CN117925619A - 一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR cas12a系统及其应用，所述的crRNA的序列为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8中任一所示，本发明还提出一种CRISPR cas12a系统，以及基于CRISPR cas12a系统的试剂盒，本发明的crRNA可特异性检测沙门氏菌，且具有前述crRNA的CRISPR cas12a系统能够进行无扩增检测，基于CRISPR cas12a系统的试剂盒可以实现一步法检测，大幅度简化了基于CRISPR检测的操作流程。

Description

一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其 应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPRCas12a系统及其应用。

背景技术

沙门氏菌(S.aureus)被认为是最严重的传染性食源性病原体之一，在国际食品安全事件(EFSA.2021)中，它几乎处于公共安全问题的首位或第二位，由于其侵袭性、毒力和抗生素耐药性，可导致严重的食物中毒。此外，随着抗生素在医药和农业中的滥用，细菌耐药性问题变得越来越严重。世界卫生组织将抗生素耐药性列为当前对全球健康、粮食安全和发展的威胁之一(WHO,2020)。

目前用于核酸检测的CRISPR蛋白有Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas14以及Csm6等。其检测原理基本相似，由Cas蛋白与crRNA结合形成crRNA-Cas蛋白复合体，当目标核酸分子存在时，可特异性性与目标核酸分子结合并激活Cas蛋白的旁路核酸切割活性，任意切割荧光修饰报告探针。在这一过程中，Cas蛋白的活性是由目标核酸(激活序列)激活的，目标核酸的浓度直接影响检测灵敏度。大量研究显示，在不经扩增的情况下，该方法只能检测到pM(10^-9M)浓度级别的核酸。

基于Cas12a的分子生物学诊断可以特异性检测核酸和生物标志物，可以用于准确鉴定致病菌中的基因型，包括毒力基因和耐药基因。但基于Cas12a的方法仍然存在许多待解决问题：(1)在没有核酸预扩增的情况下，直接检测的灵敏度被限制在皮摩尔级和10³CFU/mL的范围内，迄今为止报道的大多数基于CRISPR的平台通常与核酸目标的等温预扩增相结合。然而，预扩增需要增加多组处理步骤和温度控制程序，限制了POCT场景得使用；(2)此外核酸扩增和CRISPR的反式切割还无法同时进行，使用时还需要两步过程(扩增靶序列后进行CRISPR检测)，移液处理的多个步骤增加了操作时间和交叉污染的风险；(3)CRISPR体系使用过程中多步添加酶、引物、crRNA，易受环境干扰，且对设备、无RNase环境依赖性强，保藏运输困难。SHERLOCK已被进一步开发为STOPCovid.v1，采用等温扩增的方法与CRISPR结合实现一锅法检测(one pot)来解决这一问题，然而，它们的灵敏度远低于核酸检测金标准qPCR和RT-qPCR，并且需要大约1h的总反应时间。

设计对Cas12a蛋白具有更好亲和力的替代DNA报告物，从而能够提高灵敏度和反式裂解率，有可能显著提高检测灵敏度。与双链DNA相比，短的单链DNA探针具有更好的反式裂解活性，是最常用的报告探针。目前针对信号报告探针的研究较少，绝大部分的诊断检测仍然依赖于使用线性单链DNA作为信号表达工具。然而，特定的DNA二级结构(如发夹结构；环状结构；三联体等)的影响还没有被充分研究，不同的二级结构探针可以带来更低的背景荧光和更强终点荧光，改变信号输入与输出的相对变化之比(提高输入/输出函数的陡度)，提高检测灵敏度。

因此，一种快速、廉价且灵敏的沙门氏菌及其耐药菌的检测方法对于确保食品安全和人类健康至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种用于沙门氏菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用，由于Cas12a对发夹DNA结构的亲和力(Km)的改善，我们发现其反式切割活性的速度更快，与广泛使用的线性单链DNA报道分子相比，使用发夹DNA探针我们可以显著增强基于FITC的信号转导。能够在不存在上游预扩增步骤的情况下，通过改进的灵敏度和特异度，更快地检测相关的双链DNA靶标。

第一方面：本发明提供了一种用于沙门氏菌检测的crRNA，所述crRNA的序列为SEQID NO.1-SEQ ID NO.8中任一所示。

第二方面，本发明提供第一方面所述的用于沙门氏菌检测的crRNA在制备制备沙门氏菌检测产品中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统，所述CRISPRCas12a系统包括权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crRNA。

