CN115404279A - 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用 - Google Patents

基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115404279A
CN115404279A CN202210149832.4A CN202210149832A CN115404279A CN 115404279 A CN115404279 A CN 115404279A CN 202210149832 A CN202210149832 A CN 202210149832A CN 115404279 A CN115404279 A CN 115404279A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
crispr
sers
analysis device
pad
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210149832.4A
Other languages
English (en)
Inventor
马龙
庄建文
满淑丽
叶盛英
刘国珍
殷利眷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202210149832.4A priority Critical patent/CN115404279A/zh
Publication of CN115404279A publication Critical patent/CN115404279A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及其应用，所述方法该只需提取出样品中病原菌的基因组，进行RPA等温扩增后即可通过CRISPR/Cas系统在μPAD上与夹心金纳米星探针结合反应，实现对微生物致病菌沙门氏菌的检测，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。

Description

基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原 菌的方法及应用
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及其应用。
背景技术
致病菌是目前国际上公认的食品微生物污染的主要原因。据世界卫生组织统计，2010 年有5.5亿例腹泻病例，其中63.7％可归因于细菌感染。细菌性腹泻死亡占81.4％。某些致病菌如沙门氏菌，即使含量很低或很少，也会引起食源性疾病。欧盟委员会(EC)长期以来一直强制执行食品微生物标准，规定对肉末、奶粉和奶酪等食品的沙门氏菌检测应该是“阴性”的。这就要求沙门氏菌的检测灵敏度应降低到单细胞水平。我们也知道，在某些情况下，细菌的致病性与浓度密切相关。这可以从EC条例中得到印证，该条例规定，对于某些即食食品，单核增生李斯特菌应小于100CFU/g，这意味着定量检测的重要性。因此，无论从预防、日常监测、大规模筛查还是食品安全事故应急处理的任何角度，开发快速、高灵敏度、现场、高成本效益的生物传感方法来判断是否污染是势在必行的。
传统的标准方法依赖于微生物培养和生化检测，费时费力。近年来，建立了一系列新的方法，包括PCR和qPCR等分子扩增技术、基于抗原-抗体的免疫分析、基因芯片、质谱和各种生物传感器。但是，它们通常存在时间长、仪器昂贵、人员训练有素、灵敏度低、周转时间长等缺点，无法进行现场检测。
微流控纸分析装置(μPAD)除了被广泛应用于基于纸侧流分析的试纸条外，还因其提供了一个样品的检测平台而在PON检测中引起了广泛的关注。它们是小型化的，一次性的，并且可以在包括食品安全在内的一系列分析场景中定制，成为一种很有前途的工具，特别是在资源有限和护理点测试(POCT)中。虽然μPAD制造简单、经济、对终端用户友好，然而，它们存在两个主要的局限性：检测灵敏度低和定量检测能力有限。
CRISPR/Cas系统不仅被应用于基因编辑，还被用于分子诊断。一个显著的例子是CRISPR/Cas12a，作为二类ⅤCRISPR系统的成员，在CRISPR RNA(crRNA)的指导下，专门识别和切割目标DNA。当目标DNA被识别时，Cas12a的反式裂解活性被触发，导致 ssDNA的任意破碎。利用这种反分裂特性作为生物催化信号发生器和放大器， CRISPR/Cas12a被制成了一种新型的生物传感平台，如DETECTR。近年来，已经建立了一些基于CRISPR/Cas12a的方法，可以用不同的信号读数(比色法、荧光法、电化学法、 SERS等)检测核酸、单核苷酸多态性、病毒、细菌、酶、小分子、离子等。通常，在基于 CRISPR/Cas12a的检测中也会应用RPA等信号放大技术，以进一步提高灵敏度。
表面增强拉曼光谱(SERS)是一种基于分子增强拉曼散射的强有力的分析方法，分子吸附在表面或近SERS活性表面，如贵金属纳米结构。它已被广泛应用于敏感和选择性的化学和生物分子。基于SERS的CRISPR/Cas检测方法具有较高的灵敏度和选择性，在PON 检测中很有吸引力，已被用于从临床样本或其他病毒中识别SARS-CoV-2。最近，基于 CRISPR/Cas12a的横向流动检测实现了双链DNA的单碱基突变，并具有SERS信号读数。但这些方法从未在μPAD上应用过。
发明内容
针对上述的不足，本发明的目的是提供一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，该方法为检测食物中病原微生物提供了一种新思路。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，所述方法包括有以下步骤：
1)提取病原菌基因组并进行RPA等温扩增，得到待测基因组；
2)将夹心金纳米星探针加到μPAD分析装置的加载区域中进行干燥；
3)将步骤1)中的待测基因组加入到CRISPR/Cas系统中进行反应，得到CRISPR/Cas反应体系；
