CN113801920A - 一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法 - Google Patents

一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRSIPR‑Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法。先对待测样品进行RPA扩增，再在crRNA探针介导下，利用CRISPR‑Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，最后通过信号产物的显色检测进行判断。本发明的检测沙门氏菌的RPA‑CRISPR/cas12a技术，通过RPA扩增及crRNA识别双重特异对沙门氏菌进行检测，特异性强，且灵敏度可低至在10‑4ng/μL或102CFU/mL，与qPCR仪器方法相当。本发明检测时间短，灵敏度高，无需大型仪器，只需一个恒温装置和可携带荧光装置，37℃即可完成全部反应，适用于现场的快速检测，具有较好的应用前景。

Description

一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及食源性致病菌检测技术领域，更具体地，涉及一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法。
背景技术
沙门氏菌是一种兼性厌氧的细菌，属肠杆菌科，是革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌与其他食源性致病菌如：弯曲杆菌，单增生李斯特菌，金黄色葡萄球菌，产志贺毒素的大肠杆菌等均是导致大量食源性病例的常见细菌。据统计，食品安全事件中细菌性食物中毒事件高达40％，且沙门氏菌引起的中毒事件高居首位。沙门氏菌通常会污染的食物主要有蛋制品，乳制品，肉制品，水生动物也会因水质受到污染而被感染，对人类的健康安全造成极大危害。感染沙门氏菌的临床症状常表现为腹痛，头痛恶心，呕吐，腹泻等，严重者会危及生命。
在GB29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》所列出的所有食品类别中，无论是肉制品，粮食制品，饮料，还是即食豆制品，即食果蔬制品，沙门氏菌的限量标准均是一致的，即同一批次采集的5个样品中，沙门氏菌不得检出(n＝5，c＝0)。国际食品微生物标准委员会、欧盟、国际食品法典委员会对各类食品分别做了不同要求，总体上比我国更为严格，有些甚至能达到n＝60，c＝0。因此，沙门氏菌的危害性可见一斑，沙门氏菌的快速检测也一直都是食品安全中的研究重点之一。
我国现行的沙门氏菌检验标准为GB4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》。该法为最基础最标准的沙门氏菌检验方法，其准确度高，稳定性好，成本低，但其操作复杂，耗时长，需要耗费大量的人力物力。因此，各种快速检测沙门氏菌的技术和方法应运而生，包括基于免疫学的方法，如酶联免疫吸附法和侧流免疫层析法；基于传感器以及适配体的生物技术，如光学生物传感器，电化学生物传感器；基于核酸序列的方法，如PCR，实时荧光定量PCR(qPCR)等。目前各种方法均有各自的局限性，其中基于DNA的分子生物学检测方法因其具有灵敏度高、特异性强、成本低等优点而应用较为广泛。但目前的分子生物学方法对检测人员、样品DNA质量、检测环境要求高，且PCR和qPCR仪价格昂贵，多用于实验室，较难应用到现场快速检测。因此，建立一种同时满足快速、便捷且灵敏度高的沙门氏菌检测方法至关重要，能够为食品安全和人们健康带来保障。
中国专利CN111961705A公开了一种沙门氏菌的检测方法，是以待测样品的核酸为模板，利用沙门氏菌特异性引物使用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增，得到扩增产物；再在特异crRNA的介导下，利用CRISPR系统对所得到的扩增产物进行裂解反应，得到裂解产物；最后将得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测；其LAMP扩增时间为1h，且需要65℃，检测时间较长、检测温度较高，同时胶体金检测结果不稳定且需要额外的耗材。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于CRSIPR-Cas体系的快速沙门氏菌检测方法。先通过对待测样品核酸模板进行恒温扩增反应得到扩增产物，再在特异crRNA的介导下，利用含ssDNA荧光探针的CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，最后通过信号产物的显色检测进行判断，简单快捷。
本发明的第一目的在于提供一种快速检测沙门氏菌的RPA引物和crRNA探针。
本发明的第二个目的在于提供一种快速检测沙门氏菌的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种快速检测沙门氏菌的试剂盒，包括RPA引物和crRNA探针；所述RPA引物包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，所述crRNA探针序列如SEQ IDNO.3所示。
所述RPA引物用于先对待测样品核酸使用重组酶聚合酶等温扩增，得到RPA扩增产物，再在特异性crRNA探针的介导下，利用CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，从而进行判断。
优选地，所述试剂盒还包含Cas12a酶和ssDNA荧光探针，所述ssDNA荧光探针一端采用荧光基团进行修饰，另一端采用淬灭基团进行修饰。
进一步优选地，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列包括但不仅限于FAM-TTTTTT-BHQ，任何DNA单链荧光探针均可实现本发明发明目的。
本发明还提供所述试剂盒在快速检测沙门氏菌中的应用。
本发明还提供一种快速检测沙门氏菌的方法，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；
S3.将步骤S2的RPA扩增产物加入到含ssDNA荧光探针、所述crRNA探针的CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到信号产物；
S4.将步骤S3的信号产物在蓝光下进行显色，若信号产物在蓝光照射下显色无荧光亮度，证明待测样品中无沙门氏菌污染，为阴性(－)；若信号产物在蓝光照射下显色有荧光亮度，证明待测样品中有沙门氏菌污染，为阳性(+)。
上述检测方法的原理是CRISPR-Cas12a在crRNA的引导下识别RPA扩增产物中特异性靶标，CRISPR-Cas12a、crRNA和靶标序列分子结合成复合物；所述复合物切割检测体系内的ssDNA荧光探针，探针分子被切开后，产生大量荧光可被检测。
优选地，步骤S2所述等温扩增反应的体系为5μL 2×Reaction Buffer、1μL10×Basic E-Mix、0.5μL 20×Core Reaction Mix、40μM上下引物各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μLDNA模板、0.71μL MgOAc加入PCR管中，混匀，覆盖15μL矿物油；37℃孵育25min。
进一步优选地，所述CRISPR/cas12a体系中，cas12a：crRNA探针：ssDNA荧光探针＝80nM:80nm:200nM。
进一步优选地，步骤S3所述裂解反应的体系为1μM cas12a酶2μL、1μM crRNA 2μL、10μM ssDNA荧光探针0.5μL、0.8U/μL RNase Inhibitor 0.5μL、2.5μL NEBuffer 2.1、7.5μL ddH2O；37℃孵育5～20min。
作为一种优选的可实施方式，所述快速检测沙门氏菌的方法，为将待测样品核酸利用上述的RPA引物、crRNA探针、Cas12a酶、ssDNA荧光探针进行RPA扩增、Cas12a切割和荧光分析一体化检测(RPA-CRISPR/cas12a)；所述RPA-CRISPR/cas12a方法的反应体系为：5μL2×Reaction Buffer、1μL10×Basic E-Mix、0.5μL20×Core Reaction Mix、上下引物(40μM)各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μL DNA模板、0.71μL MgOAc加入PCR管中，混匀，覆盖15μL矿物油。2μL cas12a酶(1μM)、2μL crRNA(1μM)、0.5μL ssDNA荧光探针(10μM)、0.5μL RNaseInhibitor(0.8U/μL)、2.5μL NEBuffer 2.1、7.5μL ddH2O混匀，共15μL加入PCR管盖，37℃孵育25min。待RPA扩增反应(37℃孵育25min)完成后离心，37℃孵育5～20min即可在蓝光装置下得到结果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法。通过先对待测样品进行RPA扩增，低温37℃25min即能完成扩增，在终点检测中，在crRNA探针介导下，利用含ssDNA荧光探针的CRISPR-Cas12a体系对RPA扩增产物进行裂解反应，得到信号产物，最后通过信号产物的显色检测进行判断，5～20min即可显色，更稳定且不用额外增加试纸条的步骤，简单快捷。本发明的检测沙门氏菌的RPA-CRISPR/cas12a技术，通过RPA扩增及crRNA识别双重特异的对沙门氏菌进行检测，特异性强，且在DNA灵敏度上可低至10-4ng/μL，菌液检测灵敏度上可低至102CFU/mL，与qPCR仪器方法相当。本发明检测时间短，灵敏度高，无需大型仪器，只需一个恒温装置和可携带荧光装置，37℃即可完成全部反应，适用于现场的快速检测，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明分别对不同食源性致病菌进行的特异性检测结果。1.CMCC50041：肠炎沙门氏菌；2.ATCC14028：鼠伤寒沙门氏菌；3.TA97a：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌；4.TA102：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌；5.S：金黄色葡萄球菌；6.VP.：副溶血性弧菌；7.CO：大肠杆菌；8.LM.：单增生李斯特菌；9.Bc：蜡样芽胞杆菌；10.NTC：阴性对照。
图2为本发明分别对不同沙门氏菌基因组浓度的DNA模板进行的检测结果。
图3是本发明分别对不同沙门氏菌浓度的菌液进行的检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 RPA引物设计筛选及扩增体系确定