在一些实施方式中，所述CRISPR Cas12a系统还包括：Cas12a核酸酶和发夹探针，所述发夹探针的序列为SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.16中任一所示。

第四方面，本发明提供一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，该试剂盒中含有第三方面所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有非还原糖和甘露醇。

在一些实施方式中，非还原糖为非还原二糖或非还原多糖，例如蔗糖、普鲁兰糖等。

在一些实施方式中，试剂盒中，所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统为冻干状态。

第五方面，本发明提供一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的方法，所述方法包括：利用第三方面所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统对待测样品进行检测。

第六方面，本发明提供第三方面所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统在制备沙门氏菌检测产品中的应用。

本发明相对于现有技术具有以下有益效果：

本发明基于CRISPR Casl2a技术设计得到针对沙门氏菌的crRNA，其中，SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.8所示的crRNA可以特异性的用于检测沙门氏菌。

本发明构建了基于发夹结构的FRET信号转化探针，与广泛使用的线性单链DNA报道分子相比，使用发夹DNA探针可以显著增强基于FRET的信号传导，实现无扩增检测。

本发明构建了冻干固定化的CRISPR Casl2a体系，将操作流程从十多步缩短至四步，且本发明的冻干体系活力良好，保证了检测灵敏度。通过无扩增检测和固定化的CRISPR体系实现一步法检测，大幅度简化了基于CRIPSR检测方案的操作流程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的CRISPR Casl2a系统进行一步法检测的操作流程；

图2为在目标细菌活度为10⁴CFU/mL的条件下，具有最佳反应活力的crRNA；

图3为发夹探针长度的筛选测试图：(A)不同长度发夹探针的背景荧光；(B)不同长度发夹探针探针的反式切割活力；

图4为不同发夹探针序列的筛选测试图；

图5为CRISPR Cas12a系统冻干缓冲液优化：(A)CRISPR系统缓冲液的冻干优势示意图；(B)在目标菌活性为10⁴CFU/mL的条件下，酶稳定剂和赋形剂比例优化；(C)冻干前和冻干后添加金属盐溶液和PEG对反应的影响；

图6为一步法方法检测的特异性分析图；

图7为DPAM-LPP方法的检测灵敏度分析图：(A)发夹探针对一步法检测方法的检测灵敏度的影响；(B)两组特异性crRNA在纯培养中的检测灵敏度分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明实施例所属技术领域普通技术人员通常理解相同的含义。如果此部分中陈述的定义与通过引用纳入本文的所述专利、专利申请、公布的专利申请和其他出版物中陈述的定义相反或其他方面不一致，此部分中列出的定义优先与通过引用纳入本文中的定义。

下述实施例中使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。所用材料、试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

实施例1

crRNA的筛选及液体环境检测方法构建

本发明实施例中，基于CRISPR Casl2a技术快速检测沙门氏菌，该方法用于非诊断或治疗目的，检测流程如图1所示，包括如下步骤：

通过Vmatch筛选和blast比对，筛选其保守特异性的核酸序列crRNA S1～S8，具体见表1，针对沙门氏菌标准菌株设计Cas12a核酸酶(AsCas12a(cpf1)-NLS酶)及crRNA识别的靶序列，靶序列前含有“TTTN”PAM识别位点，通过荧光动力学筛选具有最佳优势的crRNA。

测定前，先将沙门氏菌标准菌株在营养肉汤中于37℃孵育过夜，以获得纯细菌培养物，通过标准平板计数测定每种细菌种类的浓度。通过加热裂解法或称水提法提取DNA，将1mL细菌溶液重悬于200μL Tris-EDTA(TE)缓冲液中，并在100℃下加热裂解8min。裂解后菌液在12000×g下离心2min，上清液作为核酸样品进行后续实验，测定前使用超微分光光度计(Kaiao technology development Co.，let，Beijing China)测量DNA浓度。

荧光检测反应体系：Cas12a裂解试验由1×NEB buffer 2.1μL(50mM NaCl、10mMTris-HCl、10mM MgCl2、100ug/mL BSA，pH7.9，在25℃)、150nM AsCas12a(cpf1)-NLS酶、100nm crRNA、300nM ssDNA-FQ报告探针和4μL核酸样品，最后使用无核酸酶的水添加到最终体积25μL。

荧光检测反应条件：将荧光检测反应体系置于37℃反应30min后检测荧光强度。反应产物在酶标仪中，使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长525nm处检测荧光强度以获得检测结果。通过图2可知，针对沙门氏菌设计的crRNA序列crRNAS3和crRNAS6具有最好的荧光恢复。

