KR101612094B1 - 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이의 이용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체(targeting antibody)을 포함하는 표적-특이적 프로브, 상기 표적-특이적 프로브와 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지방법 또는 탐지키트에 관한 것이다.

Description

표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이의 이용방법 {COMPOSITION FOR DETECTING BIOMARKER COMPRISING TARGET-SPECIFIC PROBE AND DETECTABLE LABELING AGENT-ANTIBODY COMPOSITE AND USING METHOD OF THE SAME}

본 발명은 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체(targeting antibody)을 포함하는 표적-특이적 프로브, 상기 표적-특이적 프로브와 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)에 결합된 탐지 항체(detecting antibody)를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는 바이오마커 탐지용 조성물 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지방법 또는 탐지키트에 관한 것이다.

바이오마커(biomarker)는 생물학적 또는 의학적 검체내에 존재하는 일종의 생체분자로서, 이들의 구조나 농도의 변화를 정성적 및/또는 정량적으로 탐지함으로써 질병의 상태를 진단하고, 약물의 치료효과 및 다른 질병과의 연관성을 종합적으로 판단하게 해주는 표식자 역할을 수행한다. 질병의 조기진단을 위해서는 발병 초기단계에서 나타나는 바이오마커를 정량적으로 분석하는 기술이 필수적이다. 이는, 질병의 모니터링을 위해 현재 사용되는 기술은 민감도, 검역속도, 및 비용 등의 한계성 때문에 질병의 조기진단에 대한 기술적 요구에 적절히 대응하지 못하고 있기 때문이다.

바이오마커를 정량적으로 분석하기 위해서, 효소면역항체법 (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)법, 및 웨스턴 블랏팅법 및 질량분석기(Mass spectrometry)를 이용한 방법이 보편적으로 사용된다. ELISA의 경우 검정시료에 존재하는 다당류 혹은 페놀화합물들에 의해 반응이 저해되거나 조직 내에 존재하는 박테리오파지의 농도가 낮아, 정확히 탐지하기 어렵다. 질량분석기를 이용한 방법은 민감도가 매우 좋아서 미량의 바이오마커 분석에 적용 가능하나 주로 크로마토그래피법과 연계되어 분석되는 실험방법으로 인하여 재현성 확보가 곤란하고, 기기오차로 인하여 분석 데이터의 편차가 심한 단점이 있다. 또한 이들 방법은 과도한 노동력과 많은 시간이 소요된다.

또한, 다양한 암 및 전염성 질환 등의 질병 진단을 위한 바이오마커의 검지가능 농도는 매우 불규칙하다. 현재 많이 사용되는 진단방법들은 바이오마커의 농도가 특정 임계값 이상이 되어야만 검출이 가능하고, 바이오마커가 검지될 수 있을 정도의 농도에서는 일반적으로 이미 질병이 심각하게 진전 또는 전파된 경우가 많기 때문에, 임계치 이하의 바이오마커 농도 즉, 조기에 질병 바이오마커를 검출하여 환자의 생존율을 높이고 전염성 질환의 전파를 예방할 수 있는 고감도의 검출기술이 필요하다.

저 농도의 바이오마커를 검출할 수 있는 시스템을 구축하기 위해서는 질환 특이적 마커 단백질을 효과적으로 검출할 수 있는 초고감도 검출 프로브의 개발과 미량의 바이오마커 검출을 통해 생성된 검출 신호를 증폭할 수 있는 기술개발이 필수적이다.

이와 관련된 선행 특허로, 페리틴의 표면에 항체의 Fab만을 여러 개 발현시켜 바이오마커를 검지할 수 있는 프로브(WO 2008-053229)기술은 바이오마커를 탐지해야 하는 다양한 조건에 맞게 페리틴 표면에 결합한 항체의 개수를 용이하게 조절할 수 없는 문제점이 있을 수 있으며, 자성 나노입자에 PEG를 이용하여 코팅한 프로브를 제조하여 이를 이용한 바이오마커의 검출(WO 2012-105794)기술이 있으나, PEG는 폴리에틸글리콜로 크기가 균일하게 형성되지 않아 정밀한 검출이 필요한 경우 문제가 있다.

본 발명의 목적은 페리틴 단백질, 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자, 및 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는, 표적-특이적 초상자성 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적-특이적 초상자성 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는, 바이오마커 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바이오마커를 함유하는 시료에, 상기 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계, 상기 혼합물에 자기장을 걸어 초상자성 프로브가 결합된 바이오마커를 수집하는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 상기 표지물질-항체 복합체의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는 표적-특이적 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 이용하는 경우, 분산용액에서 서로 뭉침현상 없이 목적하는 오직 바이오마커와만 결합하고, 결합된 나노프로브는 자력을 이용하여 완벽하게 분리함으로써 검출 효율을 극대화 할 수 있으며, 바이오마커의 절대 정량화가 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 페리틴 단백질, 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자, 및 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는, 표적-특이적 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 따른 표적-특이적 프로브는 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 항체를 고정화시켜 바이오마커를 표적하고 자력분리를 이용하여 쉽게 수집 및 분리할 수 있다. 또한, 잔류자화가 없는 초상자성 나노입자를 이용함으로써, 질환 바이오마커 검지 시, 나노프로브끼리 뭉치지 않고 오직 표적 바이오마커와만 결합되고, 자력분리를 이용하여 쉽게 수집할 수 있기 때문에 비 특이적인 반응을 줄이고, 검지효율을 극대화 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 페리틴 단백질과 상기 페리틴 단백질에 결합된 초상자성 나노입자와 상기 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체를 포함하는 표적-특이적 프로브를 제조하고 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 제조하여 바이오마커 탐지용 조성물을 제조하였다.상기 제조한 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 바이오마커의 농도별로 탐지 및 검출할 수 있음을 확인하였는데, 그 결과 바이오마커의 농도가 높아질수록 형광의 강도 또한 강해지는 것을 확인하였다(실시예 3). 또한, 바이오마커를 샌드위치로 표적화 한 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 자석을 이용하여 분리한 후, 자외선을 조사하여 형광의 강도를 측정하였다. 그 결과, 형광의 강도가 더욱 선명하게 구별되는 밴드형태로 나타나 바이오마커의 검출결과가 더욱 효과적임을 확인하였다(실시예 4).

