CN113151584A - 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151584A CN113151584A CN202110032321.XA CN202110032321A CN113151584A CN 113151584 A CN113151584 A CN 113151584A CN 202110032321 A CN202110032321 A CN 202110032321A CN 113151584 A CN113151584 A CN 113151584A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cov
- sars
- cas12a
- detection
- region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 40
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 5
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 5
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 5
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 5
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 3
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004224 UV/Vis absorption spectrophotometry Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种新型的SARS‑CoV‑2基因组比色检测方法，包括以下步骤：采用RT‑RPA工艺可在等温条件下实现短时间内靶标的指数扩增；Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，可直接通过肉眼观察检测结果。本发明还公开一种SARS‑CoV‑2检测试剂盒，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBufferTM2.1和ssDNA修饰的AuNPs。本发明利用AuNPs表面等离子共振(SPR)性质实现不同靶序列的通用比色法信号输出；在本发明中，利用RT‑RPA和Cas12a的协同错配检查作用显着降低了假阳性事件的概率，在COVID‑19的高敏感诊断中具有巨大应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法。
背景技术
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)，是导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体。虽然疫苗的研制正在进行中，但诊断在感染预防和流行病控制中仍然起着至关重要的作用。基于SARS-CoV-2基因组特异性序列的识别，逆转录(RT)PCR技术发展迅速，已成为SARS-CoV-2检测的主要手段。在典型的RT-PCR测定过程中，病毒RNA被逆转录为互补DNA (cDNA)，然后通过温度循环实现指数放大。尽管RT-PCR已被广泛使用，但有若干限制仍需改进。比如，取样和操作程序导致的高假阴性率。此外，对训练有素的工作人员和昂贵的实验室仪器的依赖可能会妨碍在设备不健全区域的实际应用以及POC诊断。
重组酶聚合酶扩增(RPA)具有与PCR相似的灵敏度，RPA可在单一温度下操作，已被用于核酸检测。特别是，通过结合CRISPR技术，等温扩增方法已成功应用于SARS-CoV-2检测。据报道，Cas9、Cas12a、Cas13和Cas14在目标核酸的位点特异性结合后都表现出非特异性的反式切割活性，从而赋予了 CRISPR/Cas系统开发精确和便携式诊断工具的巨大潜力。因此，就操作成本和检测稳健性而言，DNA响应型Cas12a可能在SARS-CoV-2的POC技术开发中提供更多优势。然而，大多数基于CRISPR的策略都依赖于昂贵的双标记荧光报告基因和荧光检测设备。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种 SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法。
为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺在等温条件下实现短时间内靶标指数放大；(2)Cas12a结合诱导的非特异性切割能力将检查扩增产物的准确性并特异性的针对靶序列响应；(3)利用ssDNA 修饰的AuNPs作为通用的结果输出方式，可肉眼直接观察检测结果。Cas12a 可对与crRNA结合的双链DNA表现出位点特异性的切割活性(顺式切割)，随后不加区别地进行ssDNA水解(反式切割)。通过整合RT-RPA偶联的Cas12a 系统和AuNPs的光学特性，本发明的检测方法中，被ssDNA覆盖的AuNPs 充当Cas12a切割的通用底物。在没有SARS-CoV-2基因组的情况下，Cas12a 没有活性，AuNPs保持良好的分散状态。当通过RT-RPA扩增病毒基因组时，所得大量dsDNA将经历crRNA引导的结合以激活Cas12a。在反式裂解下，被修饰的ssDNA链逐渐被水解，AuNPs将发生聚集，导致SPR发生变化。整体检测在均质溶液中进行，无需任何分离或加热循环过程，从而大大提高了 POC检测COVID-19的可行性。
进一步的，所述检测方法可以特异性靶向由两对引物和相应的crRNA介导的SARS-CoV-2基因组的ORF1ab和N区。
进一步的，所述检测方法的靶标线性响应浓度为10pM至100nM。
本发明的实施例还提供了一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBufferTM2.1和ssDNA修饰的AuNPs。
进一步的，所述RPA扩增用试剂包括OFR1ab正向引物、OFR1ab反向引物、N region正向引物、N region反向引物、RNA逆转录酶与Rnase抑制剂及RPA 
Basic试剂盒。
上述的，OFR1ab正向引物的序列为：
5’-TACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATC-3’；
OFR1ab反向引物的序列为：
