TWI825567B - 核酸樣本之檢測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種核酸樣本之檢測方法。此檢測方法結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子進行，利用參考核酸樣本之已知濃度與不對稱粒子產生的複數個第一閃爍訊號建立標準曲線後，取得待測核酸樣本之複數個第二閃爍訊號並根據標準曲線轉換為濃度測量值，從而縮短檢測方法之檢測時間，並降低檢測方法之檢測極限。
Description
本發明係有關於一種核酸樣本之檢測方法，且特別是有關於一種結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子進行之核酸樣本的檢測方法。
對於病原菌之快速且靈敏之快篩方法為傳染性疾病之早期管控的重要工具。在疾病的早期，極低濃度的病原菌對快速篩檢造成極大的挑戰。核酸增幅試驗在提供高選擇性及高靈敏度之病原菌檢測上扮演重要角色。透過特定的核酸序列之酵素增幅試驗能夠檢測疾病早期之微量的病毒或細菌的核酸。在分子診斷中，由於聚合酶連鎖反應(PCR)的高準確度，所以PCR被視為分子診斷的黃金標準。然而，傳統PCR需使用複雜的熱循環過程(即高溫與低溫之循環過程)，所以費時，如4小時至6小時，且需要高科技的昂貴儀器及受過訓練的操作員進行操作。因此，發展快速且靈敏的核酸增幅的檢測方法仍存有高度的需求。
過去，已開發多種基於比色法(Colorimetry)、螢光法(Fluorimetry)、表面電漿共振及電化學的新一代生物感測器，以利於高靈敏及具選擇性快速地檢測病原體。舉例而言，功能性的量子點及其他螢光訊號轉換器已用於檢測大腸桿菌、結核桿菌及金黄色葡萄球菌。此外，基於奈米粒子的比色生物轉換器、光學及光譜生物檢測技術(如表面增強拉曼光譜)及暗視野顯微鏡技術已用於檢測病原體。然而，此些技術仍遭遇到困難，例如：大規模的預處理、高科技儀器及昂貴的檢測標記。
有鑑於此，亟需發展一種新的核酸樣本之檢測方法，以改善習知的核酸樣本之檢測方法的上述缺點。
有鑑於此，本發明之一態樣係在提供一種核酸樣本之檢測方法。此檢測方法結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子進行，其中利用參考核酸樣本之已知濃度與不對稱粒子產生的第一閃爍訊號建立標準曲線後，取得待測核酸樣本之第二閃爍訊號並根據標準曲線轉換為濃度測量值，從而縮短檢測方法之檢測時間，並降低檢測方法之檢測極限。
本發明之另一態樣係在提供一種核酸樣本之檢測方法。此檢測方法結合使用三組引子對之恆溫核酸增幅反應與具有特定濃度之不對稱粒子進行，其中利用參考核酸樣本之已知濃度與不對稱粒子產生的第一閃爍訊號建立標準曲線後，取得待測核酸樣本之第二閃爍訊號並根據標準曲線轉換為濃度測量值，從而縮短檢測方法之檢測時間，並降低檢測方法之檢測極限。
根據本發明之一態樣，提出一種核酸樣本之檢測方法。此檢測方法包含建立標準曲線及檢測待測核酸樣本。於建立標準曲線之操作中，對參考核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得參考產物，其中參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段，參考產物包含複數個產物濃度之複數個核酸產物。接著，添加複數個不對稱粒子至參考產物，以形成第一混合物。然後，對第一混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第一閃爍訊號，其中影像擷取處理是使用光源照射第一混合物，此些不對稱粒子之平均粒徑為0.1μm至3.0μm，此些不對稱粒子之每一者的表面排除共價修飾，表面係由第一區域及第二區域所組成，第一區域係暴露出此些不對稱粒子之核心表面，第二區域係設有物理性沉積之金屬材料，且第一區域提供此些第一閃爍訊號。後續，使用互相關演算法處理此些第一閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，其中此些已知濃度及此些參考關聯時間係用以建立標準曲線。在檢測待測核酸樣本之操作中，對待測核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得待測產物。接著，添加此些不對稱粒子至待測產物，以形成第二混合物。然後，對第二混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第二閃爍訊號，其中影像擷取處理是使用光源照射第二混合物。後續，使用互相關演算法處理此些第二閃爍訊號，以獲得待測關聯時間，其中根據標準曲線，由待測關聯時間獲得待測核酸樣本之濃度測量值。
依據本發明之一實施例，第一區域及第二區域之面積比值為0.25至0.75。
依據本發明之另一實施例，金屬材料係選自於由金、銀、鉑、鋁、鈷、鎳及氧化鐵所組成之一族群。
依據本發明之又一實施例，此些不對稱粒子之核心係由聚合物層及螢光核心所組成，且聚合物層包覆螢光核心。
依據本發明之又一實施例，此些不對稱粒子之濃度為1
10
9至1
10
10顆粒/mL。
依據本發明之又一實施例，恆溫核酸增幅反應之反應溫度為60℃至75℃。
依據本發明之又一實施例，此些已知濃度為1 fg/μL至10
6fg/μL。
依據本發明之又一實施例，影像擷取處理之取像速率為5 Hz至100 Hz。
