JP6977939B2 - アルドステロン及びレニンの検出方法 - Google Patents

アルドステロン及びレニンの検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、生物学的サンプル中のアルドステロン及びレニンの新規検出方法に関する。より具体的には、本発明は、ナノサイズの多相ポリマー微粒子を用いてアルドステロン及びレニンを高感度かつ迅速に検出する方法を提供する。本発明の方法は、原発性アルドステロン症の診断に利用することができる。
日本人の高血圧症患者は3人に1人であり、高血圧症患者の約5〜10％、治療抵抗性高血圧症患者の約20％が原発性アルドステロン症であるとされている。原発性アルドステロン症は、副腎皮質に腺腫や過形成が生じ、それらの病変により過剰なアルドステロンが産生され、高血圧症を発症することが知られている。
原発性アルドステロン症は、手術によって腫瘍や過形成を取り除くことで症状の大幅な改善が見られることから、早期発見が重要視されている疾患である。一方、早期発見できなかった場合には、心筋梗塞、脳卒中、心房細動等の血管系重篤疾患や、人工透析を必要とする慢性腎臓病等の合併症を多数起こすため、予後が悪い疾患でもある。
一方、本発明者等は、各半球が異なる材質からなる多相ポリマー微粒子を簡便に製造できる方法を開発している（特許文献１及び２）。これらの方法は、自己組織化析出（SORP: Self-ORganized Precipitation）法を用いて、性質の異なる2種のポリマーを含む溶液にポリマーが溶けない貧溶媒を加え、次いで良溶媒を蒸発除去することで貧溶媒への置換を行い、相分離したサブミクロンサイズのポリマー粒子を含む分散液を得るものである。製法によらず、性質の異なる複数、多くの場合には2つの表面を有する異方性粒子をヤヌス粒子と呼ぶことがある。
特許第5103611号 特許第5239004号
原発性アルドステロン症の診断は、限られた病院の専門医でしか行われておらず、0.1％未満の患者しか診断及び治療がなされていない。残りの患者は上記のような合併症を併発する可能性が高く、その結果、大きな社会的損失及び医療費高騰をもたらしている。国内では、約200〜400万人の潜在的な原発性アルドステロン症患者がいると推定されており、その患者の多くが見過ごされているのが現状である。
原発性アルドステロン症の診断には、血液中の血漿アルドステロン濃度および活性型レニン濃度をELISA（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay）法やラジオイムノアッセイで測定し、その比の値（ARR: Aldosterone to Renin Ratio）から診断する方法等が用いられてきた（例えばJournal of hypertension, Vol.33, No.12, 2015等）。しかし、この方法は、診察を行うクリニック等で測定を行うには作業工程が複雑で難しく、臨床検査センター等に検体を送って測定を依頼することが多い。この場合、通常、検査結果を得るために1週間程度かかるため、より容易で迅速に測定できる方法が求められている。
本発明者等は、既に開発した自己組織化析出法によって調製し得る多相ポリマー微粒子を、原発性アルドステロン症の診断のためのアッセイ法に利用し得ることに着目し、種々検討を重ねた結果、微粒子の一方の表面にアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質を結合させ、他方の表面を検出用の標識物質で修飾することで、アルドステロン又はレニンの検出のために機能化させたヤヌス粒子を得ることに成功した。
一方、本発明者等は、マイクロ流路中に固定し得るチップデバイスの開発を行っている（例えば特開2008-14791号）。このチップデバイスは、流路内の表面に検出すべきアルドステロン又はレニンと相互作用する捕捉用試薬を固定化できるため、種々のアルドステロン又はレニンを検出することができる。
本発明者等は、上記の機能化ヤヌス粒子を、上記チップデバイスと組合せることで、従来の検出方法に比べて、より高精度に迅速かつ簡便に原発性アルドステロン症の診断のための計測センサとして機能し得ることを見出した。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相にアルドステロン若しくはレニン、又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が共有結合しており、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子。
２．第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、上記１記載の微粒子。
３．標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、上記１又は２記載の微粒子。
４．被験者由来の生物学的サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンを検出する方法であって、以下の工程：
アルドステロン又はレニンのいずれかに特異的に結合する1種以上の捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
該固相支持体と上記１〜３のいずれか記載の微粒子とを接触させる工程；及び
固相支持体上の捕捉用試薬に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む、上記方法。
５．微粒子がアルドステロンに共有結合した微粒子であり、サンプル中のアルドステロンが未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在するアルドステロンとが結合する、上記４記載の方法。
６．微粒子が抗レニン抗体に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中のレニンと微粒子上に存在する抗レニン抗体とが結合する、上記４記載の方法。
７．生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、上記４〜６のいずれか記載の方法。
８．捕捉用試薬がアルドステロン又はレニンに対して特異的な抗体である、上記４〜７のいずれか記載の方法。
９．生物学的サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンの捕捉手段と、捕捉されたアルドステロン又はレニンの検出手段とを含む、サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンの検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、アルドステロン又はレニンのいずれかと特異的に結合する1種以上の試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中のアルドステロン若しくはレニンと未結合の捕捉用試薬、又は捕捉用試薬と結合したアルドステロン若しくはレニンと、上記１〜３のいずれか記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
１０．小型デバイスの形態で提供される、上記９記載のシステム。
１１．固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、上記１０記載のシステム。
１２．検出手段が、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラである、上記１０又は１１記載のシステム。
１３．アルドステロン又はレニンの量及び／又は濃度を測定する、上記９〜１２のいずれか記載のシステム。
１４．更に、サンプル中のアルドステロン濃度と活性型レニン濃度との比率を算出し、原発性アルドステロン症に罹患する可能性の有無を示す計測結果が表示される、上記９〜１３のいずれか記載のシステム。
１５．アルドステロン若しくはレニン、又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が予め結合された上記１〜３のいずれか記載の微粒子と、アルドステロン又はレニンと特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉されたアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中のアルドステロン又はレニンの検出のためのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-084764号の開示内容を包含する。
本発明の方法を用い、原発性アルドステロン症患者の血液中のARRを、従来の診断方法と比較して、より高精度に迅速かつ簡便に測定できる診断用のセンサを提供することができる。従って、クリニック等の医療機関で容易に患者のスクリーニング及び診断を行うことができ、従来適切な診断及び治療を受けることができなかった原発性アルドステロン症患者を早期に発見・治療することができる。