본 명세서에서, 페리틴 단백질이라 함은 페리틴 단백질 자체, 페리틴의 중쇄, 페리틴의 경쇄, 이들의 동족체(analogue), 및 아포페리틴(apoferritin)를 포함한다. 페리틴(Ferritin) 은 세포외 기질 (extracellular matrix)에 광범위하게 존재하는 단백질 집합체로 24개의 단일 서브유닛으로 이루어져 있고, 외경이 12 nm, 내경이 8nm인 케이지 형태의 구조(cage-line nanostructure)을 형성한다. ferritin cage 는 약 8 nm 크기의 내부 빈 공간을 지니고 있으며, 내부에는 약 4500 개의 철 (Fe) 원자를 산화철 (ferric oxide) 상태로 담지하며, 이러한 철 원자를 대사과정 중에 공급하는 역할을 하고 있다.

본 명세서에서 용어 "초상자성 나노입자는"는 외부에서 자기장을 가하는 경우 강한 자성을 띄는 물질을 의미한다. 구체적으로 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 초상자성 나노입자는 평균 입경이 3 내지 100 nm일 수 있고, 4 내지 30 nm을 갖는 입자일 수 있다. 또한, 초상자성 나노입자는 평균자화력이 60 emu/g ~ 150 emu/g일 수 있고, 80 emu/g ~ 130 emu/g 일 수 있다.

초상자성 나노입자를 합성하는 방법은 플라스크안에 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 상온의 원료 용액을 190~195℃까지 가온 한 다음 입자가 핵이 생성되도록 30분 동안 유지한다. 상기 핵생성 단계에서 얻어진 원료 용액을 용매의 끓는점까지 가온한 다음 동일 온도에서 30 ~ 50분 유지시켜 입자를 성장시키는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 페리틴의 표면에 링커를 발현시켜 초상자성을 나타내는 다량의 자성 나노입자를 결합시킴으로써, 뭉침현상 없이 표면적을 극대화하여 극미량의 질환 바이오마커 검출을 용이하게 한다. 구체적으로 페리틴의 표면에 결합되는 초상자성 나노입자의 비는 몰비를 기준으로 페리틴 : 초상자성 나노입자 = 1:1 내지 1:6일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같이, 페리틴의 표면에 초상자성 나노입자를 다량 결합시켜 표면적을 극대화시킴으로써 표적하는 바이오마커와의 반응의 최대화를 추구할 수 있다.

상기 초상자성 나노입자는 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질을 포함하는 표면층을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 양친성 물질은 1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-hosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000), 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈쏠트(1,2-dioleoyl-snglycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)일 수 있으나, 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질로 초상자성 나노입자의 표면을 친수성으로 기능화할 수 있는 물질에 해당하면 제한없이 본 발명의 범위에 해당한다.

본 명세서에서, 표적화 항체는 탐지 또는 정량대상 바이오마커에 특이적인 표적화 능력을 갖는 항체로서, 구체적인 예를 들면 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 분자, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 탐지 또는 정량대상 바이오마커에 특이적인 표적화 능력을 갖는 앱타머, 앱타이드 또는 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자 사이에는 제1 링커를 추가로 포함할 수 있고, 상기 제1 링커는 상기 페리틴 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결되며 페리틴 단백질의 페리틴 구조 형성을 저해하지 않는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자는 직접 연결되거나, 30 개 이내의 아미노산을 포함하는, 바람직하게는 15 내지 25개 아미노산으로 구성된 링커를 사용하여 연결될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예에서, 상기 상기 페리틴 단백질과 제1 링커는 하나의 융합 단백질로 구성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 페리틴 단백질의 표면에 제1 링커를 발현시킨 것일 수 있다.

페리틴 단백질과 초상자성 나노입자를 결합시키는 방법은, i) 중쇄(heavy chain)와 경쇄(lightchain)로 구성된 24개의 동일한 단백질 서브유닛(subunit)의 페리틴 단백질 표면에 헥사히스티딘 시퀀스(Hexahistidine sequence)를 포함하는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 링커 단백질을 발현시키는 단계, ii) MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지질을 이용하여 초상자성 나노입자의 표면을 친수성으로 변환하여 기능화 시키는 단계, iii) 초상자성 나노입자의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스를 포함하는 링커 단백질을 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계를 포함하는 방법으로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에는 제2 링커를 추가로 포함하며, 상기 제2 링커는 상기 초상자성 나노입자의 표면 중 상기 페리틴 단백질과 연결되지 않은 부분에 결합된 것일 수 있다. 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체는 직접 연결되거나, 30 개 이내의 아미노산을 포함하는, 바람직하게는 15 내지 25개 아미노산으로 구성된 링커를 사용하여 연결될 수 있다.

상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체는 직접 결합되거나 제2 링커를 통하여 결합된 것일 수 있는데, 구체적으로, i) 친수성으로 변환 시킨 초상자성 나노입자 표면 중 페리틴과 결합되지 않은 부분에 제2 링커를 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 결합시키는 단계, ii) 표적화 항체를 페리틴의 표면에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 고정시켜서 표적화 항체의 Fab를 활성화 시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 "링커"란, 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자의 연결, 초상자성 나노입자와 표적화 항체의 연결 또는 하기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 연결에 사용되는 것으로, 예를 들어, 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 따른 표적-특이적 프로브의 구조는 페리틴 단백질을 심으로 초상자성 나노입자가 페리틴 단백질을 둘러쌓고 있고, 상기 초상자성 나노입자의 외부로 표적화 항체가 고정화되어 있을 수 있다. 이는 페리틴 단백질을 코어라고 할 때, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체를 표면으로 볼 수 있어, 코어-표면층 구조를 갖는다고 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 표적-특이적 프로브에서 페리틴 단백질, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체의 비율은 몰비를 기준으로 1: 1: 1 내지 1: 6: 6일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 일 구현예로, 본 발명의 표적-특이적 프로브 및 탐지 가능한 표지물질에 결합된 탐지 항체를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는, 바이오마커 탐지용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오마커 탐지용 조성물은 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자의 표면에 항체를 고정화시켜 바이오마커를 표적하고 자력분리를 이용하여 쉽게 수집 및 분리할 수 있다. 표지물질-항체 복합체를 이용함으로써, 양자점 및 형광을 이용하여 특이적인 항원을 샌드위치 방법으로 검출할 수 있다. 또한 표지물질-항체 복합체에 결합된 다량의 양자점을 통해서 증폭된 검지 신호를 얻을 수 있어 극미량의 바이오마커 검지시의 오차를 최소화 할 수 있으며, 농도에 따른 선형적인 검출신호를 통하여 질환 바이오마커를 절대 정량화 할 수 있다.

상기 표적-특이적 초상자성 프로브의 표적화 항체와 표지물질-항체 복합체의 탐지 항체는 동일하거나 상이할 수 있으며, 탐지대상 바이오마커에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로 표적화 항체와 탐지 항체는 단일클론 항체 또는 다클론항체(polyclonal antibody)일 수 있다. 일예로, 표적화 항체는 단일클론 항체이고 탐지 항체는 바이오 마커에 결합하는 부분이 표적화 항체와 다른 단일클론 항체를 사용하거나, 다클론항체일 수 있다.

상기 탐지 항체는 표적-특이적 프로브에 포함된 표적화 항체와 동일한 바이오마커의 상이한 부분을 표적화할 수 있다. 구체적으로 탐지 항체가 표적화 하는 바이오마커의 부분과 표적화 항체가 표적화 하는 바이오마커의 부분은 바이오마커와의 결합에 방해가 되지 않을 만큼 충분히 떨어져 있는 부분일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 사이에 제3 링커를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 상기 탐지 가능한 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자일 수 있다. 상기 표지물질은 그 자체로 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘에 결합시킬 수 있고 상기 링커에 대한 결합능을 높이고자 표지물질에 화학적 처리를 가한 후에 링커에 결합시킬 수도 있다. 구체적으로, 상기 양자점은 양친성 물질을 포함하는 물질을 이용하여 표면을 친수성으로 변화시킨 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

구체적으로 상기 양자점과 탐지 항체는 직접 결합되거나 제3 링커를 통하여 결합된 것일 수 있다. 예를 들어, ⅰ) MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 이용하여 양자점들의 표면을 친수성으로 변환시키는 단계, ii) 양자점의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스를 포함하는 제3 링커를 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계, 및 iii) 제3 링커 위에 탐지 항체를 고정시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다. 제3 링커에 의해 탐지 항체의 Fab가 항상 활성화될 수 있다.

상기 초상자성 나노입자 및 양자점의 표면은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 일정량의 MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA를 순서대로 나노입자와 같이 혼합하여 에멀젼 상태로 만들고, 초음파로 처리해서 나노입자 표면에 기능성 지질층을 형성할 수 있다. 이 경우, 소수결합에 의해 나노입자 표면에 지질의 소수성 부분이 결합되어 지질의 친수성 부분이 외측을 향한 채 나노입자 표면에 코팅되므로 나노입자 표면을 친수성으로 기능화 시킬 수 있다.

MHPC는 단일 아실(acyl)기 사슬 지질이므로, 초상자성 나노입자 및 양자점의 구형 표면에 조밀하게 코팅할 수 있다. 또한, DPPE-PEG2000은 지질이 코팅된 나노입자에 분산 안정성을 부여할 수 있다. 그리고 Ni-NTA는 단백질 G에 있는 히스티딘과 결합하여 친수성의 초상자성 나노입자 및 양자점과 단백질 G를 결합시키고, 초상자성 나노입자 및 양자점의 분리를 위해 후속 공정에서 이미다졸이 첨가된 경우, 선택적으로 분리하는 역할을 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 페리틴 단백질과 초상자성 나노입자 사이에 위치한 제1 링커, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에 위치한 제2 링커 및 상기 표지물질과 탐지 항체 사이에 위치한 제3 링커는 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 일 양태로, 본 발명은 바이오마커를 함유하는 시료에, 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계, 및 상기 바이오마커에 표적화된 상기 표지물질-항체 복합체의 표지물질을 검출하는 단계를 포함하는, 바이오마커의 탐지방법일 수 있다. 예를 들어, 상기 검출하는 단계는 양자점에서 방출되는 형광강도를 측정하여 이루어질 수 있다. 본 발명에서 형광강도(Fluorescence intensity) 값은 상대적인 수치이고, Arbitrary unit(a.u.)이다.