根據本發明之另一態樣，提出一種核酸樣本之檢測方法。此檢測方法包含建立標準曲線及檢測待測核酸樣本。此檢測方法包含建立標準曲線及檢測待測核酸樣本。於建立標準曲線之操作中，對參考核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得參考產物，其中參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段，參考產物包含複數個產物濃度之複數個核酸產物，並且恆溫核酸增幅反應使用外引子對、內引子對及環形引子對。以偵測大腸桿菌為例，外引子對之第一正向引子為如SEQ ID NO:1所示之序列，外引子對之第一反向引子為如SEQ ID NO:2所示之序列，內引子對之第一正向引子為如SEQ ID NO:3所示之序列，內引子對之第二反向引子為如SEQ ID NO:4所示之序列，環形引子對之第三正向引子為如SEQ ID NO:5所示之序列，環形引子對之第三反向引子為如SEQ ID NO:6所示之序列。接著，添加複數個不對稱粒子至參考產物，以形成第一混合物。然後，對第一混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第一閃爍訊號，其中影像擷取處理是使用光源照射第一混合物，此些不對稱粒子之平均粒徑為0.1μm至3.0μm，此些不對稱粒子之濃度為
至
，此些不對稱粒子之每一者的表面排除共價修飾，表面係由第一區域及第二區域所組成，第一區域係暴露出此些不對稱粒子之核心表面，第二區域係設有物理性沉積之金屬材料，且第一區域提供此些第一閃爍訊號。後續，使用互相關演算法處理此些第一閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，其中此些已知濃度及此些參考關聯時間係用以建立標準曲線。在檢測待測核酸樣本之操作中，對待測核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得待測產物。接著，添加此些不對稱粒子至待測產物，以形成第二混合物。然後，對第二混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第二閃爍訊號，其中影像擷取處理是使用光源照射第二混合物。後續，使用互相關演算法處理此些第二閃爍訊號，以獲得待測關聯時間，其中根據標準曲線，由待測關聯時間獲得待測核酸樣本之濃度測量值。
依據本發明之一實施例，此些已知濃度為1 fg/μL至10
3fg/μL。
應用本發明之核酸樣本的檢測方法，其中結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子，以於利用參考核酸樣本之已知濃度與不對稱粒子產生的第一閃爍訊號建立標準曲線後，取得待測核酸樣本之第二閃爍訊號並根據標準曲線轉換為濃度測量值，從而縮短檢測方法之檢測時間，並降低檢測方法之檢測極限。
以下仔細討論本發明實施例之製造和使用。然而，可以理解的是，實施例提供許多可應用的發明概念，其可實施於各式各樣的特定內容中。所討論之特定實施例僅供說明，並非用以限定本發明之範圍。
本發明之核酸樣本之檢測方法係結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子進行。由於恆溫核酸增幅法使用恆溫的反應溫度，所以不需要升溫及降溫之循環，從而縮短反應時間。再者，不對稱粒子的表面係由可產生閃爍訊號及不可產生閃爍訊號之二個區域所組成。不對稱粒子與恆溫核酸增幅反應所獲得之產物(包含參考產物及待測產物)混合後，不對稱粒子之旋轉的布朗運動受到產物的黏度影響，故產生不同的閃爍訊號，其可靈敏地反應出產物的黏度，且產物的黏度由產物中的核酸產物的濃度決定，核酸產物的濃度由核酸樣本(包含參考核酸樣本及待測核酸樣本)中之核酸片段的濃度所貢獻。由於旋轉的布朗運動屬於不對稱粒子固有的特性，且由其產生之閃爍訊號不受背景干擾，故可降低檢測方法之檢測極限。以下針對本發明之核酸樣本之檢測方法進行詳細說明。
請參閱圖1，其係繪示根據本發明之一實施例之核酸樣本之檢測方法的流程圖。如操作110所示，核酸樣本之檢測方法100係先建立標準曲線。在步驟111中，對參考核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得參考產物。參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段。
在一些實施例中，參考核酸樣本可為經前處理之生物檢體或人工培養的病原體。前處理可包含從病原體萃取出核酸片段。萃取方法可為具有通常知識者所慣用之方法。相應地，在一些實施例中，參考核酸樣本之核酸片段可為病原體之核酸片段，此病原體可包含病毒及細菌，例如：結核桿菌、大腸桿菌(Escherichia coli)、新型冠狀病毒或其他具有傳染性病原體。在一些具體例中，核酸片段可包含脱氧核醣核酸(DNA)片段。舉例而言，病原體可為大腸桿菌，且其目標基因可為uidA基因(uidA gene)。在一些實施例中，核酸片段的長度可為50至300鹼基對。
參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段。在一些實施例中，已知濃度可在1 fg/μL至10
6fg/μL之間，較佳地可在1 fg/μL至10
3fg/μL之間。當已知濃度在前述之範圍時，由其所建立之標準曲線可適用於低濃度之核酸樣本的檢測，故能降低檢測方法100的偵測極限。在一些具體例中，已知濃度的數目可為2以上，較佳可為3至6，以建立標準曲線。
恆溫核酸增幅反應可藉由後述之技術達成，此些技術可包含環型恆溫核酸增幅(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、核酸依賴性增幅(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、指數鏈置換增幅(Exponential strand displacement amplification，E-SDA)、指數滾環式增幅(Exponential rolling circle amplification，E-RCA)、依賴解旋酶增幅(Helicase-dependent amplification，HDA)、重組酶聚合酶增幅(Recombinase polymerase amplification，RPA)、指數增幅(Exponential amplification reaction，EXPAR)及全基因組增幅(Whole genome amplification，WGA)。