表1.CRISPR Cas12a检测中所用的寡核苷酸序列

实施例2

发夹探针提高CRISPR Cas12a系统检测的灵敏度

设计了一组三个环状近端报告探针，它们保留了共同的茎序列(即3GC+2AT)和荧光团/猝灭剂对(6-FAM/BHQ-1)，但存在不同长度的环结构域5T、10T、30T。图3(A)可以看出，5T的环状近端探针随时间变化在短时间内有最低的背景，而过长的茎环则会导致不稳定的环状近端状态，更易裂解产生背景荧光。在对不同长度环状近端探针反式切割活力的评价中发现，10T长度的环状近端探针具有相对较低的背景荧光，和最佳的反式切割活力(图3(B))，因此选择长度为10T的环状近端探针用于下一步实验。

进一步探索了DNA序列含量对切割活性的影响，在目前已报道过的CRISPR-Cas12a系统中，通常富含AT的DNA报告基因会优先反式切割。测试了在环区域中含有不同数量胸腺嘧啶发夹探针的三种变体(变体1，由12T组成的环；变体2，由10T+2A组成的环；变体3，7T+5A的环)。图4可以看出与线性ssDNA报告基因相比，三种发夹探针的变体都证实能更好地转导荧光信号。但三种发夹探针的变体有着近似的信号恢复强度。这表明Cas12a反式切割对DNA报告基因的一级序列没有或具有较低偏好，观察到的增强可能主要归因于二级结构的存在。

通过绘制测得三种变体发夹探针和线性单链ssDNA与DNA(底物)反应速度的关系曲线，并使用Michaelis-Menten方程对数据进行拟合，我们得到了kcat和Km值。发夹DNA报告物的kcat/Km比线性-ssDNA报告物高5倍。这种差异可归因于三种发夹报告器获得的Km值的降低(Kmlinear-ssDNA，＝250±50nM；Kmstem-loop#5T＝42±5nM；Kmstem-loop#10T＝34±2nM；Kmstem-loop#30T＝69±5nM)，而kcat值非常相似(kcat linear-ssDNA，＝0.30±0.02s-1；kcatstem-loop#5T＝0.24±0.02s-1；kcatstem-loop#10T＝0.23±0.01s-1；kcatstem-loop#30T＝0.28±0.02s-1)。这些数据表明，LbCas12a与发夹形成底物的结合亲和力增强导致了转环作用的增强。

为了研究LbCas12a的增强活性，我们对不同的DNA报告物进行了Michaelis-Menten动力学研究。我们使用不同浓度的DNA报告来确定初始反应速度(V0)，校准曲线用于将V0从u.a./min转换为nM/min。通过绘制测得的反应速度与DNA报告物(底物)浓度的关系曲线，并使用Michaelis-Menten方程对数据进行拟合，我们得到了kcat和Km值。发夹型DNA报告物的kcat/Km值比线性-ssDNA报告物高5倍。

这种在分子对接前后使用MD的方法使我们能够减少单链DNA的对接计算可能产生的偏差。为了计算结合自由能，我们对茎环DNA和线性DNA与Cas12a的复合物进行了约200ns的无约束MD模拟。通过这种方法，我们对两个系统的结合能进行了比较。我们观察到，与线性-ssDNA相比，茎环#12T的自由能相差-8.24kcal/mol。这表明发夹DNA模型促进了与Cas12a催化口袋更强的结合。对相互作用的分析进一步显示，茎环DNA与Nuc结构域的相互作用比线性DNA更广泛。因此，与线性DNA相比，由于与Nuc的相互作用增加，茎环DNA更稳定地结合在Cas12a核心中。底物在活性位点内更稳定的位置有利于催化，最终导致催化效率的提高。这与我们的实验观察结果相吻合。

实施例3

固定化CRISPR/Cas12a体系优化

冻干固定化可以解决CRISPR试剂保藏及运输的难题，并大幅简化用户的操作流程(图5A)。但是冻干过程中会导致酶表面的单层水分子开始冻结，使蛋白质分子表面的氢键及极性基团就会暴露而发生变性，从而破坏Cas12a酶的活力，降低检测灵敏度。因此，通过添加非还原二糖(例如蔗糖)或者多糖(如普鲁兰糖)充当稳定剂和酶类增强剂，添加甘露醇作为稀释剂和赋形剂，防止由于蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。此外，冻干时高盐离子及聚合物浓度会破坏Cas酶的稳定性，因此在冻干时除去，并在后期用含有这些组分的再水化buffer重悬。

在目的菌浓度为10⁴CFU/mL的条件下，通过终点荧光判断冻干后Cas12a crRNARNP的活力。图5(B)可以看出，相较于原始1×CRISPR缓冲液，添加5％w/v的蔗糖、2.5％w/v普鲁兰糖和300mm甘露醇使Cas12a酶活力相较于直接冻干提高了2.7、3.4和3.1倍，按优化后的最终浓度混合添加，使酶活力提高了4.7倍，保证了冻干后的检测灵敏度；PEG和金属离子分别作为Cas12a酶反式裂解时的融合剂和诱导剂，直接除去会显著降低反应活力，因此如图5(C)所示，将电解质和高聚物等物质在冻干时除去，减少冻干过程中高离子浓度对酶活性的损害，并在反应前使用预制的再水化buffer(3.5％w/v PEG-8000、40mM KCl和20mMMgCl2)复水，酶活力提高了2.4倍。使用非离子缓冲液Hapes替代Tris HCl也使Cas12a酶活性小幅提高。因此最终选择冻干试剂的成分为(20mM Hepes、5％w/v蔗糖、2.5％w/v普鲁兰糖、5％甘露醇、100nM Cas12a、200nM crRNA、pH8.0)，之后的测试都在冻干试剂的基础上进行。

实施例4

检测特异性的判断

分别提取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌标准菌株、耐药沙门氏菌的核酸作为核酸样品全部稀释至10³CFU/ml分别按上述方法进行反应，如图4所示，图4A为样品中添加crRNA5+6-S组合后的荧光恢复，图4B为添加crRNA1+4-Q组合后在不同样品中的荧光恢复。样品编号如下：1.大肠杆菌、2.金黄色葡萄球菌、3.铜绿假单胞菌、4.嗜水气单胞菌、5.副溶血性弧菌、6.沙门氏菌标准菌株、7.耐药沙门氏菌、8.大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+耐药沙门氏菌、9.副溶血性弧菌+大肠杆菌+铜绿假单胞菌+金黄色葡萄球菌+嗜水气单胞菌，10.大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌标准菌株+金黄色葡萄球菌；11.大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌+副溶血性弧菌+嗜水气单胞菌+耐药沙门氏菌；12.大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌+嗜水气单胞菌+耐药沙门氏菌+沙门氏菌标准菌株；13.沙门氏菌标准菌株+耐药沙门氏菌。

由图6(A)和图6(B)可知使用crRNAS2和S6两组最佳crRNA时，只有含沙门氏菌标准菌株出现荧光恢复，证明具有良好的特异性，能够特异性的检测沙门氏菌。

实施例5

检测灵敏度的判断

标准曲线的绘制方法是：

提取不同初始浓度(10⁰-10⁸CFU/mL)的纯培养的耐药沙门氏菌，测定DPAM-LPP方法的检测限和线性范围，每个数据点至少取三个技术重复的平均值±标准差表示。如图7(A)和7(B)所示，两组特异性的crRNA的LOD都可以达到10⁰CFU/mL，并在10⁰-10⁸CFU/mL的区间内具有良好的线性关系，R²分别为0.9914和0.9884，而单链探针用于one pot检测，LOD为10¹和10²CFU/mL，灵敏度又提高了一个数量级。在实际样品中，还选择了菠菜、生猪肉和鸡蛋共5种样品进行加标回收，以模拟真实检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于沙门氏菌检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA的序列为SEQ ID NO.1-SEQID NO.8中任一所示。

2.权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crRNA在制备沙门氏菌检测产品中的应用。

3.一种检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统，其特征在于：所述CRISPR Cas12a系统包括权利要求1所述的用于沙门氏菌检测的crRNA。

4.如权利要求3所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统，其特征在于，所述CRISPRCas12a系统还包括：Cas12a核酸酶和发夹探针，所述发夹探针的序列为SEQ ID NO.10-SEQID NO.16中任一所示。

5.一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括有权利要求3-4中任一所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统。

6.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括非还原糖和甘露醇。

7.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统为冻干状态。

8.一种基于CRISPR Cas12a系统快速检测沙门氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求3-4中任一所述的CRISPR Cas12a系统对待测样品进行检测。

9.权利要求3-4中任一所述的检测沙门氏菌的CRISPR Cas12a系统在制备沙门氏菌检测产品中的应用。