한다(단계 S214).

이어, 2%의 농도를 갖는 250ul의 PBST(phosphate buffered saline solution containing 0.05% Tween™ 20) 용액으로 웰플레이트를 세정한다(단계 S216). 여기서, 세정은 6회 정도 수행될 수 있다.

이어, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브 100ul를 웰프레이트의 웰들에 분배한다(단계 S218).

이어, 실온에서 대략 90분 동안 배양한다(단계 S220).

이어, 0.2%의 농도를 갖는 200ul의 PBST로 웰플레이트를 세정한다(단계 S222). 여기서, 세정은 6회 정도 수행될 수 있다.

이어, 1ug/ml의 농도를 갖는 100 ul의 6X히스택-니켈-HRP 처리한다(단계 S224).

이어, 대략 15분 동안 암실에서 웰플레이트를 배양한다(단계 S226).

이어, 0.2%의 농도를 갖는 200ul의 PBST로 웰플레이트를 세정한다(단계 S228). 여기서, 세정은 6회 정도 수행될 수 있다.

이어, 대략 10분 동안 TMB 기질을 처리한다(단계 S230).

이어, 정지액으로 0.2M의 HSO4를 첨가한다(단계 S232).

이어, 마이크로플레이트 판독기를 기준광 450nm에서 웰플레이트를 읽는다(단계 S234).

도 6a는 본 발명에 따라 C-반응성 단백질(CRP)의 검출을 설명하기 위한 표이고, 도 6b는 도 6a의 표를 CRP 농도 대 흡광도로 나타낸 그래프이다.

도 6a 및 도 6b를 참조하면, CRP 농도가 0pg/ml일 때, 기준광 450nm에 대한 흡광도는 0.0785로 측정되었다. CRP 농도가 50pg/ml일 때, 기준광 450nm에 대한 흡광도는 0.1026로 측정되었다. CRP 농도가 100pg/ml일 때, 기준광 450nm에 대한 흡광도는 0.1247로 측정되었다. CRP 농도가 500pg/ml일 때, 기준광 450nm에 대한 흡광도는 0.2408로 측정되었다. CRP 농도가 2000pg/ml일 때, 기준광 450nm에 대한 흡광도는 0.3201로 측정되었다.

이하, C-반응성 단백질 검출을 위한 상업용 ELISA 기반 분석방법과 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브 기반 면역 측정법과의 민감도 비교를 아래 표 1을 참조하여 설명한다.

[표 1]

표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 분석방법과 상업적 ELISA 분석방법을 비교하면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 이용한 분석방법은 포획 항체와 2차 항체를 사용하지 않고 직접적인 분석방법을 개발하여 전체 비용과 복잡성을 줄일 수 있다.

또한 C-반응성 단백질에 대한 비색 분석의 성능을 동일한 항체를 사용하는 상용 키트와 비교했을 때, 본 발명에 따른 분석 감도가 27.7pg/ml 이상임을 확인할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 6X히스택 금나노 프로브와 다른 나노입자 기반 프로브간의 비교를 아래 표 2를 참조하여 설명한다.

[표 2]

표 2를 참조하면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 비교적 낮은 온도에서 물을 사용하는 녹색 합성 절차를 통해 디자인되었다.

다른 나노 프로브 합성(즉, 자성 입자 기반 프로브, 양자점 기반 프로브, 탄소 도트 기반 프로브)에 비해 프로브의 디자인 절차가 2시간 이내로 빠르고, 단순하다.

최초의 동일한 나노입자 상용(34.29pg/ml)에 펩타이드(6X히스택)와 항체의 이중 접합을 확인한 결과, 본 발명에 따라 개발된 프로토콜은 신호 감도를 향상시킨다.

이하, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브와 다른 금나노입자의 비교를 아래 표 3을 참조하여 설명한다.

[표 3]

표 3을 참조하면, 다른 금나노입자 기반 기술에서 압타머(aptamer) 및 항체의 접합 시간은 12~16시간인 반면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브에서 6X히스택과 항체의 접합 시간은 2시간 이내이다. 여기서, 압타머는 시료 내의 검출하고자 하는 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적물질의 존재를 확인할 수 있다. 압타머의 제조는 일반적인 압타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적물질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있다.

또한 마이크로플레이트 판독기를 통한 용액 분석으로 얻은 LOD의 경우, 다른 금나노입자 기반 기술은 페이퍼 기질 기반 10pg/ml인 반면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 용액 기반 27.7pg/ml이다.

또한 다른 금나노입자 기반 기술은 다른 금나노 프로브 디자인에 적용되는 버퍼 기반이므로 녹색 결합 과정이 불가능한 반면, 본 발명에 따른 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 물을 기반으로 하므로 녹색 결합 과정이 가능하다. 따라서, 버퍼를 사용하지 않으므로 비용을 줄일 수 있고, 친환경적이라 할 수 있다.

이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면, 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 간단하고 빠른 합성 프로토콜로 성공적으로 디자인되었다. 본 발명에 따라 디자인된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브의 타당성은 CRP 단백질 검출에서 검증되었다.

본 발명에 따라 디자인된 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브는 다른 임상적으로 중요한 단백질 바이오마커 검출에 적용될 수 있다.

이상에서는 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

금나노입자;
상기 금나노입자에 결합되고, 단백질 또는 금속 이온에 높은 친화성을 갖는 항체(antibody); 및
상기 금나노입자에 결합되고, 광학 리포터로 태그된 표지된 니켈에 대해 높은 친화성을 갖는 6X히스택를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
제1항에 있어서, 상기 금나노입자의 평균 직경은 대략 15nm인 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
제1항에 있어서, 상기 금나노입자는 구연산염(citrate)으로 덮힌 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
제1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
제1항에 있어서, 전체 신호 강도를 증가시키기 위해 단일 금나노입자의 표면상에 복수의 6X히스택들이 결합된 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)인 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브.
(i) CRP-항체-금나노입자 접합체를 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 CRP 단일클론항체-금나노입자 접합체에 6X히스택을 로딩하여 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법.
제7항에 있어서, 단계(i)는,
(i-1) 안티 CRP 단일클론항체(Anti-CRP mAb)와 금나노입자 용액(AuNP)의 혼합 용액을 교반하는 단계;
(i-2) 단계(i-1)에서 획득된 결과물을 원심 분리하는 단계; 및
(i-3) 단계(i-2)에서 획득된 결과물에서 상층액을 제거하여 CRP-항체-금나노입자 접합체를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 안티 CRP 단일클론항체와 상기 금나노입자 용액은 농도는 10 : 1의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법.
제7항에 있어서, 단계(ii)는,
(ii-1) 6X히스택을 첨가하는 단계;
(ii-2) 단계(ii-1)에서 획득된 혼합물을 교반하는 단계;
(ii-3) 단계(ii-2)에서 획득된 결과물을 원심 분리하는 단계; 및
(ii-4) 단계(ii-3)에서 획득된 결과물에서 상층액을 제거하여 6X히스택-금나노입자-안티 CRP 프로브를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적단백질 검출용 바이오프로브의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브; 및
상기 표적단백질 검출용 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출할 수 있는 측정 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석장치.
(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 표적단백질 검출용 바이오프로브를 분석 대상 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계(a)을 거친 표적단백질 검출용 바이오프로브로부터 발산되는 신호를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.