5’-CATTAGCACAAGTTGTAGGTATTTGTACATAC-3’；
N region正向引物的序列为：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；
N region反向引物的序列为：5’-AGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’。
进一步的，所述OFR1ab正向引物和N region正向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab正向引物和N region正向引物的浓度为10μM，所述OFR1ab 反向引物和N region反向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab反向引物和N region反向引物浓度为10μM。
进一步的，所述Cas12a的体积为4-6μL，所述crRNA的体积为8-10μL，所述1×NEBufferTM2.1的体积为100-150μL；所述Cas12a和crRNA的最终浓度分别为4μM和8μM。
本发明的实施例另外还提供一种SARS-CoV-2检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将病毒基因组通过RPA扩增用试剂进行RT-RPA 扩增；将Cas12a和crRNA分别添加到1×NEBufferTM2.1中，在37℃下孵育 10分钟后，扩增产物包含大量的dsDNA，将结合并激活Cas12a；在反式裂解作用下，修饰的ssDNA底物将从AuNPs上逐渐被水解，造成表面等离子共振 (SPR)变化，可通过紫外吸光光谱和裸眼观察进行监测。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明的检测试剂盒及检测方法利用ssDNA修饰的金纳米粒子 (AuNPs)作为通用比色信号输出方式，可以专门靶向SARS-CoV-2基因组的 ORF1ab和N区域；病毒基因组通过RT-RPA扩增后，由此产生的大量dsDNA 将结合并激活Cas12a。在反式裂解作用下，ssDNA作为底物将被裂解并从 AuNPs上脱离，AuNPs产生表面等离子共振(SPR)的变化，可以通过紫外吸光光谱和裸眼观察进行监测。
(2)本发明的检测试剂盒及检测方法，利用RT-RPA的高效率扩增和 Cas12a反式切割作用，使检测灵敏度高达1个拷贝的病毒基因组序列。在等温扩增和Cas12a激活过程的双重变异检测下，可以有效避免其他β冠状病毒成员的假阳性事件，从而显著提高特异性。本发明能够对ORF1ab和N基因区域的有效响应均可低至1个拷贝，这种高灵敏度确保了我们的方法在 COVID-19POC诊断中的巨大应用潜力。
(3)本发明的实施例中，通过医院检验科的标准临床样品，验证了该比色法的可靠性，通过肉眼观察溶液的颜色变化，可以清楚地观察到阳性结果，极大的简便了检测过程。通过将RPA/Cas12a系统固有的高灵敏度和特异性与基于AuNPs的比色法的简单性相结合，我们所建立的方法具有SARS-CoV-2 检测的实用性。
(4)本发明由于Cas12a介导的催化作用，具有很高的灵敏度，通过配合 RT-RPA的预扩增过程，其在COVID-19诊断中具有巨大的潜力。
(5)本发明的实施例中通过对严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS-CoV)序列以及临床标准SARS-CoV-2基因组样本进行了测试，验证了该方法的可靠性，RPA和Cas12a的协同作用降低了假阳性事件的可能性，并增加了本发明的特异性。
附图说明
图1为本发明的检测方法的流程示意图，整个过程包括三个步骤：选定 SARS-CoV-2基因组区域的RT-RPA、Cas12a激活和比色检测。
图2为本发明的SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV基因组在ORF1ab 和N蛋白基因目标区域序列比对。
图3为本发明中用PAGE分析Cas12a被靶标链激活后的反式切割能力的结果图。
图4为本发明中不同反应条件下AuNPs探针的UV-Vis吸收光谱图。
图5为本发明中不同反应条件下AuNPs探针的颜色变化图和TEM图。
图6为本发明中不同反应条件下ORF1ab基因靶标在520nm处的吸收相对变化率图。
图7为本发明中不同反应条件下N基因靶标在520nm处的吸收相对变化率图。
图8为本发明中ssDNA经过MCH处理或ssDNA长度对比色测定的影响图。
图9为本发明中Cas12a/crRNA对读出信号的浓度依赖性关系图。
图10为本发明中反应时间的优化，时间与紫外吸光度之间的关系图。以 20分钟的间隔记录UV-vis吸收光谱。
图11为本发明中反应时间的优化后，时间与紫外吸收相对变化率之间的关系图，以20分钟的间隔记录UV-vis吸收光谱。
图12为本发明中紫外吸收相对变化率和变色图像与目标链浓度的相关性图。
图13为本发明中检测程序插图以及不同病毒产生的颜色示意图。
图14为本发明中针对ORF1ab中的SARS-CoV和MERS-CoV序列的特异性图。
图15为本发明中不同基质中不同浓度靶序列在520nm处的紫外相对吸收变化率图。
图16为本发明中灵敏度测试图，通过Cas12a介导的比色法分析经RPA 扩增后的ORF1ab基因区中不同数量的SARS-CoV-2序列。
图17为本发明中灵敏度测试图，通过Cas12a介导的比色法分析经RPA 扩增后的N基因区中不同数量的SARS-CoV-2序列。
图18为本发明中RT-RPA偶联Cas12a比色测定法用于检测临床 SARS-CoV-2基因组样品的示意图。
图19为本发明中医院检验科提供的阴性和阳性临床标准样品在520nm 处的紫外相对吸收变化率图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，如图1所示，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺将在等温条件下在短时间内实现靶标指数放大； (2)Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；(3)利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，肉眼观察检测结果。
实施例1
本发明所采用的AuNPs的直径为