4)将步骤3)中的CRISPR/Cas反应体系加到步骤2)中干燥有夹心金纳米星探针的μPAD分析装置中进行反应，并在μPAD分析装置的检测区域内形成检测点；
5)采用手持拉曼仪对步骤4)中μPAD分析装置的检测区域进行拉曼检测。
进一步地，所述夹心金纳米星探针的制备方法包括有以下步骤：
前期准备：将制备过程中所用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO3：HCl＝3:1)中浸泡30min以上，然后用超纯水冲洗；
制备纳米星种子：利用种子培养法，将HAuCl4溶液加热直至沸腾后迅速向沸腾溶液中加入二水柠檬酸三钠溶液，不断搅拌溶液从浅黄色逐渐变成酒红色，得到纳米星种子溶液；
制备夹心金纳米星：在离心管中加入超纯水、HAuCl4、HCl，然后加入制备好的纳米星种子溶液，搅拌均匀后，迅速加入硝酸银溶液和抗坏血酸溶液，振荡30s后，溶液迅速由淡红色转化成黑绿色，然后加入十二烷基硫酸钠溶液，搅拌混匀，离心，弃掉上清，用超纯水重悬，得到金纳米星溶液AuNSs，加入4-MBA，于37℃孵育2h，加入CTAC、 HAuCl4、AA，搅拌混匀，离心，弃掉上清，用超纯水重悬后，得到夹心金纳米星溶液 AuNS@4-MBA@Au；
将一端修饰巯基SH-的两条单链DNA干粉，即DNA1和DNA2，加入ddH2O，配制成含DNA1和DNA2溶液；
取含DNA1和DNA2溶液加入到AuNS@4-MBA@Au溶液中，振荡混匀后在-20℃条件下冷冻结合，解冻后离心，弃掉上清，用缓冲液HEPES重复离心洗脱3次，然后重悬，得到结合好的夹心金纳米星探针即AuNS@4-MBA@Au@DNA探针。
进一步地，所述两条SH-DNA的序列分别如下所示：
DNA1：SH-AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3’；
DNA2：5’-TCACAGATGCGTAAAAAAAAA-SH。
进一步地，所述μPAD分析装置的构建方法具体步骤如下：
先用蜡打印机在纤维素滤纸上将蜡打印出来，制作为墙壁和蜡阀，然后在120摄氏度的温度下用热板加热90秒，让熔化的蜡渗透到纤维素滤纸上，蜡堵微孔形成疏水屏障，蜡阀将μPAD分割为加载区域和检测区域，将1×2.2cm的胶条粘贴在装置背面作为后垫，以保留溶液，即构建得到μPAD分析装置。
进一步地，所述CRISPR/Cas系统选自CRISPR-Cas12a系统。
进一步地，所述病原菌为鼠伤沙门氏菌。
进一步地，所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法在制备微生物检测试剂中的应用。
采用以上方案，本发明具有如下优点：
1、本发明为CRISPR/Cas系统结合μPAD(即RPA-Cas12a-μPAD)进行检测鼠伤沙门氏菌的方法，应用此方法仅包括将样品进行前处理再结合夹心金纳米星探针进行SERS 检测两部分，即可检测沙门氏菌基因组target DNA的浓度。更重要的是，该方法只需提取出样品中沙门氏菌的基因组，进行RPA等温扩增后即可在μPAD上实现对微生物致病菌沙门氏菌的检测，极大拓宽了CRISPR-Cas12a与SERS在分子检测领域的应用。
2、本发明经过一系列实验建立起来CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的方法，即，在EP管中检测的沙门氏菌基因组无扩增以及PCR扩增后的标准曲线的相关系数R2的值分别为0.97、0.98，线性良好，同时利用RPA-Cas12a-μPAD方法检测的标准曲线的相关系数R2的值为0.97。由此本发明中的标准曲线检测出的微生物拷贝数较准确。
3、本发明建立的起来的RPA-Cas12a-μPAD检测方法检测限低，无扩增的样品最低检测限度为10-100CFU/mL，并且能够检测上至108CFU/mL，检测范围较宽，并且灵敏度高。
4、本方法建立起来的RPA-Cas12a-μPAD检测方法特异性强，以检测沙门氏菌为例，对于大肠杆菌、酵母菌、根瘤芽孢杆菌等微生物没有明显的拉曼信号增强，证明本发明对于沙门氏菌具有良好的选择性，而不受其他微生物的影响。
5、本发明设计的夹心金纳米星探针(AuNS@4-MBA@Au@DNA探针)，可以准确的检测沙门氏菌，仅需要简单设计引物序列，即可用于检测其他病原微生物，该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。
6、经过与其他传统方法的比较，本发明设计具有方法简单、灵敏性高等优点，同时与其他检测方法(平板培养、qPCR)相比，本发明设计极大地缩减了检测成本，因此便于对样品进行大规模快速检测。
7、本发明中RPA-Cas12a-μPAD系统检测沙门氏菌方法的原理为：Cas12a-crRNA复合物仅当存在能与crRNA互补结合的特异性target DNA时，才会激发Cas12a的附属切割活性，即可以切割无关的的单链DNA(ssDNA)。若将ssDNA与连接夹心金纳米星探针的 SH-DNA互补结合，测定拉曼强度，就可以将切割效应转化拉曼信号输出。当Cas12a-crRNA 检测到相应的target DNA时，便可以切割linker-ssDNA，使其与夹心金纳米星探针结合的 SH-DNA1/2无法互补配对，游离在上清中的夹心金纳米星探针便具有很强的拉曼信号；
简单来说，拉曼信号的强弱与target DNA的浓度，即沙门氏菌未扩增的基因组具有线性关系，从而可以将沙门氏菌基因组的浓度即沙门氏菌基因组拷贝数(CFU/mL)转化成相应的拉曼信号。
8、在μPAD分析装置的作用下，不同聚集状态的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针的分离可以通过自然的毛细管驱动的流体流经纤维滤纸来完成，而不需要外力或额外的离心拉下AuNS@4-MBA@Au@DNA探针，节约成本、加快了检测速率。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
图1为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的可行性拉曼光谱图；
图2为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的可行性拉曼强度柱形图；
图3为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的紫外表征图；
图4为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的的DLS图；
图5为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的linker ssDNA优化图
图6为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的pH优化图；
图7为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的Cas12a酶量优化图；
图8为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的切割时间优化图；
图9为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的Buffer优化图；
图10为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌PCR扩增后的LogCFU/mL与拉曼强度的线性拟合标准曲线；
图11为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌PCR扩增后的LOD柱形图；
图12为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌无扩增的LogCFU/mL与拉曼强度的线性拟合标准曲线；
图13为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌无扩增的LOD柱形图；
图14为本发明CRISPR-Cas12a系统特异性检测不同致病菌和细胞的拉曼强度柱形图；
图15为本发明CRISPR-Cas12a系统特异性检测不同致病菌和细胞的拉曼光谱图；
图16为本发明Cas12结合突变后的crRNA并搭配特异性识别的target测定的拉曼强度热图；
图17为本发明μPAD的构建及Cas12a-μPAD的操作步骤图；
图18为本发明μPAD分析装置检测区域的SERS检测点示意图；
图19为本发明μPAD结合Cas12a进行的可行性实验拉曼图；
图20为本发明μPAD结合Cas12a进行的可行性实验柱形图；
图21为本发明AuNS@4-MBA@Au@DNA1与DNA2探针附着在μPAD表面的TEM 表征图；
图22为本发明RPA-Cas12a-μPAD检测牛奶样品的μPAD实物图和LogCFU/mL与拉曼强度的线性拟合标准曲线；
图23为本发明RPA-Cas12a-μPAD检测鸡肉样品的μPAD实物图和LogCFU/mL与拉曼强度的线性拟合标准曲线；
图24为本发明RPA-Cas12a-μPAD检测牛奶样品的LOD柱形图；
图25为本发明RPA-Cas12a-μPAD检测鸡肉样品的LOD柱形图；
图26为本发明与RPA-Cas12a-μPAD方法进行比较的两种qPCR结果图；
图27为本发明SYBR Green法与TapMan法的标准曲线图；
图28为本发明TapMan法测定的沙门基因组的阳性与阴性的倍数对照图；
图29为本发明SYBR Green法的阳性与阴性的倍数对照图；
图30为本发明测定的果汁中沙门氏菌基因组的阴性和阳性拉曼强度倍数对照图；
图31为本发明CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的方法与qPCR的两种方法对比形成的ROC曲线图；
图32为本发明为样品的阴性和阳性分别测定10次后，拉曼信号的重复性图；
图33为本发明为10个不同的阴性与阳性样品分别测定拉曼信号后，样品的拉曼信号重现图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述，但实施例并不对本发明作任何形式的限定，除非特别说明，本发明所涉及的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：沙门氏菌基因组的提取
1.1细菌培养和菌落形成单位(CFU)试验
沙门氏菌在Luria-Bertani肉汤培养基中生长，液体培养在37℃下用振动器在烧瓶中进行，对于菌落形成单位(CFU)试验，制备了细菌的系列稀释剂，取稀释后的样品100μL，涂于Hektoen肠溶(HE)琼脂平板，37℃保持24h，记录每个平板上的菌落数量。
2.1沙门氏菌基因组的提取
取300μl菌液至1.5ml离心管，12000r/min离心2min，弃上清，于沉淀中加入提取液(25％Chelex-100，0.5％NP40，TE配制，pH＝9.0)，56℃孵育30min，100℃水浴10min，12000r/min离心2min，取上清，即提取得到沙门氏菌的DNA。
实施例2：crRNA的设计与纯化
按照TwistAmp Basic Kit手册进行RPA等温扩增：
将合成后得到的定制的沙门氏菌DNA模板干粉使用离心机12000rpm离心10min，然后使用DEPC水将其溶解并稀释至5μM，然后将配置好的溶液于PCR仪中聚合DNA 双链，其退火体系见表1，退火程序见表2。取适量聚合后的双链DNA退火产物用于后续实验，剩余部分放置于-20℃冰箱冷藏保存。
表1退火体系
Figure BDA0003510314820000071
Figure BDA0003510314820000081
将上述物质依次加入到EP管中，涡旋震荡混匀，进行瞬时离心。
表2退火程序
Figure BDA0003510314820000082
退火完成后，使用HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒进行转录步骤。具体CrRNA转录体系见表3，
表3转录体系
Figure BDA0003510314820000083
将上述物质依次加入到EP管中，涡旋震荡混匀，进行瞬时离心，于PCR仪中37℃孵育转录16h。
取出PCR仪中37℃孵育过夜的转录样品，向上一步的反应体系中加入2μL DNase I(2000U/mL)，并用移液器混合均匀，瞬时离心使溶液全部汇集于管底，置于热循环仪上 37℃孵育反应30min，以彻底消除体系中的DNA模板，随后按照Monarch RNA纯化试剂盒说明书步骤进行RNA纯化。纯化后的RNA使用Eppendorf
Figure BDA0003510314820000091
basic 超微量核酸定量仪测定RNA浓度，最终于储存-80℃冰箱中。
实施例3：夹心金纳米星探针的制备
1、夹心金纳米星的制备：
前期准备：将制备过程中所用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO3：HCl＝3:1)中浸泡 30min以上，然后用超纯水冲洗；
制备纳米星种子：利用种子培养法，向250mL的三角瓶中加入100mL(1mM)HAuCl4溶液，加热直至沸腾。然后迅速向溶液中加入3mL(1％质量分数)的二水柠檬酸三钠溶液，不断搅拌，溶液从浅黄色逐渐变成酒红色，继续加入至15min，冷却至室温，得到纳米星种子溶液，并在4℃冷藏保存备用；
制备夹心金纳米星：在50mL离心管中加入20mL超纯水，而后加入HAuCl4，使其浓度为0.25mM，加入20μL浓度为1M的HCl，然后加入200μL制备好的纳米星种子溶液。搅拌均匀后，迅速加入200μL的硝酸银溶液(2mM)和100μL的抗坏血酸溶液(0.1 M)，振荡30s后，溶液迅速由淡红色转化成黑绿色。而后加入200μL的十二烷基硫酸钠溶液(2％)搅拌5min。1300g离心15min后，弃掉上清，用20mL超纯水重悬，得到金纳米星溶液(AuNSs)放在4℃冰箱避光备用；
取40μL 1mM的4-MBA加到4mL AuNSs溶液中，于37℃孵育2h，之后加入2mL CTAC(0.2M)，60μL的HAuCl4(10mM)，以及120μL的AA(0.2M)，搅拌20min。之后1000g离心20min，弃掉上清，用超纯水重悬后，得到夹心金纳米星溶液 (AuNS@4-MBA@Au)，4℃冰箱避光保存。
2、夹心金纳米星与巯基DNA合成制备夹心金纳米星探针：
将订制的一端修饰巯基(SH-)两条单链DNA，即DNA1和DNA2干粉，加入ddH2O 配制成100μM的DNA1和DNA2溶液。两条巯基DNA的序列如下所示：
DNA1：SH-AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3’
DNA2：5’-TCACAGATGCGTAAAAAAAAA-SH
分别取5uL的巯基DNA1和DNA2(100uM)加入到200uL夹心金纳米星溶液中，振荡混匀后在-20℃条件下冷冻结合2h。解冻后在4℃条件下12000rpm离心30min，弃掉上清，用缓冲液Buffer A(5mM HEPES，pH 7.6)重复离心洗脱3次，然后用缓冲液Buffer B (10mMHEPES、300mM NaCl，pH 7.6)重悬，得到结合好的夹心金纳米星探针 (AuNS@4-MBA@Au@DNA探针)，放在4℃备用。
实施例4：μPAD分析装置的构建
先用蜡打印机在Whatman 4级滤纸(即纤维素滤纸)上将蜡打印出来，用来制作墙壁和阀门，然后在120摄氏度的温度下用热板加热90秒，让熔化的蜡渗透到纸上。蜡堵微孔形成疏水屏障。此外，30％透明度的蜡阀与通道壁同时印在滤纸上。蜡阀是一个疏水区域，在μPAD上用作分离加载区域和检测区域。液体溶液被蜡阀保留在加载区域内。加入 0.4μL异丙醇后，蜡溶解，溶液流动。另外，将1×2.2cm的胶条粘贴在装置背面作为后垫，以保留溶液；
μPAD的构建和逐步操作如图17所示，图18展示了使用μPAD进行检测且箭头所示的位置为SERS的测试点。
实施例5：CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的可行性实验
1、实验方法：
准备5个不同的样品，分别为Positive、No Cas12a、No crRNA、No target以及Onlyreporter各组成100μL体系；Positive：200nM Cas12a、250nM crRNA以及1nM与crRNA 互补的target DNA、15nM linker DNA和HEPES buffer(5mM HEPES，150mM NaCl，10 mM MgCl2，pH 7.6)，No Cas12a指Positive样品中除去了Cas12a酶，同理可知No crRNA 和No target。Only reporter则只有15nM linker DNA；分别在37℃反应10min，然后放在 65℃灭活8min。从每个样品中分别取50μL加入到含有AuNS@4-MBA@Au@DNA1和 DNA2各25μL的EP管中，放在37℃孵育10min，然后5000rpm/min离心3min，分别测定5个样品中上清的拉曼信号。
2、实验结果
如图1和图2所示，当且仅当Cas12a、crRNA以及与crRNA互补的target DNA同时存在时才会产生强烈的拉曼信号，验证了Cas12a具有核酸特异性识别引发的附属切割能力，证明了本发明方法的可行性，具有特异性识别能力。
实施例6：CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的表征实验
1、实验方法
紫外表征：取AuNSs、AuNSs@4-MBA、AuNSs@4-MBA@Au溶液各100μL加入到不透明96孔板中，利用酶标仪扫描紫外全光谱，扫描范围400-800nm，扫描间隔2nm。
DLS表征：取AuNPs、AuNSs@4-MBA、AuNSs@4-MBA@Au和After linking(linkerssDNA与AuNSs@4-MBA@Au@DNA1和DNA2互补配对后)的样品各1mL，利用DLS 分别测定样品的水和粒径。
2、实验结果
如图3所示，4-MBA与AuNSs结合后，AuNSs表面的等离子体共振发生了轻微的红移，然后在被金纳米壳层包覆后发生蓝移，蓝移至586nm；