本発明に用いることができる多相ポリマー微粒子を模式的に示す。 アルドステロンに官能基を導入後に縮合試薬を用いてヤヌス粒子に結合させる態様を模式的に示す。 本発明の多相ポリマー微粒子を使用した検出方法の一実施形態を模式的に示す。Ａ：サンプル中にアルドステロン又はレニン（□）が含まれない場合、捕捉用試薬（▽）に結合した多相ポリマー微粒子上の標識物質からの高い信号（例えば蛍光）強度が検出される。Ｂ，Ｃ：サンプル中にアルドステロン又はレニンが含まれる場合、捕捉用試薬に結合する多相ポリマー微粒子量が少なくなり、検出される信号（例えば蛍光）強度が低くなる。 本発明の多相ポリマー微粒子を使用した検出方法の一実施形態を模式的に示す。Ａ：サンプル中にアルドステロン又はレニン（□）が含まれない場合、捕捉用試薬（▽）に結合しないため、多相ポリマー微粒子からの信号（例えば蛍光）が検出されない。Ｂ，Ｃ：サンプル中にアルドステロン又はレニンが含まれる場合、捕捉用試薬に結合した検体物質に多相ポリマー微粒子上のアルドステロン又はレニンと特異的に結合し得る物質（▼）が結合して、標識物質からの信号（例えば蛍光）が検出される。 本発明のシステムを模式的に示す。 本発明の多相ポリマー微粒子の製造を模式的に示す。１：一方のポリマー相にアミノ基を有し、他方のポリマー相に蛍光物質を有するヤヌス粒子、２：アルドステロンCMOの合成、３：ヤヌス粒子とアルドステロンCMOとの反応による本発明の粒子の製造。 多相ポリマー微粒子の一部のポリマー相が選択的に標識されることを示す。Ａ：明視野像において、四酸化オスミウムで染色されるポリマー領域（ポリブタジエン）と染色のないポリマー領域（ポリスチレン）を示す。Ｂ：蛍光像において、ポリスチレンからなる領域で青色の蛍光が見られ、ポリブタジエンからなる領域では蛍光が見られない。 複数種のアルドステロン誘導体が生成したことを示す。 アルドステロン-3-オキシムの選択的合成を示す。 アルドステロン濃度に対する3-アルドステロンCMOの光吸収（波長350nm）を示す。 本発明の方法によるアルドステロンの検出を示す。Ａ：検出方法を模式的に示す。Ｂ：サンプル中のアルドステロン濃度の増加に依存して蛍光強度が低下していることを示す。縦軸はアルドステロンを含まない場合（B0）の蛍光強度を100とした場合の相対蛍光強度（％）、横軸はサンプル中のアルドステロン濃度（pg/ml）を示す。
［多相ポリマー微粒子］
本発明は、2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相にアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が共有結合しており、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子を提供する。微粒子に含まれるポリマー相は2種以上であれば良く、必要に応じて3種、4種又はそれ以上であり得る。しかしながら、ポリマー相の数が少ない場合に微粒子の製造がより容易となるため、本発明の目的であるサンプル中のアルドステロン又はレニンの検出のためにはポリマー相は2種であれば良い。ポリマー相の識別のために、本明細書中において便宜上「第1のポリマー相」、「第2のポリマー相」等と表記するが、これらの表記はポリマーの種類を特定するものではない。
本発明の多相ポリマー微粒子を構成する2種以上のポリマーは、いずれも下記のポリマーから選択することができる：
１）水溶性ポリマー、例えばN-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール等；
２）非水溶性ポリマー、例えば1,4-シス-イソプレン、イソプレンエラストマー、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリメチルメタクリレート、ポリn-ブチルアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸等；
３）共重合体、例えばブタジエン：スチレン共重合体等。
2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を有する多相ポリマー微粒子は、例えば本発明者等が先に発明した特許第5103611号及び特許第5239004号に記載された方法によって製造することができる。これらの方法では、上記2種以上のポリマーとして、溶解度パラメータの差が特定の範囲内にあるポリマーを選択し、これらのポリマーに対する良溶媒に溶解して良溶媒溶液を調製した後、この良溶媒と相溶するがポリマーに対する貧溶媒である溶媒を添加して、良溶媒を蒸発により除去することで、それぞれのポリマーが別個に集合して複数のポリマー相を有する微粒子が形成される。ポリマー相が3種以上の場合も同様に、3種以上のポリマーに共通の良溶媒に溶解して良溶媒溶液を調製した後、この良溶媒と相溶するが3種以上のポリマーに共通の貧溶媒を混和した後、良溶媒を蒸発させることにより、3種以上のポリマー相を有する微粒子が形成される。
例えば2種のポリマーを使用する場合、限定するものではないが、好適な組合せは、ポリエチレングリコールとN-イソプロピルアクリルアミド、ポリスチレンとポリイソプレン、ポリスチレンとポリブタジエン、ポリスチレンとポリ乳酸、ポリスチレンとポリブチルアクリレート等であり得る。また、ポリエチレングリコールとN-イソプロピルアクリルアミドの組合せを用いる場合、良溶媒としては水、貧溶媒としてはDMSO若しくは1-プロパノールを使用し得る。ポリスチレンとポリイソプレンの組合せを用いる場合、良溶媒としてはテトラヒドロフラン（THF）、貧溶媒としては水を使用し得る。使用するポリマーの種類及び組合せに応じて、微粒子の調製のために使用し得る良溶媒及び貧溶媒を適切に選択することができる。
本発明の多相ポリマー微粒子の製造方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば予め作製したシリカ、セラミック等のコア上に、コアと親和性が高い2種以上のポリマー相が被覆した形態のものであっても良い。すなわち、多相ポリマー微粒子は、微粒子全体がポリマーで形成されたものである必要はなく、当分野において通常用いられる技術を用いて、2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有するものであれば良い。
本発明の多相ポリマー微粒子は、第1のポリマー相がアルドステロン若しくはレニン、又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質に共有結合している。レニンは、好ましくは活性型レニンであり、レニンと特異的に結合し得る物質は、好ましくは活性型レニンと特異的に結合し得る物質である。
アルドステロンは、副腎皮質から分泌されるホルモンであり、以下の化学式を有するステロイド化合物である。アルドステロンの分泌により、腎臓におけるナトリウムの再吸収が促進されるが、その過剰な分泌はナトリウムの再吸収と共に水分の再吸収及び血圧上昇につながり、高血圧をもたらし得る。アルドステロンは、例えばToronto Research Chemicals Inc.等から市販品を入手することができる。
Figure 0006977939
一方、レニンは、タンパク質分解酵素の一種であり、血圧調節に関わるアンジオテンシンＩを活性化して間接的に血圧を調節する糖タンパク質である。レニンは血中では活性型と不活性型の2つの形態で存在しており、活性型レニンが基質であるアンジオテンシノーゲンに作用してアンジオテンシンＩを生成させる。レニンのアミノ酸配列及びレニンをコードする核酸の塩基配列はそれぞれ報告されており、例えばNCBI等のデータベースにおいてGenBank: AAA60363.1等として見出すことができる。ヒトのレニンは、まず406個のアミノ酸からなるプレプロレニン（不活性型）として合成され、N末端のプレペプチド23残基を切り離してプロレニン（不活性型）となり、更に43残基のプロペプチドを切り離して、最終的に340残基の活性型レニンとなる。ヒト活性型レニンの分子量は約4万である。レニンは、例えば組換え型レニンとして入手することができる（例えば商品コード：4277-AS-020、R&D systems社製）。
本明細書において、アルドステロン又はレニンと「特異的に結合し得る物質」は、アルドステロン又はレニンと特異的に結合できるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば抗体、受容体、アプタマー等が挙げられる。検体物質と特異的に結合し得る物質は、好ましくは抗体である。第1のポリマー相に共有結合させる検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質は、例えば100〜100万の範囲の分子量、1nm〜100nmの範囲の大きさを有するものである。
抗体は、アルドステロン又はレニンに対して特異的に結合可能である限り、いずれかの生物種に由来する天然の抗体であっても、遺伝子改変された抗体であっても、あるいは合成された抗体であっても良い。また、検体物質に対して特異的に結合可能である限り、抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良く、従って結合特異性の異なる複数種の抗体の混合物を結合のために使用することもできる。更に、抗体は、特に限定するものではないが、目的の検体物質と特異的に結合し得るIgG抗体、その抗原結合性を保持する断片、又は誘導体であっても良く、例えばFab、F(ab')2断片等を好適に使用できる。また、構造的安定性を高めるため、あるいは後の検出工程のため等の目的で、当分野で通常使用されるような改変を有するものであっても良い。
本発明において使用可能なアルドステロンに対する抗体としては、例えばATCCにCRL-1846として記載されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体A2E11（Steroids. 1987;49:581-587）等が挙げられる。また、レニンに特異的に結合し得る抗レニン抗体としては、例えばモノクローナル抗体MAB4090（R&D systems社）、モノクローナル抗体Renin MCA 11-6及びRenin MCA 12-12（藤倉化成株式会社）（Acta Endocrinol (Copenh). 1989;120:81-86；特許第2877222号）、モノクローナル抗体3E8及び4G1（J. Hypertens. 3 (Suppl. 3): S275-S278, 1985; J. Clin. Invest., Vol. 83, 679-687, 1989）、ポリクローナル抗体#AF4277（R&D systems社）等が挙げられる。検出のためにビオチン化等の修飾を有する抗レニン抗体も使用することができ、このような抗体として、例えばポリクローナル抗体#BAF4277（R&D systems社）等が挙げられる。例えば、活性型レニンの検出のための既存のELISAキット（コスモ・バイオ株式会社）には、モノクローナル抗体3E8及び4G1が含まれている。
あるいはまた、アルドステロンに対する抗体、及びレニンに対する抗体は、当分野において周知の方法に基づいて取得することができる。例えば、活性型レニンに対して特異的に結合し得るモノクローナル抗体は、以下のようにして取得することができる。アルドステロンに対する抗体、及び活性型／不活性型レニンに対する抗体も、同様にして取得することができる。
まず、アミノ酸配列に基づいて合成するか、又は市販品として入手した活性型ヒトレニンを抗原としてマウス等の動物に投与して免疫する。免疫後の動物の血清中には抗原として投与した活性型ヒトレニンに対する抗体が複数種類含まれる（ポリクローナル抗体）。 一方、免疫後の動物から脾臓を摘出し、細胞を分離して、ミエローマ細胞と融合させることで、継代培養可能なハイブリドーマが得られる。得られたハイブリドーマから、目的の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。この場合、活性型レニンに対して結合するが、不活性型レニンに対しては結合しない抗体を産生するクローンのみをスクリーニングすることができる。
次いで、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを単離・培養して、培養上清から抗体を精製することができる。
目的の結合特異性を有する抗体は、単離・精製後にそのアミノ酸配列を決定することができ、重鎖及び軽鎖について、それぞれ相補性決定領域（CDR）等の情報を得ることができる。抗体タンパク質のアミノ酸配列情報が得られれば、これをコードするヌクレオチド配列も得られ、通常の遺伝子組み換え技術を用いて、抗体をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込んで適切な宿主細胞に導入し、宿主細胞に抗体を発現させることで、組換えタンパク質として抗体を取得することもできる。
本発明の目的においては、抗体は、活性型ヒトレニンに対して特異的に結合し得る抗体であれば良く、ヒト抗体である必要はない。しかしながら、必要に応じて、得られた抗原特異性を有するキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体が得られることは当業者には明らかである。
第1のポリマー相とアルドステロン若しくはレニン、またはこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質は、アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が多相ポリマー微粒子と挙動を共にすることを確実なものとするために、共有結合させる。
アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質との結合を可能とするために、第1のポリマー相を構成するポリマーとして、例えば末端にアミノ基又はカルボキシル基等の官能基を有するポリマーを用いることができる。末端にアミノ基又はカルボキシル基を有するポリマーは合成することができ、また例えばPolymer Source社等から市販品を購入することもできる。この場合、生成した多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上にアミノ基又はカルボキシル基があるため、アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質のカルボキシル基又はアミノ基等と共有結合を形成することができる。
多相ポリマー微粒子1個あたりに結合させるアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質の分子数は、1個〜1000個の範囲内であり得る。微粒子1個あたりのアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質の量は、上記の共有結合を生じさせる反応条件を選択することで適宜調整することができ、用途に応じて変動可能である。例えばサンプル中のアルドステロン又はレニンと微粒子上に共有結合したアルドステロン又はレニンとの競合的結合（間接競合的結合の場合も同様）を利用したアルドステロン又はレニンの検出のために使用する場合には、微粒子1個あたりのアルドステロン又はレニンの分子数は、10個以下、好ましくは5個以下、特に好ましくは1個である。また、サンプル中のアルドステロン又はレニンと微粒子上に共有結合したこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質との結合を利用して検体物質を検出する場合には、微粒子に共有結合したこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質の分子数は、特に限定するものではないが、微粒子1個あたり10個以下、5個以下、例えば1個とすることができる。
本発明の多相ポリマー微粒子は、第2のポリマー相が標識物質を有するように構成される。標識物質としては、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質が挙げられる。蛍光色素の例としては、特に限定するものではないが、フルオレセイン及びその誘導体、ピレン及びその誘導体、量子ドット等の量子収量が優れた蛍光色素が挙げられる。化学発光物質としては、例えばペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（ALP）等の酵素等が挙げられる。放射性標識物質としては、例えば14C、3H、125I等を有する試薬が挙げられる。標識物質との結合を可能とするために、第2のポリマー相を構成するポリマーは、例えば末端にアミノ基又はカルボキシル基等の官能基を有するポリマーを用いることができる。末端にアミノ基又はカルボキシル基を有するポリマーは合成することができ、また例えばPolymer Source社等から市販品を購入することもできる。この場合、生成した多相ポリマー微粒子の第2のポリマー相上にアミノ基又はカルボキシル基があるため、標識物質のカルボキシル基若しくはシアノ基又はアミノ基等と共有結合を形成することができる。あるいはまた、第2のポリマー相のために末端にピレニル基等を有するポリマー、化学発光物質を有するように改変したポリマー、又は放射性同位元素を有するように改変したポリマーを使用することもでき、この場合、多相ポリマー微粒子の生成時点で第2のポリマー相上に標識物質が存在し得る。
第1及び第2のポリマー相は適宜選択することができる。生成した多相ポリマー微粒子上の第2のポリマー相に標識物質を結合させる場合、第1のポリマー相にはアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が結合し、第2のポリマー相には標識物質が存在し得るように、ポリマー相上に生成するアミノ基、カルボキシル基等の官能基は異なるものとすることが必要である。
第1及び第2のポリマー相の比率は、特に限定するものではないが、微粒子上のそれぞれの表面積として1：9〜9：1の範囲であり得る。ポリマー相の比率は、微粒子の作製時に使用する各ポリマー量の比率を調整することで、適宜変更することができる。
尚、一般的に、2つの半球が物理的及び／又は化学的に異なる非対称の球状粒子に対して「ヤヌス粒子」との用語が使用されるが、本明細書に記載する多相ポリマー微粒子も異方性を有する非対称「ヤヌス粒子」であり得る。
本発明の多相ポリマー微粒子は、一部のポリマー相に磁性体を含むことができる。磁性体を含むポリマー相は、上記の第1又は第2のポリマー相のいずれかであっても良く、あるいはこれらと異なる第3のポリマー相であっても良い。ポリマー相中に磁性体を組み込むことで、多相ポリマー微粒子の挙動を磁場によって制御することが可能である。
磁性体は、特に限定するものではないが、鉄、クロム、コバルト、ネオジウムおよびその酸化物、硫化物等が挙げられ、好適に使用することができる。磁性体の大きさは、特に限定するものではないが、ナノサイズの微粒子中に組み込むために、粒径1〜100nmの範囲の磁性ナノ粒子とすることができる。また、それらが数個から数十個の凝集体を形成していてもよい。磁性ナノ粒子は、例えばAldrich社製酸化鉄ナノ粒子等を好適に使用することができる。
本発明に用いることができる多相ポリマー微粒子を図１に模式的に示す。図１に示す微粒子は、一方のポリマー相（第1のポリマー相）にアミノ基１を有し、このアミノ基を介してアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質と共有結合することができる。他方のポリマー相には標識物質、例えば蛍光物質２を有するものとすることができる。また、図１では、第1のポリマー相中に磁性体３が組み込まれている。
磁性体は、ポリマー中に安定に組み込むために、磁性体と親和性を有する部分とポリマーと親和性を有する部分とを有する化合物、例えばポリスチレン-ポリドーパミンメタクリルアミドランダム共重合体（PS-r-PDMA）を用い、磁性体をポリマー親和性を有する材質で被覆した状態で多相ポリマー微粒子中に組み込むことができる。このようにしてポリマーとの親和性が増大した形態の磁性体は、多相ポリマー微粒子の生成過程でポリマー溶液中に混和させる事により、析出した微粒子中に組み込むことができる。例示したPS-r-PDMAは、ポリスチレンを含むため、ポリスチレンポリマーからなるポリマー相に好都合に組み込まれ得る。磁性体のポリマー被覆は、例えば特許第5008009号に記載の方法によって好適に行うことができる。磁性体は、得られる多相ポリマー微粒子が、例えば約50mT以上の磁場において収集可能なものとなるように組み込むことが好適であり得る。
本発明の多相ポリマー微粒子は、上記のように第1のポリマー相の表面上にアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質を共有結合させたものである。アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質は、そのまま多相ポリマー微粒子に共有結合させることができる。あるいは、アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質を化学的に修飾して反応性基を付加することができる。結合は、当分野において通常使用されるリンカーを用いるものでも良い。
例えば、アルドステロンは、上記に構造を示す通り、1個のカルボキシル基、1個の水酸基及び2個のカルボニル基が存在する。上記の官能基のうち、比較的反応性が高い水酸基が存在する位置は抗アルドステロン抗体の認識部位と重なり得るため、本発明の目的においてアルドステロンを多相ポリマー微粒子に結合するためには、例えばO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩等の試薬を用いて上記の水酸基以外の部位に結合のための官能基を導入することが好ましい。アルドステロンに官能基を導入後に縮合試薬を用いたヤヌス粒子に結合させる態様を図２に模式的に示す。
また、下記に示すように、アルドステロン分子中にO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンで修飾可能な部位は3カ所あり、それぞれについて修飾された場合と修飾されない場合、一置換体が3種、二置換体が3種、及び三置換体が1種存在し得る。
Figure 0006977939
従って、官能基を導入する際の反応条件を調整して、目的の部位にのみ多相ポリマー微粒子との結合のための官能基を有する誘導体を作製することが好ましい。本発明において、アルドステロンの3位のカルボニル基における一置換体を作製することが特に好ましい。そのような選択的合成は、本明細書の記載及び当分野の技術常識に基づいて実施することができる。
一方、レニンは、タンパク質であるために、その構成アミノ酸中に多数のアミノ基及びカルボキシル基が存在する。従って、レニンと多相ポリマー微粒子との結合は、縮合剤の存在下で単に混合することによって達成できる。
この場合、後に記載する捕捉用試薬とアルドステロン又はレニンとの結合を妨げないように、アルドステロン又はレニン上の反応性基又は修飾部位を考慮して選択することが必要となる。例えば、アルドステロン又はレニンが抗原であり、捕捉用試薬が抗体である場合には、抗体が特異的に認識して結合するアルドステロン又はレニン上のエピトープではない部位を結合又は修飾するようにすることが必要である。当業者であれば、アルドステロン又はレニンの種類、及び捕捉用試薬との結合の種類に応じて、反応性基及び修飾部位を適宜選択し、決定することができる。例えば、レニンはそのＣ末端で多相ポリマー微粒子に共有結合させることができる。
また、アルドステロン又はレニンに代えて、これらのいずれかと特異的に結合し得る物質、例えば抗アルドステロン抗体、又は抗レニン抗体を第1のポリマー相の表面上に共有結合させることもできる。抗体もタンパク質であり、その構成アミノ酸中に多数のアミノ基及びカルボキシル基が存在するため、抗体と多相ポリマー微粒子との結合も、縮合剤の存在下で混合することによって達成できる。
多相ポリマー微粒子にアルドステロン又はレニンと特異的に結合し得る物質を結合させる態様では、アルドステロン又はレニンの検出に際して使用する捕捉用試薬、例えば抗体が特異的に認識して結合するアルドステロン又はレニン上のエピトープではない部位に結合する物質を選択する。例えば、捕捉用試薬としての抗体は、特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体とし、多相ポリマー微粒子に共有結合させる物質、例えば抗体は、捕捉用試薬が結合する部位とは異なる部位、例えば異なるエピトープに結合するもの、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とすることができる。あるいはまた、捕捉用試薬としてポリクローナル抗体を使用し、多相ポリマー微粒子に共有結合させる物質として、異なるエピトープに結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用することもできる。また、抗体の抗原結合部位以外の部位を多相ポリマー微粒子との結合のために選択する。
本発明の多相ポリマー微粒子はまた、一態様では上記のように第2のポリマー相の表面上に官能基を有し、この官能基と反応する反応性基を有する標識物質と共有結合させることができる。上記と同様に、標識物質自体に反応性基が存在する場合には、そのまま多相ポリマー微粒子に共有結合させることができ、標識物質に反応性基が存在しない場合には、予め標識物質が反応性基を有するように化学的に修飾することができる。あるいはまた、別の態様では、上記の通り、ポリマー微粒子の製造過程で標識物質を第2のポリマー相に組み込むことができる。
多相ポリマー微粒子は、平均粒径が1nm〜1mm、例えば100nm〜1mmの範囲の大きさのものを製造条件に応じて取得することが可能であり、特に限定するものではないが、例えば用途の一つとしての小型デバイス内でのアルドステロン又はレニンの検出のためには、平均粒径が約10nm〜約100μm、好ましくは約50nm〜約50μm、更に好ましくは約100nm〜約10μmの範囲のものとすることができる。ポリマー相中に磁性体を封入する場合には、十分な量の磁性体の封入のために平均粒径は約100nm以上のものとすることが好適である。粒径の変動係数は20％以内、好ましくは10％以内である。
本発明の多相ポリマー微粒子は、以下に具体的に記載する方法により、サンプル中のアルドステロン又はレニンを高感度・高精度に計測することができる。
［アルドステロン又はレニンの検出方法］
本発明はまた、被験者由来の生物学的サンプル中のアルドステロン又はレニンを検出する方法を提供する。
原発性アルドステロン症のスクリーニングのために、血漿中のアルドステロン濃度とレニン濃度の比率を用いることができることは知られている（例えばJournal of hypertension, Vol.33, No.12, 2015等）。血漿中のアルドステロン濃度の基準値は通常臥位で29.9〜159.0pg/mL、立位で38.9〜307.0pg/mLの範囲内であり、血漿中のレニン濃度の基準値は通常臥位で3.2〜36pg/mL、立位で3.6〜64pg/mLの範囲内であるとされており、血漿中のアルドステロン濃度（pg/mL）と活性型レニン濃度（pg/mL）の比が40を超える場合に原発性アルドスレロン症の疑いがあると考えられている。この場合、更に精密検査を受けることで、原発性アルドスレロン症の可能性を早期に見出し、治療及び合併症等の予防につなげることができる。
本発明の方法は、被験者由来のサンプル中のアルドステロン、及び／又はレニンの濃度を検出することができるため、原発性アルドステロン症のスクリーニングに使用することができる。本発明の方法は、アルドステロン濃度のみを検出しても良く、またレニン濃度のみを検出しても良い。あるいはまた、本発明の方法は、アルドステロン及びレニンの双方の濃度を、好ましくは同時に、検出することができる。レニンの検出は、特に限定するものではないが、好ましくは活性型レニンを検出する。
本発明の方法は、具体的には、以下の工程：
アルドステロン又はレニンのいずれかに特異的に結合する1種以上の捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
該固相支持体と上記本発明の多相ポリマー微粒子とを接触させる工程；及び
固相支持体上の捕捉用試薬に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む。
本発明の方法の一実施形態では、微粒子はアルドステロン又はレニン、例えばアルドステロンが共有結合した微粒子であり、サンプル中のアルドステロンと微粒子上に存在するアルドステロンとが捕捉用試薬に競合的に結合し、サンプル中のアルドステロンが未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在するアルドステロンとが結合するものである。
本発明の方法の別の実施形態では、微粒子はアルドステロン又はレニンと特異的に結合し得る物質、例えば抗レニン抗体が共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中のレニンと微粒子上に存在する抗レニン抗体とが結合するものである。
上記の方法において、特に限定するものではないが、生物学的サンプルは、具体的には血液、血漿、又は血清である。サンプルはそのまま本発明の方法に使用しても良く、あるいは上記の固相支持体と接触させる工程の前に、溶解工程、及び／又は反応と無関係の夾雑物質、例えば赤血球、白血球、血小板、検出対象以外のタンパク質等を除去する工程等を含めても良い。夾雑物質を除去する工程は、例えば遠心分離等の操作によって行うことができる。また、サンプルは、必要に応じて希釈又は濃縮することができる。溶解及び希釈は、本発明の方法に適した水性溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水等を使用して行うことができる。
捕捉用試薬としては、特に限定するものではないが、例えばアルドステロン又はレニンを抗原とする抗体とすることができる。抗体は、いずれかの生物種に由来する天然の抗体であっても、遺伝子改変された抗体であっても、あるいは合成された抗体であっても良く、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体は、特に限定するものではないが、アルドステロン又はレニンと特異的に結合し得るIgG抗体、その抗原結合性を保持する断片、又は誘導体であっても良く、例えばFab、F(ab')2断片等を好適に使用できる。捕捉用試薬とアルドステロン又はレニンとは、分子単位で１：１で結合することが好ましい。
アルドステロンに特異的に結合し得る抗アルドステロン抗体としては、例えばモノクローナル抗体A2E11等が挙げられる。また、レニンに特異的に結合し得る抗レニン抗体としては、例えばモノクローナル抗体MAB4090、モノクローナル抗体3E8及び4G1、モノクローナル抗体Renin MCA 12-12及びRenin MCA 11-6が挙げられる。モノクローナル抗体MAB4090、4G1、Renin MCA 12-12は活性型レニン及び不活性型レニンのいずれにも結合することができ、一方モノクローナル抗体3E8、Renin MCA 11-6は活性型レニンにのみ結合することができる。
レニンの検出の場合、捕捉用試薬、多相ポリマー微粒子の少なくともいずれかが活性型レニンの検出に適したものとすることが好ましい。例えば、捕捉用試薬を活性型レニンのみに結合する抗体とし、活性型レニンを共有結合させた多相ポリマー微粒子、又は活性型及び不活性型レニンの双方に結合し得る抗レニン抗体を共有結合させた多相ポリマー微粒子を使用することが好ましい。あるいは、捕捉用試薬を活性型及び不活性型レニンの双方に結合し得る抗レニン抗体とし、活性型レニンのみに結合する抗体を共有結合させた多相ポリマー微粒子を使用することが好ましい。
捕捉用試薬は、予想されるサンプル中のアルドステロン又はレニンの量に対して分子単位で同量以上とすることが望まれる。捕捉用試薬の量が少なすぎる場合には、検出すべきアルドステロン又はレニンの一部が捕捉用試薬に結合せず、従ってアルドステロン又はレニンの正確な検出ができないためである。後の工程において、固相支持体と多相ポリマー微粒子とを結合させ、結合した多相ポリマー微粒子の標識を検出するために、捕捉用試薬は予想されるサンプル中のアルドステロン又はレニンの量に対して過剰量、例えば1.1倍以上、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上とすることが好ましい。
捕捉用試薬は、後の工程のために、固相支持体上に固定されている。固相支持体は、当分野において通常使用される材質のもの、例えばプラスティック、ガラス、シリコン等を好適に使用し得る。固相支持体は、アルドステロン又はレニンの非特異的な吸着を防止するために表面処理されたものを使用し得る。
サンプルと固相支持体との接触は、静止状態で行っても、流動的に行っても良い。例えば、ウェル等の固相支持体上にサンプルを添加することで接触させることができ、また固相支持体が固定された流路にサンプルを通過させて接触させることができる。サンプルと固相支持体との接触の後、アルドステロン又はレニン以外のサンプル中の成分を、緩衝液を用いた洗浄によって除去することが好ましい。
次いで、サンプル中のアルドステロン又はレニンが結合した固相支持体と、上記本発明の多相ポリマー微粒子とを接触させる。上記の通り、固相支持体上の捕捉用試薬は、サンプル中のアルドステロン又はレニンの量に対して分子単位で同量以上であり、好ましくは過剰量である。従って、固相支持体上には、サンプル中のアルドステロン又はレニンと未結合の捕捉用試薬が存在し得る。
多相ポリマー微粒子としてアルドステロン又はレニンが共有結合した微粒子を使用する実施形態では、多相ポリマー微粒子にサンプル中のアルドステロン又はレニンと実質的に同じアルドステロン又はレニンが共有結合されているため、多相ポリマー微粒子に結合した状態のアルドステロン又はレニンが捕捉用試薬と結合することができる。すなわち、多相ポリマー微粒子に共有結合したアルドステロン又はレニンと、サンプル中のアルドステロン又はレニンとは、捕捉用試薬に競合的に結合し得る性質を有し、捕捉用試薬に対する結合親和性は同等である。
本実施形態では、捕捉用試薬を先にサンプルと接触させるため、多相ポリマー微粒子に共有結合したアルドステロン又はレニンは、既に結合したアルドステロン又はレニンの結合を阻害することなく、未結合の捕捉用試薬と結合することができる。捕捉用試薬と結合しなかった微粒子は、必要に応じて、その後の洗浄操作により除去することができる。
本実施形態では、次に、固相支持体上の捕捉用試薬に結合した微粒子上の標識を検出する。標識は、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質であり、それぞれ蛍光、化学発光又は放射性物質からの放射線を検出することにより、微粒子上の標識を検出することができる。
図３に示すように、サンプル中に多量のアルドステロン又はレニンが存在する場合（図３Ｃ）には、アルドステロン又はレニン（□で示す）が捕捉用試薬（▽で示す）に結合するため、未結合の捕捉用試薬が少なくなり、従って多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上のアルドステロン又はレニン（□）との結合は競合的に阻害されるため、捕捉用試薬に結合した微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度は比較的低くなる。
これに対して、サンプル中にアルドステロン又はレニンが存在しない（図３Ａ）か少量である（図３Ｂ）場合には、アルドステロン又はレニンと未結合の捕捉用試薬が多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上のアルドステロン又はレニンと結合することとなり、微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が高くなる。
多相ポリマー微粒子としてアルドステロン又はレニンと特異的に結合し得る物質が共有結合した微粒子を使用する実施形態では、多相ポリマー微粒子に結合した状態の物質が、捕捉用試薬に結合したサンプル中のアルドステロン又はレニンと結合することができる。この場合、多相ポリマー微粒子に結合した物質と、捕捉用試薬とは、アルドステロン又はレニンの異なる部位を認識して結合するものとし、サンドイッチアッセイ法としての検出方法となる。
本実施形態では、捕捉用試薬を先にサンプルと接触させるため、多相ポリマー微粒子に共有結合した物質は、捕捉用試薬に既に結合したアルドステロン又はレニンと結合し、アルドステロン又はレニンが結合していない捕捉用試薬とは反応しない。アルドステロン又はレニンと結合しなかった微粒子は、必要に応じて、その後の洗浄操作により除去することができる。
本実施形態では、次に、捕捉用試薬を介して固相支持体上に存在するアルドステロン又はレニンに結合した微粒子上の標識を検出する。標識は、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質であり、それぞれ蛍光、化学発光又は放射性物質からの放射線を検出することにより、微粒子上の標識を検出することができる。
図４に示すように、サンプル中に多量のアルドステロン又はレニンが存在する場合（図４Ｃ）には、アルドステロン又はレニン（□で示す）が捕捉用試薬（▽で示す）に結合し、多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上のアルドステロン又はレニンと特異的に結合し得る物質（▲）が更に結合するため、アルドステロン又はレニンに結合した微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が高くなる。
これに対して、サンプル中にアルドステロン又はレニンが存在しない（図４Ａ）か少量である（図４Ｂ）場合には、捕捉用試薬と結合したアルドステロン又はレニン量が少なくなるため、微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が低くなる。
本発明の方法により、サンプル中のアルドステロン若しくはレニンの量又は濃度を別個に検出することもできる。あるいは、サンプル中のアルドステロン及びレニンの量又は濃度を同時に検出することもできる。アルドステロン及びレニンを同時に検出する場合には、これらをそれぞれ表面上に有する2種の多相ポリマー微粒子を作製し、これらを別個に、連続して、又は同時に固相支持体と接触させる。この場合、検出に用いる標識物質を異なるものとし、例えば蛍光波長の異なる蛍光物質を用いることが好ましい。
磁性体を含む多相ポリマー微粒子を用いる場合、磁性体は、アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質と結合したポリマー相中に封入することが好ましい。この場合、固相支持体に磁場をかけた状態で、例えば予め個数が定められた粒子数の多相ポリマー微粒子を固相支持体上と接触させることで、多相ポリマー微粒子上に共有結合したアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質と固相支持体上の捕捉用試薬又はアルドステロン若しくはレニンとの結合を効率的に行うことができると共に、多くの場合に微粒子の反対側表面上に存在する標識からの信号の検出感度を上げることができる。
本発明の方法により、0.1pg/mL〜1000mg/mLの範囲の検体物質を検出することができる。サンプルは、必要に応じ、濃縮又は希釈して本発明の検出方法に供することができる。
［アルドステロン又はレニンの検出システム］
本発明はまた、サンプル中のアルドステロン又はレニンの捕捉手段と、捕捉されたアルドステロン又はレニンの検出手段とを含む、サンプル中のアルドステロン又はレニンの検出のためのシステムを提供する。
本発明のシステムにおいて、上記捕捉手段は、アルドステロン又はレニンと特異的に結合する試薬が固定された固相支持体である。固相支持体は、当分野において通常使用される材質のもの、例えばプラスティック、ガラス、シリコン等を好適に使用し得る。固相支持体は、アルドステロン又はレニンの非特異的な吸着を防止するために表面処理されたものを使用し得る。固相支持体は、例えばウェル、チップ等の形態であって良く、一実施形態では、サンプル及び多相ポリマー微粒子を通過させる流路上に固定したものであって良い。また、流路内表面の材質としては、固定化する分子に合わせて、限定するものではないが、例えばニトロセルロース膜、シリコン樹脂、金コーティング等を使用することができる。
固相支持体には、アルドステロン及びレニンのいずれかと特異的に結合して捕捉できる1種以上の捕捉用試薬を固定化する。例えば、固相支持体には、アルドステロンと特異的に結合する捕捉用試薬のみを固定化しても良く、レニンと特異的に結合する捕捉用試薬のみを固定化しても良い。あるいは、固相支持体には、アルドステロン及びレニンの双方の検出が可能であるように、双方に特異的に結合する捕捉用試薬を同時に固定化することもできる。捕捉用試薬としては、特に限定するものではないが、例えばアルドステロン又はレニンを抗原とする抗体とすることができる。アルドステロン又はレニンと捕捉用試薬との特異的結合を確実なものとするための反応条件等は、当業者であれば容易に認識し、適宜選択することができる。
本発明のシステムにおいて、上記検出手段は、サンプル中のアルドステロン若しくはレニンと未結合の捕捉用試薬、又は捕捉用試薬に結合したアルドステロン若しくはレニンと上記本発明の多相ポリマー微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである。
本発明のシステムは、使用が簡便な小型デバイスの形態で提供することができる。この場合、デバイス内に、サンプル及び本発明の多相ポリマー微粒子を通過させるマイクロ流路を設け、流路上に捕捉用試薬を固定した固相支持体としてチップを固定しても良い。あるいはまた、ポンプ及び検出系を有するシステム中に捕捉用試薬を固定したチップの形状にしたマイクロ流路（流路チップ）を挿入するような構成としても良い。マイクロ流路は、例えば断面の高さが約50μm〜約200μm、幅が約100μm〜約2mm、長さが約10mm〜50mmの範囲のものとすることができる。マイクロ流路の材質は、ポリジメチルシロキサンなどのシリコン樹脂やポリエチレンテレフタラート等のプラスティックとすることができる。また、チップの材質としては、例えばプラスティックやガラス等を使用することができる。チップはディスポーザブルタイプのものとすることができる。小型デバイスの構成及び形状は、当分野において通常用いられている手段を用いて、適宜選択することができる。特に限定するものではないが、小型デバイスとしては、約0.25〜400cm3の範囲のサイズ、0.4〜20gの重量のものが好適に使用できる。
また、蛍光による検出を行う態様では、検出手段として、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラ、フォトダイオード、フォトマルチプライヤー等を使用することができる。化学発光物質による検出を行う態様では、検出手段として、CCDカメラを使用することができる。放射性標識物質による検出を行う態様では、検出手段として、シンチレーション検出器等を使用することができる。検出手段は、上記の捕捉手段と共に同じデバイス中に構成することもできるが、捕捉手段と検出手段とは別個に構成しても良い。
図５に、本発明のシステムを模式的に示す。図５に示すように、固相支持体４上に固定された捕捉用試薬５に、サンプル中のアルドステロン又はレニンと未結合の捕捉用試薬に結合した多相ポリマー微粒子、又はアルドステロン若しくはレニンを介して捕捉用試薬に結合した多相ポリマー微粒子が存在する（図示せず）ため、第1のポリマー相とは異なる領域、例えば逆の半球側に存在する第2のポリマー相に結合した標識物質からの信号、例えば蛍光の量を、検出手段６（例えばCCDカメラ）によって計測することができる。磁性体を含む多相ポリマー微粒子を用いる場合には、磁性体は、第1のポリマー相中に封入することが好ましい。この場合、固相支持体に磁場７をかけた状態で多相ポリマー微粒子を通過させることで、流路上に多相ポリマー微粒子を集積させることができる。これにより、多相ポリマー微粒子上に共有結合したアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質と、固相支持体上の捕捉用試薬又はアルドステロン若しくはレニンとの結合を効率的に行うことができると共に、多くの場合に微粒子の反対側表面上に存在する標識からの信号の検出感度を上げることができる。多相ポリマー微粒子は、予め定められた粒子数を用いることにより、検出結果から捕捉用試薬に結合した微粒子の数を容易に算出することができる。
本発明のシステムでは、上記の検出手段によって多相ポリマー微粒子中の標識を検出し、それによってサンプル中のアルドステロン又はレニンの量及び／又は濃度を測定することができる。
更に、本発明のシステムは、サンプル中のアルドステロン濃度と活性レニン濃度との比率を算出する手段、例えばコンピュータ、原発性アルドステロン症に罹患する可能性の有無を示す計測結果を表示するような表示手段、例えばディスプレイを組み込んでも良い。
本発明のシステムは、ナノサイズの多相ポリマー微粒子とマイクロ流路を有する小型デバイスを組合せることにより、サンプル中のアルドステロン又はレニンを高感度で迅速かつ簡便に測定できる。マイクロ流路には、アルドステロン又はレニンを捕捉できる捕捉用試薬、例えば抗体を固定化する。例えば、流路中に捕捉用試薬として抗レニン抗体を固定化し、多相ポリマー微粒子（ヤヌス粒子）と結合した抗活性型レニン抗体を用いて、サンドイッチ法のイムノアッセイ法により、サンプル中の活性型レニンを高感度で検出することができる。
小型デバイス形態のシステムは、アルドステロン又はレニンを含む可能性のある被験者由来のサンプル（臨床検体）をデバイスの挿入口に塗布するだけで計測することができ、必要とされる検体量が少量であり、また検査・診断に使用する試薬量も少なくすることができる。従って、検査費用の削減に繋がり、従来使用されてきた検査システムと比較してより安価な診断薬および診断装置としての提供が可能である。
また、本発明のシステムは、洗浄することで繰り返し使用可能であり、またディスポーサブルタイプとすることができる。
［キット］
本発明は更に、アルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が共有結合された本発明の多相ポリマー微粒子と、サンプル中のアルドステロン又はレニンと特異的に結合する捕捉用試薬、及び捕捉されたアルドステロン又はレニンの検出器を有するデバイスと、アルドステロン又はレニンと捕捉用試薬との結合反応、多相ポリマー微粒子の結合反応、及び検出のために必要な試薬とを含む、サンプル中のアルドステロン又はレニンの検出のためのキットを提供することができる。検出手段として化学発光物質を用いる場合には、酵素反応のために必要な基質等もキットに含めることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［調製例１：ヤヌス粒子の製造］
末端にピレニル基を有するポリスチレン（PS-Pyr、Mn=3,500、Polymer Source社）の0.1、1.0又は5.0mg/mL THF溶液0.5mL、及び末端にアミノ基を有するポリブタジエン（PB-NH2、Mn=1,700、Polymer Source社）の0.1、1.0又は5.0mg/mL THF溶液0.5mlを12 mlのシランカップリング剤で処理した褐色疎水化バイアル中で混合した後、水を1ml/分の速度で1.0ml添加し、ボルテックスで撹拌した。得られた混合液を真空オーブン中で常温で2時間加熱してTHFを蒸発させ、冷却後に0.2％の四酸化オスミウム水溶液を添加して15分間染色し、透過型及び走査型電子顕微鏡で粒子を観察した。上記の製造工程を図６（１）に模式的に示す。
得られた粒子は、図７Ａ及びＢの顕微鏡写真からわかるように、四酸化オスミウムで染色されるポリマー領域（ポリブタジエン）と、ピレニル基からの蛍光が検出されるポリマー領域とが明確に分かれており、ポリスチレンからなるポリマー相が選択的に蛍光標識されていることが確認された。他の条件を同一とした場合に、用いる出発ポリマー濃度が高い程粒径が大きくなることが確認された（データは示さず）。
［調製例２：磁性ヤヌス粒子の製造］
酸化第二鉄（Fe2O3）粉末（粒径50nm以下）90 mgを10 mlの透明バイアル中のDMF 5mlに分散し、ホモジナイザー（強度30％）で10分間ホモジナイズした。これにMacromolecular Rapid Communications, 35(20), 1763-1769 (2014)に記載の方法で合成したドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの４：１ランダム共重合体（D41）又は８：１ランダム共重合体（D81）30mg、及びTHF 1mlを添加して更に10分間ホモジナイズした後、最大振とう速度にて12時間、振とうしながら反応させた。反応液をテフロン（登録商標）製遠心管に移し、10,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去した。これにクロロホルム10mlを添加して約30秒間ボルテックスして同様に遠心分離することで3回洗浄した。ペレットにクロロホルムを添加した分散液を再度10 mlの透明バイアルに移し、常温で2時間真空乾燥したのち、重量を測定し、10g/l又は1g/lの粒子濃度のTHF分散液とし、透過型電子顕微鏡（TEM）により粒子を観察すると共にファイバー光学動的光散乱光度計（Fiber-optic Dynamic Light Scattering、FDLS）により粒径分布を測定した。
その結果、D41を使用した場合には、約200〜350nmの範囲の粒径を有し、平均粒子径は約430nmの磁性ナノ粒子が得られ、D81を使用した場合には、約100〜約400nmの範囲の粒径を有し、平均粒子径は約285nmの磁性ナノ粒子が得られた。
得られた磁性ナノ粒子を10g/l THF溶液0.1mlを、ポリスチレンのTHF溶液及びポリブタジエンのTHF溶液に加え、調製例１と同様にしてヤヌス粒子を製造した。
［調製例３：アルドステロン-CMOの合成］
アルドステロン（Toronto Research Chemicals Inc.）25mg（0.038 mM）、
Figure 0006977939
 及びO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（Sigma-Aldrich）45mg（0.196 mM）を、ピリジン/メタノール/水を1:4:1で含む混合溶液2.1 mL中で室温で一晩反応させた。反応生成物をクロロホルムで抽出し、真空下でクロロホルムをエバポレートして、生成物を粘調な液体として得た。アルドステロンには、上記の反応によってO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミノ基が結合し得る部位が複数存在するため、生成物はこれらの反応産物の混合物と考えられた。
誘導体の生成を確認するために、アルドステロンと、反応後の生成物とをフーリエ変換赤外分光分析（FT-IR）によって分析した。反応後の生成物の分析結果では、アルドステロンで見られたピーク（1715〜1740cm-1におけるC=Oのピーク、及び1680cm-1におけるC=Oのピークが見られなくなり、代わりに生成オキシムによると思われる3つのピークが観察された（データは示さない）。
次に、得られた生成物を質量分析により分析した。質量分析は、MALDI-TOF-MS（AB SCIEX社製、CHCAマトリクス）で行った。その結果、アルドステロンによるピークに加えて、アルドステロンに1分子、2分子、及び3分子のO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンが結合した化合物によると思われるピークがそれぞれ確認された（図８）。
［調製例４：アルドステロン-3-オキシムの選択的合成］
調製例３では、アルドステロンへのO-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンの結合部位及び結合分子数が異なる複数の生成物の混合物が得られた。これらの混合物を精製することで目的の置換体を得ることは可能であるが、次いで、以下に示す構造を有する一置換体の3-オキシムを選択的に合成することを検討した。
Figure 0006977939
具体的には、J. K. McKenzie及びJ.A. Clements, J. Clin. Endocrinol. Metab., 38(4), 622 (1974)に記載された方法を用いて行い、アルドステロン40mg（1.108mM）、O-(カルボキシメチル)ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩20mg（1.828mM）、及び無水酢酸ナトリウム40mgを、窒素下でメタノール10mLに溶解し、室温で2時間撹拌した。反応物の生成は、反応開始から30分、1.5時間及び2時間後に、ベンゼン：メタノール＝7：3を展開溶媒とするアルミナ及びシリカ上の薄層クロマトグラフィーによって確認した。
2時間の反応後に、生成物を水に溶解させ、1N 塩酸を添加してpH2.0に調整した後、塩化メチレンを最終量が50mLになるように加え、上清の水相を除去した。次いで、塩化メチレン相に1N NaOHを添加して良く混合した後、上清（NaOH相）を除去した。塩化メチレン相を更に水で2回洗浄した後、硫化ナトリウムを加え、吸引濾過を行い、濾液の溶媒をエバポレーターで除去した。
得られた生成物を、調製例２と同様の条件を用いて質量分析により分析した。結果を図９に示す通り、上記の反応で目的の一置換体を選択的に得ることができた。上記の製造工程を図６（２）に模式的に示す。
［実施例１：ヤヌス粒子へのアルドステロンの固定］
10mL透明バイアル中で、調製例１で得られたヤヌス粒子1 mgの水分散液1mLに、調製例４で得られたアルドステロン-3-オキシム 5mg/mLメタノール溶液1mLを添加し、縮合剤として1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-カルボジイミド（EDC）約3mgを用いて、室温で一晩、振とうしながら反応させた。その結果、アルドステロン-CMOが蛍光標識されたポリスチレン領域ではないポリブタジエン領域に選択的に結合することが確認された。また、アルドステロン-CMOとの結合反応後、ポリスチレン領域からの蛍光も保持されていることが確認された（データは示さない）。上記の製造工程を図６（３）に模式的に示す。
上記の反応により、用いたアルドステロン-3-オキシムの約32％がヤヌス粒子と結合し、ヤヌス粒子の粒径を500nmとした場合の結合数は粒子あたり191個であった。図１０は、アルドステロン-3-オキシムの濃度に比例して350nmにおける吸光度が上昇し、アルドステロン-3-オキシムが粒子に結合していることを示す。
［実施例２：磁性ヤヌス粒子へのアルドステロンの固定］
調製例２で得られた磁性ヤヌス粒子を用い、実施例１と同様にしてアルドステロン-3-オキシムを固定した。
得られた粒子は、実施例１の粒子と同様に、ポリスチレン領域からの蛍光が確認され、かつポリブタジエン領域に選択的なアルドステロン-CMOの結合が確認され、また、磁性を有するため、磁石を用いて回収することができる。
［実施例３：ヤヌス粒子を用いたアルドステロンアッセイ］
96ウェルプレート（Nunc社）の各ウェル表面に抗アルドステロン抗体（A2E11）を固相化し、0.1〜100pg/mL濃度のアルドステロン（Toronto Research Chemicals Inc.）を含有するサンプルを添加し、室温で5分間インキュベートした。次いで、実施例１で調製したアルドステロン結合ヤヌス粒子1.0mg/mLを添加し、室温で一晩インキュベートした。
洗浄後、励起波長345nm、蛍光波長450nmとして蛍光顕微鏡（Olympus Cell Dimension）で観察し、画像ソフトを用いて蛍光（合計輝度）を数値化した。アルドステロン結合ヤヌス粒子のみを添加した場合の蛍光強度を100とし（B0）、アルドステロン含有サンプルを添加した場合の蛍光強度をBとし、グラフを作成した。
その結果、図１１Ｂに示す通り、サンプル中のアルドステロン量が少ない場合にヤヌス粒子に結合した蛍光色素であるピレンからの蛍光強度が高くなり、サンプル中のアルドステロン量が多くなるにつれて蛍光強度が低くなることが示された。
［実施例４：ヤヌス粒子を用いたレニンの測定］
調製例１で得られたヤヌス粒子に縮合剤の存在下で抗マウスレニン抗体(#AF4277, R&D systems社)を共有結合させ、ヤヌス粒子を調製した。
一方、抗マウスレニン抗体（#BAF4277, R&D systems社）を捕捉用試薬として、PBSバッファ中1μg/mLで96ウェルプレート（Nunc社）の各ウェル表面に固定し、これに組換えマウスレニン（4277-AS-020, R&D systems社）を含むサンプルを加え、室温で2時間インキュベートした。
次いで、上記の抗マウスレニン抗体結合ヤヌス粒子（4×106個/mL, 100μL）を添加し、4℃で一晩インキュベートした。
洗浄後、蛍光顕微鏡で観察し、励起波長345nm、蛍光波長450nmとして蛍光を検出した。サンプル中のレニン量が少ない場合にはウェル表面上の抗マウスレニン抗体と結合するレニン量が少なくなり、ヤヌス粒子の結合も少なくなるため、蛍光強度が低くなり、サンプル中のレニン量が多くなるにつれて、得られる蛍光強度は高くなり、従って、サンプル中のレニン濃度に依存した蛍光が検出されることが確認された。
本発明により、血漿等の生物学的サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンの測定のための多相ポリマー微粒子が提供される。この微粒子をセンサとして、マイクロ流路のチップデバイスを組合せることにより、原発性アルドステロン症診断用として、臨床検体中のアルドステロンあるいはレニンを高感度で迅速かつ簡便に測定できる高血圧症用の診断センサを提供することができる。
１ アミノ基
２ 蛍光物質
３ 磁性体
４ 固相支持体
５ 捕捉用試薬
６ 検出手段
７ 磁場
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相にアルドステロン若しくはレニン、又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が共有結合しており、第2のポリマー相が標識物質を有し、該2種以上のポリマーが、いずれも
    １）N-イソプロピルアクリルアミド若しくはポリエチレングリコールである水溶性ポリマー、
    ２）非水溶性ポリマー、及び
    ３）共重合体
    から選択される、上記微粒子。
  2. 第1及び第2のポリマー相のポリマーの組合せが、ポリエチレングリコールとN-イソプロピルアクリルアミド、ポリスチレンとポリイソプレン、ポリスチレンとポリブタジエン、ポリスチレンとポリ乳酸、又はポリスチレンとポリブチルアクリレートである、請求項１記載の微粒子。
  3. 第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、請求項１又は２記載の微粒子。
  4. 標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の微粒子。
  5. 被験者由来の生物学的サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンを検出する方法であって、以下の工程：
    アルドステロン又はレニンのいずれかに特異的に結合する1種以上の捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
    該固相支持体と請求項１〜４のいずれか１項記載の微粒子とを接触させる工程；及び
    固相支持体上の捕捉用試薬に結合した微粒子上の標識を検出する工程
    を含む、上記方法。
  6. 微粒子がアルドステロンに共有結合した微粒子であり、サンプル中のアルドステロンが未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在するアルドステロンとが結合する、請求項５記載の方法。
  7. 微粒子が抗レニン抗体に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中のレニンと微粒子上に存在する抗レニン抗体とが結合する、請求項５記載の方法。
  8. 生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 捕捉用試薬がアルドステロン又はレニンに対して特異的な抗体である、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 生物学的サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンの捕捉手段と、捕捉されたアルドステロン又はレニンの検出手段とを含む、サンプル中のアルドステロン及び／又はレニンの検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、アルドステロン又はレニンのいずれかと特異的に結合する1種以上の試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中のアルドステロン若しくはレニンと未結合の捕捉用試薬、又は捕捉用試薬と結合したアルドステロン若しくはレニンと、請求項１〜４のいずれか１項記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
  11. 小型デバイスの形態で提供される、請求項１０記載のシステム。
  12. 固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、請求項１１記載のシステム。
  13. 検出手段が、CCDカメラ、フォトダイオード、フォトマルチプライヤー、又はシンチレーション検出器である、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のシステム。
  14. アルドステロン又はレニンの量及び／又は濃度を測定する、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のシステム。
  15. 更に、サンプル中のアルドステロン濃度と活性型レニン濃度との比率を算出し、原発性アルドステロン症に罹患する可能性の有無を示す計測結果が表示される、請求項１０〜１４のいずれか１項記載のシステム。
  16. アルドステロン若しくはレニン、又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質が予め結合された請求項１〜４のいずれか１項記載の微粒子と、アルドステロン又はレニンと特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉されたアルドステロン若しくはレニン又はこれらのいずれかと特異的に結合し得る物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中のアルドステロン又はレニンの検出のためのキット。
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