일예로, 상기 바이오마커 탐지용 조성물을 혼합하는 단계는, 상기 표적-특이적 프로브를 용기에 첨가하는 단계, 바이오마커를 함유하는 시료를 표적-특이적 프로브가 첨가된 용기에 혼합하는 단계, 상기 용기에 표지물질-항체 복합체를 혼합하는 단계, 및 용기 외부에서 자기장을 인가하여 초상자성 나노입자가 결합된 바이오마커를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체의 농도의 비는 몰비를 기준으로 표적-특이적 프로브 : 표지물질-항체 복합체의 농도 = 1: 1 내지 1 : 5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 자기장을 인가하는 방법은 자석을 이용하여 간단히 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 초상자성 나노입자에 인력을 나타낼 수 있는 방법이면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 바이오마커의 탐지방법의 일 구현예로, 상기 표지물질이 검출되는 경우 바이오마커가 상기 시료에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 바이오마커의 탐지방법은 ⅰ) 본 발명의 표적-특이적 프로브를 제공하는 단계, ⅱ) 본 발명의 표지물질-항체 복합체를 제공하는 단계, ⅲ) 상기 표적-특이적 프로브와 상기 표지물질-항체 복합체에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계, ⅳ) 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

일예로, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 페리틴을 함유하는 페리틴 용액에 초상자성 나노입자와 표적용 항체(표적화 항체)를 혼합하여 본 발명에 따른 표적-탐지용 프로브(페리틴에 초상자성 나노입자와 항체가 결합된 프로브)를 제조하고, 상기 제조한 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체(양자점이 결합된 탐지용 항체)를 바이오마커가 포함된 용기에 혼합한다. 이 과정에서 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체는 바이오마커를 샌드위치 표적화 할 수 있다. 이 후, 자석을 이용하여 샌드위치 표적화된 바이오마커를 쉽게 분리하고 바이오마커의 양을 정량분석 할 수 있다.

상기 샌드위치 표적화된 바이오마커는 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이오마커의 한 부분이 페리틴 단백질에 초상자성 나노입자의 표면에 결합된 표적화 항체에 결합되고, 표적화 항체가 결합된 부분과 다른 부분이 표지물질-항체 복합체의 탐지용 항체에 의해 결합됨으로써, 바이오마커의 서로 다른 부분이 표적-탐지용 프로브와 표지물질-항체 복합체에 의해 탐지 및 검출되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 표지물질을 다양한 농도에서 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 제작한 표준 곡선과 상기 본 발명의 바이오마커의 탐지방법을 통해 검출한 바이오마커에 표적화된 표지물질-항체 복합체에 포함된 표지물질의 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 시료 내 바이오마커를 정량할 수 있다.

구체적으로 바이오마커를 정량화하는 방법은 i) 농도가 서로 상이한 또 다른 양자점들을 포함하는 복수의 용액들을 제공하는 단계, ii) 복수의 용액들의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, iii) 또다른 양자점들의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 표준 곡선을 제공하는 단계, iv) 분리된 양자점의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, v) 분리된 양자점의 350 nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 분리된 양자점의 농도를 계산하는 단계, 및 vi) 분리된 양자점의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명은 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물의 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는, 바이오마커의 진단키트에 관한 것이다. 구체적으로 상기 검출기는 자외선 방출기, 자외선 램프, 형광검출기 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용하는 탐지 물질을 검출할 수 있는 것에 해당하면 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 일예로, 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이오마커의 진단키트는 표적-특이적 프로브 용액(도 8의 A), 표지물질-항체 복합체 용액(도 8의 B), 반응용기(도 8의 C), 분리용 자석(도 8의 D)를 포함할 수 있다.

본 발명은 페리틴 단백질 입자의 표면에 초상자성 자성 나노입자와 제 1 표적용 항체를 결합시켜 극대화 된 표면적을 이용하여 저농도의 바이오마커를 초고감도로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에서 초상자성 나노입자를 이용함으로써 뭉침현상 없이 외부 자장인가를 통해서 손쉽게 나노프로브를 수집하여 효율적으로 바이오마커를 탐지할 수 있다.

본 발명은 페리틴과 결합된 초상자성 나노입자에 부착된 바이오마커 검출용 항체를 집약시켜서 감도를 높이고, 초상자성 나노입자가 외부 자장에 반응하는 성질을 이용하여 효울적으로 자력분리를 하고, 다량의 양자점의 형광 및 흡광도를 이용하여 검지 된 바이러스의 신호 증폭 및 절대 정량화까지 가능한 신개념의 바이오마커 탐지용 조성물에 관한 것으로, 이를 이용하면, 조기에 다양한 전염성 질병 및 질환을 검지하여 질환의 전파 방지 및 진단/치료비의 획기적인 절감에 기여를 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 표적-특이적 프르브와 표지물질-항체 복합체가 표적하는 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 개념도를 나타낸다.
도 2는 페리틴 단백질과 단백질 G의 융합 단백질의 유전자 지도를 나타낸다.
도 3은 페리틴 단백질 표면에 초상자성 나노입자를 결합하고, 그 표면에 제1 표적용 항체를 결합한 표적-특이적 프로브의 개발 과정 및, 제2 표적용 항체를 양자점에 결합시켜 표지물질-항체 복합체(바이오마커 정량분석용)를 제작한 뒤, 상기 두 가지를 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적하는 모식도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 표적용 나노프로브를 제작할 때의 단계마다 크기를 측정한 DLS 결과를 나타낸다. 맨 위(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 크기, 가운데(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 크기, 맨 아래(파란색)는 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 크기를 나타낸다.
도 5는 바이오마커를 본 발명의 조성물을 이용하여 검출한 뒤, 절대 정량화를 위한 양자점의 광학적 특성을 보여준다.
도 6a는 본 발명의 표적-특이적 프로브의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 6b는 나노프로브의 자력분리효율을 나타낸다.
도 6c는 다양한 농도 (8.3 ng/ml, 33.3 ng/ml, 83.3 ng/ml, 166.7 ng/ml)의 바이오마커가 들어있는 시료를 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출한 뒤(좌측 상단), 이를 자외선을 이용하여 확인하는 (우측 상단) 사진을 나타낸다. 또한, 시료에 자석을 이용하여 수집하여(좌측 하단) 이에, 자외선을 조사한 사진(우측 하단)을 나타낸다.
도 7 a는 다양한 농도(0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5 nM)의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표로 나타낸 표준곡선으로, 양자점 농도와 형광세기가 선형으로 비례하는 것을 보여주는 그래프이다. 도 7b는 다양한 농도(5.0, 8.3, 33.3, 83.3, 166.7 ng/mL)의 바이오마커가 들어있는 시료를 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출 한 뒤, 도 7의 a의 표준곡선을 이용하여 검출된 바이오마커의 개수와 나노프로브의 양자점의 개수가 일치하여, 정량분석이 가능함을 보여준다.
도 8은 본 발명에서 개발된 나노프로브를 이용한 바이오마커 검출키트를 나타낸다. A는 본 발명의 표적-특이적 프로브 용액, B는 본 발명의표지물질-항체 복합체 용액, C는 반응용기, D는 분리용 자석을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 표적-특이적 프로브의 제조

1-1: 페리틴의 표면에 단백질 G를 발현시킨 융합 단백질의 제조

페리틴 단백질과 Genescript 사에서 구입한 Protein G의 유전자를 연결하기 위해 5가지 프라이머로 구성된 총 3쌍의 프라이머(표 1)를 사용하여 PCR를 실시하였다. 상기 프라이머들은 코스모진텍(Cosmogenetech, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 또한 제한효소 NdeⅠ, BamHⅠ, XhoⅠ은 뉴잉글랜드바이오랩스(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)로부터 구입했다.

명명	서열 5'→3'	서열번호
정방향 프라이머 1	CATATGACGACCGCGTCCACCTCG	1
역방향 프라이머 2	ACTGCCACCTCCAGTACCGCCTCCGCTTTCATTATCACTGTC	2
정방향 프라이머 1	CATATGACGACCGCGTCCACCTCG	1
역방향 프라이머 3	GGATCCTCCACCGCTTCCACCGCCTGTTCCACCGCCACTGCCACCTCCAGTACC	3
정방향 프라이머 4	GGATCCACTTACAAATTAATCCTT	4
역방향 프라이머 5	CTCGAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCAGTTACCGTAAAGGT	5

페리틴과 단백질 G 사이는 54bp의 링커를 이용하여 연결하였으며, 링커를 2개로 나눠서 PCR을 실시하였다. 먼저 페리틴 부분은 프라이머① (SEQ ID NO:1) 과 프라이머② (SEQ ID NO:2)를 사용하여 NdeⅠ과 페리틴, 링커1을 연결하였다.

다음으로 PCR 생성물 (NdeⅠ+페리틴+링커1)과 링커2+BamHⅠ을 연결하기 위해 프라이머①(SEQ ID NO:1) 과 프라이머③ (SEQ ID NO:3)을 사용하였다.

단백질 G 부분은 BamHⅠ과 단백질 G, XhoⅠ는 프라이머④(SEQ ID NO:4) 와 프라이머⑤(SEQ ID NO:5) 를 이용하여 연결하였다. PCR을 아래 표 2와 같은 조건으로 실시 하였으며, 각각의 PCR 생성물은 아가로즈 젤에 PCR 생성물을 넣고 전기영동을 실시하여 확인하였다.

segment	사이클수	온도	시간
1	30	95 ℃	4 min, 30 sec
2	30	55 ℃	30 sec
3	30	72 ℃	40 sec
4	1	72 ℃	7 min
5	1	4 ℃	∞

PCR을 통해 만들어진 페리틴 부분과 단백질 G 부분을 제한효소인 BamHⅠ을 이용하여 각각 유전자의 말단 부분을 절단한다. 스티키 엔드로 절단된 두 유전자를 라이게이션 효소를 이용하여 페리틴과 단백질 G를 융합하였으며, 페리틴 단백질과 단백질 G의 융합 단백질의 유전자 지도를 도 2에 나타냈다.

페리틴과 단백질 G사이에 아미노산 링커를 이용하여 연결함으로써 페리틴과 단백질 G가 서로 영향을 주지 않고 독립적인 기능을 할 수 있도록 하였다.

1-2 초상자성 나노입자의 합성

플라스크안에 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는 상온의 원료 용액을 200℃까지 가온 한 다음 입자가 핵이 생성되도록 30분 동안 유지하였다. 그 다음 295℃로 가온 하여 원료 용액이 끓는점에 도달 하도록 한 뒤 45분 동안 동일한 온도로 유지시켜 입자가 성장하도록 하였다. 반응이 끝나면 용액의 온도가 50℃ 밑으로 내려갈 때까지 천천히 기다렸다. 무수 에틸 알코올(99.9%)을 사용하여 합성된 용액을 잘 세척하였다. 이 때 무수 에틸 알코올 30 ml와 헥산 용액 15 ml를 넣고 초음파처리(sonication)를 30분 한 뒤, 원심 분리기를 이용하여 7000rpm 으로 10분동안 실시하여 상등액을 버린다. 그 다음 무수 에틸 알코올을 넣고 샤레에 부어 완전히 말린 후 헥산에 분산하여 초상자성 나노입자를 합성하였다.

최종 결과물로 합성된 초상자성 나노입자의 크기는 투과전자현미경 (TEM: Transmission electron microscope)으로 관찰한 결과, 평균입경이 7 nm (5 ~ 13 nm)로 관찰되었고, VSM (vibrating sample magnetometer)로 측정한 결과, 평균 자화력이 71 emu/g을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 실시예 1-2에 따라 제조된 초상자성 나노입자는 일반적인 자석과 충분히 인력이 작용할 수 있는 평균 자화력을 나타내므로, 상기 초상자성 나노입자가 결합된 본 발명의 표적-특이적 프로브 또는 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체에 샌드위치 표적화된 바이오마커를 자석을 이용하여 간단하게 분리할 수 있다.

1-3. 융합 페리틴 단백질에 초상자성 나노입자의 결합

실시예 1-2에서 합성된 초상자성 나노입자는 페리틴과의 결합을 위하여 다음과 같은 방법으로 표면을 코팅 하였다. 탈이온수(deionized water) 3.5 ml가 들어있는 비이커를 물의 온도를 85 로 만들어 놓은 sonicator 위에 띄워 놓는다. 지방질 조합 (MHPC 270μl, DPPE-PEG2000 151.2μl, Ni-NTA 47.7μl)을 1-2에서 합성된 초상자성 나노입자 (20mg/ml) 70μl 에 넣고 섞은 후 sonicator 안에 있는 비이커 위에 drop by drop으로 떨어뜨린다. 1시간 동안 초음파처리를 한 뒤, 원심 분리기를 이용하여 10,000 G로 10분 동안 실시하여 상등액만을 모아 0.2 μm 필터로 걸러준 후 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 버퍼를 바꾸었다.

반응용기에 상기 실시예 1-1 에서 제조된 단백질 G가 표면에 발현된 페리틴을 함유하는 0.5 μM 페리틴 용액 30 μl 와 표면이 코팅 된 초상자성 나노입자 용액 10 μl를 섞은 후, 상온에서 1 시간 반응시켰다. 융합 페리틴 단백질 G의 표면에 있는 히스티딘과 초상자성 나노입자에 코팅된 Ni-NTA가 결합하여 초상자성 나노입자를 융합페리틴 표면에 결합시킴으로써 페리틴 단백질의 표면에 초상자성 나노입자를 결합시켰다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 상단 그래프(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 평균 입경 크기(13.43nm), 중단 그래프(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 평균 입경 크기(17.16nm)를 나타내는데, 페리티니 단백질에 초상자성 나노입자가 결합함으로써 평균 입경 크기가 3.73nm 증가함을 확인할 수 있고, 이를 통하여 페리틴 단백질에 초상자성 나노입자가 결합한 것을 입증하였다.

1-4. 페리틴 단백질 표면에 결합된 초상자성 나노입자에 표적화 항체의 결합

상기 실시예 1-3 에서 제조된 페리틴에 결합된 초상자성 나노입자에, 100 μg/ml 농도의 단백질 G 용액 3 μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 단백질 G의 히스티딘 부분이 페리틴의 표면에 있는 초상자성 나노입자에 코팅된 Ni-NTA와 결합 시켰다. 여기에 1 mg/ml 농도의 B형간염 바이오마커인 비루스 겉질(HBs) 항체 용액 1.8 μl를 섞은 후 상온에서 1시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 항체 표적항체의 Fc 부분을 결합 시킨다. 과량의 HBs 항체는 pH7.4의 인산버퍼용액으로 3번 세척하여, 초상자성 나노입자에 표적화 항체를 결합시켰다(도 4 및 도 6a).

도 4에 나타낸 바와 같이, 표적용 나노프로브를 제작할 때의 단계마다 크기를 측정한 DLS 결과를 나타내는 것으로서, 상단 그래프(녹색)는 페리틴 단백질과 단백질 G 융합 단백질의 크기, 중단 그래프(주황색)는 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 크기, 하단 그래프(파란색)는 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 크기를 나타내었다. 도 6a는 본 발명의 표적-특이적 프로브의 전자현미경 사진을 나타냈다.

이를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체의 평균 입경 크기 17.16nm이고, 초상자성 나노입자의 표면에 표적화 항체를 고정화 시킨 표적-특이적 프로브의 평균 입경 크기는 20.60nm이므로, 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체에 항체가 고정화됨으로써 평균 입경 크기가 3.44nm 증가함을 확인할 수 있고, 이를 통하여 초상자성 나노입자와 상기 융합 단백질이 결합한 복합체에 항체가 고정화된 것을 입증하였다.