通过硫-金键将硫醇化的ssDNA 修饰到AuNPs表面，根据现有技术文献合成了AuNPs。简要地说，将100mg HAuCl4·3H2O溶于300mL水中煮沸，然后添加30mL含有264mg柠檬酸钠的水溶液。溶液在沸腾的同时搅拌10分钟。冷却至室温后，获得直径约为15 nm的AuNPS。然后根据UV-vis吸收将AuNPs浓度调节至5nM。ssDNA以 400：1的摩尔比连接到AuNPs表面。将20μL ssDNA底物(100μM)和2μL TCEP(30mM)添加到78μL DEPC水中，使最终体积为100μL。温育20分钟后，将上述溶液与1mL AuNPs(5nM)混合。添加10μL吐温20(20％) 以避免AuNPs聚集。将上述混合物在室温下轻轻搅拌12小时，在此期间，以每40分钟为间隔添加8次NaCl溶液(前两次为0.05M，其余为0.1M)。随后，将反应溶液缓慢搅拌24小时，然后以16000g离心15分钟以去除未结合的核酸。制备的AuNPs探针经PBS洗涤两次后获得，并在使用前于4℃保存。
对于MCH处理，将上面准备的AuNPs探针与MCH(10μM)混合。温育30分钟后，将混合物溶液以16000g离心30分钟。用PBS洗涤3次后，获得经MCH处理的AuNPs探针。
RPA流程以扩增靶序列。为了进行cDNA扩增，根据操作说明将2.4μL OFR1ab正向引物、OFR1ab反向引物、N region正向引物、N region反向引物(具体如表1中Forward primer(OFR1ab)，Reverse primer(OFR1ab)，Forward primer(N region)，Reverse primer(Nregion)所示)，各引物均为10μM，添加到RPA 
Basic试剂盒中。然后与13.2μL目标溶液混合。最后，加入2.5μL MgOAc(280mM)以启动扩增。在37℃下孵育20分钟后，即获得 RPA产品，产物存储在4℃。
用于本发明的所有序列定量至100μM，具体如下表1所示：
表1本发明所涉及到的所有序列
ORF1ab target/ORF1ab target-com或N region target/N region target-com激活双链以终浓度为1μM在100μL的1×TAMg缓冲液中混合均匀，将离心管放入PCR仪中从95℃维持5分钟然后至降温至4℃，从而得到激活双链。
实施例2
验证Cas12a的反式切割能力。以5×TBE 1.2mL、30％Arc.Bis.1.6mL、三蒸水3.2mL、过硫酸铵60μL、TEMED 6μL为配方制备8％PAGE凝胶，室温放置30分钟使其凝固。
按照顺序，泳道1-5分别是:Substrate；Substrate+Cas12a； Substrate+Cas12a+crRNA；Substrate+Cas12a+Target；Substrate+Cas12a+
crRNA+Target。Cas12a、crRNA、Target和Substrate终浓度分别为20nM、 40nM、40nM和1μM。孵育15分钟后每8μL样品溶液中加入2μL上样缓冲液，混匀后加入10uL到上样孔内，在1xTBE缓冲液中以80V电压运行80 分钟，然后凝胶在1％的gel-red水溶液中染色10分钟，最后在成像仪里显影。从图3中看出，只有在crRNA和target同时存在时，Cas12a才有反式切割活性，切割溶液中随机单链，表现为泳道5中substrate条带变浅。
实施例3
为了进行比色测定，将4μL Cas12a和8uL crRNA添加到100μL 1× NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加RPA或RT-RPA的目标序列，然后添加80μL制备好的AuNPs。在设定时间点，进行UV-vis吸收光谱检测。预孵育的Cas12a/crRNA复合物的添加对吸收曲线没有任何影响。而加入RPA靶标和Cas12a/crRNA则导致吸收率明显降低以及SPR峰出现红移，如图4所示。在设定时间点观察以上不同反应条件下的颜色变化。在图5中，孔5中的反应颜色从红色变为紫色，颜色的变化可以归因于AuNPs的聚集。
实施例4
为了进行比色测定，将4μL Cas12a和8μL crRNA添加到100μL 1× NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加8μL RPA或RT-RPA的目标序列，然后添加80μL制备好的AuNPs。孵育1小时后，进行UV-vis吸收光谱检测。图6和图7分析了520nm处的相对吸收变化率(ΔA/A0)，这表明由靶标序列引起的SPR变化可用于进行ORF1ab区或N区靶序列检测分析。只有ORF1ab区或N区靶序列和Cas12a/crRNA复合体的存在才能显着提高ΔA/A0。
实施例5
研究MCH处理和底物长度对比色测定的影响，将4μL Cas12a和8μL crRNA添加到100μL 1×NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，然后分别加入80μL 20-70nt ssDNA修饰的AuNPs 探针或MCH处理的AuNPs探针,各加入8μL Target(ORF1ab片段，1μM)，总反应体积为100μL，混合均匀后反应1小时后获得UV-vis吸收光谱。从图 8中可以看出ssDNA长度对CAS12a性能没有显着影响，但在MCH处理后具有较高的相对变化率。
实施例6
研究Cas12a/crRNA对读出信号的浓度依赖性作用。将Cas12a和crRNA 化学计量比为1:1，两者以终浓度为5nM、10nM、20nM、40nM、60nM分别加到1×NEBufferTM2.1中，在37℃下孵育10分钟后加入目标序列(终浓度 40nM)，然后添加80μL制备好的AuNPs，总反应体系为100μL，混合反应 1小时后获得UV-vis吸收光谱，如图9所示，可以说明相对吸收变化率的增加直到Cas12a/crRNA浓度为20nM，并且在较高浓度下性能达到平稳。
实施例7
反应时间优化。将4μL Cas12a和8μL crRNA添加到100μL 1× NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加RPA或RT-RPA的目标序列，然后添加80μL制备好的AuNPs。每间隔 20分钟测520nm处紫外吸收，测4小时。随着时间延长紫外吸收逐渐降低，如图10所示；ΔA/A0分析表明，反应动力学在60分钟后变慢，如图11所示。
实施例8
将4μL Cas12a和8μL crRNA添加到100μL 1×NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加不同浓度(0、0.001、 0.01、0.1、1、10、100和1000nM)ORF1ab区域的目标序列，如图12所示，随着目标浓度的增加，在520nm处的UV-Vis吸收相应降低，这与反应溶液的颜色变化一致。在10pM至100nM的范围内获得了良好的线性。