如图4所示，AuNPs、AuNSs、AuNS@4-MBA@Au和交联AuNS@4-MBA@Au@DNA 的平均水化粒径分别为18.4±0.94、58.1±4.37、295.8±13.8和3000.5±247.4nm。
实施例7：CRISPR-Cas12a系统结合SERS检测沙门氏菌的优化实验
1、实验方法
优化ssDNA的浓度：将两种巯基DNA的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针加入50μL 含有不同浓度ssDNA的溶液中，且ssDNA的浓度分别为0、1、2、5、10、15、20、30nM。反应在37℃下保持10min，在5000rpm离心1min后，分别收集上清液并进行拉曼光谱分析；
Cas12a反式切割持续时间优化：含有200nM Cas12a、250nM crRNA、15nM ssDNA 和1nM目标双链DNA(dsDNA)在HEPES缓冲液(5mM HEPES,150mM NaCl,10mM MgCl2,pH 7.6)37℃下持续不同的时间，持续时间分别为0、3、5、10、20、30、40min，然后65℃灭活8分钟。将50μL反应物与25μL两种AuNS@4-MBA@Au@DNA探针混合并在37℃下孵育5min后5000rpm离心1min，收集上清液，使用便携式拉曼光谱仪进行分析，配备785nm激光束；
Cas12a浓度、pH值、缓冲系统优化：Tris缓冲盐水(TBS)：50mM Tris-HCl，0.2MNaCl，pH＝7.5；磷酸盐缓冲盐水(PBS)：100mM NaH2PO4、100mM Na2HPO4，pH＝7.0； Tris缓冲液：50mM Tris-HCl,100mM NaCl，1mM DTT，pH＝7.0；HEPES缓冲液：10mM HEPES、300mMNaCl，进行上述反应，收集上清液并进行拉曼光谱分析。
2、实验结果
如图5-图9所示，
对于linker ssDNA浓度的优化，从图5可以看出，随着linker ssDNA浓度的逐渐提高，溶液中的SERS探针逐渐被下拉聚集，上清中的拉曼强度逐渐降低，当浓度为15nM时，拉曼强度达到平台期，趋于稳定。因此，linker ssDNA的浓度选择15nM；
对于Cas12a切割时间的优化，0-10min时，拉曼信号呈逐渐增强趋势，10min以后，拉曼信号趋于稳定，因此Cas12a切割时间定为10min；
对于pH的优化，由于在pH：5-9的范围内，pH的变化对拉曼信号的强弱影响不大，并且Cas12a反应的Buffer pH为7.6，因此选择pH为8，作为体系优化后的pH值；对于 Cas12a浓度的优化，当Cas12a浓度小于200nM时，拉曼信号逐渐增强，而在大于200nM 后，拉曼信号的强度趋于稳定，因此选择200nM作为Cas12a的酶浓度；对于Cas12a反应Buffer的优化，可以很明显的看到，在不同浓度的反应Buffer中，拉曼信号的强弱，其中HEPES Buffer的信号为最高，因此将HEPES Buffer作为Cas12a的反应Buffer。
实施例8：CRISPR-Cas12a系统结合SERS用于沙门氏菌检测的标准曲线、灵敏度、特异性和选择性
1、实验方法
1.1标准曲线：
在SERS-Cas12a系统中，200nM LbCas12a、250nM crRNA、15nM linker DNA和不同浓度(100—108)的沙门氏菌基因组target DNA在HEPES缓冲液(5mM,pH 7.6,NaCl 150 mM,10mM MgCl2)中37℃反应10min，然后65℃失活2分钟。取50μL反应后的溶液分别加入到两种25μL的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针中37℃反应5分钟。将混合物5000 rpm/min离心3分钟。收集上层清液进行拉曼光谱分析。
建立了SERS信号与沙门氏菌浓度的相关性，并进行了相应的线性拟合。由于提取的沙门氏菌基因组分为扩增的以及未扩增的，因此标准曲线分别如图10、图12所示。
1.2灵敏度：
建立拉曼信号与沙门氏菌浓度的标准曲线后，根据LOD分别计算扩增与未扩增两种方法的灵敏度。如图11、图13所示。
1.3特异性：
SERS-Cas12a系统的特异性：从8种与沙门氏菌浓度相同的不同干扰生物中提取基因组DNA，其中8种不同干扰生物分别为根瘤农杆菌、酵母菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、Hela细胞、HT29细胞、MGC803细胞，利用沙门氏菌特异性引物进行 PCR扩增，然后进行SERS-Cas12a检测。特异性如图14、15所示；
SERS-Cas12a在crRNA设计方面的特异性：合成了3个与正确的crRNA相比只有一个或两个突变核苷酸的crRNA，分别对应四个不同的target dsDNA。如图16所示：
1.4选择性：
从8种与沙门氏菌浓度相同的不同干扰生物中提取基因组DNA，利用沙门氏菌特异性引物进行PCR扩增，然后进行SERS-Cas12a检测。
2、实验结果
标准曲线：如图10-图12所示，对于扩增与未扩增两种方法的标准曲线，其线性相关系数R2分别为0.98和0.97，说明拉曼信号的强度对沙门氏菌的浓度成线性依赖关系；
灵敏度：根据图11、13中的LOD所示，扩增后LOD可以达到1CFU/mL，等同于0.1 aMDNA；而未扩增的LOD可以达到101CFU/mL，等同于1aM DNA；
特异性：如图14-图16所示，检测八种与沙门氏菌浓度相同的不同干扰生物中提取的基因组DNA，通过测定拉曼信号，可以发现，只有检测沙门氏菌时，才会激活Cas12a的反式切割活性，使得拉曼信号增强，由此说明SERS-Cas12a系统对沙门氏菌的选择性特异识别能力。另外，SERS-Cas12a还能够分析单核苷酸多态性(SNP)，因为它严格地通过 Cas12a-crRNA识别target DNA激活反式切割活性。因此，crRNA严格识别其同源target dsDNA，产生了强烈的的拉曼信号。相比之下，其他碱基错配的crRNA与非同源target dsDNA并未激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性，因此拉曼信号很低。结果表明， SERS-Cas12a在鉴别单核苷酸改变中具有较高的特异性；