从GenBank数据库中下载沙门氏菌(CMCC50041)全基因组序列，选择沙门氏菌特异性片段，将此特异性片段使用NCBI网页Primer-BLAST工具搜索确认本片段在沙门氏菌中的同源性，确定扩增靶标为Fim Y基因；根据所述靶标序列设计得到了一系列满足RPA引物设计原则的引物对，经过一系列的前期检测、筛选后。引物筛选结果如下所示：
沙门氏菌特异性引物组，扩增片段284bp：
上游引物：5’-CCCAGCCATACGGATAAACTGTGTTATAGCGG-3’；
下游引物：5’-CTCAGGCAATAATTACAACTGACAACTACCTC-3’；
确定最佳引物组后，对RPA扩增体系进行建立，对引物浓度、dNTPs浓度、MgOAc浓度，扩增温度、扩增时间等条件进行优化。
(1)引物浓度
RPA反应体系如下，改变引物浓度，其他条件均保持不变，测试不同引物浓度的荧光变化，以此选择最优的引物浓度为0.48μM。
(2)dNTPs浓度
RPA反应体系如下，改变dNTPs浓度，其他条件均保持不变，测试不同dNTPs浓度的荧光变化，以此选择最优的dNTPs浓度为2.2mM。
(3)MgOAc浓度
RPA反应体系如下，改变MgOAc浓度，其他条件均保持不变，测试不同MgOAc浓度的荧光变化，以此选择最优的MgOAc浓度为20mM。
(4)扩增时间
体系浓度已定，现改变不同的扩增时间，其他条件均保持不变，测试不同扩增时间的荧光变化，以此选择最优的扩增时间为25min。
(5)扩增温度
体系浓度已定，现改变不同的扩增温度，其他条件均保持不变，测试不同扩增时间的荧光变化，以此选择最优的扩增温度为37℃。
RPA扩增体系优化为：5μL 2×Reaction Buffer、1μL 10×Basic E-Mix、0.5μL 20×Core Reaction Mix、上下引物(40μM)各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μLDNA模板、0.71μLMgOAc；RPA反应程序为：37℃加热25min。
实施例2 crRNA筛选及CRISPR/cas12a体系优化
在扩增的284bp片段中，对比沙门氏菌种间差异，选择了一段满足cas12a检测需求的TTTV-(PAM位点)的21bp片段，确定为crRNA探针的靶标，所述特异性靶标核苷酸序列为5’-AATCCACAAAGAAATGTCATC-3’，同时根据所述特异性靶标核苷酸设计合成相对应的crRNA。
crRNA序列如下：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCCACAAAGAAAUGUCAUC
(1)cas12a/crRNA比例
设定不同比例的cas12a/crRNA，以此用不同荧光亮度来确定最佳比例条件，确定最终比例为1:1。
(2)cas12a/ssDNA荧光探针比例
设定不同比例的cas12a/ssDNA荧光探针，以此用不同荧光亮度来确定最佳比例条件，确定最终比例为1:2.5。所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为FAM-TTTTTT-BHQ。
最佳反应条件为cas12a：crRNA探针：ssDNA荧光探针＝80nM:80nm:200nM
所述CRISPR/cas12a条件的优化为：2μL cas12a酶(1μM)、2μL crRNA(1μM)、0.5μLssDNA荧光探针(10μM)、0.5μL RNase Inhibitor(0.8U/μL)、2.5μL NEBuffer 2.1、7.5μLddH2O。
实施例3 RPA-CRISPR/cas12a方法的建立
(1)沙门氏菌的培养及DNA提取
配置固体培养基倒置平板，用于单菌落培养，同时配置液体培养基为了进行增菌实验。将购买的沙门氏菌菌种进行液体培养复苏，接着在平板上划线培养单菌落后，挑取单菌落进行液体扩大培养，200rpm，37℃培养10-12h。
为保证提取的基因组DNA的纯度及浓度都保持上等水平，因此采用试剂盒进行提取，具体操作步骤如下：
1.取细菌培养液1-5mL，10,000rpm(～11,500xg)离心1min，尽量吸净上清。
2.向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
3.向管中加入20μLProteinase K溶液，混匀。
4.加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400xg)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
9.重复操作步骤8。
10.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400*g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。
(2)沙门氏菌RPA-CRISPR/cas12a方法的检测
通过对RPA扩增反应和CRISPR/cas12a体系的优化，确定RPA-CRISPR/cas12a方法的反应体系为：5μL 2×Reaction Buffer、1μL10×Basic E-Mix、0.5μL20×Core ReactionMix、上下引物(40μM)各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μL DNA模板、0.71μL MgOAc加入PCR管中，混匀，覆盖15μL矿物油。2μL cas12a酶(1μM)、2μL crRNA(1μM)、0.5μL ssDNA荧光探针(10μM)、0.5μL RNase Inhibitor(0.8U/μL)、2.5μL NEBuffer 2.1、7.5μL ddH2O混匀，共15μL加入PCR管盖，37℃孵育25min。待RPA扩增反应完成后离心，37℃孵育5-20min即可在蓝光装置下得到结果；
阴性(－)：信号产物在蓝光装置照射下显色无荧光亮度，证明待测样品中无沙门氏菌污染；
阳性(+)：信号产物在蓝光装置照射下显色有荧光亮度，证明待测样品中有沙门氏菌污染。
实施例4 RPA-CRISPR/cas12a方法特异性验证
所述实施例3完成后，为了验证本发明所构建的RPA-CRISPR/cas12a方法特异性，提取不同分型的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增生李斯特菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌的DNA，作为RPA反应模板对构建的RPA-CRISPR/cas12a检测体系进行特异性验证。DNA提取、RPA-CRISPR/cas12a检测体系及反应条件、检测装置均与实施例3相同。RPA-CRISPR/cas12a检测方法特异性验证结果如图1所示，可以看到RPA-CRISPR/cas12a方法只对沙门氏菌有肉眼可见的荧光，除沙门氏菌外均不能被检测产生荧光信号。这表明本发明的RPA-CRISPR/cas12a方法特异性高。
实施例5 RPA-CRISPR/cas12a方法基因组检测限
为了验证本发明所构建的RPA-CRISPR/cas12a方法基因组检测限，分别对不同沙门氏菌基因组浓度的DNA模板进行检测。按照实施例3的DNA提取方法对沙门氏菌进行DNA提取，将其作为模板进行RPA反应，将扩增产物进行纯化，纯化步骤如下：
1.柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)
2.估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。
3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
4.向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
5.重复操作步骤4。
6.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
7.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm(～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。
对纯化回收的扩增产物进行DNA浓度的测量，经过计算，将得到的DNA产物进行梯度稀释，浓度分别为10-2ng/μL，10-3ng/μL，10-4ng/μL，10-5ng/μL，结果如图2所示，表明本发明RPA-CRISPR/cas12a方法对于沙门氏菌的检测限达到10-4ng/μL。
实施例6 RPA-CRISPR/cas12a菌浓度检测限
为了验证本发明所构建的RPA-CRISPR/cas12a方法菌浓度检测限，分别对不同沙门氏菌菌液浓度进行检测。按照实施例3中对沙门氏菌进行培养，对培养后的菌液采用国标的方法进行菌落计数，同时梯度稀释菌液使其浓度分别为106CFU/mL，105CFU/mL，104CFU/mL，103CFU/mL，102CFU/mL，101CFU/mL。为了最大程度的提取沙门氏菌的DNA，采用水煮法对不同菌浓度的菌液进行DNA提取。取5mL菌液，12000rpm离心10min，弃去上清液。加入100μL无菌水重悬，在100℃下加热10分钟后，将重悬液在12000rpm离心10min，吸取上清液。将水煮提取的DNA模板，按照实施例3中所述进行RPA-CRISPR/cas12a体系检测，结果如图3所述，表明本发明RPA-CRISPR/cas12a方法对于沙门氏菌的菌液浓度检测限能达到2×102CFU/mL。
本发明所述方法特异性强，灵敏度高，准确性好，RPA恒温扩增避免了使用大型仪器，整个过程能够在恒温条件甚至是体温下就可完成检测，CRISPR/cas12a系统在crRNA探针介导下靶向识别识别沙门氏菌扩增产物，激活cas12a酶的dsDNA切割活性，并激活其附属切割活性非特异性地切割ssDNA，产生荧光信号，避免假阳性，荧光可借助简单仪器达到可视化的要求，操作简便，检测快速，能够很好的应用于沙门氏菌的快速检测。
序列表
<110> 广州艾迪基因科技有限责任公司
<120> 一种基于CRSIPR-Cas体系的快速检测沙门氏菌的试剂盒及方法
<141> 2021-08-19
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccagccata cggataaact gtgttatagc gg 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaggcaat aattacaact gacaactacc tc 32
<210> 3
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uaauccacaa agaaauguca uc 42

Claims (8)

1.一种快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，包括RPA引物和crRNA探针；所述RPA引物包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，所述crRNA探针序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包含Cas12a酶和ssDNA荧光探针。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针的核苷酸序列为FAM-TTTTTT-BHQ。
4.权利要求1～3任一所述试剂盒在快速检测沙门氏菌中的应用。
5.一种快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品基因组DNA；
S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求1中所述RPA引物进行等温扩增反应，得RPA扩增产物；
S3.将步骤S2的RPA扩增产物加入到含ssDNA荧光探针、权利要求1中所述crRNA探针的CRISPR/cas12a体系中进行裂解反应，得到信号产物；
S4.将步骤S3的信号产物在蓝光下进行显色，若信号产物在蓝光照射下显色无荧光亮度，证明待测样品中无沙门氏菌污染；若信号产物在蓝光照射下显色有荧光亮度，证明待测样品中有沙门氏菌污染。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2所述等温扩增反应的体系为5μL 2×Reaction Buffer、1μL10×Basic E-Mix、0.5μL 20×Core Reaction Mix、40μM上下引物各0.12μL、0.55μL dNTPs、2μL DNA模板、0.71μL MgOAc加入PCR管中，混匀，覆盖15μL矿物油；37℃孵育25min。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述CRISPR/cas12a体系中，cas12a：crRNA探针：ssDNA荧光探针＝80nM:80nm:200nM。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S3所述裂解反应的体系为1μM cas12a酶2μL、1μM crRNA 2μL、10μM ssDNA荧光探针0.5μL、0.8U/μL RNase Inhibitor 0.5μL、2.5μLNEBuffer 2.1、7.5μL ddH2O；37℃孵育5～20min。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114487045A (zh) * 2022-01-26 2022-05-13 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒
CN115404279A (zh) * 2022-02-18 2022-11-29 天津科技大学 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用
WO2023216612A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 江南大学 一种无扩增时间分辨荧光侧向层析检测方法检测沙门氏菌及耐药菌
CN117925619A (zh) * 2024-01-26 2024-04-26 宝应县产品质量综合检验检测中心(宝应县计量测试检定所) 一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186313A (zh) * 2021-05-06 2021-07-30 常州市疾病预防控制中心 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113186313A (zh) * 2021-05-06 2021-07-30 常州市疾病预防控制中心 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YEH KS等: "《PCR amplification of the Salmonella typhimurium fimY gene sequence to detect the Salmonella species》", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY》 *
程辉等: "《双重RT-RPA法快速检测沙门氏菌及其1类整合酶基因》", 《浙江农业学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114487045A (zh) * 2022-01-26 2022-05-13 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒
CN114487045B (zh) * 2022-01-26 2023-05-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒
CN115404279A (zh) * 2022-02-18 2022-11-29 天津科技大学 基于SERS的CRISPR/Cas系统联合微流控纸分析装置检测病原菌的方法及应用
WO2023216612A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 江南大学 一种无扩增时间分辨荧光侧向层析检测方法检测沙门氏菌及耐药菌
CN117925619A (zh) * 2024-01-26 2024-04-26 宝应县产品质量综合检验检测中心(宝应县计量测试检定所) 一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用

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