就恆溫核酸增幅反應而言，聚合酶可為具有通常知識者所慣用之者，如Bst 聚合酶(Bst polymerase)。
恆溫核酸增幅反應使用之引子對可為具有通常知識者所慣用之者。舉例而言，引子對可包含內引子對(Inner primers)、外引子對(Outer primers)及環形引子對(Loop primers)。
前述三組引子對之熔點(Tm)可在60℃至75℃之間，以使核酸樣本之檢測方法100可於前述溫度範圍下完成，故核酸樣本之檢測方法100不需要進行複雜的熱循環，從而縮短循環時間。此外，核酸樣本之檢測方法100不需要控制溫度之設備，故能夠適用於現場或居家檢測。
在一些實施例中，恆溫核酸增幅反應之總反應時間可為10分鐘至30分鐘，較佳地可為10分鐘至20分鐘，更佳可為10分鐘，其相較於傳統PCR的總反應時間(1至2小時)更短。
如具有通常知識者所理解，恆溫核酸增幅反應所獲得之核酸產物的長度依據前述三組引子對標定核酸片段的序列之條件決定。
除了核酸片段、聚合酶及引子對之外，恆溫核酸增幅反應中使用之其他試劑可為具有通常知識者所慣用者。
於步驟111之後，添加複數個不對稱粒子至參考產物，以形成第一混合物，如步驟113所示。本發明所稱之「不對稱粒子(Janus particle)」係指具有由第一區域及第二區域所組成之表面的粒子。第一區域係暴露出此些不對稱粒子之核心表面，且第二區域係設有物理性沉積之金屬材料。前述物理性沉積之具體例可包含使用蒸鍍、濺鍍或電鍍，但不以前述方法為限制。
在一些實施例中，於後述之影像擷取處理所使用之光源照射下，第一區域可發出螢光，且第二區域不可發出螢光，其中第一區域所發出之螢光可產生後述之第一閃爍訊號及第二閃爍訊號。在一些具體例中，此些不對稱粒子之核心係由高分子層及螢光核心所組成，且聚合物層包覆螢光核心。高分子層之材料及厚度沒有特別限制，惟以不阻止螢光核心發射螢光為目的，即不完全吸收入射的光源且不完全吸收發射的螢光，且較佳為不吸收入射的光源且不吸收發射的螢光。舉例而言，高分子層之材料可包含有機高分子、無機高分子及其組合，且較佳可選自於由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸-2-肉桂酸乙基酯(PCEMA)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)、聚矽氧烷及其組合所組成之一族群。
進一步，螢光核心之材料可包含螢光劑，此螢光劑使螢光核心發出螢光。舉例而言，螢光劑可包括但不限於異硫氰酸螢光素(FITC)、5-羧基螢光素(5-FAM)或羅丹明(rhodamine)。
在此些實施例中，金屬材料沒有特別限制，惟以達成前述之不發出螢光為目的。在一些實施例中，金屬材料係選自於由金、銀、鉑、鋁、鈷、鎳及氧化鐵所組成之一族群。當金屬材料為金時，金具有520nm至550nm之吸收峰，故可與綠色光源產生表面電漿共振，從而降低偵測極限。
在另一些實施例中，第一區域可吸收後述之影像擷取處理所使用之光源，且第二區域可反射此光源，其中第二區域所反射之光源可產生後述之第一閃爍訊號及第二閃爍訊號。在一些具體例中，此些不對稱粒子之核心係高分子核心。高分子核心之材料沒有特別限制，惟以吸收後述之影像擷取處理所使用之光源為目的。此高分子核心之材料可如前述之高分子層之材料。在此些實施例中，金屬材料沒有特別限制，惟以達成前述之反射光源為目的。舉例而言，金屬材料可如前述之金屬材料。
前述不對稱粒子之第一區域及第二區域之面積比值可為0.25至0.75，較佳可為0.8至1.2，且更佳可為1。當此面積比值為前述之範圍時，可使閃爍訊號靈敏地反應出產物的黏度，故降低偵測極限。
此些不對稱粒子之每一者的表面排除進行共價修飾，此共價修飾如將螢光劑、核酸及/或蛋白質共價修飾於不對稱粒子之表面。倘若不對稱粒子的表面共價修飾螢光劑，螢光劑容易受到環境(即後述之參考產物或待測產物)的pH影響，而使螢光劑產生的螢光衰退(decay)或淬熄(quench)，故增加背景干擾而提高偵測極限。換句話說，藉由表面共價修飾螢光劑之不對稱粒子之檢測方法需要額外進行校正步驟，以降低背景干擾。然而本發明之檢測方法100之螢光劑位於不對稱粒子內部，而不受環境的pH影響，故無需校正步驟，即能夠降低偵測極限。
其次，倘若不對稱粒子的表面共價修飾核酸，核酸會吸附或非專一性黏附恆溫核酸增幅反應產生之核酸產物，而影響不對稱粒子之旋轉擴散(即後述之布朗運動)，故提高偵測極限。再者，倘若不對稱粒子的表面共價修飾蛋白質，蛋白質會減慢不對稱粒子之旋轉擴散(即後述的布朗運動)，故提高偵測極限。
在一些實施例中，此些不對稱粒子之濃度可為1×10
9顆粒/mL至1×10
10顆粒/mL，較佳可為1×10
9顆粒/mL至3×10
9顆粒/mL。當不對稱粒子之濃度為前述之範圍時，適量濃度的不對稱粒子可均勻分散於參考產物或待測產物中，以利於後續閃爍訊號的取得，從而降低核酸樣本的檢測方法100的偵測極限。
在添加此些不對稱粒子至參考產物後，在參考產物中，此些不對稱粒子之布朗運動會受到參考產物之黏度的影響，且參考產物之黏度與參考產物中之核酸產物的濃度成正相關的關係，且核酸產物的濃度由核酸樣本中之核酸片段的濃度所決定。舉例而言，核酸樣本中之核酸片段的濃度愈高，核酸產物的濃度愈高，參考產物的黏度愈高，且反之則相反。
詳述之，不對稱粒子之布朗運動包含旋轉擴散(Rotational diffusion)及移動擴散(Translational diffusion)。由於相較於移動擴散，旋轉擴散對於參考產物之黏度較敏感，而可靈敏地反映出核酸樣本中之核酸片段的濃度，所以核酸樣本的檢測方法100係利用旋轉擴散進行檢測，從而降低偵測極限。
前述之旋轉擴散的具體表現為旋轉擴散度(Rotational diffusometry)，其係由斯托克斯-愛因斯坦-德拜關係(Stokes-Einstein-Debye relation)所定義，如下式(I)所示：
(I)
於式(I)中，D
r代表不對稱粒子進行布朗運動的旋轉擴散度，K
B代表波茲曼常數，T代表不對稱粒子所處之液體的絕度溫度，μ代表不對稱粒子所處之液體的黏度，dp代表不對稱粒子的粒徑。此處所稱之「不對稱粒子所處之液體」係指參考產物。附帶說明的是，當參考產物及不對稱粒子以溶液方式混合時，「液體」更包含參考產物及不對稱粒子之溶液中的其他組成(除了參考產物及不對稱粒子之外的組成)。
在一些實施例中，根據式(I)，旋轉擴散度(D
r)與液體(即參考產物)的黏度成反比。參考產物的黏度會隨著核酸產物的產物濃度增加而增加，所以不對稱粒子的旋轉擴散度與核酸產物濃度成反比。也就是，核酸產物濃度愈高，不對稱粒子旋轉愈慢。
在式(I)中，旋轉擴散度(D
r)與不對稱粒子的粒徑(dp)的三次方成反比。在一些實施例中，當不對稱粒子為球形時，前述直徑可為平均粒徑。不對稱粒子的粒徑為0.1μm至3.0μm。倘若不對稱粒子的粒徑小於0.1μm，過小的不對稱粒子傾向於堆疊在一起，反而導致聚集成大顆粒子，進而增長關聯時間，故提高偵測極限。反之，倘若不對稱粒子的粒徑大於3.0μm，布朗運動的旋轉擴散度與參考產物的黏度之關係較不敏感，所以提高偵測極限。
如上式(I)所示，旋轉擴散度可與液體(即參考產物)的絕度溫度成正比，故控制參考產物於恆溫下，可利於降低由溫度所造成之誤差。此外，控制參考產物於適當的溫度範圍內，可增加不對稱粒子的旋轉擴散度，進而提升核酸樣本之檢測方法100的靈敏度。在一具體例中，可控制參考產物於室溫之恆溫的環境，例如:22℃至28℃。
不對稱粒子因自我驅動(Shelf-driving)之布朗運動而旋轉，所以不對稱粒子不需要具備磁性，即可應用於檢測核酸樣本。然而，傳統的使用磁性粒子之核酸樣本之檢測方法必須額外使用磁場設備，以利於磁性粒子的操作，例如：進行清洗，以去除非專一性吸附於磁性粒子上的干擾物。據此，相較於傳統的使用磁性粒子之核酸樣本之檢測方法，本發明之核酸樣本的檢測方法100可排除使用磁性粒子，故較簡單且省時。
於步驟113之後，對第一混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第一閃爍訊號，如步驟115所示。前述之影像擷取處理係使用光源照射第一混合物。在可發出螢光的第一區域之實施例中，光源做為激發光源。於光源照射第一混合物中之不對稱粒子時，此不對稱粒子之第一區域發出螢光，且此螢光基於不對稱粒子的旋轉而呈現閃爍，故第一區域產生閃爍訊號。
另外，在可反射光源的第二區域之實施例中，光源做為入射光源。於光源入射至第一混合物中之不對稱粒子時，此不對稱粒子之第二區域反射光源而產生反射光，且此反射光基於不對稱粒子的旋轉而呈現閃爍，故第二區域產生閃爍訊號。
在一些實施例中，影像擷取處理可於顯微鏡下拍攝不對稱粒子之第一區域所發出之螢光的影像或第二區域產生之反射光的影像，以下以螢光的情況做說明。當不對稱粒子的第一區域正面朝向影像擷取元件(例如：照相機)時，第一區域所產生之螢光影像呈現較大面積。反之，當不對稱粒子的第一區域非正面朝向或者背離影像擷取元件時，第一區域所產生之螢光影像呈現較小面積或無螢光影像。相應地，如圖2所示，隨著時間的變化，不對稱粒子發生布朗運動之旋動擴散，此旋動擴散使得第一區域以不同之角度朝向影像擷取元件，從而對應地使螢光影像產生連續性如月亮形狀的改變。隨著時間歷程所擷取之影像，即為前述之閃爍訊號。如前述之說明，具有通常知識者能夠明確理解反射光的情況。
在一些實施例中，影像擷取處理之取像速率為5 Hz至100 Hz，較佳可為5 Hz至15 Hz，更佳可為10 Hz。當影像擷取處理之取像速率為前述之範圍時，可擷取到清晰的影像，以利於進行互相關演算法，故降低影像處理所需的時間。
請再參閱圖1，於步驟115之後，使用互相關演算法(Cross-correlation algorithm)處理此些閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，並建立標準曲線，如步驟117所示。詳述之，使用互相關演算法處理閃爍訊號，而非追蹤單一粒子的移動軌跡。舉例而言，使用市售MATLAB軟體進行處理，並進行相互關聯之分析，其中關聯強度(Correlation intensity)從比較在預定的時間區間內之一系列不對稱粒子的螢光影像而得。前述之關聯強度相等於關聯函數的峰值。由於旋轉擴散及平移擴散的效果，所以造成此些影像之間的關聯強度隨著時間而下降。相較於含有較低產物濃度的核酸產物之第一混合物，由於不對稱粒子在含有較高產物濃度的核酸產物之第一混合物中旋轉擴散較慢，使得含有較高產物濃度的核酸產物之第一混合物的關聯強度呈現緩慢遞減。從下式(II)之指數回歸方程式，關聯強度的曲線被歸一化：
(II)
於式(II)中，A及B代表以數據擬合指數曲線後所決定之常數，t代表經過時間(elapsed time)，φ代表指數回歸線的特徵關聯時間(correlation time)，關聯時間呈現不對稱粒子的初始位向的母群體(Oriented population)。從斯托克斯-愛因斯坦-德拜關係，關聯時間可使用下式(III)表示：
於式(III)中，V代表不對稱粒子的等效體積，μ代表不對稱粒子所處之液體的黏度，K
B代表波茲曼常數，T代表不對稱粒子所處之液體的絕度溫度。因此，在固定不對稱粒子的等效體積及液體的絕度溫度之情況下，不對稱粒子的指數回歸線的特徵關聯時間與液體的黏度成正比。如前所述，此處所稱之「不對稱粒子所處之液體」係指參考產物。
關聯時間的變化顯示出液體黏度(即參考產物黏度)的變化，而參考產物黏度的變化在固定不對稱粒子的條件下係由核酸產物之產物濃度決定。當核酸產物之產物濃度愈多，參考產物的黏度愈高，而核酸產物之產物濃度受到核酸樣本中之核酸片段的已知濃度之影響，故關聯時間與核酸樣本的已知濃度呈現關聯關係，其可使用後述之標準曲線來表示。
進一步，利用此些已知濃度及此些參考關聯時間建立標準曲線，以供後續定量待測核酸樣本中的核酸片段濃度。在一些實施例中，標準曲線如下式(IV)所示：
y=mx+a (IV)
於式(IV)中，y代表參考核酸樣本中之核酸片段的已知濃度，x代表參考核酸樣本的參考關聯時間，m代表斜率，a代表截距，其中已知濃度以10的次方表示，例如：當已知濃度為10
2fg/μL時，已知濃度以2表示。
在一些具體例中，可利用標準曲線計算出偵測極限，其係空白值加上三倍標準偏差，且空白值為未含有核酸片段之參考核酸樣本所測得之參考關聯時間。
請再參閱圖1，於操作110後，核酸樣本之檢測方法100進行檢測待測核酸樣本，如操作130所示。在一些實施例中，待測核酸樣本可包含但不限於生物檢體(例如：血液、尿液、淚液、淋巴液及唾液)、食品(例如：生食及熟食)及環境樣本(例如：空氣、水樣及土壤)等。
於操作130中，對待測核酸樣本進行恆溫核酸增幅反應，以獲得待測產物，如步驟131所示。此恆溫核酸增幅反應之條件與前述參考核酸樣本進行之恆溫核酸增幅反應相同，不同之處在於，以待測核酸樣本取代參考核酸樣本，且於恆溫核酸增幅反應後獲得之產物為待測產物，而非參考產物。
於步驟131後，添加此些不對稱粒子至待測產物，以形成第二混合物，如步驟133所示。此些不對稱粒子之條件與前述步驟113所使用之不對稱粒子相同，不同之處在於，以待測產物取代參考產物，且形成之混合物稱作第二混合物，而非第一混合物。
於步驟133後，對第二混合物進行影像擷取處理，以獲得複數個第二閃爍訊號，如步驟135所示。此影像擷取處理與前述步驟115使用之影像擷取處理相同，不同之處在於，以待測產物取代參考產物，以第二混合物取代第一混合物，以待測關聯時間取代參考關聯時間，以第二閃爍訊號取代第一閃爍訊號。
於步驟135之後，使用互相關演算法處理第二閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，並根據標準曲線獲得待測核酸樣本之濃度測量值，如步驟137所示。根據上式(IV)所示之標準曲線，將待測關聯時間代入x，計算出y，此即待測核酸樣本之濃度測量值。
核酸樣本之檢測方法100利用不對稱粒子的第二閃爍訊號，並將其轉換為待測關聯時間，以根據參考核酸樣本之已知濃度與參考關聯時間所建立之標準曲線，定量待測核酸樣本中核酸片段的濃度測量值。然而，傳統之PCR方法係利用膠電泳或者C
T數(即達到門檻螢光值所需之時間)來定量待測核酸樣本的濃度測量值。由於膠電泳需要額外的跑膠步驟，所以更費時。
再者，如前所述，核酸樣本的檢測方法100係使用恆溫核酸增幅法，故可於恆溫下進行增幅反應。藉此，核酸樣本的檢測方法100縮短增幅反應時間，所以相較於使用C
T數之傳統PCR方法更快速。在一些實施例中，核酸樣本之檢測方法100之檢測時間可為10分鐘至20分鐘，較佳可為15分鐘。據此，核酸樣本的檢測方法100可適用於現場或居家檢測。
以下利用實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例1
1.不對稱粒子之製備
實施例1之不對稱粒子的製備係使用波長為172nm的紫外光對玻璃片進行表面修飾，以使玻璃片呈現超親水性，然後將0.1wt.%之含有粒徑為1μm的聚苯乙烯(PS)粒子的乙醇溶液均勻鋪於玻璃片上，經乾燥45分鐘，以於玻璃片上獲得單層排列的PS粒子。以蒸鍍速率為1Å/s的電子束蒸鍍厚度為15nm的金層於前述單層排列的PS粒子之上表面(即靠近蒸鍍源的一側)，以形成上表面鍍上金殼且下表面未鍍上金殼(即露出原始之PS粒子表面)之不對稱粒子。然後，利用超音波從玻璃片上收集不對稱粒子，且將不對稱粒子移至1%(V/V)的聚山梨醇酯-20(Tween20)水溶液中，再以孔徑為5.0μm的過濾盤濾除聚集的粒子及蒸鍍時產生的金片段物，以獲得濾液，並使用離心機濃縮成濃度為2×10
9顆粒/mL的不對稱粒子儲存溶液。
2.參考核酸樣本之環型恆溫核酸增幅反應
先對大腸桿菌(E. coli，ATCC 25922)菌液進行萃取，以獲得含有大腸桿菌之基因體DNA(Genomic DNA)之萃取物，並以紫外-可見光(UV-Vis)光譜儀測量萃取物中之基因體DNA的濃度，其值為167.06 ng/μL。接著，分別取出不同體積的萃取物，以序列稀釋方式調配出具有複數個已知濃度之核酸片段之參考核酸樣本。
然後，對參考核酸樣本進行環型恆溫核酸增幅反應。混合1 μL的參考核酸樣本、12.5 μL的反應試劑(商品名為LavaLAMP DNA master mix，型號為30066-1，製造商為Lucigen)、0.1μL 0.2 μM的外引子對、0.8 μL之1.6 μM的內引子對及0.4 μL之1.6 μM的環形引子對，並加入水，以使總體積到達25μL，而獲得反應混合溶液。目標基因係大腸桿菌的uidA gene。於70℃下歷經10分鐘(即總反應時間)，對25μL的反應混合溶液進行LAMP反應，以獲得參考產物。
以偵測大腸桿菌為例，前述外引子對之正向引子為如SEQ ID NO:1所示之序列，外引子對之反向引子為如SEQ ID NO:2所示之序列，內引子對之正向引子為如SEQ ID NO:3所示之序列，內引子對之反向引子為如SEQ ID NO:4所示之序列，環形引子對之正向引子為如SEQ ID NO:5所示之序列，且環形引子對之反向引子為如SEQ ID NO:6所示之序列。此外，對應於外引子對、內引子對及環形引子對之擴增產物之長度介於100至300鹼基對之間。
3.影像擷取處理
利用超音波將不對稱粒子與參考產物混合均勻，取出2 μL的混合溶液(即第一混合溶液)至玻璃片上，再蓋上另一玻璃片(以下簡稱玻璃上蓋)，以使混合溶液的高度為110 μm。再將玻璃片、混合溶液及玻璃上蓋所組成之三明治結構體移置螢光顯微鏡下，照射波長為540 nm的激發光源，於25℃的恆溫環境下，在10倍之放大倍率下，以10Hz的取像速率，經由電荷耦合器件(CCD)相機擷取一系列連續的不對稱粒子之影像，以獲得第一閃爍訊號。
此閃爍訊號以MATLAB軟體進行處理，並進行相互關聯分析，其中數據分析及處理的總時間(以下簡稱數據處理時間)為5分鐘。每一個產物濃度收集三個參考核酸樣本的數據，對於每一個參考核酸樣本，進行300張影像的六次量測，並繪製成參考關聯時間對於參考核酸樣本的濃度之關係圖如圖3及圖4所示，其中「空白組」代表未含有核酸片段之樣本所進行之試驗。圖3標示的p值顯示此些參考核酸樣本的濃度所測得之參考關聯時間之間存在統計上的顯著差異，其中「*」代表p＜0.05，「**」代表p＜0.01，且「***」代表p＜0.001。於圖4中，標示之式(V)為標準曲線：y=0.5384x+0.8017 (V)，且R
2=0.9813。關於實施例1之參考核酸樣本的評價結果如下表1所示。
4.待測核酸樣本之檢測
待測核酸樣本之檢測係採用與前述之參考核酸樣本使用之不對稱粒子、LAMP及影像擷取處理相同的條件，不同之處在於，以待測核酸樣本取代參考核酸樣本，且對應地，以待測產物取代參考產物，以第二混合物取代第一混合物，以待測關聯時間取代參考關聯時間，以第二閃爍訊號取代第一閃爍訊號，其中待測核酸樣本為大腸桿菌的核酸萃取物(即僅含有大腸桿菌的uidA基因之水)，以及含有大腸桿菌之水、牛奶及果汁。關於實施例1之待測核酸樣本的評價結果如下表2所示。
附帶說明的是，實施例1之參考核酸樣本及待測核酸樣本可分別放置於一個多孔盤中之個別的孔槽(well)中，以同時進行環型恆溫核酸增幅反應，所以參考核酸樣本及待測核酸樣本所需要之孔槽數目不大於多孔盤的孔槽數目之情況下，前述之總反應時間不會增加，仍為10分鐘。此外，由於可在一個玻片上放置多個混合溶液(不對稱粒子與參考產物之混合物，或者不對稱粒子與待測產物之混合物)的液滴，以形成對應之多個三明治結構體，而可於一個顯微鏡下一併進行影像擷取，並同時數據處理，所以與總反應時間相同地，前述之數據處理時間不會增加，仍為5分鐘。
比較例1
1.參考核酸樣本之檢測
比較例1之參考核酸樣本的檢測係使用即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR，RT-PCR)，且參考核酸樣本與實施例1所使用之參考核酸樣本相同。混合1μL的參考核酸樣本、0.4μL 10μM的引子對及10μL的反應試劑(商品名為Fast-start universal SYBR green master，型號為4913914001，製造商為羅氏公司)，並加入水，以使總體積到達20μL，而獲得反應混合溶液，然後取出20μL的反應混合溶液進行PCR反應。前述引子對之正向引子為如SEQ ID NO:7所示之序列，且反向引子為如SEQ ID NO:8所示之序列。
即時聚合酶連鎖反應係先於95℃下持續10分鐘，進行初始變性，接著進行40個變性循環，在每一個循環中，於95℃下持續15秒，再於60℃下持續60秒進行黏合及延展(extension)，接續熱變性的流程，其中即時聚合酶連鎖反應的總反應時間為120分鐘。然後使用RT-PCR反應儀器(型號為Step one plus system，製造商為Applied Biosystems公司)的軟體進行數據處理及分析，其中數據分析及處理的總時間(以下簡稱數據處理時間)為20分鐘。參考核酸樣本之C
T對於參考核酸樣本的濃度之關係圖如圖5及圖6所示，且參考核酸樣本的評價結果如下表1所示。
2.待測核酸樣本之檢測
待測核酸樣本之檢測係採用與前述之參考核酸樣本使用之不對稱粒子及RT-PCR相同的條件，不同之處在於，以待測核酸樣本取代參考核酸樣本，且對應地，以待測產物取代參考產物，其中待測核酸樣本與實施例1所使用之待測核酸樣本相同。關於比較例1之待測核酸樣本的評價結果如下表2所示。
表1
| 實施例1 | 比較例1 | ||
| 條件 | 樣本 | 參考核酸樣本 | 參考核酸樣本 |
| 核酸增幅反應 | LAMP | RT-PCR | |
| 總反應時間(分鐘) | 10 | 120 | |
| 數據處理時間(分鐘) | 5 | 20 | |
| 檢測時間(分鐘) | 15 | 140 | |
| 結果 | 標準曲線 | y=0.5384x+0.8017 R 2=0.9813 | y=-3.901x+41.91 R 2=0.9838 |
| 偵測極限(fg/μL) | 42.8 | 100 | |
| 可偵測濃度範圍(log 10fg/μL) | 2~6 | 2~6 |
表2
備註：實施例1之待測核酸樣本的結果與比較例1之待測核酸樣本的結果之誤差皆在4%相對標準偏差(RSD)以內。
| 實施例1 | |||||
| 條件 | 樣本 | 核酸 萃取物 | 水 | 牛奶 | 果汁 |
| 核酸增幅 反應 | LAMP | ||||
| 總反應時間 (分鐘) | 10 | ||||
| 數據處理時間 (分鐘) | 5 | ||||
| 檢測時間 (分鐘) | 15 | ||||
| 結果 | 測得濃度 (fg/μL) | ||||
| 關聯時間(秒) | 2.96 | 2.46 | 2.67 | 2.76 |
請參閱表1，實施例1結合LAMP與不對稱粒子進行核酸樣本之檢測。相較於使用即時聚合酶連鎖反應之比較例1，實施例1之檢測方法可縮短檢測時間，並降低檢測極限。
請參閱表2，實施例1及比較例1之待測核酸樣本的結果之誤差皆在4%相對標準偏差(RSD)以內，代表實施例1之檢測方法與比較例1之RT-PCR檢測方法二者不具統計上顯著差異，證明實施例1之檢測方法具有相當的準確度。
綜上所述，應用本發明之核酸樣本之檢測方法，其中結合恆溫核酸增幅法與不對稱粒子進行檢測，並於利用參考核酸樣本之已知濃度與不對稱粒子產生的第一閃爍訊號建立標準曲線後，取得待測核酸樣本之第二閃爍訊號並根據標準曲線轉換為濃度測量值，從而縮短檢測方法之檢測時間，並降低檢測方法之檢測極限。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的分析模式或其他的評估方法亦可用於本發明，並不限於上述。舉例而言，可針對其他病原設計病原專一性的內引子對、外引子對及環形引子對，以應用本發明方法執行檢測。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100:方法
110,130:操作
111,113,115,117,131,133,135,137:步驟
為了對本發明之實施例及其優點有更完整之理解，現請參照以下之說明並配合相應之圖式。必須強調的是，各種特徵並非依比例描繪且僅係為了圖解目的。相關圖式內容說明如下：
圖1係繪示根據本發明之一實施例的核酸樣本之檢測方法之流程圖。
圖2係繪示根據本發明之實施例1的參考核酸樣本之螢光影像。
圖3及圖4係繪示根據本發明之實施例1的參考關聯時間對於參考核酸樣本的濃度之關係圖。
圖5及圖6係繪示根據本發明之比較例1的C
T對於參考核酸樣本的濃度之關係圖。
<110> 國立成功大學
<120> 核酸樣本之檢測方法
<140> TW 111103030
<141> 2022-01-25
<160> 8
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向外引子
<220>
<223> k為g或t/u
<400> 1
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向外引子
<220>
<223> w為a或t/u
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向內引子
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向內引子
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向環形引子
<400> 5
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向環形引子
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 8
100:方法
110,130:操作
111,113,115,117,131,133,135,137:步驟
Claims (9)
- 一種核酸樣本之檢測方法，包含：建立一標準曲線，包含：對一參考核酸樣本進行一恆溫核酸增幅反應，以獲得一參考產物，其中該參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段，該參考產物包含複數個產物濃度之複數個核酸產物；添加複數個不對稱粒子至該參考產物，以形成一第一混合物；對該第一混合物進行一影像擷取處理，以獲得複數個第一閃爍訊號，其中該影像擷取處理是使用一光源照射該第一混合物，該些不對稱粒子之一平均粒徑為0.1μm至3.0μm，該些不對稱粒子之一濃度為1×109至1×1010顆粒/mL，該光源之波長範圍為450nm至570nm，該些不對稱粒子之每一者的一表面排除一共價修飾，該共價修飾係將螢光劑、核酸及/或蛋白質共價修飾於該些不對稱粒子之每一者的該表面，該表面係由一第一區域及一第二區域所組成，該第一區域係暴露出該些不對稱粒子之一核心表面，該第二區域係設有利用物理性沉積之金屬材料，該物理性沉積包含蒸鍍、濺鍍或電鍍，該金屬材料係選自於由金、銀、鉑、鋁、鈷、鎳及氧化鐵所組成之一族群，且該第一區域或該第二區域提供該些第一閃爍訊號；以及使用一互相關演算法處理該些第一閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，其中該些已知濃度及該些參考關聯 時間係用以建立該標準曲線；以及檢測一待測核酸樣本，包含：對該待測核酸樣本進行該恆溫核酸增幅反應，以獲得一待測產物；添加該些不對稱粒子至該待測產物，以形成一第二混合物；對該第二混合物進行該影像擷取處理，以獲得複數個第二閃爍訊號，其中該影像擷取處理是使用該光源照射該第二混合物；以及使用該互相關演算法處理該些第二閃爍訊號，以獲得一待測關聯時間，其中根據該標準曲線，由該待測關聯時間獲得該待測核酸樣本之一濃度測量值。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該第一區域及該第二區域之一面積比值為0.25至0.75。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該些不對稱粒子之核心係由一聚合物層及一螢光核心所組成，且該聚合物層包覆該螢光核心，該聚合物層之材料選自於由聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸-2-肉桂酸乙基酯、聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、聚矽氧烷及其組合所組成之一族群。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該些不對稱粒子之該濃度為1×109至3×109顆粒/mL。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該恆溫核酸增幅反應之一反應溫度為60℃至75℃。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該些已知濃度為1fg/μL至106fg/μL。
- 如請求項1所述之核酸樣本之檢測方法，其中該影像擷取處理之一取像速率為5Hz至100Hz。
- 一種核酸樣本之檢測方法，包含：建立一標準曲線，包含：對一參考核酸樣本進行一恆溫核酸增幅反應，以獲得一參考產物，其中該參考核酸樣本包含複數個已知濃度之複數個核酸片段，該參考產物包含至少二個產物濃度之複數個核酸產物，並且該恆溫核酸增幅反應使用一外引子對、一內引子對及一環形引子對，該外引子對之一第一正向引子為如SEQ ID NO：1所示之序列，該外引子對之一第一反向引子為如SEQ ID NO：2所示之序列，該內引子對之一第一正向引子為如SEQ ID NO：3所示之序列，該內引子對之一第二反向引子為如SEQ ID NO：4所示之序列， 該環形引子對之一第三正向引子為如SEQ ID NO：5所示之序列，該環形引子對之一第三反向引子為如SEQ ID NO：6所示之序列；添加複數個不對稱粒子至該參考產物，以形成一第一混合物；對該第一混合物進行一影像擷取處理，以獲得複數個第一閃爍訊號，其中該影像擷取處理是使用一光源照射該第一混合物，該些不對稱粒子之一平均粒徑為0.1μm至3.0μm，該些不對稱粒子之一濃度為1×109至3×10-9顆粒/mL，該光源之波長範圍為450nm至570nm，該些不對稱粒子之每一者的一表面排除一共價修飾，該共價修飾係將螢光劑、核酸及/或蛋白質共價修飾於該些不對稱粒子之每一者的該表面，該表面係由一第一區域及一第二區域所組成，該第一區域係暴露出該些不對稱粒子之一核心表面，該第二區域係設有利用物理性沉積之金屬材料，該物理性沉積包含蒸鍍、濺鍍或電鍍，該金屬材料係選自於由金、銀、鉑、鋁、鈷、鎳及氧化鐵所組成之一族群，且該第一區域或該第二區域提供該些第一閃爍訊號；以及使用一互相關演算法處理該些第一閃爍訊號，以獲得複數個參考關聯時間，其中該些已知濃度及該些參考關聯時間係用以建立該標準曲線；以及檢測一待測核酸樣本，包含：對該待測核酸樣本進行該恆溫核酸增幅反應，以獲得一待測產物； 添加該些不對稱粒子至該待測產物，以形成一第二混合物；對該第二混合物進行該影像擷取處理，以獲得複數個第二閃爍訊號，其中該影像擷取處理是使用該光源照射該第二混合物；以及使用該互相關演算法處理該些第二閃爍訊號，以獲得一待測關聯時間，其中根據該標準曲線，由該待測關聯時間獲得該待測核酸樣本之一濃度測量值。
- 如請求項8所述之核酸樣本之檢測方法，其中該些已知濃度為1fg/μL至103fg/μL。
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|---|---|---|---|
| TW111103030A TWI825567B (zh) | 2022-01-25 | 2022-01-25 | 核酸樣本之檢測方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200200742A1 (en) * | 2017-04-21 | 2020-06-25 | Haplopharma Inc. | Method of detecting specimen substance using multiphase polymer fine particles |
-
2022
- 2022-01-25 TW TW111103030A patent/TWI825567B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200200742A1 (en) * | 2017-04-21 | 2020-06-25 | Haplopharma Inc. | Method of detecting specimen substance using multiphase polymer fine particles |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 期刊 Hyeong Jin Chun, et al., "Salmonella Typhimurium Sensing Strategy Based on the Loop-Mediated Isothermal Amplification Using Retroreflective Janus Particle as a Nonspectroscopic Signaling Probe", ACS Sensors, Vol. 3, No.11, 無, 17 October 2018, Pages 2261-2268; * |
| 期刊 Wei-Long Chen and Han-Sheng Chuang, "Trace Biomolecule Detection with Functionalized Janus Particles by Rotational Diffusion", Analytical Chemistry, Vol. 92, No. 19, 無, 15 September 2020, Pages 12996-13003; * |
| 期刊 Yi Yi, et al., "Janus particles for biological imaging and sensing", Analyst, Vol. 141, Issue 12, 無, 07 Apr 2016, Pages 3526–3539 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202330932A (zh) | 2023-08-01 |
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