选择性：如图15-图16所示，只有沙门氏菌存在时，拉曼信号强度出现明显增高，证明在不同干扰生物的存在下，该方法对沙门氏菌具有很好的选择性。
实施例9：RPA-Cas12a-μPAD系统检测沙门氏菌的可行性实验
1、实验方法
将25μL的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针预混，滴入μPAD加载区。10min后，每个μPAD在37℃下干燥5min，然后将linker ssDNA加入到100μL Cas12a反式切割体系中 (50μL RPA扩增后的浓度为100-108的target DNA，触发Cas12a在10min内反式切割，然后在65℃下失活5min)。用0.4μL异丙醇溶解蜡阀后，反应混合物沿桥液渗透1min。在 SERS测试点对各μPAD的检测区域进行拉曼光谱分析。在激光功率为150mW、积分时间为10s的条件下，利用波长为785nm的近红外激光发射光记录了拉曼光谱；
在沙门氏菌阴性的日常食品样品如牛奶和肉类中添加不同浓度的沙门氏菌培养物，提取沙门氏菌的基因组使用RPA-Cas12a-μPAD系统进行检测。
2、实验结果
如图19、20所示，RPA-Cas12a-μPAD系统只会对阳性样品产生较强的SERS信号；
如图21所示，利用扫描电镜(SEM)技术，可以证明测试点被SERS纳米粒子浸渍。这表明，未交联的AuNS@4-MBA@Au@DNA探针可以比交联的纳米探针扩散得更远，最终到达被困在测试点；
如图22-23所示，所设计的μPAD的SERS信号随着沙门氏菌浓度的增加而增加，可以得到线性关系，说明所设计的μPAD对沙门氏菌的特异性反应性；
如图24-25所示，牛奶和肉类样品的LOD值均为1CFU/mL；
如图26所示A为TapMan方法，B为SYBR Green方法，首先，基于SYBR Green和TaqMan进行了两种qPCR，两种方法的标准曲线见图27，然后，如图28-30所示，设计双盲实验，利用RPA-Cas12a-μPAD和qPCR方法对污染样品和灭菌样品进行区分，相应采用受试者工作特征(ROC)曲线。如图31所示，AF-Cas12-iT的ROC曲线下面积(AUC)为1.0， SYBR GreenqPCR的AUC为0.884，TaqMan qPCR的AUC为0.981；
如图32和33所示，RPA-Cas12a-μPAD系统的重复性和重现性，获得相对标准偏差(RSD)值，所有计算的重复性和重现性的RSD值均小于6％，表明可接受的重复性和重现性。可重复性和可重复性是RPA-Cas12a-μPAD系统发展的关键问题。一般建议RSD值小于10％是验证所研制RPA-Cas12a-μPAD系统可靠性的先决条件。
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述方法包括有以下步骤：
1)提取病原菌基因组并进行RPA等温扩增，得到待测基因组；
2)将夹心金纳米星探针加到μPAD分析装置的加载区域中进行干燥；
3)将步骤1)中的待测基因组加入到CRISPR/Cas系统中进行反应，得到CRISPR/Cas反应体系；
4)将步骤3)中的CRISPR/Cas反应体系加到步骤2)中干燥有夹心金纳米星探针的μPAD分析装置中进行反应，并在μPAD分析装置的检测区域内形成检测点；
5)采用手持拉曼仪对步骤4)中μPAD分析装置的检测区域进行拉曼检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述夹心金纳米星探针的制备方法包括有以下步骤：
前期准备：将制备过程中所用到的玻璃器皿都需要在王水(HNO3：HCl＝3:1)中浸泡30min以上，然后用超纯水冲洗；
制备纳米星种子：利用种子培养法，将HAuCl4溶液加热直至沸腾后迅速向沸腾溶液中加入二水柠檬酸三钠溶液，不断搅拌溶液从浅黄色逐渐变成酒红色，得到纳米星种子溶液；
制备夹心金纳米星：在离心管中加入超纯水、HAuCl4、HCl，然后加入制备好的纳米星种子溶液，搅拌均匀后，迅速加入硝酸银溶液和抗坏血酸溶液，振荡30s后，溶液迅速由淡红色转化成黑绿色，然后加入十二烷基硫酸钠溶液，搅拌混匀，离心，弃掉上清，用超纯水重悬，得到金纳米星溶液AuNSs，加入4-MBA，于37℃孵育2h，加入CTAC、HAuCl4、AA，搅拌混匀，离心，弃掉上清，用超纯水重悬后，得到夹心金纳米星溶液AuNS@4-MBA@Au；
将一端修饰巯基SH-的两条单链DNA干粉，即DNA1和DNA2，加入ddH2O，配制成含DNA1和DNA2溶液；
取含DNA1和DNA2溶液加入到AuNS@4-MBA@Au溶液中，振荡混匀后在-20℃条件下冷冻结合，解冻后离心，弃掉上清，用缓冲液HEPES重复离心洗脱3次，然后重悬，得到结合好的夹心金纳米星探针即AuNS@4-MBA@Au@DNA探针。
3.根据权利要求2所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述两条SH-DNA的序列分别如下所示：
DNA1：SH-AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT-3’；
DNA2：5’-TCACAGATGCGTAAAAAAAAA-SH。
4.根据权利要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述μPAD分析装置的构建方法具体步骤如下：
先用蜡打印机在纤维素滤纸上将蜡打印出来，制作为墙壁和蜡阀，然后在120摄氏度的温度下用热板加热90秒，让熔化的蜡渗透到纤维素滤纸上，蜡堵微孔形成疏水屏障，蜡阀将μPAD分割为加载区域和检测区域，将1×2.2cm的胶条粘贴在装置背面作为后垫，以保留溶液，即构建得到μPAD分析装置。
5.根据权利要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas系统选自CRISPR-Cas12a系统。
6.根据权利要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法，其特征在于，所述病原菌为鼠伤沙门氏菌。
7.根据权利要求1所述的一种基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法在制备微生物检测试剂中的应用。
CN202210149832.4A 2022-02-18 2022-02-18 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用 Pending CN115404279A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210149832.4A CN115404279A (zh) 2022-02-18 2022-02-18 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210149832.4A CN115404279A (zh) 2022-02-18 2022-02-18 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115404279A true CN115404279A (zh) 2022-11-29

Family

ID=84156997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210149832.4A Pending CN115404279A (zh) 2022-02-18 2022-02-18 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115404279A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116794013A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 一种银杏酮酯总混样品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105107557A (zh) * 2015-07-01 2015-12-02 太原理工大学 高通量三维微流控纸芯片的制备方法及应用
CN110412014A (zh) * 2019-08-28 2019-11-05 济南大学 表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用
CN110632302A (zh) * 2019-10-30 2019-12-31 中国农业科学院农产品加工研究所 一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法
KR20210087303A (ko) * 2020-01-02 2021-07-12 서강대학교산학협력단 CRISPR/Cas12a를 이용한 표면증강 라만산란 기반 표적 DNA 검출용 센서
CN113801920A (zh) * 2021-08-20 2021-12-17 广州艾迪基因科技有限责任公司 一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105107557A (zh) * 2015-07-01 2015-12-02 太原理工大学 高通量三维微流控纸芯片的制备方法及应用
CN110412014A (zh) * 2019-08-28 2019-11-05 济南大学 表面增强拉曼散射纸基传感器在肿瘤标志物检测中的应用
CN110632302A (zh) * 2019-10-30 2019-12-31 中国农业科学院农产品加工研究所 一种同时检测待测样品中大肠杆菌和沙门氏菌的含量的方法
KR20210087303A (ko) * 2020-01-02 2021-07-12 서강대학교산학협력단 CRISPR/Cas12a를 이용한 표면증강 라만산란 기반 표적 DNA 검출용 센서
CN113801920A (zh) * 2021-08-20 2021-12-17 广州艾迪基因科技有限责任公司 一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116794013A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 一种银杏酮酯总混样品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhuang et al. SERS-based CRISPR/Cas assay on microfluidic paper analytical devices for supersensitive detection of pathogenic bacteria in foods
Zhang et al. Visual detection for nucleic acid-based techniques as potential on-site detection methods. A review
Yuan et al. Universal and naked-eye gene detection platform based on the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas12a/13a system
Nnachi et al. Biosensors for rapid detection of bacterial pathogens in water, food and environment
Ma et al. CRISPR-Cas12a-powered dual-mode biosensor for ultrasensitive and cross-validating detection of pathogenic bacteria
Yue et al. Advances in clustered, regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based diagnostic assays assisted by micro/nanotechnologies
Shi et al. A fluorescence resonance energy transfer (FRET) biosensor based on graphene quantum dots (GQDs) and gold nanoparticles (AuNPs) for the detection of mecA gene sequence of Staphylococcus aureus
Ma et al. A ratiometric fluorescent biosensing platform for ultrasensitive detection of Salmonella typhimurium via CRISPR/Cas12a and silver nanoclusters
Lim et al. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare
Xia et al. Isothermal nucleic acid amplification for food safety analysis
Cocolin et al. The challenge of merging food safety diagnostic needs with quantitative PCR platforms
Ma et al. A SERS-signalled, CRISPR/Cas-powered bioassay for amplification-free and anti-interference detection of SARS-CoV-2 in foods and environmental samples using a single tube-in-tube vessel
Xiang et al. High-throughput microfluidic strategy based on RAA-CRISPR/Cas13a dual signal amplification for accurate identification of pathogenic Listeria
Zhang et al. CRISPR/Cas Systems‐Inspired Nano/Biosensors for Detecting Infectious Viruses and Pathogenic Bacteria
Xue et al. Isothermal RNA amplification for the detection of viable pathogenic bacteria to estimate the Salmonella virulence for causing enteritis
Tian et al. An ultrasensitive and contamination-free on-site nucleic acid detection platform for Listeria monocytogenes based on the CRISPR-Cas12a system combined with recombinase polymerase amplification
Lu et al. State of the art in CRISPR/Cas system-based signal conversion and amplification applied in the field of food analysis
Wang et al. Determination of bacterial DNA based on catalytic oxidation of cysteine by G-quadruplex DNAzyme generated from asymmetric PCR: Application to the colorimetric detection of Staphylococcus aureus
EP3902929A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method
Nouri et al. Figure of merit for CRISPR-based nucleic acid-sensing systems: Improvement strategies and performance comparison
Shanker et al. Nanotechnology and detection of microbial pathogens
Chen et al. Research progress of CRISPR-based biosensors and bioassays for molecular diagnosis
CN115404279A (zh) 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用
Lu et al. Rapid and highly specific detection of communicable pathogens using one-pot loop probe-mediated isothermal amplification (oLAMP)
Zhang et al. Self-assembly of multivalent aptamer-tethered DNA monolayers dedicated to a fluorescence polarization-responsive circular isothermal strand displacement amplification for Salmonella Assay

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination