WO2018194151A1 - 多相ポリマー微粒子を用いた検体物質の検出方法 - Google Patents

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藪　浩
久美 井上
さつき 佐藤
珠玖　仁
靖久 根本
郁麻 前田
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株式会社ハプロファーマ
国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to a novel multiphase polymer fine particle and a method for detecting a specimen substance using the fine particle. More specifically, the present invention provides a high-sensitivity detection / analysis technique for a specimen substance derived from a living body by using nano-sized multiphase polymer fine particles.
  • Janus particles Anisotropic particles with multiple, often two, surfaces with different properties are sometimes called Janus particles. Since Janus particles are anisotropic in interaction with other molecules and other environments, for example, in a dispersed system, they are self-organized into various structures according to different regions, and crystals that are not found in ordinary isotropic particles. Form a structure. For these reasons, Janus particles are also used as a model system for elucidating characteristics of physical properties such as anisotropic particle dispersion characteristics and dynamic behavior of particles.
  • Patent Documents 1 and 2 The present inventors have developed a method for easily producing Janus particles made of different materials in each hemisphere. These methods use a self-organized precipitation (SORP) method to add a poor solvent that does not dissolve the polymer to a solution containing two types of polymers with different properties, and then evaporate and remove the good solvent. The dispersion liquid containing the submicron-sized polymer fine particles separated by phase substitution with a poor solvent is obtained.
  • SORP self-organized precipitation
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay
  • radioimmunoassay is generally used to detect biological specimens.
  • the work process is complicated and time-consuming, so improvements are required. It has been.
  • the inventors focused on the fact that Janus particles that can be prepared by the self-assembled precipitation method that have already been developed can be used to improve the detection method of the above-mentioned specimen substance, and for the configuration and practical application of fine particles.
  • the surface of one of the microparticles is modified with a sample substance or a substance that can specifically bind to the sample substance, and the other surface is modified with a labeling substance for detection.
  • magnetic Janus particles having magnetic field responsiveness could be produced by mixing a magnetic substance into a polymer solution during the Janus particle production process.
  • the present inventors have developed a chip device that can be fixed in a microchannel (for example, JP 2008-14791 A). Since this chip device can immobilize a capture reagent that interacts with the sample substance on the surface in the flow channel, it can detect various sample substances.
  • the above functionalized Janus particles can function as a measurement sensor capable of detecting a specimen substance with higher accuracy and speed and convenience than in the conventional detection method.
  • the present invention provides the following.
  • a multiphase polymer fine particle having at least two or more kinds of polymer phases formed by aggregation of two or more kinds of polymers on the surface, wherein the first polymer phase specifically binds to the analyte substance or the analyte substance. Said microparticles capable of binding to the resulting substance and wherein the second polymer phase has a labeling substance.
  • 2. The fine particles according to 1 above, wherein the first or second polymer phase or the third polymer phase contains a magnetic substance.
  • 3. A multiphase polymer microparticle having a sample substance covalently bonded to the first polymer phase of the microparticle according to 1 or 2 or a substance capable of specifically binding to the sample substance. 4). 4.
  • a method for detecting an analyte substance in a sample comprising the following steps: Contacting the sample with a solid phase support on which a capture reagent that specifically binds to the analyte is immobilized; The method as described above, comprising the step of bringing the solid support into contact with the fine particles according to any one of 3 to 6 above; and detecting a label on the fine particles bound on the solid support. 8).
  • the microparticles are microparticles covalently bound to the analyte substance, and the capture reagent to which the analyte substance in the sample is not bound binds to the analyte substance present on the microparticle.
  • a microparticle is a microparticle that is covalently bonded to a substance that can specifically bind to the analyte substance, and the analyte substance in the sample bound to the capture reagent and a substance that can specifically bind to the analyte substance present on the microparticle are 8.
  • the method according to 7 above which is combined. 10. 10. The method according to any one of 7 to 9 above, wherein the analyte is contained in the biological sample. 11. 11. The method according to 10 above, wherein the biological sample is blood, plasma, or serum. 12 12. The method according to any one of 7 to 11 above, wherein the capture reagent is an antibody. 13.
  • a system for detecting an analyte substance in a sample comprising a means for capturing an analyte substance in a sample and a means for detecting the captured analyte substance, wherein the capture means specifically binds to the analyte substance 7.
  • a solid phase support on which a reagent is fixed, wherein the detection means comprises an analyte substance in the sample and an unbound capture reagent or an analyte substance bound to the capture reagent, and any one of 3 to 6 above A system as described above for detecting a detectable label by binding to microparticles. 14 14.
  • the solid support is a chip fixed on a microchannel in a device through which a sample passes.
  • the detection means is a CCD camera that detects fluorescence from fine particles captured on a solid support.
  • 17. The system according to any one of 13 to 16, which measures the amount and / or concentration of the analyte substance. 18.
  • 18. The system according to any one of 13 to 17, wherein a measurement result is displayed when the concentration is higher or lower than at least a preset threshold value. 19.
  • microparticles according to any one of 3 to 6 above, wherein the target analyte substance or a substance capable of specifically binding to the analyte substance is bound in advance, a capture reagent that specifically binds to the analyte substance in the sample, and the captured analyte
  • a kit for detecting an analyte substance in a sample comprising a device having an analyte substance detector and a reagent necessary for a reaction.
  • the measurement sensor that combines the multiphase polymer fine particles of the present invention with a chip device can be used for various biological origins by making use of the anisotropic particle dispersion characteristics of the Janus particles and the physical properties such as the dynamic behavior of the particles.
  • the sensitivity and accuracy of the detection system with respect to the sample substance can be improved.
  • the detection system can be used for diagnosis with a disease biomarker, inspection for viruses and pathogens, and the like.
  • the multiphase polymer fine particle which can be used for this invention is shown typically.
  • A An example in which magnetic nanoparticles are incorporated into a part of the polymer phase (referred to as polymer B) of the multiphase polymer fine particles is schematically shown.
  • B An electron micrograph of multiphase polymer fine particles in which iron oxide (Fe 2 O 3 ) is incorporated into polymer B is shown.
  • 1 schematically shows an embodiment of a detection method using the multiphase polymer fine particles of the present invention.
  • a high signal for example, fluorescence
  • B and C When the sample substance is contained in the sample, the amount of the multiphase polymer fine particles bound to the capture reagent is decreased, and the detected signal (for example, fluorescence) intensity is decreased.
  • 1 schematically shows an embodiment of a detection method using the multiphase polymer fine particles of the present invention.
  • A When the sample substance ( ⁇ ) is not included in the sample, the sample does not bind to the capture reagent ( ⁇ ), and thus a signal (for example, fluorescence) from the multiphase polymer microparticles is not detected.
  • B, C When the sample substance is contained in the sample, the substance ( ⁇ ) that can specifically bind to the sample substance on the multiphase polymer fine particles is bound to the sample substance bound to the capture reagent, Signal (for example, fluorescence) is detected.
  • Signal for example, fluorescence
  • 1 schematically illustrates a system of the present invention. The measurement result by a Fourier transform infrared spectrophotometer (FT-IR) is shown. A: Iron oxide (Fe 2 O 3 ) before reacting with D81, B: Magnetic nanoparticles coated with D81 after reacting.
  • FT-IR Fourier transform infrared spectrophotometer
  • a diameter distribution (B) is shown.
  • TEM Transmission electron microscope
  • D81 1 random copolymer of dodecylacrylamide and dopamine methacrylamide
  • FDLS fiber optic dynamic light scattering photometer
  • B A diameter distribution
  • the manufacturing process of the multiphase polymer fine particle of this invention is shown.
  • 2 shows an electron micrograph of multiphase polymer microparticles of the present invention incorporating D21-coated magnetic nanoparticles.
  • B Scanning transmission electron microscope image showing a dark polybutadiene (PB) region and a bright polystyrene (PS) region. 2 shows an electron micrograph of multiphase polymer microparticles of the present invention incorporating D41-coated magnetic nanoparticles.
  • A Scanning electron microscope image showing that the polybutadiene (PB) region is bright and the polystyrene (PS) region is dark.
  • B Scanning transmission electron microscope image showing a dark polybutadiene (PB) region and a bright polystyrene (PS) region. 2 shows an electron micrograph of multiphase polymer microparticles of the present invention incorporating D81-coated magnetic nanoparticles.
  • A Scanning electron microscope image showing that the polybutadiene (PB) region is bright and the polystyrene (PS) region is dark.
  • B Scanning transmission electron microscope image showing a dark polybutadiene (PB) region and a bright polystyrene (PS) region.
  • the particle diameters of the multiphase polymer fine particles prepared as a 0.1 mg / mL (A), 1.0 mg / mL (B), or 5.0 mg / mL (C) THF solution of polystyrene and polybutadiene are shown by graphs and micrographs, respectively. It shows that some polymer phases of the multiphase polymer microparticles are selectively labeled.
  • A In a bright-field image, a polymer region (polybutadiene) stained with osmium tetroxide and a polymer region (polystyrene) without staining are shown.
  • B In the fluorescence image, blue fluorescence is seen in the region made of polystyrene, and no fluorescence is seen in the region made of polybutadiene.
  • A An example in which a fluorescent dye is modified on one side of a magnetic nanoparticle.
  • B A fluorescence microscopic image in which fluorescence is observed only in a part of the polymer phase. An example in which a fluorescent dye is modified on one side of a nonmagnetic nanoparticle will be shown.
  • Figure 2 shows detection of aldosterone by the method of the present invention.
  • A A detection method is schematically shown.
  • B It shows that the fluorescence intensity is decreasing depending on the increase in the aldosterone concentration in the sample.
  • the vertical axis represents the relative fluorescence intensity (%) when the fluorescence intensity without aldosterone (B0) is taken as 100, and the horizontal axis represents the aldosterone concentration (pg / ml) in the sample.
  • the present invention is a multiphase polymer fine particle having at least two or more kinds of polymer phases formed by aggregation of two or more kinds of polymers on the surface, wherein the first polymer phase is specific to the specimen substance or the specimen substance.
  • the microparticles are capable of binding to a material capable of binding, and wherein the second polymer phase has a labeling substance.
  • the polymer phase contained in the fine particles may be two or more, and may be three, four or more as necessary. However, since the production of fine particles becomes easier when the number of polymer phases is small, the number of polymer phases may be two in order to detect the analyte substance in the sample which is the object of the present invention.
  • first polymer phase in this specification, for the sake of convenience, they are referred to as “first polymer phase”, “second polymer phase”, etc., but these notations do not specify the type of polymer.
  • any of the two or more polymers constituting the multiphase polymer fine particles of the present invention can be selected from the following polymers: 1) Water-soluble polymers such as N-isopropylacrylamide, polyethylene glycol and the like; 2) Water-insoluble polymers such as 1,4-cis-isoprene, isoprene elastomers, polystyrene, polybutadiene, polyisoprene, polymethyl methacrylate, poly n-butyl acrylate, polyvinyl chloride, polyacrylonitrile, polylactic acid and the like; 3) Copolymers such as butadiene: styrene copolymers.
  • Water-soluble polymers such as N-isopropylacrylamide, polyethylene glycol and the like
  • Water-insoluble polymers such as 1,4-cis-isoprene, isoprene elastomers, polystyrene, polybutadiene, polyisoprene, polymethyl methacryl
  • the multiphase polymer fine particles having two or more polymer phases formed by aggregation of two or more polymers are described in, for example, Patent No. 5103611 and Patent No. 5239004 previously invented by the present inventors. It can be manufactured by a method. In these methods, a polymer having a difference in solubility parameter within a specific range is selected as the above two or more types of polymers, dissolved in a good solvent for these polymers, and a good solvent solution is prepared. By adding a solvent that is compatible with the polymer but is a poor solvent for the polymer and removing the good solvent by evaporation, the respective polymers are separately assembled to form fine particles having a plurality of polymer phases.
  • a good solvent solution is prepared by dissolving in a good solvent common to three or more polymers, and then compatible with the good solvent but common to three or more polymers. After mixing the poor solvent, the fine solvent having three or more polymer phases is formed by evaporating the good solvent.
  • suitable combinations include polyethylene glycol and N-isopropylacrylamide, polystyrene and polyisoprene, polystyrene and polybutadiene, polystyrene and polylactic acid, polystyrene and polybutyl acrylate, and the like. It can be.
  • polyethylene glycol and N-isopropylacrylamide water can be used as a good solvent and DMSO or 1-propanol can be used as a poor solvent.
  • THF tetrahydrofuran
  • water can be used as a poor solvent.
  • a good solvent and a poor solvent that can be used for the preparation of the fine particles can be appropriately selected.
  • the method for producing the multiphase polymer fine particles of the present invention is not limited to the above-described method.
  • two or more polymer phases having high affinity with the core are coated on a core made of silica, ceramic or the like prepared in advance. It may be of the form. That is, the multiphase polymer fine particles do not need to be formed entirely of a polymer, as long as they have at least two types of polymer phases on the surface using a technique commonly used in this field. good.
  • the multiphase polymer fine particles of the present invention are configured so that the first polymer phase can bind to the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance.
  • analyte substance refers to a known substance that can be contained in a sample such as a biological sample and whose presence or amount is required to be detected.
  • the sample substance include, but are not limited to, natural in-vivo substances, drugs administered for treatment / prevention / diagnosis of diseases, and proteins or peptides, saccharides, nucleic acids, lipids, steroid compounds Etc.
  • the “substance that can specifically bind to the analyte substance” may be any substance that can specifically bind to the analyte substance, and is not particularly limited.
  • a nucleic acid for example, DNA
  • a lectin when the sample substance is a saccharide, and the like can be mentioned.
  • the substance that can specifically bind to the analyte substance is preferably an antibody.
  • the analyte substance to be covalently bonded to the first polymer phase or the substance that can specifically bind to the analyte substance has, for example, a molecular weight in the range of 1 to 1,000,000 and a size in the range of 1 nm to 100 nm.
  • the antibody may be a natural antibody derived from any biological species, a genetically modified antibody, or a synthesized antibody.
  • the antibody to be covalently bound to the first polymer phase may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can specifically bind to the specimen substance, and therefore, a plurality of types of antibodies having different binding specificities. A mixture of these can also be used for binding.
  • the antibody is not particularly limited, and may be an IgG antibody that can specifically bind to the target analyte, a fragment or derivative that retains its antigen binding property, such as Fab, F (ab ') Two fragments etc. can be used conveniently. Moreover, you may have a modification which is normally used in this field
  • the binding between the first polymer phase and the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance is such that the bound analyte substance or the substance that can specifically bind to the analyte substance behaves together with the multiphase polymer fine particles.
  • a covalent bond is preferable.
  • the polymer constituting the first polymer phase is, for example, a polymer having a functional group such as an amino group or a carboxyl group at the terminal. Can be used.
  • a polymer having an amino group or a carboxyl group at the terminal can be synthesized, and a commercially available product can also be purchased from Polymer Source, for example.
  • a commercially available product can also be purchased from Polymer Source, for example.
  • the amino group or carboxyl group is present on the first polymer phase of the generated multiphase polymer fine particles, the sample substance or the carboxyl group, cyano group or amino group of the substance that can specifically bind to the sample substance A covalent bond can be formed.
  • the number of molecules of the analyte substance to be bound per one multiphase polymer fine particle or a substance that can specifically bind to the analyte substance can be in the range of 1 to 1000.
  • the amount of the analyte substance per microparticle or the substance that can specifically bind to the analyte substance can be adjusted as appropriate by selecting the reaction conditions that cause the above-described covalent bond, and can vary depending on the application. is there. For example, when detecting a sample substance using competitive binding between the sample substance in the sample and the sample substance covalently bound on the microparticle (the same applies to indirect competitive binding), the sample substance covalently bound to the microparticle
  • the number of molecules per particle is 10 or less, preferably 5 or less, particularly preferably 1.
  • the sample substance that is covalently bonded to the fine particle is specifically detected.
  • the number of molecules of the substance that can bind to is not particularly limited, but may be 10 or less, 5 or less, for example, 1 per fine particle.
  • the multiphase polymer fine particles of the present invention are configured so that the second polymer phase has a labeling substance.
  • the labeling substance include fluorescent dyes, chemiluminescent substances, and radioactive labeling substances.
  • fluorescent dyes include, but are not limited to, fluorescent dyes having excellent quantum yield such as fluorescein and derivatives thereof, pyrene and derivatives thereof, and quantum dots.
  • the chemiluminescent substance include enzymes such as peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (ALP).
  • HRP peroxidase
  • ALP alkaline phosphatase
  • the radiolabeling substance include reagents having 14 C, 3 H, 125 I and the like.
  • a polymer having a functional group such as an amino group or a carboxyl group at the terminal can be used as the polymer constituting the second polymer phase.
  • a polymer having an amino group or a carboxyl group at the terminal can be synthesized, and a commercially available product can be purchased from, for example, Polymer Source.
  • a covalent bond can be formed with the carboxyl group, cyano group, amino group or the like of the labeling substance.
  • a polymer having a pyrenyl group at the terminal a polymer modified to have a chemiluminescent substance, or a polymer modified to have a radioisotope can be used.
  • a labeling substance may be present on the second polymer phase at the time of production of the multiphase polymer microparticles.
  • the first and second polymer phases can be appropriately selected.
  • the first and second polymer phases are bound to the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance and the labeling substance.
  • the functional groups such as amino groups and carboxyl groups generated on the polymer phase are different.
  • the ratio of the first and second polymer phases is not particularly limited, but can be in the range of 1: 9 to 9: 1 as the respective surface areas on the fine particles.
  • the ratio of the polymer phase can be changed as appropriate by adjusting the ratio of the amounts of each polymer used when producing the fine particles.
  • Janus particle is used for asymmetric spherical particles in which the two hemispheres are physically and / or chemically different, but the multiphase polymer fine particles described herein are also used. It may be an asymmetric “Janus particle” having anisotropy.
  • the multiphase polymer fine particles of the present invention can contain a magnetic substance in a part of the polymer phase.
  • the polymer phase containing the magnetic substance may be either the first or second polymer phase described above, or may be a third polymer phase different from these.
  • the behavior of the multiphase polymer fine particles can be controlled by a magnetic field.
  • the magnetic material is not particularly limited, and examples thereof include iron, chromium, cobalt, neodymium, oxides thereof, sulfides, and the like, which can be preferably used.
  • the size of the magnetic material is not particularly limited, but can be made into magnetic nanoparticles having a particle size in the range of 1 to 100 nm for incorporation into nano-sized fine particles. Moreover, they may form several to several tens of aggregates.
  • the magnetic nanoparticles for example, iron oxide nanoparticles manufactured by Aldrich can be preferably used.
  • FIG. 1 schematically shows multiphase polymer fine particles that can be used in the present invention.
  • the fine particles shown in FIG. 1 have an amino group 1 in one polymer phase (first polymer phase), and are covalently bonded to the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance via this amino group. Can do.
  • the other polymer phase can have a labeling substance, for example a fluorescent substance 2.
  • the magnetic body 3 is incorporated in the first polymer phase.
  • FIG. 2A schematically shows an example in which magnetic nanoparticles are incorporated into the polymer B phase of the multiphase polymer fine particles composed of the polymer A and the polymer B.
  • FIG. 2B shows an electron micrograph of multiphase polymer fine particles in which iron oxide (Fe 2 O 3 ) is incorporated into polymer B.
  • Each of the polymer A and the polymer B may be any of the first and second polymer phases described above.
  • a compound having a part having an affinity for the magnetic substance and a part having an affinity for the polymer such as a polystyrene-polydopamine methacrylamide random copolymer (PS-r- PDMA) can be incorporated into the multiphase polymer particles in a state where the magnetic material is coated with a material having polymer affinity.
  • PS-r- PDMA polystyrene-polydopamine methacrylamide random copolymer
  • the exemplified PS-r-PDMA comprises polystyrene
  • it can be conveniently incorporated into a polymer phase consisting of polystyrene polymer.
  • the polymer coating of the magnetic material can be suitably performed by the method described in, for example, Japanese Patent No. 5008009.
  • the magnetic material may be suitably incorporated such that the resulting multiphase polymer microparticles can be collected, for example, in a magnetic field of about 50 mT or higher.
  • the multiphase polymer fine particle of the present invention has a functional group on the surface of the first polymer phase as described above, and specifically includes a specimen substance or a specimen substance having a group reactive with the functional group. It can be covalently bound to a substance that can bind.
  • the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance can be covalently bound to the multiphase polymer microparticles as it is when a reactive group is present in itself. If there is no reactive group in the sample substance or the substance that can specifically bind to the sample substance, it is chemically modified in advance so that the sample substance or the substance that can specifically bind to the sample substance has a reactive group can do.
  • the reactive group or modification site should be selected so as not to interfere with the binding between the capture reagent described later and the sample substance, or the binding between the substance that can specifically bind to the sample substance and the sample substance. It is necessary to do.
  • the analyte is an antigen and the capture reagent is an antibody
  • a site that is not an epitope on the antigen that is specifically recognized and bound by the antibody is bound to the microparticle or modified for binding. It is necessary to make it.
  • a person skilled in the art can appropriately select and determine the reactive group and the modification site according to the type of the sample substance or the substance that can specifically bind to the sample substance and the type of binding to the capture reagent. it can.
  • the binding may be performed using a linker that is usually used in the art.
  • a protein such as an antibody When a protein such as an antibody is bound to the multiphase polymer microparticles, a large number of amino groups and carboxyl groups are present in the amino acids constituting the protein. Bonding can be achieved.
  • the antibody When the antibody is bound to the multiphase polymer microparticles, it is necessary to use an antibody that recognizes a site other than the site of the analyte substance to which the capture reagent binds.
  • the multiphase polymer fine particles of the present invention also have a functional group on the surface of the second polymer phase as described above, and are covalently bonded to a labeling substance having a reactive group that reacts with the functional group.
  • a labeling substance having a reactive group that reacts with the functional group.
  • the sample substance when a reactive group is present in the labeling substance itself, it can be covalently bonded to the multiphase polymer microparticles as it is, and when there is no reactive group in the labeling substance, the labeling substance is previously labeled.
  • the substance can be chemically modified to have a reactive group.
  • the labeling substance can be incorporated into the second polymer phase during the production process of the polymer fine particles.
  • the multiphase polymer fine particles having an average particle size of 1 nm to 1 mm, for example, 100 nm to 1 mm can be obtained according to production conditions, and are not particularly limited.
  • the average particle size should be in the range of about 10 nm to about 100 ⁇ m, preferably about 50 nm to about 50 ⁇ m, more preferably about 100 nm to about 10 ⁇ m. be able to.
  • the average particle diameter is about 100 nm or more in order to enclose a sufficient amount of the magnetic substance.
  • the variation coefficient of the particle size is within 20%, preferably within 10%.
  • the multiphase polymer fine particles of the present invention can measure the analyte substance in the sample with high sensitivity and high accuracy by the method specifically described below.
  • the present invention also provides a method for detecting analyte material in a sample.
  • the method of the present invention comprises the following steps: Contacting the sample with a solid phase support on which a capture reagent that specifically binds to the analyte is immobilized; Contacting the solid phase support with the multiphase polymer microparticles of the present invention; and detecting a label on the microparticles bound on the solid phase support.
  • the microparticle is a microparticle in which the analyte substance is covalently bound, and the analyte substance in the sample and the analyte substance present on the microparticle are competitively bound to the capture reagent,
  • the capturing reagent to which the sample substance is not bound binds to the sample substance present on the fine particles.
  • the microparticle is a microparticle in which a substance capable of specifically binding to the analyte substance is covalently bound, and the analyte substance in the sample bound to the capture reagent and the analyte substance present on the microparticle And a substance capable of specifically binding.
  • the sample is not particularly limited, and the sample is a biological sample that may contain the analyte, such as blood (including plasma, serum, etc.), spinal fluid, pus, puncture fluid, urine, stool, etc. Often, the sample is blood, plasma, or serum.
  • the sample may be used as it is in the method of the present invention, or before the step of contacting with the above-mentioned solid support, a lysing step and / or contaminants unrelated to the reaction, such as red blood cells, white blood cells, platelets, detection.
  • a step of removing proteins other than the target may be included. The step of removing contaminants can be performed by an operation such as centrifugation.
  • the sample can be diluted or concentrated as necessary. Dissolution and dilution can be performed using an aqueous solution suitable for the method of the present invention, such as phosphate buffered saline.
  • the capture reagent is not particularly limited.
  • it may be an antibody having a specimen substance as an antigen, a lectin capable of specifically binding to a saccharide, or a complementary polynucleotide capable of hybridizing with a nucleic acid substance. it can.
  • the antibody may be a natural antibody derived from any biological species, a genetically modified antibody, or a synthesized antibody.
  • the antibody is not particularly limited, and may be an IgG antibody that can specifically bind to a target analyte, a fragment or a derivative that retains its antigen binding property, for example, Fab, F (ab ′) Two fragments and the like can be preferably used.
  • the polynucleotide may be DNA, RNA, or a synthetic polynucleotide modified to improve stability. It is preferable that the capture reagent and the sample substance are bonded at a molecular unit of 1: 1.
  • the amount of the capture reagent be equal to or greater than the expected amount of analyte in the sample in molecular units. This is because when the amount of the capture reagent is too small, a part of the sample substance to be detected does not bind to the capture reagent, and therefore the sample substance cannot be accurately detected.
  • the capture reagent is used against the expected amount of analyte in the sample to bind the solid support to the multiphase polymer microparticles and detect the label of the bound multiphase polymer microparticles. It is preferable that the excess amount is, for example, 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 3 times or more.
  • the capture reagent is immobilized on a solid support for later steps.
  • a material usually used in the art for example, plastic, glass, silicon and the like can be preferably used.
  • a solid support that has been surface-treated to prevent non-specific adsorption of the analyte substance can be used.
  • the contact between the sample and the solid support may be performed in a stationary state or fluidly.
  • the sample can be brought into contact with a solid support such as a well, or the sample can be passed through a flow path in which the solid support is fixed.
  • a buffer solution After the contact between the sample and the solid support, it is preferable to remove components in the sample other than the analyte substance by washing with a buffer solution.
  • the solid phase support to which the specimen substance in the sample is bound is brought into contact with the multiphase polymer fine particles of the present invention.
  • the amount of the capture reagent on the solid phase support is equal to or greater than the amount of the analyte substance in the sample in the molecular unit, preferably an excess amount. Therefore, on the solid support, there may be a capture reagent that is not bound to the analyte substance in the sample.
  • the analyte substance in the state can be combined with the capture reagent. That is, the analyte substance covalently bonded to the multiphase polymer microparticles and the analyte substance in the sample have substantially the same structure, and thus have the property of competitively binding to the capture reagent. The binding affinity is comparable.
  • the analyte substance covalently bound to the multiphase polymer microparticles binds to the unbound capture reagent without inhibiting the binding of the already bound analyte substance. can do.
  • the fine particles that are not bound to the capture reagent can be removed by a subsequent washing operation, if necessary.
  • the label on the microparticles bound to the capture reagent on the solid support is detected.
  • the label is, for example, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, or a radioactive label substance, and the label on the fine particles can be detected by detecting radiation from the fluorescent, chemiluminescent or radioactive substance, respectively.
  • the analyte substance (indicated by ⁇ ) binds to the capture reagent (indicated by ⁇ ), so that unbound capture On the second polymer phase of the microparticles bound to the capture reagent, since there is less reagent to be used and therefore binding of the multiphase polymer microparticles to the analyte ( ⁇ ) on the first polymer phase is competitively inhibited.
  • the detection intensity of fluorescence or the like from the labeling substance is relatively low.
  • the sample substance and the unbound capture reagent are present on the first polymer phase of the multiphase polymer fine particles. This increases the detection intensity of fluorescence and the like from the labeling substance on the second polymer phase of the fine particles.
  • a substance that can specifically bind to the analyte substance in a state of being bound to the multiphase polymer microparticle is used for capture. It can bind to the analyte material in the sample bound to the reagent.
  • the substance that can specifically bind to the analyte substance bound to the multiphase polymer microparticles and the capture reagent recognize and bind to different parts of the analyte substance, and a detection method as a sandwich assay method, Become.
  • the substance that can specifically bind to the analyte substance covalently bound to the multiphase polymer microparticles binds to the analyte substance already bound to the capture reagent, It does not react with the capture reagent to which the analyte is not bound.
  • the fine particles that have not bound to the specimen substance can be removed by a subsequent washing operation, if necessary.
  • the label on the fine particles bound to the sample substance existing on the solid support is then detected via the capture reagent.
  • the label is, for example, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, or a radioactive label substance, and the label on the fine particles can be detected by detecting radiation from the fluorescent, chemiluminescent or radioactive substance, respectively.
  • the analyte substance (indicated by ⁇ ) binds to the capture reagent (indicated by ⁇ ), Since the substance ( ⁇ ) that can specifically bind to the analyte substance on the first polymer phase further binds, the detection intensity such as fluorescence from the label substance on the second polymer phase of the fine particles bound to the analyte substance is increased. Get higher.
  • the magnetic substance is preferably enclosed in a polymer phase bonded to a sample substance or a substance that can specifically bind to the sample substance.
  • a multiphase polymer fine particle having a predetermined number of particles is brought into contact with the solid phase support so as to be covalently bonded onto the multiphase polymer fine particle. It is possible to efficiently bind the analyte substance or a substance that can specifically bind to the analyte substance to the capture reagent or the analyte substance on the solid support, and in many cases, on the opposite surface of the microparticle.
  • the detection sensitivity of the signal from the existing label can be increased.
  • Specimens in the range of 0.1 pg / mL to 1000 mg / mL can be detected by the method of the present invention. If necessary, the sample can be concentrated or diluted for use in the detection method of the present invention. In addition, two or more kinds of analyte substances in a sample can be detected simultaneously by the method of the present invention. When two or more kinds of analyte substances are detected at the same time, two kinds of multiphase polymer fine particles are prepared, and these are brought into contact with a solid support separately, sequentially or simultaneously. In this case, it is preferable to use different labeling substances for detection, for example, fluorescent substances having different fluorescence wavelengths.
  • sample substance detection system also provides a system for detection of analyte material in a sample, comprising means for capturing the analyte material in the sample, and means for detecting the captured analyte material.
  • the capturing means is a solid phase support on which a reagent that specifically binds to a sample substance is fixed.
  • a material usually used in the art for example, plastic, glass, silicon and the like can be preferably used.
  • a solid support that has been surface-treated to prevent non-specific adsorption of the analyte substance can be used.
  • the solid support may be in the form of, for example, a well or a chip.
  • the solid support may be fixed on a flow path through which the sample and multiphase polymer particles pass.
  • the material of the inner surface of the flow path is not limited according to the molecule to be immobilized. For example, a nitrocellulose film, a silicon resin, a gold coating, or the like can be used.
  • the capture reagent that can specifically bind to and capture the sample substance is immobilized on the solid support.
  • the capture reagent is not particularly limited.
  • it may be an antibody having a specimen substance as an antigen, a lectin capable of specifically binding to a saccharide, or a complementary polynucleotide capable of hybridizing with a nucleic acid substance. it can.
  • Those skilled in the art can easily recognize and appropriately select reaction conditions for ensuring specific binding between the sample substance and the capture reagent.
  • the detection means comprises a label that can be detected by the binding of the analyte substance in the sample and the unbound capture reagent, or the analyte substance bound to the capture reagent and the multiphase polymer microparticle of the present invention. Is detected.
  • the system of the present invention can be provided in the form of a small device that is easy to use.
  • the chip may be fixed as a solid phase support in which a microchannel through which the sample and the multiphase polymer fine particles of the present invention are passed is provided in the device, and a capture reagent is fixed on the channel.
  • the microchannel can have a cross-sectional height of about 50 ⁇ m to about 200 ⁇ m, a width of about 100 ⁇ m to about 2 mm, and a length of about 10 mm to 50 mm.
  • the material of the microchannel can be a silicone resin such as polydimethylsiloxane or a plastic such as polyethylene terephthalate.
  • a material of the chip for example, plastic or glass can be used.
  • the chip can be of a disposable type.
  • the configuration and shape of the small device can be appropriately selected using means usually used in this field. Although not particularly limited, a small device having a size in the range of about 0.25 to 400 cm 3 and a weight of 0.4 to 20 g can be preferably used.
  • a CCD camera, a photodiode, a photomultiplier, or the like that detects fluorescence from fine particles captured on a solid support can be used as the detection means.
  • a CCD camera can be used as the detection means.
  • a scintillation detector or the like can be used as the detection means.
  • the detection means can be configured in the same device together with the capture means described above, but the capture means and the detection means may be configured separately.
  • FIG. 5 schematically shows an example of the system of the present invention.
  • the capture reagent 5 immobilized on the solid support 4 captures the sample substance in the sample and the multiphase polymer fine particles bonded to the unbound capture reagent, or the specimen substance. Since there are bound multiphase polymer microparticles bound to the reagent for use (not shown), the labeling substance bound to the second polymer phase existing in a region different from the first polymer phase, for example, on the opposite hemisphere side.
  • This signal for example, the amount of fluorescence
  • the detection means 6 for example, a CCD camera
  • the magnetic material is preferably encapsulated in the first polymer phase.
  • the multiphase polymer particles can be accumulated on the flow path by allowing the multiphase polymer particles to pass through the solid support with the magnetic field 7 applied.
  • the multiphase polymer fine particles can efficiently perform the binding between the analyte substance covalently bound on the multiphase polymer fine particles or the substance that can specifically bind to the analyte substance and the capture reagent or the analyte substance on the solid support.
  • the multiphase polymer fine particles by using a predetermined number of particles, the number of fine particles bound to the capture reagent can be easily calculated from the detection result.
  • the label in the multiphase polymer fine particles can be detected by the above-described detection means, and thereby the amount and / or concentration of the analyte substance in the sample can be measured.
  • the analyte in the sample has a higher or lower concentration than the preset threshold.
  • the measurement result can be displayed so that a warning can be given.
  • the system of the present invention can measure analyte substances in various samples quickly and easily with high sensitivity by combining nano-sized multiphase polymer particles and a small device having a microchannel.
  • a system in the form of a small device can measure a sample that may contain an analyte only by applying it to the insertion port of the device, requires a small amount of sample, and is used for inspection and diagnosis.
  • the amount of reagent can also be reduced. Therefore, it leads to reduction of the inspection cost, and can be provided as a cheaper diagnostic agent and diagnostic device as compared with a conventionally used inspection system.
  • the system of the present invention can be used repeatedly by washing, and can also be a disposable type.
  • the present invention further includes a multiphase polymer microparticle of the present invention in which a target analyte substance or a substance capable of specifically binding to the analyte substance is previously bound, a capture reagent that specifically binds to the analyte substance in the sample, and
  • a sample comprising: a device having a detector for a captured analyte material; and a reagent required for the binding reaction between the analyte material and the capture reagent, the binding reaction of the multiphase polymer microparticles, and the detection of the analyte material.
  • a kit for the detection of analyte material can be provided. When a chemiluminescent substance is used as the detection means, a substrate necessary for the enzyme reaction can also be included in the kit.
  • a neodymium magnet was brought close to a container, and after collecting the particles, chloroform was added, washed 3 times to remove unreacted D81, and dried under vacuum at room temperature for 3.5 hours.
  • the product was redispersed in THF to a concentration of 1 mg / ml and sonicated for 5 minutes.
  • FIG. 7A when D21 was used, magnetic nanoparticles having a particle size in the range of about 100 to 2000 nm were obtained, and the average particle size was about 500 nm.
  • FIG. 7-2 when D41 was used, it had a particle size in the range of about 200 to 350 nm, and the average particle size was about 430 nm.
  • FIG. 7-3 when D81 was used, it had a particle size in the range of about 100 to about 400 nm, and the average particle size was about 285 nm.
  • Example 2 Production 2 of magnetic Janus particles
  • the particle size of the particles produced when polystyrene and polybutadiene were changed to 0.1 mg / mL, 1.0 mg / mL, or 5.0 mg / mL THF solution was confirmed.
  • FIG. 10 it was confirmed that when the other conditions were the same, the particle size increased as the starting polymer concentration used increased.
  • Example 3 Confirmation of binding of labeling substance to Janus particles
  • Binding of the fluorescent labeling substance to one polymer phase of the magnetic Janus particles obtained in Example 1 was confirmed.
  • the polymer region (polybutadiene) stained with osmium tetroxide and the polymer region where fluorescence from the pyrenyl group is detected are clearly separated, and a polymer phase made of polystyrene. was confirmed to be selectively fluorescently labeled.
  • Example 4 Production 3 of magnetic Janus particles
  • 0.5 g of 1 g / L THF solution of polystyrene (PS, Mn 10,000, Polymer Source)
  • 0.5 ml of a 10 g / l THF solution of the magnetic nanoparticles prepared in Preparation Example 2 were mixed in a brown hydrophobized vial treated with 12 ml of a silane coupling agent, and then 1.0 ml of water was added at a rate of 1 ml / min. And vortexed.
  • the obtained mixture was heated in a vacuum oven at room temperature for 2 hours to evaporate THF, and FITC was added to the obtained particles to react.
  • FITC fluorescence was observed in the polymer phase made of polybutadiene on one side of the particles, indicating that FITC could be introduced selectively (FIG. 12).
  • Nonmagnetic Janus particles were produced in the same manner as in Example 4 except that carboxy-terminated polystyrene and amino-terminated polybutadiene (both from Polymer Source) were used and no magnetic nanoparticles were added. When the obtained particles were reacted with FITC and observed with a fluorescence microscope, FITC fluorescence was observed in the polymer phase composed of polybutadiene, indicating that FITC could be introduced site-selectively (FIG. 13). ).
  • Example 6 Detection of aldosterone using Janus particles
  • An anti-aldosterone antibody (A2E11) is immobilized on the surface of each well of a 96-well plate (Nunc), and a sample containing aldosterone (Toronto ⁇ ⁇ Research Chemicals Inc.) at a concentration of 0.1-100 pg / mL is added for 5 minutes at room temperature. Incubated. Next, 1.0 mg / mL of aldosterone-conjugated Janus particles prepared in Example 1 was added and incubated overnight at room temperature.
  • a graph was prepared by setting the fluorescence intensity when only the aldosterone-binding Janus particles were added to 100 (B0), and the fluorescence intensity when adding the aldosterone-containing sample as B.
  • Janus particles were prepared by covalently binding an anti-mouse renin antibody (# AF4277, R & D systems) in the presence of a condensing agent to Janus particles produced in the same manner as in Example 1 except that magnetic nanoparticles were not added.
  • an anti-mouse renin antibody # AF4277, R & D systems
  • an anti-mouse renin antibody (# BAF4277, R & D systems) was immobilized on the surface of each well of a 96-well plate (Nunc) at 1 ⁇ g / mL in PBS buffer as a capture reagent. -AS-020, R & D systems) was added and incubated at room temperature for 2 hours. Subsequently, the above-mentioned anti-mouse renin antibody-bound Janus particles (4 ⁇ 10 6 particles / mL, 100 ⁇ L) were added and incubated overnight at 4 ° C.
  • the sample was observed with a fluorescence microscope, and fluorescence was detected at an excitation wavelength of 345 nm and a fluorescence wavelength of 450 nm.
  • the amount of renin in the sample is small, the amount of renin that binds to the anti-mouse renin antibody on the surface of the well is reduced and the binding of Janus particles is also reduced, resulting in lower fluorescence intensity and higher amount of renin in the sample.
  • the fluorescence intensity obtained increased, and therefore fluorescence depending on the renin concentration in the sample was detected.
  • analyte substances in a sample for example, biomarkers related to various diseases, viruses, pathogens, and the like. It can be used for monitoring. More specifically, for example, screening of patients with primary aldosteronism related to hypertension, which is estimated to have 2 to 4 million people in Japan, determination of the degree of nephropathy by urinalysis, diagnosis of tumor markers, airport and It can be used for inspection of infectious diseases of pathogenic microorganisms at clinics, inspection of toxins in foods such as botulinum toxin and histamine, and inspection of infectious diseases of livestock and pets.

Abstract

本発明は、サンプル中の検体物質の検出方法の改良方法の提供を課題とする。本発明は、2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子を提供する。本微粒子を利用して、生体由来等のサンプル中の検体物質を高感度で迅速に検出することができる。

Description

多相ポリマー微粒子を用いた検体物質の検出方法
　本発明は、新規多相ポリマー微粒子、及びこの微粒子を用いた検体物質の検出方法に関する。より具体的には、本発明は、ナノサイズの多相ポリマー微粒子を用いることにより、生体由来等の検体物質に対する高感度検出・分析技術を提供する。
　性質の異なる複数、多くの場合には2つの表面を有する異方性粒子をヤヌス粒子と呼ぶことがある。ヤヌス粒子は他の分子等の環境との相互作用が異方的であるため、例えば分散系において、異なる領域に応じて多様な構造に自己組織化し、通常の等方的な粒子にはない結晶構造を形成する。こうしたことから、ヤヌス粒子は、異方的粒子分散特性や、粒子の動的挙動等の物性の特徴を解明するためのモデル系としても使用されている。
　本発明者等は、各半球が異なる材質からなるヤヌス粒子を簡便に製造できる方法を開発している（特許文献１及び２）。これらの方法は、自己組織化析出（SORP: Self-ORganized Precipitation）法を用いて、性質の異なる2種のポリマーを含む溶液にポリマーが溶けない貧溶媒を加え、次いで良溶媒を蒸発除去することで貧溶媒への置換を行い、相分離したサブミクロンサイズのポリマー微粒子を含む分散液を得るものである。
特許第5103611号 特許第5239004号
　従来、生体由来の検体物質の検出には、一般的にELISA（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay）法やラジオイムノアッセイ等が用いられているが、作業工程が複雑で時間もかかることから改善が求められている。
　本発明者等は、既に開発した自己組織化析出法によって調製し得るヤヌス粒子を、上記の検体物質の検出方法を改良するために利用し得ることに着目し、微粒子の構成及び実用化のために種々検討を重ねた結果、微粒子の一方の表面を検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質で修飾し、他方の表面を検出用の標識物質で修飾することで、検体物質の検出のために機能化させたヤヌス粒子を得ることに成功した。更に、ヤヌス粒子の製造過程で磁性体をポリマー溶液中に混合することで、磁場応答性の磁性ヤヌス粒子を作製することができた。
　一方、本発明者等は、マイクロ流路中に固定し得るチップデバイスの開発を行っている（例えば特開2008-14791号）。このチップデバイスは、流路内の表面に検体物質と相互作用する捕捉用試薬を固定化できるため、種々の検体物質を検出することができる。
　そして、上記の機能化ヤヌス粒子を、上記チップデバイスと組合せることで、従来の検出方法に比べて、より高精度に迅速かつ簡便に検体物質の検出が行える計測センサとして機能し得る。
　すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．　2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子。
２．　第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、上記１記載の微粒子。
３．　上記１若しくは２記載の微粒子の第1のポリマー相に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質を有する、多相ポリマー微粒子。
４．　第2のポリマー相に共有結合した標識物質を有する、上記３記載の多相ポリマー微粒子。
５．　検体物質が、タンパク質若しくはペプチド、糖類、核酸、脂質、又はステロイド化合物である、上記１～４のいずれか記載の微粒子。
６．　標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、上記１～５のいずれか記載の微粒子。
７．　サンプル中の検体物質を検出する方法であって、以下の工程：
　検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
　該固相支持体と上記３～６のいずれか記載の微粒子とを接触させる工程；及び
　固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む、上記方法。
８．　微粒子が検体物質に共有結合した微粒子であり、サンプル中の検体物質が未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在する検体物質とが結合する、上記７記載の方法。
９．　微粒子が検体物質と特異的に結合し得る物質に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と微粒子上に存在する上記検体物質と特異的に結合し得る物質とが結合する、上記７記載の方法。
１０．　検体物質が生物学的サンプル中に含まれる、上記７～９のいずれか記載の方法。
１１．　生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、上記１０記載の方法。
１２．　捕捉用試薬が抗体である、上記７～１１のいずれか記載の方法。
１３．　サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、検体物質と特異的に結合する試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬又は捕捉用試薬と結合した検体物質と、上記３～６のいずれか記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
１４．　小型デバイスの形態で提供される、上記１３記載のシステム。
１５．　固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、上記１４記載のシステム。
１６．　検出手段が、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラである、上記１４又は１５記載のシステム。
１７．　検体物質の量及び／又は濃度を測定する、上記１３～１６のいずれか記載のシステム。
１８．　少なくとも予め設定した閾値と比較して高濃度又は低濃度である場合に計測結果が表示される、上記１３～１７のいずれか記載のシステム。
１９．　目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された上記３～６のいずれか記載の微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-084812号の開示内容を包含する。
　本発明の多相ポリマー微粒子とチップデバイスを組合せた計測センサは、ヤヌス粒子が有する異方的粒子分散特性や、粒子の動的挙動等の物性の特徴を生かすことで、様々な生体由来等の検体物質に対する検出系の感度・精度を向上させることができ、例えば疾患バイオマーカーによる診断や、ウイルス、病原菌の検査等に利用できる。
本発明に用いることができる多相ポリマー微粒子を模式的に示す。 Ａ：多相ポリマー微粒子の一部のポリマー相（ポリマーＢとする）に磁性ナノ粒子を組み込んだ例を模式的に示す。Ｂ：ポリマーＢに酸化鉄（Fe2O3）を組み込んだ多相ポリマー微粒子の電子顕微鏡写真を示す。 本発明の多相ポリマー微粒子を使用した検出方法の一実施形態を模式的に示す。Ａ：サンプル中に検体物質（□）が含まれない場合、捕捉用試薬（▽）に結合した多相ポリマー微粒子上の標識物質からの高い信号（例えば蛍光）強度が検出される。Ｂ，Ｃ：サンプル中に検体物質が含まれる場合、捕捉用試薬に結合する多相ポリマー微粒子量が少なくなり、検出される信号（例えば蛍光）強度が低くなる。 本発明の多相ポリマー微粒子を使用した検出方法の一実施形態を模式的に示す。Ａ：サンプル中に検体物質（□）が含まれない場合、捕捉用試薬（▽）に結合しないため、多相ポリマー微粒子からの信号（例えば蛍光）が検出されない。Ｂ，Ｃ：サンプル中に検体物質が含まれる場合、捕捉用試薬に結合した検体物質に多相ポリマー微粒子上の検体物質と特異的に結合し得る物質（▼）が結合して、標識物質からの信号（例えば蛍光）が検出される。 本発明のシステムを模式的に示す。 フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR）による測定結果を示す。Ａ：D81と反応させる前の酸化鉄（Fe2O3）、Ｂ：反応させた後にD81で被覆された磁性ナノ粒子。 ドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの２：１ランダム共重合体（D21）で被覆された磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）写真（Ａ）及びファイバー光学動的光散乱光度計（FDLS）による粒径分布（Ｂ）を示す。 ドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの４：１ランダム共重合体（D41）で被覆された磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）写真（Ａ）及びファイバー光学動的光散乱光度計（FDLS）による粒径分布（Ｂ）を示す。 ドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの８：１ランダム共重合体（D81）で被覆された磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）写真（Ａ）及びファイバー光学動的光散乱光度計（FDLS）による粒径分布（Ｂ）を示す。 本発明の多相ポリマー微粒子の製造工程を示す。 D21被覆磁性ナノ粒子が組み込まれた本発明の多相ポリマー微粒子の電子顕微鏡写真を示す。Ａ：走査電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が明るく、ポリスチレン（PS）領域が暗く示される。Ｂ：走査型透過電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が暗く、ポリスチレン（PS）領域が明るく示される。 D41被覆磁性ナノ粒子が組み込まれた本発明の多相ポリマー微粒子の電子顕微鏡写真を示す。Ａ：走査電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が明るく、ポリスチレン（PS）領域が暗く示される。Ｂ：走査型透過電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が暗く、ポリスチレン（PS）領域が明るく示される。 D81被覆磁性ナノ粒子が組み込まれた本発明の多相ポリマー微粒子の電子顕微鏡写真を示す。Ａ：走査電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が明るく、ポリスチレン（PS）領域が暗く示される。Ｂ：走査型透過電子顕微鏡像であり、ポリブタジエン（PB）領域が暗く、ポリスチレン（PS）領域が明るく示される。 ポリスチレン及びポリブタジエンを0.1mg/mL（Ａ）、1.0mg/mL（Ｂ）又は5.0mg/mL（Ｃ）THF溶液として調製した多相ポリマー微粒子の粒径をグラフ及び顕微鏡写真でそれぞれ示す。 多相ポリマー微粒子の一部のポリマー相が選択的に標識されることを示す。Ａ：明視野像において、四酸化オスミウムで染色されるポリマー領域（ポリブタジエン）と染色のないポリマー領域（ポリスチレン）を示す。Ｂ：蛍光像において、ポリスチレンからなる領域で青色の蛍光が見られ、ポリブタジエンからなる領域では蛍光が見られない。 Ａ：磁性ナノ粒子の半面に蛍光色素を修飾した例を示す。Ｂ：ポリマー相の一部のみに蛍光が観察される蛍光顕微鏡像を示す。 非磁性ナノ粒子の半面に蛍光色素を修飾した例を示す。 本発明の方法によるアルドステロンの検出を示す。Ａ：検出方法を模式的に示す。Ｂ：サンプル中のアルドステロン濃度の増加に依存して蛍光強度が低下していることを示す。縦軸はアルドステロンを含まない場合（B0）の蛍光強度を100とした場合の相対蛍光強度（％）、横軸はサンプル中のアルドステロン濃度（pg/ml）を示す。
［多相ポリマー微粒子］
　本発明は、2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子を提供する。微粒子に含まれるポリマー相は2種以上であれば良く、必要に応じて3種、4種又はそれ以上であり得る。しかしながら、ポリマー相の数が少ない場合に微粒子の製造がより容易となるため、本発明の目的であるサンプル中の検体物質の検出のためにはポリマー相は2種であれば良い。ポリマー相の識別のために、本明細書中において便宜上「第1のポリマー相」、「第2のポリマー相」等と表記するが、これらの表記はポリマーの種類を特定するものではない。
　本発明の多相ポリマー微粒子を構成する2種以上のポリマーは、いずれも下記のポリマーから選択することができる：
１）水溶性ポリマー、例えばN-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレングリコール等；
２）非水溶性ポリマー、例えば1,4-シス-イソプレン、イソプレンエラストマー、ポリスチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリメチルメタクリレート、ポリn-ブチルアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリ乳酸等；
３）共重合体、例えばブタジエン：スチレン共重合体等。
　2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を有する多相ポリマー微粒子は、例えば本発明者等が先に発明した特許第5103611号及び特許第5239004号に記載された方法によって製造することができる。これらの方法では、上記2種以上のポリマーとして、溶解度パラメータの差が特定の範囲内にあるポリマーを選択し、これらのポリマーに対する良溶媒に溶解して良溶媒溶液を調製した後、この良溶媒と相溶するがポリマーに対する貧溶媒である溶媒を添加して、良溶媒を蒸発により除去することで、それぞれのポリマーが別個に集合して複数のポリマー相を有する微粒子が形成される。ポリマー相が3種以上の場合も同様に、3種以上のポリマーに共通の良溶媒に溶解して良溶媒溶液を調製した後、この良溶媒と相溶するが3種以上のポリマーに共通の貧溶媒を混和した後、良溶媒を蒸発させることにより、3種以上のポリマー相を有する微粒子が形成される。
　例えば2種のポリマーを使用する場合、限定するものではないが、好適な組合せは、ポリエチレングリコールとN-イソプロピルアクリルアミド、ポリスチレンとポリイソプレン、ポリスチレンとポリブタジエン、ポリスチレンとポリ乳酸、ポリスチレンとポリブチルアクリレート等であり得る。また、ポリエチレングリコールとN-イソプロピルアクリルアミドの組合せを用いる場合、良溶媒としては水、貧溶媒としてはDMSO若しくは1-プロパノールを使用し得る。ポリスチレンとポリイソプレンの組合せを用いる場合、良溶媒としてはテトラヒドロフラン（THF）、貧溶媒としては水を使用し得る。使用するポリマーの種類及び組合せに応じて、微粒子の調製のために使用し得る良溶媒及び貧溶媒を適切に選択することができる。
　本発明の多相ポリマー微粒子の製造方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば予め作製したシリカ、セラミック等のコア上に、コアと親和性が高い2種以上のポリマー相が被覆した形態のものであっても良い。すなわち、多相ポリマー微粒子は、微粒子全体がポリマーで形成されたものである必要はなく、当分野において通常用いられる技術を用いて、2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有するものであれば良い。
　本発明の多相ポリマー微粒子は、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であるように構成される。本明細書において、「検体物質」とは、生物学的サンプル等のサンプル中に含まれ得る既知の物質であって、その存在又は量を検出することが必要とされる物質をいうものとする。検体物質としては、限定するものではないが、例えば天然における生体内物質、疾患の治療・予防・診断のために投与された薬剤等であって、タンパク質若しくはペプチド、糖類、核酸、脂質、ステロイド化合物等であり得る。
　本明細書において、「検体物質と特異的に結合し得る物質」は、検体物質と特異的に結合できるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば抗体、受容体、アプタマー、あるいは検体物質が核酸である場合、検体物質の核酸配列と相補的な配列を有する核酸（例えばDNA）、検体物質が糖類である場合のレクチン等が挙げられる。検体物質と特異的に結合し得る物質は、好ましくは抗体である。第1のポリマー相に共有結合させる検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質は、例えば100～100万の範囲の分子量、1nm～100nmの範囲の大きさを有するものである。
　抗体は、いずれかの生物種に由来する天然の抗体であっても、遺伝子改変された抗体であっても、あるいは合成された抗体であっても良い。第1のポリマー相に共有結合させる抗体は、検体物質に対して特異的に結合可能である限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良く、従って結合特異性の異なる複数種の抗体の混合物を結合のために使用することもできる。また、抗体は、特に限定するものではないが、目的の検体物質と特異的に結合し得るIgG抗体、その抗原結合性を保持する断片、又は誘導体であっても良く、例えばFab、F(ab')2断片等を好適に使用できる。また、構造的安定性を高めるために、あるいは後の検出工程のため等の目的で、当分野で通常使用されるような改変を有するものであっても良い。
　第1のポリマー相と検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質との結合は、結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が多相ポリマー微粒子と挙動を共にすることを確実なものとするために、共有結合とすることが好ましい。検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質との結合を可能とするために、第1のポリマー相を構成するポリマーは、例えば末端にアミノ基又はカルボキシル基等の官能基を有するポリマーを用いることができる。末端にアミノ基又はカルボキシル基を有するポリマーは合成することができ、また例えばPolymer Source社等から市販品を購入することもできる。この場合、生成した多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上にアミノ基又はカルボキシル基があるため、検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質のカルボキシル基若しくはシアノ基又はアミノ基等と共有結合を形成することができる。
　多相ポリマー微粒子1個あたりに結合させる検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質の分子数は、1個～1000個の範囲内であり得る。微粒子1個あたりの検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質の量は、上記の共有結合を生じさせる反応条件を選択することで適宜調整することができ、用途に応じて変動可能である。例えばサンプル中の検体物質と微粒子上に共有結合した検体物質との競合的結合（間接競合的結合の場合も同様）を利用して検体物質を検出する場合には、微粒子に共有結合した検体物質の分子数は、微粒子1個あたり10個以下、好ましくは5個以下、特に好ましくは1個である。また、サンプル中の検体物質と微粒子上に共有結合した検体物質と特異的に結合し得る物質との結合を利用して検体物質を検出する場合には、微粒子に共有結合した検体物質と特異的に結合し得る物質の分子数は、特に限定するものではないが、微粒子1個あたり10個以下、5個以下、例えば1個とすることができる。
　本発明の多相ポリマー微粒子は、第2のポリマー相が標識物質を有するように構成される。標識物質としては、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質が挙げられる。蛍光色素の例としては、特に限定するものではないが、フルオレセイン及びその誘導体、ピレン及びその誘導体、量子ドット等の量子収量が優れた蛍光色素が挙げられる。化学発光物質としては、例えばペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ（ALP）等の酵素等が挙げられる。放射性標識物質としては、例えば14C、3H、125I等を有する試薬が挙げられる。標識物質との結合を可能とするために、第2のポリマー相を構成するポリマーは、例えば末端にアミノ基又はカルボキシル基等の官能基を有するポリマーを用いることができる。末端にアミノ基又はカルボキシル基を有するポリマーは合成することができ、また例えばPolymer Source社等から市販品を購入することもできる。この場合、生成した多相ポリマー微粒子の第2のポリマー相上にアミノ基又はカルボキシル基があるため、標識物質のカルボキシル基若しくはシアノ基又はアミノ基等と共有結合を形成することができる。あるいはまた、第2のポリマー相のために末端にピレニル基等を有するポリマー、化学発光物質を有するように改変したポリマー、又は放射性同位元素を有するように改変したポリマーを使用することもでき、この場合、多相ポリマー微粒子の生成時点で第2のポリマー相上に標識物質が存在し得る。
　第1及び第2のポリマー相は適宜選択することができる。生成した多相ポリマー微粒子上の第2のポリマー相に標識物質を結合させる場合、第1及び第2のポリマー相のそれぞれに検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質及び標識物質が結合し得るように、ポリマー相上に生成するアミノ基、カルボキシル基等の官能基は異なるものとすることが必要である。
　第1及び第2のポリマー相の比率は、特に限定するものではないが、微粒子上のそれぞれの表面積として1：9～9：1の範囲であり得る。ポリマー相の比率は、微粒子の作製時に使用する各ポリマー量の比率を調整することで、適宜変更することができる。
　尚、一般的に、2つの半球が物理的及び／又は化学的に異なる非対称の球状粒子に対して「ヤヌス粒子」との用語が使用されるが、本明細書に記載する多相ポリマー微粒子も異方性を有する非対称「ヤヌス粒子」であり得る。
　本発明の多相ポリマー微粒子は、一部のポリマー相に磁性体を含むことができる。磁性体を含むポリマー相は、上記の第1又は第2のポリマー相のいずれかであっても良く、あるいはこれらと異なる第3のポリマー相であっても良い。ポリマー相中に磁性体を組み込むことで、多相ポリマー微粒子の挙動を磁場によって制御することが可能である。
　磁性体は、特に限定するものではないが、鉄、クロム、コバルト、ネオジウムおよびその酸化物、硫化物等が挙げられ、好適に使用することができる。磁性体の大きさは、特に限定するものではないが、ナノサイズの微粒子中に組み込むために、粒径1～100nmの範囲の磁性ナノ粒子とすることができる。また、それらが数個から数十個の凝集体を形成していてもよい。磁性ナノ粒子は、例えばAldrich社製酸化鉄ナノ粒子等を好適に使用することができる。
　本発明に用いることができる多相ポリマー微粒子を図１に模式的に示す。図１に示す微粒子は、一方のポリマー相（第1のポリマー相）にアミノ基１を有し、このアミノ基を介して検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質と共有結合することができる。他方のポリマー相には標識物質、例えば蛍光物質２を有するものとすることができる。また、図１では、第1のポリマー相中に磁性体３が組み込まれている。
　また、図２Ａに、ポリマーＡ及びポリマーＢからなる多相ポリマー微粒子のポリマーＢ相に磁性ナノ粒子を組み込んだ例を模式的に示す。図２Ｂは、ポリマーＢに酸化鉄（Fe2O3）を組み込んだ多相ポリマー微粒子の電子顕微鏡写真を示す。ポリマーＡ及びポリマーＢは、それぞれが上記の第1及び第2のポリマー相のいずれであっても良い。
　磁性体は、ポリマー中に安定に組み込むために、磁性体と親和性を有する部分とポリマーと親和性を有する部分とを有する化合物、例えばポリスチレン-ポリドーパミンメタクリルアミドランダム共重合体（PS-r-PDMA）を用い、磁性体をポリマー親和性を有する材質で被覆した状態で多相ポリマー微粒子中に組み込むことができる。このようにしてポリマーとの親和性が増大した形態の磁性体は、多相ポリマー微粒子の生成過程でポリマー溶液中に混和させる事により、析出した微粒子中に組み込むことができる。例示したPS-r-PDMAは、ポリスチレンを含むため、ポリスチレンポリマーからなるポリマー相に好都合に組み込まれ得る。磁性体のポリマー被覆は、例えば特許第5008009号に記載の方法によって好適に行うことができる。磁性体は、得られる多相ポリマー微粒子が、例えば約50mT以上の磁場において収集可能なものとなるように組み込むことが好適であり得る。
　本発明の多相ポリマー微粒子は、上記のように第1のポリマー相の表面上に官能基を有しており、この官能基と反応性を有する基を有する検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質と共有結合させることができる。検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質は、それ自体に反応性基が存在する場合には、そのまま多相ポリマー微粒子に共有結合させることができる。検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に反応性基が存在しない場合には、予め検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が反応性基を有するように化学的に修飾することができる。この場合、後に記載する捕捉用試薬と検体物質との結合、あるいは検体物質と特異的に結合し得る物質と検体物質との結合を妨げないように、反応性基又は修飾部位を考慮して選択することが必要となる。例えば、検体物質が抗原であり、捕捉用試薬が抗体である場合には、抗体が特異的に認識して結合する抗原上のエピトープではない部位を微粒子に結合する又は結合のために修飾するようにすることが必要である。当業者であれば、検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質の種類、及び捕捉用試薬との結合の種類に応じて、反応性基及び修飾部位を適宜選択し、決定することができる。結合は、当分野において通常使用されるリンカーを用いるものでも良い。
　多相ポリマー微粒子に抗体等のタンパク質を結合させる場合には、タンパク質の構成アミノ酸中に多数のアミノ基及びカルボキシル基が存在するため、縮合剤の存在下で混合することによって多相ポリマー微粒子との結合を達成することができる。多相ポリマー微粒子に抗体を結合させる場合、捕捉用試薬が結合する検体物質の部位以外の部位を認識する抗体を使用することが必要とされる。
　本発明の多相ポリマー微粒子はまた、一態様では上記のように第2のポリマー相の表面上に官能基を有しており、この官能基と反応する反応性基を有する標識物質と共有結合させることができる。検体物質の場合と同様に、標識物質自体に反応性基が存在する場合には、そのまま多相ポリマー微粒子に共有結合させることができ、標識物質に反応性基が存在しない場合には、予め標識物質が反応性基を有するように化学的に修飾することができる。あるいはまた、別の態様では、上記の通り、ポリマー微粒子の製造過程で標識物質を第2のポリマー相に組み込むことができる。
　多相ポリマー微粒子は、平均粒径が1nm～1mm、例えば100nm～1mmの範囲の大きさのものを製造条件に応じて取得することが可能であり、特に限定するものではないが、例えば用途の一つとしての小型デバイス内での検体物質の検出のためには、平均粒径が約10nm～約100μm、好ましくは約50nm～約50μm、更に好ましくは約100nm～約10μmの範囲のものとすることができる。ポリマー相中に磁性体を封入する場合には、十分な量の磁性体の封入のために平均粒径は約100nm以上のものとすることが好適である。粒径の変動係数は20％以内、好ましくは10％以内である。
　本発明の多相ポリマー微粒子は、以下に具体的に記載する方法により、サンプル中の検体物質を高感度・高精度に計測することができる。
［検体物質の検出方法］
　本発明はまた、サンプル中の検体物質を検出する方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：
　検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
　該固相支持体と上記本発明の多相ポリマー微粒子とを接触させる工程；及び
　固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
を含む。
　本発明の方法の一実施形態では、微粒子は検体物質が共有結合した微粒子であり、サンプル中の検体物質と微粒子上に存在する検体物質とが捕捉用試薬に競合的に結合し、サンプル中の検体物質が未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在する検体物質とが結合するものである。
　本発明の方法の別の実施形態では、微粒子は検体物質と特異的に結合し得る物質が共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と微粒子上に存在する検体物質と特異的に結合し得る物質とが結合するものである。
　上記の方法において、特に限定するものではないが、サンプルは検体物質を含み得る生物学的サンプル、例えば血液（血漿、血清等も含む）、髄液、膿、穿刺液、尿、大便等であり、多くの場合、サンプルは血液、血漿、又は血清である。サンプルはそのまま本発明の方法に使用しても良く、あるいは上記の固相支持体と接触させる工程の前に、溶解工程、及び／又は反応と無関係の夾雑物質、例えば赤血球、白血球、血小板、検出対象以外のタンパク質等を除去する工程等を含めても良い。夾雑物質を除去する工程は、例えば遠心分離等の操作によって行うことができる。また、サンプルは、必要に応じて希釈又は濃縮することができる。溶解及び希釈は、本発明の方法に適した水性溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水等を使用して行うことができる。
　捕捉用試薬としては、特に限定するものではないが、例えば検体物質を抗原とする抗体、糖類と特異的に結合し得るレクチン、核酸物質とハイブリダイズし得る相補性を有するポリヌクレオチドとすることができる。抗体は、いずれかの生物種に由来する天然の抗体であっても、遺伝子改変された抗体であっても、あるいは合成された抗体であっても良い。抗体は、特に限定するものではないが、目的の検体物質と特異的に結合し得るIgG抗体、その抗原結合性を保持する断片、又は誘導体であっても良く、例えばFab、F(ab')2断片等を好適に使用できる。また、ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、若しくは安定性向上等のために改変された合成ポリヌクレオチドであっても良い。捕捉用試薬と検体物質とは、分子単位で１：１で結合することが好ましい。
　捕捉用試薬は、予想されるサンプル中の検体物質の量に対して分子単位で同量以上とすることが望まれる。捕捉用試薬の量が少なすぎる場合には、検出すべき検体物質の一部が捕捉用試薬に結合せず、従って検体物質の正確な検出ができないためである。後の工程において、固相支持体と多相ポリマー微粒子とを結合させ、結合した多相ポリマー微粒子の標識を検出するために、捕捉用試薬は予想されるサンプル中の検体物質の量に対して過剰量、例えば1.1倍以上、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上とすることが好ましい。
　捕捉用試薬は、後の工程のために、固相支持体上に固定されている。固相支持体は、当分野において通常使用される材質のもの、例えばプラスティック、ガラス、シリコン等を好適に使用し得る。固相支持体は、検体物質の非特異的な吸着を防止するために表面処理されたものを使用し得る。
　サンプルと固相支持体との接触は、静止状態で行っても、流動的に行っても良い。例えば、ウェル等の固相支持体上にサンプルを添加することで接触させることができ、また固相支持体が固定された流路にサンプルを通過させて接触させることができる。サンプルと固相支持体との接触の後、検体物質以外のサンプル中の成分を、緩衝液を用いた洗浄によって除去することが好ましい。
　次いで、サンプル中の検体物質が結合した固相支持体と、上記本発明の多相ポリマー微粒子とを接触させる。上記の通り、固相支持体上の捕捉用試薬は、サンプル中の検体物質の量に対して分子単位で同量以上であり、好ましくは過剰量である。従って、固相支持体上には、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬が存在し得る。
　多相ポリマー微粒子として検体物質が共有結合した微粒子を使用する実施形態では、多相ポリマー微粒子にサンプル中の検体物質と実質的に同じ検体物質が共有結合されているため、多相ポリマー微粒子に結合した状態の検体物質が捕捉用試薬と結合することができる。すなわち、多相ポリマー微粒子に共有結合した検体物質と、サンプル中の検体物質とは、実質的に同じ構造であるため、捕捉用試薬に競合的に結合し得る性質を有し、捕捉用試薬に対する結合親和性は同等である。
　本実施形態では、捕捉用試薬を先にサンプルと接触させるため、多相ポリマー微粒子に共有結合した検体物質は、既に結合した検体物質の結合を阻害することなく、未結合の捕捉用試薬と結合することができる。捕捉用試薬と結合しなかった微粒子は、必要に応じて、その後の洗浄操作により除去することができる。
　本実施形態では、次に、固相支持体上の捕捉用試薬に結合した微粒子上の標識を検出する。標識は、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質であり、それぞれ蛍光、化学発光又は放射性物質からの放射線を検出することにより、微粒子上の標識を検出することができる。
　図３に示すように、サンプル中に多量の検体物質が存在する場合（図３Ｃ）には、検体物質（□で示す）が捕捉用試薬（▽で示す）に結合するため、未結合の捕捉用試薬が少なくなり、従って多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上の検体物質（□）との結合は競合的に阻害されるため、捕捉用試薬に結合した微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度は比較的低くなる。
　これに対して、サンプル中に検体物質が存在しない（図３Ａ）か少量である（図３Ｂ）場合には、検体物質と未結合の捕捉用試薬が多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上の検体物質と結合することとなり、微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が高くなる。
　多相ポリマー微粒子として検体物質と特異的に結合し得る物質が共有結合した微粒子を使用する実施形態では、多相ポリマー微粒子に結合した状態の検体物質と特異的に結合し得る物質が、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と結合することができる。この場合、多相ポリマー微粒子に結合した検体物質と特異的に結合し得る物質と、捕捉用試薬とは、検体物質の異なる部位を認識して結合するものとし、サンドイッチアッセイ法としての検出方法となる。
　本実施形態では、捕捉用試薬を先にサンプルと接触させるため、多相ポリマー微粒子に共有結合した検体物質と特異的に結合し得る物質は、捕捉用試薬に既に結合した検体物質と結合し、検体物質が結合していない捕捉用試薬とは反応しない。検体物質と結合しなかった微粒子は、必要に応じて、その後の洗浄操作により除去することができる。
　本実施形態では、次に、捕捉用試薬を介して固相支持体上に存在する検体物質に結合した微粒子上の標識を検出する。標識は、例えば蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質であり、それぞれ蛍光、化学発光又は放射性物質からの放射線を検出することにより、微粒子上の標識を検出することができる。
　図４に示すように、サンプル中に多量の検体物質が存在する場合（図４Ｃ）には、検体物質（□で示す）が捕捉用試薬（▽で示す）に結合し、多相ポリマー微粒子の第1のポリマー相上の検体物質と特異的に結合し得る物質（▲）が更に結合するため、検体物質に結合した微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が高くなる。
　これに対して、サンプル中に検体物質が存在しない（図４Ａ）か少量である（図４Ｂ）場合には、捕捉用試薬と結合した検体物質量が少なくなるため、微粒子の第2のポリマー相上の標識物質からの蛍光等の検出強度が低くなる。
　磁性体を含む多相ポリマー微粒子を用いる場合、磁性体は、検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質と結合したポリマー相中に封入することが好ましい。この場合、固相支持体に磁場をかけた状態で、例えば予め個数が定められた粒子数の多相ポリマー微粒子を固相支持体上と接触させることで、多相ポリマー微粒子上に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質と固相支持体上の捕捉用試薬又は検体物質との結合を効率的に行うことができると共に、多くの場合に微粒子の反対側表面上に存在する標識からの信号の検出感度を上げることができる。
　本発明の方法により、0.1pg/mL～1000mg/mLの範囲の検体物質を検出することができる。サンプルは、必要に応じ、濃縮又は希釈して本発明の検出方法に供することができる。また、本発明の方法により、サンプル中の2種以上の検体物質を同時に検出することもできる。2種以上の検体物質を同時に検出する場合には、2種の多相ポリマー微粒子を作製し、これらを別個に、連続して、又は同時に固相支持体と接触させる。この場合、検出に用いる標識物質を異なるものとし、例えば蛍光波長の異なる蛍光物質を用いることが好ましい。
［検体物質の検出システム］
　本発明はまた、サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムを提供する。
　本発明のシステムにおいて、上記捕捉手段は、検体物質と特異的に結合する試薬が固定された固相支持体である。固相支持体は、当分野において通常使用される材質のもの、例えばプラスティック、ガラス、シリコン等を好適に使用し得る。固相支持体は、検体物質の非特異的な吸着を防止するために表面処理されたものを使用し得る。固相支持体は、例えばウェル、チップ等の形態であって良く、一実施形態では、サンプル及び多相ポリマー微粒子を通過させる流路上に固定したものであって良い。また、流路内表面の材質としては、固定化する分子に合わせて、限定するものではないが、例えばニトロセルロース膜、シリコン樹脂、金コーティング等を使用することができる。
　固相支持体には、検体物質と特異的に結合して捕捉できる捕捉用試薬を固定化する。捕捉用試薬としては、特に限定するものではないが、例えば検体物質を抗原とする抗体、糖類と特異的に結合し得るレクチン、核酸物質とハイブリダイズし得る相補性を有するポリヌクレオチドとすることができる。検体物質と捕捉用試薬との特異的結合を確実なものとするための反応条件等は、当業者であれば容易に認識し、適宜選択することができる。
　本発明のシステムにおいて、上記検出手段は、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬、又は捕捉用試薬に結合した検体物質と上記本発明の多相ポリマー微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである。
　本発明のシステムは、使用が簡便な小型デバイスの形態で提供することができる。この場合、デバイス内に、サンプル及び本発明の多相ポリマー微粒子を通過させるマイクロ流路を設け、流路上に捕捉用試薬を固定した固相支持体としてチップを固定しても良い。あるいはまた、ポンプ及び検出系を有するシステム中に捕捉用試薬を固定したチップの形状にしたマイクロ流路（流路チップ）を挿入するような構成としても良い。マイクロ流路は、例えば断面の高さが約50μm～約200μm、幅が約100μm～約2mm、長さが約10mm～50mmの範囲のものとすることができる。マイクロ流路の材質は、ポリジメチルシロキサンなどのシリコン樹脂やポリエチレンテレフタラート等のプラスティックとすることができる。また、チップの材質としては、例えばプラスティックやガラス等を使用することができる。チップはディスポーザブルタイプのものとすることができる。小型デバイスの構成及び形状は、当分野において通常用いられている手段を用いて、適宜選択することができる。特に限定するものではないが、小型デバイスとしては、約0.25～400cm3の範囲のサイズ、0.4～20gの重量のものが好適に使用できる。
　また、蛍光による検出を行う態様では、検出手段として、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラ、フォトダイオード、フォトマルチプライヤー等を使用することができる。化学発光物質による検出を行う態様では、検出手段として、CCDカメラを使用することができる。放射性標識物質による検出を行う態様では、検出手段として、シンチレーション検出器等を使用することができる。検出手段は、上記の捕捉手段と共に同じデバイス中に構成することもできるが、捕捉手段と検出手段とは別個に構成しても良い。
　図５に、本発明のシステムの一例を模式的に示す。図５に示すように、固相支持体４上に固定された捕捉用試薬５に、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬に結合した多相ポリマー微粒子、又は検体物質を介して捕捉用試薬に結合した結合した多相ポリマー微粒子が存在する（図示せず）ため、第1のポリマー相とは異なる領域、例えば逆の半球側に存在する第2のポリマー相に結合した標識物質からの信号、例えば蛍光の量を、検出手段６（例えばCCDカメラ）によって計測することができる。磁性体を含む多相ポリマー微粒子を用いる場合には、磁性体は、第1のポリマー相中に封入することが好ましい。この場合、固相支持体に磁場７をかけた状態で多相ポリマー微粒子を通過させることで、流路上に多相ポリマー微粒子を集積させることができる。これにより、多相ポリマー微粒子上に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質と、固相支持体上の捕捉用試薬又は検体物質との結合を効率的に行うことができると共に、多くの場合に微粒子の反対側表面上に存在する標識からの信号の検出感度を上げることができる。多相ポリマー微粒子は、予め定められた粒子数を用いることにより、検出結果から捕捉用試薬に結合した微粒子の数を容易に算出することができる。
　本発明のシステムでは、上記の検出手段によって多相ポリマー微粒子中の標識を検出し、それによってサンプル中の検体物質の量及び／又は濃度を測定することができる。
　更に、目的の検体物質について疾患との関連で重要な閾値としての血中濃度が存在する場合には、予め設定した閾値と比較してサンプル中の検体物質が高濃度又は低濃度である場合に警告できるように計測結果が表示されるようにすることもできる。
　本発明のシステムは、ナノサイズの多相ポリマー微粒子とマイクロ流路を有する小型デバイスを組合せることにより、様々なサンプル中の検体物質を高感度で迅速かつ簡便に測定できる。
　小型デバイス形態のシステムは、検体物質を含む可能性のあるサンプルをデバイスの挿入口に塗布するだけで計測することができ、必要とされるサンプル量が少量であり、また検査・診断に使用する試薬量も少なくすることができる。従って、検査費用の削減に繋がり、従来使用されてきた検査システムと比較してより安価な診断薬および診断装置としての提供が可能である。
　また、本発明のシステムは、洗浄することで繰り返し使用可能であり、またディスポーサブルタイプとすることができる。
［キット］
　本発明は更に、目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された本発明の多相ポリマー微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬、及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、検体物質と捕捉用試薬との結合反応、多相ポリマー微粒子の結合反応、及び検体物質の検出のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキットを提供することができる。検出手段として化学発光物質を用いる場合には、酵素反応のために必要な基質等もキットに含めることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［調製例１：磁性ナノ粒子の製造１］
　酸化第二鉄（Fe2O3）紛末（粒径50nm以下）37.5 mgをクロロホルム1.25 mlに分散し、5分間超音波処理した。これにMacromolecular Rapid Communications, 35(20), 1763-1769 (2014)に記載の方法で合成したドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの８：１ランダム共重合体（PS:PDMAの共重合比が8:1のPS-r-PDMA、D81）25 mg及びクロロホルム1.25 mlを添加して更に5分間超音波処理した後、室温で12時間、振とうしながら反応させた。これにネオジウム磁石を容器に近づけ、粒子を捕集した後、クロロホルムを加え、3回洗浄して未反応のD81を除去し、室温で3.5時間、真空下で乾燥した。生成物をTHFに1mg/mlの濃度となるように再度分散させて5分間超音波処理した。
　フーリエ変換赤外分光光度計（FT-IR）による測定でFe2O3がD81で被覆された複合体の生成を確認したところ、D81と反応させる前（図６Ａ）及び反応させた後（図６Ｂ）のFT-IR測定結果に示される通り、反応後の酸化鉄粒子ではアルキル及びアミド由来のピークが観察され、酸化鉄粒子にD81が被覆した形態の磁性ナノ粒子の生成が確認された。
　得られた磁性ナノ粒子は粒径100～300nmの範囲のものであり、磁性粒子が凝集した状態でポリマーに被覆されていることが確認された。
［調製例２：磁性ナノ粒子の製造２］
　酸化第二鉄（Fe2O3）粉末（粒径50nm以下）90 mgを10 mlの透明バイアル中のDMF 5mlに分散し、ホモジナイザー（強度30％）で10分間ホモジナイズした。これに調製例１と同様にして合成したドデシルアクリルアミドとドーパミンメタクリルアミドの２：１ランダム共重合体（D21）、４：１ランダム共重合体（D41）及び８：１ランダム共重合体（D81）各30mg及びTHF 1mlを添加して更に10分間ホモジナイズした後、最大振とう速度にて12時間、振とうしながら反応させた。反応液をテフロン（登録商標）製遠心管に移し、10,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去した。これにクロロホルム10mlを添加して約30秒間ボルテックスして同様に遠心分離することで3回洗浄した。ペレットにクロロホルムを添加した分散液を再度10 mlの透明バイアルに移し、常温で2時間真空乾燥したのち、重量を測定し、10g/l又は1g/lの粒子濃度のTHF分散液とし、透過型電子顕微鏡（TEM）により粒子を観察すると共にファイバー光学動的光散乱光度計（Fiber-optic Dynamic Light Scattering、FDLS）により粒径分布を測定した。結果を図７－１～７－３に示す。
　図７－１に示すように、D21を使用した場合には約100～2000nmの範囲の粒径を有する磁性ナノ粒子が得られ、平均粒子径は約500nmであった。図７－２に示すように、D41を使用した場合には、約200～350nmの範囲の粒径を有しており、平均粒子径は約430nmであった。また、図７－３に示すように、D81を使用した場合には、約100～約400nmの範囲の粒径を有しており、平均粒子径は約285nmであった。
［実施例１：磁性ヤヌス粒子の製造１］
　末端にピレニル基を有するポリスチレン（PS-Pyr、Mn=3,500、Polymer Source社）の1g/L THF溶液0.5 mL、末端にアミノ基を有するポリブタジエン（PB-NH2、Mn=1,700、Polymer Source社）の1g/L THF溶液0.5 mL、及び調製例２で調製した磁性ナノ粒子の10g/l THF溶液0.5mlを12 mlのシランカップリング剤で処理した褐色疎水化バイアル中で混合した後、水を1ml/分の速度で1.0ml添加し、ボルテックスで撹拌した。得られた混合液を真空オーブン中で常温で2時間加熱してTHFを蒸発させ、冷却後に0.2％の四酸化オスミウム水溶液を添加して15分間染色し、透過型及び走査型電子顕微鏡で粒子を観察した。上記の製造工程を図８に模式的に示す。
　その結果、図９－１～９－３に示すように、ポリスチレンからなるポリマー相とポリブタジエンからなるポリマー相とが視覚的に識別可能に分離したヤヌス粒子の生成が確認された。
［実施例２：磁性ヤヌス粒子の製造２］
　実施例１と同様にして、ポリスチレン及びポリブタジエンを0.1mg/mL、1.0mg/mL又は5.0mg/mL THF溶液とした場合に生成する粒子の粒径を確認した。その結果、図１０に示すように、他の条件を同一とした場合に、用いる出発ポリマー濃度が高い程粒径が大きくなることが確認された。
［実施例３：ヤヌス粒子への標識物質の結合の確認］
　実施例１で得られた磁性ヤヌス粒子の一方のポリマー相への蛍光標識物質の結合を確認した。図１１Ａ及びＢの顕微鏡写真からわかるように、四酸化オスミウムで染色されるポリマー領域（ポリブタジエン）と、ピレニル基からの蛍光が検出されるポリマー領域とは明確に分かれており、ポリスチレンからなるポリマー相が選択的に蛍光標識されていることが確認された。
［実施例４：磁性ヤヌス粒子の製造３］
　ポリスチレン（PS、Mn=約1万、Polymer Source社）の1g/L THF溶液0.5 mL、末端にアミノ基を有する1,2-ポリブタジエン（PB820、JSR株式会社）の1g/L THF溶液0.5 mL、及び調製例２で調製した磁性ナノ粒子の10g/l THF溶液0.5mlを12 mlのシランカップリング剤で処理した褐色疎水化バイアル中で混合した後、水を1ml/分の速度で1.0ml添加し、ボルテックスで撹拌した。得られた混合液を真空オーブン中で常温で2時間加熱してTHFを蒸発させ、得られた粒子にFITCを加えて反応させた。得られた粒子を蛍光顕微鏡で観察したところ、粒子の片面のポリブタジエンからなるポリマー相にFITCの蛍光が観察されたことから、部位選択的にFITCが導入出来ることが示された（図１２）。
［実施例５：非磁性ヤヌス粒子の製造］
　カルボキシ末端ポリスチレン及びアミノ基末端ポリブタジエン（いずれもPolymer Source社）を用い、磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例４と同様にして非磁性ヤヌス粒子を製造した。得られた粒子にFITCを加えて反応させ、蛍光顕微鏡で観察したところ、ポリブタジエンからなるポリマー相にFITCの蛍光が観察されたことから、部位選択的にFITCが導入できることが示された（図１３）。
［実施例６：ヤヌス粒子を用いたアルドステロンの検出］
　磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例１と同様にして製造したヤヌス粒子1 mgの水分散液1mLに、J. K. McKenzie及びJ.A. Clements, J. Clin. Endocrinol. Metab., 38(4), 622 (1974)に記載された方法を用いてアルドステロンの3位のみを選択的に修飾したアルドステロン-3-オキシム 5mg/mLメタノール溶液1mLを添加し、縮合剤として1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-カルボジイミド（EDC）約3mgを用いて、室温で一晩、振とうしながら反応させた。その結果、アルドステロン-CMOがポリブタジエン領域に共有結合し、蛍光物質がポリスチレン領域に存在する非磁性ヤヌス粒子が得られた。
　96ウェルプレート（Nunc社）の各ウェル表面に抗アルドステロン抗体（A2E11）を固相化し、0.1～100pg/mL濃度のアルドステロン（Toronto Research Chemicals Inc.）を含有するサンプルを添加し、室温で5分間インキュベートした。次いで、実施例１で調製したアルドステロン結合ヤヌス粒子1.0mg/mLを添加し、室温で一晩インキュベートした。
　洗浄後、励起波長345nm、蛍光波長450nmとして蛍光顕微鏡（Olympus Cell Dimension）で観察し、画像ソフトを用いて蛍光（合計輝度）を数値化した。アルドステロン結合ヤヌス粒子のみを添加した場合の蛍光強度を100とし（B0）、アルドステロン含有サンプルを添加した場合の蛍光強度をBとし、グラフを作成した。
　その結果、図１４Ｂに示す通り、サンプル中のアルドステロン量が少ない場合にヤヌス粒子に結合した蛍光色素であるピレンからの蛍光強度が高くなり、サンプル中のアルドステロン量が多くなるにつれて蛍光強度が低くなることが示された。
［実施例７：ヤヌス粒子を用いたレニンの検出］
　磁性ナノ粒子を入れない以外は実施例１と同様にして製造したヤヌス粒子に、縮合剤の存在下で抗マウスレニン抗体(#AF4277, R&D systems社)を共有結合させ、ヤヌス粒子を調製した。
　一方、抗マウスレニン抗体（#BAF4277, R&D systems社）を捕捉用試薬として、PBSバッファ中1μg/mLで96ウェルプレート（Nunc社）の各ウェル表面に固定し、これに組換えマウスレニン（4277-AS-020, R&D systems社）を含むサンプルを加え、室温で2時間インキュベートした。
　次いで、上記の抗マウスレニン抗体結合ヤヌス粒子（4×106個/mL, 100μL）を添加し、4℃で一晩インキュベートした。
　洗浄後、蛍光顕微鏡で観察し、励起波長345nm、蛍光波長450nmとして蛍光を検出した。サンプル中のレニン量が少ない場合にはウェル表面上の抗マウスレニン抗体と結合するレニン量が少なくなり、ヤヌス粒子の結合も少なくなるため、蛍光強度が低くなり、サンプル中のレニン量が多くなるにつれて、得られる蛍光強度は高くなり、従って、サンプル中のレニン濃度に依存した蛍光が検出されることが確認された。
　本発明により、サンプル中の検体物質、例えば様々な疾患に関連するバイオマーカーや、ウイルス、病原菌の検出等が可能であり、本発明の多相ポリマー微粒子や検出方法は、疾患の診断・治療効果のモニタリング等に利用することができる。
　より具体的には、例えば国内で200-400万人が潜在的にいるとされる高血圧にかかわる原発性アルドステロン症患者のスクリーニング、尿検査による腎症の進行度判断、腫瘍マーカーの診断、空港やクリニックでの病原性微生物の感染症の検査、ボツリヌス毒素、ヒスタミン等の食品中の毒素の検査、家畜やペットの感染症の検査等への利用が可能である。
１　アミノ基
２　蛍光物質
３　磁性体
４　固相支持体
５　捕捉用試薬
６　検出手段
７　磁場
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (19)

  1. 　2種以上のポリマーがそれぞれ集合して形成される2種以上のポリマー相を少なくとも表面上に有する多相ポリマー微粒子であって、第1のポリマー相が検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質に結合可能であり、第2のポリマー相が標識物質を有する、上記微粒子。
  2. 　第1若しくは第2のポリマー相、又は第3のポリマー相が磁性体を含む、請求項１記載の微粒子。
  3. 　請求項１若しくは２記載の微粒子の第1のポリマー相に共有結合した検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質を有する、多相ポリマー微粒子。
  4. 　第2のポリマー相に共有結合した標識物質を有する、請求項３記載の多相ポリマー微粒子。
  5. 　検体物質が、タンパク質若しくはペプチド、糖類、核酸、脂質、又はステロイド化合物である、請求項１～４のいずれか１項記載の微粒子。
  6. 　標識物質が蛍光色素、化学発光物質又は放射性標識物質である、請求項１～５のいずれか１項記載の微粒子。
  7. 　サンプル中の検体物質を検出する方法であって、以下の工程：
    　検体物質に特異的に結合する捕捉用試薬を固定化した固相支持体とサンプルとを接触させる工程；
    　該固相支持体と請求項３～６のいずれか１項記載の微粒子とを接触させる工程；及び
    　固相支持体上に結合した微粒子上の標識を検出する工程
    を含む、上記方法。
  8. 　微粒子が検体物質に共有結合した微粒子であり、サンプル中の検体物質が未結合の捕捉用試薬と微粒子上に存在する検体物質とが結合する、請求項７記載の方法。
  9. 　微粒子が検体物質と特異的に結合し得る物質に共有結合した微粒子であり、捕捉用試薬に結合したサンプル中の検体物質と微粒子上に存在する上記検体物質と特異的に結合し得る物質とが結合する、請求項７記載の方法。
  10. 　検体物質が生物学的サンプル中に含まれる、請求項７～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　生物学的サンプルが血液、血漿、又は血清である、請求項１０記載の方法。
  12. 　捕捉用試薬が抗体である、請求項７～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　サンプル中の検体物質の捕捉手段と、捕捉された検体物質の検出手段とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのシステムであって、上記捕捉手段が、検体物質と特異的に結合する試薬が固定された固相支持体であって、上記検出手段が、サンプル中の検体物質と未結合の捕捉用試薬又は捕捉用試薬と結合した検体物質と、請求項３～６のいずれか１項記載の微粒子との結合によって検出可能な標識を検出するものである、上記システム。
  14. 　小型デバイスの形態で提供される、請求項１３記載のシステム。
  15. 　固相支持体が、サンプルを通過させるデバイス内のマイクロ流路上に固定されたチップである、請求項１４記載のシステム。
  16. 　検出手段が、固相支持体上に捕捉された微粒子からの蛍光を検出するCCDカメラである、請求項１４又は１５記載のシステム。
  17. 　検体物質の量及び／又は濃度を測定する、請求項１３～１６のいずれか１項記載のシステム。
  18. 　少なくとも予め設定した閾値と比較して高濃度又は低濃度である場合に計測結果が表示される、請求項１３～１７のいずれか１項記載のシステム。
  19. 　目的の検体物質又は検体物質と特異的に結合し得る物質が予め結合された請求項３～６のいずれか１項記載の微粒子と、サンプル中の検体物質と特異的に結合する捕捉用試薬及び捕捉された検体物質の検出器を有するデバイスと、反応のために必要な試薬とを含む、サンプル中の検体物質の検出のためのキット。
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