실시예 2: 바이오마커 탐지용 조성물의 제조

2-1: HBs 탐지항체와 친수성 양자점의 결합

바이오마커 탐지용 조성물을 제조하기 위해서 탐지가능한 표지물질로서 표면처리된 양자점을 사용하였다. 구체적으로 상기 실시예의 1-3과 마찬가지 방법으로 지방질 조합(MHPC 300ul + DPPE-PEG2000 170ul + Ni-NTA 53ul)으로 양자점(20 mg/ml, 70μl)을 코팅한다. 표면 코팅된 0.2421 μM 농도의 양자점 50 μl에 100 μl/ml의 단백질 G 용액 3 μl를 혼합한 후 상온에서 1 시간 동안 반응시켜 단백질 G의 표면에 있는 히스티딘과 양자점에 코팅된 Ni-NTA의 결합을 통해 양자점과 단백질 G를 결합시켰다. 여기에 1 mg/ml 농도의 HBs 항체 1.8 μl(표적화 항체)를 첨가한 후 상온에서 1 시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 탐지항체의 Fc부분을 결합시켰다.

도 6c에서 HBs의 농도별로 형광이 다르게 나오는 것을 통하여, 탐지항체와 양자점이 잘 결합한 것을 확인하였다.

2-2: HBs 항원표적

상기 실시예 1-4 에서 제조된 표적-특이적 프로브를 함유한 용액에, 6 μg/ml 농도의 HBs 항원 27 μl와 pH 7.4의 인산버퍼용액을 넣어 최종 부피가 400 μl이 되게 만든 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 상기 실시예 2-1 에서 만든 양자점이 결합 된 HBs 탐지항체가 포함된 용액 55 μl를 넣어서 수집된 HBs 항원을 샌드위치 표적시켰다. 과량의 양자점이 결합된 HBs 탐지항체는 pH 7.4의 인산버퍼용액으로 5번 세척하여 완전히 제거하였다.

2-3: 정량분석

도 7a는 0.024, 0.048, 0.097, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5 nM 농도의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표로 나타낸 표준곡선, 도 7b는 5.0, 8.3, 33.3, 83.3, and 166.7 ng/mL 농도의 양자점 용액의 형광세기를 측정하여 표준곡선을 만들었다. 도 7a 및 도 7b는 선형으로 비례하는 결과로, 이는 양자점 농도와 형광세기가 선형으로 비례하는 것을 보여주는 그래프이다. 이를 통하여, 표적된 HBs 항원의 수와 같은 수의 양자점의 농도를 통해 HBs의 개수를 정량적으로 구할 수 있음을 입증하였다.

2-4: 바이오마커 탐지용 조성물의 제조

실시예 1-4에서 얻은 표적-특이적 프로브와 실시예 2-2에서 얻은 HBs 탐지항체와 친수성 양자점이 결합된 표지물질-항체 복합체를 혼합하여 바이오마커 탐지용 조성물을 제조하였다. 몰농도를 기준으로 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 1:1로 혼합하고 pH7.4의 인산버퍼용액을 첨가하여 최종 부피를 400 μl로 맞춘 후 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제조하였다.

2-5: 탐지 및 검출 효율 확인

본원 발명에 따른 바이오마커 탐지용 조성물의 우수한 탐지 및 검출 효율이 우수함을 확인하기 위하여, 동일한 농도의 HBs에 대하여 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물을 이용하여 검출한 경우에 형광강도 값이 13810 인 것에 비하여, 나노입자만을 이용하였을 때는 형광광도 값이 801, 자성 비드를 이용했을 때는 형광강도 값이 2450으로 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오마커 탐지용 프로브를 이용하여 정량분석을 하게 되면 나노입자만을 사용한 것 에 비해 약 17.4배, 자성비드에 비해 5.8배의 효율이 더 좋은 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 바이오마커 탐지용 조성물을 이용한 탐지

도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 농도의 바이오마커(HBs)를(8.3 ng/ml, 33.3 ng/ml, 83.3 ng/ml, 166.7 ng/ml) 포함한 용액에 실시예 2-3에서 얻은 바이오마커 탐지용 조성물을 주입하여 검출하고 이에 자외선을 조사하여 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 바이오마커를 샌드위치로 검출한 표지물질의 형광을 관찰함으로써 바이오마커 검출을 확인하였다.

구체적으로, 바이오마커 탐지용 조성물을 주입하여 HBs 바이오마커를 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 이용하여 샌드위치 표적시킨 후, 1M 이미다졸 용액 200 μl 를 넣어 표적된 바이오마커와 같은 개수의 양자점만을 분리시켰다. 자석을 이용하여 양자점을 제외한 프로브를 한쪽으로 모으고 상청액에 부유하고 있는 양자점 용액을 96-well 에 넣어 micro plate reader(제조사:TECAN, 모델명:Infinite F200)로 형광강도를 측정하였다.

그 결과 도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, 바이오마커의 농도가 높아질수록 형광의 강도 또한 강해지고 자석에 의하여 용이하게 분리할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바이오마커 탐지용 조성물은 농도에 따라 정밀하게 바이오마커를 탐지 및 검출할 수 있음을 입증하였다.

실시예 4: 바이오마커 탐지용 조성물을 이용한 바이오마커 분리

바이오마커를 검출한 용액에 자석을 이용하여 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 샌드위치로 검출한 바이오마커를 수집한 뒤, 이에 자외선을 조사하여 형광의 강도를 측정하였다.

도 6c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 자력에 의해서 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체가 샌드위치로 검출한 바이오마커가 효과적으로 수집되어 형광의 강도가 더욱 선명하게 구별되는 밴드형태를 나타냄으로써, 바이오마커의 검출결과가 더욱 효과적임을 확인하였다.

실시예 5: 바이오마커 진단키트를 이용한 탐지

본 발명에서는 페리틴과 초상자성 나노입자를 결합시킨 나노프로브와 양자점을 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적하고 양자점의 형광강도를 측정하여 바이오마커를 정량분석 할 수 있는 것을 확인하였고, 이를 이용하여 쉽게 이용할 수 있는 Prototype 정량분석 진단키트를 개발하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명의 진단키트는 본 발명의 표적-특이적 프로브를 용액(도 8의 A), 본 발명의 표지물질-항체 복합체를 포함하는 정량분석용 용액(도 8의 B), 반응용기(도 8의 C), 자성입자 분리용 자석(도 8의 D)을 포함하는 구성으로 개발하였다.

바이오마커 진단키트는 다음과 같은 방법으로 사용하였다. 먼저 실시예 2-2에서 얻은 표적-특이적 프로브를 용액 100μl을 반응용기에 넣었다. 다음 정량 진단하고자 하는 바이오마커(HBs) 샘플 10 μl를 반응용기에 함께 넣고 1시간 반응시켰다. 그 다음 정량분석용 용액 100μl를 넣어서 상온에서 1시간 반응시켰다.

자성입자 분리용 자석을 반응용기에 가까이 하여 자력분리를 통해서 바이오마커를 샌드위치 표적화 한 표적-특이적 프로브와 표지물질-항체 복합체를 분리시킨 후 여분의 용액을 제거하였다.

형광 측정장비를 이용하여 형광 강도값을 측정하여 주어진 표준곡선과 비교함으로써 바이오마커를 정량적으로 분석하였다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> COMPOSITION FOR DETECTING BIOMAKER COMPRISING TARGET-SPECIFIC PROBE AND DETECTABLE LABELING AGENT-ANTIBODY COMPOSITE AND USING METHOD OF THE SAME <130> DPP20135768KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1 for connecting protein G gene <400> 1 catatgacga ccgcgtccac ctcg 24 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 2 for connecting protein G gene <400> 2 actgccacct ccagtaccgc ctccgctttc attatcactg tc 42 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 3 for connecting protein G gene <400> 3 ggatcctcca ccgcttccac cgcctgttcc accgccactg ccacctccag tacc 54 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 4 for connecting protein G gene <400> 4 ggatccactt acaaattaat cctt 24 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer 5 for connecting protein G gene <400> 5 ctcgagatta gtgatggtga tggtgatgtt cagttaccgt aaaggt 46

Claims (22)

1. (a)페리틴 단백질, (b)표면에 친수성기와 소수성기를 갖는 양친성 물질을 포함하며 단백질 또는 펩타이드인 제1 링커를 통해 상기 페리틴 단백질에 C-말단 또는 N-말단에 결합된 초상자성 나노입자, 및 (c)상기 초상자성 나노입자의 표면 중 상기 페리틴 단백질과 연결되지 않은 부분에 결합된 표적화 항체(targeting antibody)을 포함하며,
   상기 페리틴 단백질, 초상자성 나노입자 및 표적화 항체의 비율은 몰비를 기준으로 1:1:1 내지 1:6:6인 표적-특이적 초상자성 프로브; 및
   탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)에 결합된 탐지 항체(detecting antibody)를 포함하는 표지물질-항체 복합체를 포함하는,
   바이오마커 탐지용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 상기 페리틴 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 연결되며 페리틴 단백질의 페리틴 구조 형성을 저해하지 않는 단백질 또는 펩타이드인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 페리틴 단백질과 제1 링커는 하나의 융합 단백질로 구성되는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자는 Fe(III), Mg, Mn, Ni, Zn 및 Co로 이루어진 군으로부터 1종 이상을 포함하는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
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7. 제1항에 있어서, 상기 양친성 물질은 1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-hosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000) 및 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈쏠트(1,2-dioleoyl-snglycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 초상자성 나노입자와 표적화 항체 사이에 위치한 제2 링커를 추가로 포함하며, 상기 제2 링커는 상기 초상자성 나노입자의 표면 중 상기 페리틴 단백질과 연결되지 않은 부분에 결합된 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 또는 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
   
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11. 제1항에 있어서, 상기 표적화 항체와 상기 탐지 항체는 동일한 바이오마커의 상이한 부분에 결합하는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 탐지 가능한 표지물질과 탐지 항체의 사이에 위치한 제3링커를 추가로 포함하며,
    상기 제3 링커는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, Fc 수용체, 바이오틴, 아비딘, 히스티딘, Ni-NTA, 및 스트랩트아비딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 탐지 가능한 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자인, 바이오마커 탐지용 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 양자점은 친수성기과 소수성기를 갖는 양친성 물질을 함유하는 친수성 표면층을 포함하는 것인, 바이오마커 탐지용 조성물.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 바이오마커 탐지용 조성물.
    
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22. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제7항 내지 제9항, 그리고 제11항 내지 제15항중 어느 한항에 따른 바이오마커 탐지용 조성물 및
    상기 바이오마커 탐지용 조성물에 포함된 표지물질을 검출하는 검출기를 포함하는, 바이오마커의 진단키트.

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