实施例9
检测不同病毒产生的颜色。将4μL Cas12a和8μL crRNA分别添加到100 μL 1×NEBufferTM2.1、血清和唾液中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加不同(SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2)的靶标。孵育1小时后测紫外吸收，图14中SARS-CoV和MERS-CoV的ΔA/A0显着低于SARS-CoV-2，只有SARS-CoV-2能使溶液变紫(图13)。
实施例10
验证检测平台的稳定性。将4μL Cas12a和8μL crRNA分别添加到100μL 1×NEBufferTM2.1、血清和唾液中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加不同浓度(1nM、10nM、50nM)的靶标。孵育1小时后测紫外吸收。反应缓冲液对加标生物样品的信号读数没有显着影响，特别是对于浓度高于10nM的样品(图15)，这表明我们的方法对于复杂的生物样品具有巨大的分析潜力。
实施例11
将4μL Cas12a和8μL crRNA分别添加到100μL 1×NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加不同cDNA 拷贝数的靶标(0、1、5、10、和20)。本发明能够检测到ORF1ab和N基因区域的基因组序列低至1个拷贝(图16、17)。
实施例12
临床标准样品分析。RT-RPA用于扩增临床标准样品中的靶序列。将2.4 μLOFR1ab正向引物(10μM)、N region正向引物(10μM)，2.4μL OFR1ab 反向引物(10μM)、N region反向引物(10μM)(具体如表1中Forward primer (OFR1ab)，Reverse primer(OFR1ab)，Forward primer(N region)，Reverse primer (N region)所示)，1μL RNA逆转录酶与10μLRnase抑制剂一起添加到RPA 
Basic试剂盒中。添加临床样品后，将混合溶液在37℃下孵育20 分钟。在用于比色测定之前，将获得的dsDNA产物存储在4℃(图18)。
将4μL Cas12a和8μL crRNA分别添加到100μL 1×NEBufferTM2.1中，最终浓度分别为4μM和8μM。在37℃下孵育10分钟后，添加上述经过RPA 扩增得到的样品，孵育1小时后测紫外吸收，比色结果显示出与ORF1ab和N 基因区域的固有样本属性完全一致，过肉眼观察溶液的颜色变化，可以清楚地观察到阳性结果(图19)。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法
<141> 2021-01-11
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 底物-20(Substrate-20)
<400> 1
cagctcagca cttttttttt sh 22
<210> 2
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 底物-30(Substrate-30)
<400> 2
gtgctgaggt gtagcattag tgtctttttt sh 32
<210> 3
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 底物-50(Substrate-50)
<400> 3
gtgctgaggt gtagcattag tgtctttttt tttttttttt tttttttttt sh 52
<210> 4
<211> 72
<212> DNA/RNA
<213> 底物-70(Substrate-70)
<400> 4
gtgctgaggt gtagcattag tgtctttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt sh 72
<210> 5
<211> 146
<212> DNA/RNA
<213> ORF1ab 靶区(ORF1ab target)
<400> 5
tacaccggaa gccaatatgg atcaagaatc ctttggtggt gcatcgtgtt gtctgtactg 60
ccgttgccac atagatcatc caaatcctaa aggattttgt gacttaaaag gtaagtatgt 120
acaaatacct acaacttgtg ctaatg 146
<210> 6
<211> 146
<212> DNA/RNA
<213> ORF1ab靶区互补序列(ORF1ab target-com)
<400> 6
cattagcaca agttgtaggt atttgtacat acttaccttt taagtcacaa aatcctttag 60
gatttggatg atctatgtgg caacggcagt acagacaaca cgatgcacca ccaaaggatt 120
cttgatccat attggcttcc ggtgta 146
<210> 7
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> OFR1ab 正向引物(Forward primer (OFR1ab))
<400> 7
tacaccggaa gccaatatgg atcaagaatc 30
<210> 8
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> OFR1ab 反向引物(Reverse primer (OFR1ab))
<400> 8
cattagcaca agttgtaggt atttgtacat ac 32
<210> 9
<211> 41
<212> RNA
<213> OFR1ab基因编辑衍生RNA(crRNA (OFR1ab))
<400> 9
uaauuucuac uaaguguaga uguggugcau cguguugucu g 41
<210> 10
<211> 98
<212> DNA/RNA
<213> N靶区(N region target)
<400> 10
ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc 60
tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtct 98
<210> 11
<211> 98
<212> DNA/RNA
<213> N靶区互补序列(N region target-com)
<400> 11
agacattttg ctctcaagct ggttcaatct gtcaagcagc agcaaagcaa gagcagcatc 60
accgccattg ccagccattc tagcaggaga agttcccc 98
<210> 12
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> N靶区正向引物(Forward primer (N region))
<400> 12
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> N靶区反向引物(Reverse primer (N region))
<400> 13
agacattttg ctctcaagct g 21
<210> 14
<211> 42
<212> RNA
<213> N靶区基因编辑衍生RNA(crRNA (N region))
<400> 14
uaauuucuac uaaguguaga ucugcugcuu gacagauuga ac 42
<210> 15
<211> 115
<212> DNA/RNA
<213> 中东呼吸综合征 OFR1ab靶区(MERS (OFR1ab) )
<400> 15
taaaccagag agtacagctg atcaagagac ttatggtgga gcttcagtgt gtctctattg 60
ccgtgcgcat atagaacatc ctgatgtctc tggtgtttgt aaatataagg gtaag 115
<210> 16
<211> 115
<212> DNA/RNA
<213> 严重急性呼吸综合征 OFR1ab靶区(SARS (OFR1ab))
<400> 16
aacaccagaa gctaacatgg accaagagtc ctttggtggt gcttcatgtt gtctgtattg 60
tagatgccac attgaccatc caaatcctaa aggattctgt gacttgaaag gtaag 115
Claims (9)
1.一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用RT-RPA工艺实现等温条件下短时间内靶标的指数扩增；(2)Cas12a结合诱导的切割性质将检查扩增拷贝的准确性和针对靶序列的反应特异性；(3)利用ssDNA修饰的AuNPs作为通用的结果输出，可直接通过肉眼观察检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，所述检测方法可以特异性靶向两对引物所对应的SARS-CoV-2基因组的ORF1ab和N区。
3.根据权利要求1所述的一种新型的SARS-CoV-2基因组比色检测方法，其特征在于，所述检测方法的线性响应靶标浓度为10pM至100nM。
4.一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，包括RPA扩增用试剂、Cas12a、crRNA、缓冲液1×NEBufferTM2.1和ssDNA修饰的AuNPs。
5.根据权利要求4所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增用试剂包括OFR1ab正向引物、OFR1ab反向引物、N region正向引物、N region反向引物、RNA逆转录酶与Rnase抑制剂及RPA 
Basic试剂盒。
6.根据权利要求5所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，OFR1ab正向引物的序列为：
5’-TACACCGGAAGCCAATATGGATCAAGAATC-3’；
OFR1ab反向引物的序列为：
5’-CATTAGCACAAGTTGTAGGTATTTGTACATAC-3’；
N region正向引物的序列为：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；
N region反向引物的序列为：5’-AGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’。
7.根据权利要求4所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，所述OFR1ab正向引物和N region正向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab正向引物和N region正向引物的浓度为10μM，所述OFR1ab反向引物和N region反向引物的体积为2.4μL，所述OFR1ab反向引物和N region反向引物浓度为10μM。
8.根据权利要求4所述的一种SARS-CoV-2检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a的体积为4-6μL，所述crRNA的体积为8-10μL，所述1×NEBufferTM2.1的体积为100μL；所述Cas12a和crRNA的最终浓度分别为4μM和8μM。
9.一种权利要求4所述的SARS-CoV-2检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将病毒基因组通过RPA扩增用试剂进行RT-RPA扩增；将Cas12a和crRNA分别添加到1×NEBufferTM2.1中，在37℃下孵育10分钟后，添加经过RPA扩增得到的样品，所述样品中大量的dsDNA将结合并激活Cas12a；在Cas12a的反式切割作用下，AuNPs上修饰的ssDNA将作为酶切底物逐渐被水解，所产生的AuNPs表面等离子共振(SPR)的变化可通过紫外吸光光谱和裸眼观察进行监测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110032321.XA CN113151584A (zh) | 2021-01-11 | 2021-01-11 | 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110032321.XA CN113151584A (zh) | 2021-01-11 | 2021-01-11 | 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151584A true CN113151584A (zh) | 2021-07-23 |
Family
ID=76878303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110032321.XA Pending CN113151584A (zh) | 2021-01-11 | 2021-01-11 | 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151584A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113699148A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-26 | 四川大学 | 一种超灵敏抗体检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096646A1 (en) * | 2011-01-10 | 2012-07-19 | The American University In Cairo | Direct detection of unamplified hepatitis c virus rna using unmodified gold nanoparticles |
| CN109355356A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-02-19 | 大连大学 | 一种dna生物传感器及其应用于测定dna的方法 |
| CN110702760A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 南华大学 | 一种检测铀酰离子的纳米金-dna网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
| CN111197112A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-05-26 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 |
| US20200224261A1 (en) * | 2018-12-06 | 2020-07-16 | Paul Mann | Assay for the Rapid Detection of Nucleic Acids via a Modified LAMP Reaction Coupled with Colorimetric Reporter Utilizing a Gold Nanoparticle Peptide Nucleic Acid AuNP-PNA Probe System |
| CN111593145A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-08-28 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒 |
| CN111781180A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-16 | 南通大学 | 一种用于检测外泌体的dna分子机器 |
-
2021
- 2021-01-11 CN CN202110032321.XA patent/CN113151584A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012096646A1 (en) * | 2011-01-10 | 2012-07-19 | The American University In Cairo | Direct detection of unamplified hepatitis c virus rna using unmodified gold nanoparticles |
| CN109355356A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-02-19 | 大连大学 | 一种dna生物传感器及其应用于测定dna的方法 |
| US20200224261A1 (en) * | 2018-12-06 | 2020-07-16 | Paul Mann | Assay for the Rapid Detection of Nucleic Acids via a Modified LAMP Reaction Coupled with Colorimetric Reporter Utilizing a Gold Nanoparticle Peptide Nucleic Acid AuNP-PNA Probe System |
| CN110702760A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-17 | 南华大学 | 一种检测铀酰离子的纳米金-dna网状结构电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
| CN111197112A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-05-26 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 |
| CN111593145A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-08-28 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 一种CRISPR/Cas12一步核酸检测方法及新型冠状病毒检测试剂盒 |
| CN111781180A (zh) * | 2020-07-09 | 2020-10-16 | 南通大学 | 一种用于检测外泌体的dna分子机器 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113699148A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-26 | 四川大学 | 一种超灵敏抗体检测方法 |
| CN113699148B (zh) * | 2021-07-15 | 2024-01-09 | 四川大学 | 一种超灵敏抗体检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111560472B (zh) | 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用 | |
| Gao et al. | Rapid and sensitive triple-mode detection of causative SARS-CoV-2 virus specific genes through interaction between genes and nanoparticles | |
| EP2167691A1 (en) | Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample | |
| Yin et al. | Ligation Chain Reaction based gold nanoparticle assembly for ultrasensitive DNA detection | |
| CN111621597A (zh) | 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法 | |
| US20230193369A1 (en) | Composition, reaction liquid and method for improving qpcr test performance, and use thereof | |
| Wang et al. | Tetra-primer ARMS-PCR combined with dual-color fluorescent lateral flow assay for the discrimination of SARS-CoV-2 and its mutations with a handheld wireless reader | |
| CN114480583B (zh) | 比色生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法 | |
| Ma et al. | CRISPR/Cas12a system responsive DNA hydrogel for label-free detection of non-glucose targets with a portable personal glucose meter | |
| Lu et al. | Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP) | |
| Choi et al. | Point-of-care COVID-19 testing: colorimetric diagnosis using rapid and ultra-sensitive ramified rolling circle amplification | |
| CN113151584A (zh) | 一种SARS-CoV-2检测试剂盒及检测方法 | |
| Kim et al. | Gold nanostructures modified carbon-based electrode enhanced with methylene blue for point-of-care COVID-19 tests using isothermal amplification | |
| Wu et al. | CRISPR/Cas12a coupling with RPA and MNPs for rapid and visualized identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
| Das et al. | Rotational diffusometric sensor with isothermal amplification for ultra-sensitive and rapid detection of SARS-CoV-2 nsp2 cDNA | |
| Kim et al. | A review of nucleic acid-based detection methods for foodborne viruses: Sample pretreatment and detection techniques | |
| JP2020533974A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルス種のニッキング及び伸長増幅反応（ｎｅａｒ） | |
| CN111471800B (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| Danielli et al. | Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at picomolar concentrations by magnetic modulation | |
| Jamaluddin et al. | G-quadruplex microspheres-based optical RNA biosensor for arthropod-borne virus pathogen detection: a proof-of-concept with dengue serotype 2 | |
| Li et al. | Graphene oxide nanosheet-mediated fluorescent RPA “turn-on” biosensor for rapid RNAi transgenic plant detection | |
| Peng et al. | Engineering of an adaptive tandem CRISPR/Cas12a molecular amplifier permits robust analysis of Vibrio parahaemolyticus | |
| WO1996024044A1 (fr) | Procede pour tester la substance d'un echantillon en ajustant la dose de chimioluminescence | |
| CN115948614A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a系统的核酸检测试剂盒和检测方法 | |
| JP2012501174A (ja) | インピーダンス分光法を用いたｄｎａの測定 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |