CN111254206A - 一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方法，包括将核酸探针与从待检测结核分枝杆菌中提取的结核分枝杆菌耐药相关基因组分别添加至缓冲液中进行杂交处理，所述核酸探针包含与已知的结核分枝杆菌耐药菌株的基因突变位点完全互补的核酸片段，且所述核酸探针能够与所述待检测结核分枝杆菌耐药相关基因组形成杂交核酸双链；杂交处理后，向反应体系中添加单链核酸酶进行酶切反应和灭活处理；对灭活处理后的产物进行核酸检测，并根据检测结果确定结核分枝杆菌是否为耐药菌株；本发明核酸探针用于结核分枝杆菌耐药菌株检测中，能够实现快速、准确地鉴定结核分枝杆菌的耐药性质，且检测方法成本较低。

Description

一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方法

技术领域

本发明实施例涉及结核分枝杆菌耐药菌株检测技术领域，具体涉及一种结 核分枝杆菌耐药菌株的检测方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性疾病，结核分枝杆菌可以感染人 体多个器官，以肺部感染为主，最终引发肺结核；据WHO报道，2015年， 新感染的结核患者上升到1040万，其中120万患者携带人免疫缺陷病毒，死 于结核杆菌感染的人数为140万，其中40万为艾滋病阳性，结核杆菌感染是 世界前十位致死疾病之一。

治疗结核杆菌感染的药物分为一线药物和二线药物；目前，一线药物主要 包括异烟肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)和 链霉素(SM)；二线药物主要包括氟喹诺酮类抗生素(FQs)、对氨基水杨酸 (PAS)和乙硫异烟胺(ETH)；临床上治疗结核杆菌感染时，通常采用两种 或两种以上药物联合的化疗方案；由于治疗结核杆菌感染是一个长期用药的过 程，因此容易产生抗药性，并且产生耐多药或者广泛耐药的结核杆菌，耐药结 核分支杆菌分为以下四类：

1)单耐药结核分枝杆菌：患者感染的结核分枝杆菌只对一种抗结核药物 有抗性；

2)多耐药结核分枝杆菌：患者体内的结核分枝杆菌对利福平或异烟肼以 外的药物具有抗性；

3)耐多药结核分枝杆菌：病人体内的结核分枝杆菌至少同时对利福平， 异烟肼具有耐药性；

4)广泛耐药结核杆菌：患者感染的结核分枝杆菌至少对利福平，异烟肼 耐药的同时，对氟喹诺酮类抗生素产生抗药性或对3种二线注射类抗结核药物 (卡那霉素、卷曲霉素、阿米卡星)中的药物至少一种具有抗性。

据WHO估计，2014年大约33万人感染了耐多药结核杆菌，占新增结核 患者的3.3％，其中9.7％的耐多药结核杆菌也具有广泛耐药性；2015年新增了 大约有48万耐多药结核杆菌感染患者；目前，结核杆菌诊断和治疗的重点和 难点则是耐多药结核杆菌和广泛耐药结核杆菌的检测及控制。

目前，结核分枝杆菌以及耐药结核分枝杆菌的诊断金标准为菌株培养。但 是，结核杆菌生长缓慢，检验报告需要一定的时间延迟，易于延误结核杆菌的 诊断和治疗；采用罗氏培养常见的致病性菌株可以在2-5周内获得阳性结果， 但是报告阴性培养结果需要在8周的时间；液态培养的阳性率高于固态培养的 阳性率10％以上，阳性结果多在1-3周内报告，报告阴性结果在培养6周之后， 总体而言，液态培养较固态培养缩短了2-3周的时间；虽然痰涂片检测时间较 短，但其灵敏度比较低(40％-50％)，而且无法确定菌株的耐药特性。

为了解决检测结核分枝杆菌耐药特性长时等待的技术瓶颈，人们发明了基 于分子生物学技术的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction， PCR)因其操作简单和反应效率高等特点，已经被广泛应用于结核分枝杆菌及 其耐药性的检测中。Priyadarshini等采用巢式PCR技术扩增热休克蛋白hsp65 编码基因的保守序列，从而检测出结核分枝杆菌复合菌群，实验结果显示 hsp65-巢式PCR的灵敏度为0.3pg，未检测出其他菌株，显示了较好的特异性。 Parashuram等利用荧光定量PCR检测结核杆菌以及耐药基因KatG和rpoB突 变，与培养检测相比，荧光定量PCR检测结核杆菌的特异性和灵敏度分别为96.5％和100％，并且发现了14株耐多药菌株，1株利福平单耐药菌株以及3 株异烟肼单耐药菌株。

此后，人们发明了利用等位基因特异性多重PCR(MAS-PCR)检测结核 分枝杆菌耐药的方法，包括利福平耐药基因rpoB、异烟肼耐药突变KatG和 inhA基因启动子、乙胺丁醇耐药基因embB和氟喹诺酮耐药基因gyrA基因； 这些基于PCR技术的结核杆菌检测方法，不仅广泛应用于实验室内的基础研 究，而且它们的相关产品已经应用于临床诊断中；GeneXpert是根据多重荧光 定量PCR对结核杆菌的核酸序列进行扩增，检测结核分枝杆菌和利福平耐药 患者样本的方法。2010年，WHO推荐使用Gene Xpert检测结核杆菌以及耐多 药结核杆菌；2013年，WHO又将Gene Xpert的应用扩展到儿童结核病和肺结 核以外的结核诊断，此方法可以代替痰涂片检测所有疑似肺结核患者。目前， Gene Xpert已经被世界上大多数国家接受，广泛应用在临床结核杆菌以及耐多 药的检测。这种方法自动化程度高、操作简单、交叉污染概率低，但是，不能 检测其他耐药的结核分枝杆菌，而且检测成本比较高，不适合资源匮乏的地区。

2016年，WHO开始推荐Xpert Ultra，GeneXpert Omni作为临床检测结核 分枝杆菌感染的新技术。Xpert Ultra是经过优化的Gene Xpert检测技术，检测 灵敏度比GeneXpert高；2017年，WHO补充到Xpert Ultra可以替代Gene Xpert 检测结核病；GeneXpertOmni是由Xpert MTB/RIF或Xpert Ultra改进而来， 检测所需要的仪器(每台仪器所需费用为5315美元)是由电池控制，每次只 检测一个样本，适合资源比较匮乏的地区。

基因测序技术也已经应用于结核杆菌的检测诊断之中，Chen采用Sanger 测序技术检测rpoB、KatG、InhA启动子、gyrA等结核杆菌耐药基因突变，以 确定菌株耐多药和广泛耐药性。检测结果显示，该技术对耐多药菌株的检出率 为84.31％，对广泛耐药性菌株的检出率为83.33％。Manson采用全基因测序， 随机检测233株结核杆菌，确定了其基因多样性、传播方式、耐药产生途径。

全基因测序检测结核分枝杆菌为一项新的技术，其检测利福平的灵敏度和 特异性分别为98％和98％，检测异烟肼灵敏度和特异性分别为97％和93％。 全基因测序检测其他一线抗结核药物，灵敏度和特异性差别比较大，主要原因 是缺少与链霉素，乙胺丁醇，吡嗪酰胺耐药分子机制和耐药相关基因的数据。 目前，全基因组测序还没有商品化试剂盒，实验室技术和数据分子也没有完全 标准化，还需要进一步的优化。

因此，急需可以快速、可靠地检测结核杆菌及其耐药性的新技术，而核酸 体外扩增技术的发展有望满足这一要求。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方法，该检测 方法能够实现快速、准确的确定结核分枝杆菌的耐药性，且使得检测方法成本 较低。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面提供一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方 法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将核酸探针与从待检测结合分枝杆菌中提取的结核分枝杆菌耐药相 关基因组分别添加至缓冲液中进行杂交处理，所述核酸探针包含与已知的结核 分枝杆菌耐药菌株的基因突变位点完全互补的核酸片段，且所述核酸探针能够 与所述待检测结核分枝杆菌耐药相关基因组形成杂交核酸双链；

(b)杂交处理后，向反应体系中添加单链核酸酶进行酶切反应、然后进 行灭活处理；

(c)对灭活处理后的产物进行核酸检测，并根据检测结果确定结核分枝 杆菌是否为耐药菌株。

本发明上述检测方法通过选择特异性的核酸探针和单链核酸酶，可以将非 目标的干扰核酸片段完全降解掉，获得待检测的目标片段，从而保证检测结果 的高度准确性；此外，本发明检测方法操作简单，而且操作步骤和作用条件比 较简单，且能够实现多样本同时检测。

进一步地，所述核酸探针为核苷酸单链，且核苷酸个数为10-30个。

进一步地，所述核酸探针由脱氧核苷酸、核苷酸和核苷酸衍生物中的任意 一种或多种构成。

进一步地，所述核苷酸衍生物包括锁核苷酸(locked nucleotide)、肽核苷 酸(peptide nucleotide)、硫代核酸(phosphorothioate nucleotide)、双脱氧核苷 酸(dideoxynucleotide)、2'-甲氧基核苷酸(2'-O-Methyl nucleotide)、2'-卤代核 苷酸(2'-hologenated nucleotide)。

进一步地，所述待检测结核分枝杆菌耐药菌株的基因突变位点选自rpoB、 KatG、inhA、embB和gyrA中的任意一种。

进一步地，所述单链核酸酶是能够降解核酸单链或杂交核酸双链中非双链 结构的核酸酶。

进一步地，所述非双链结构为不符合A:T、A:U和G:C标准碱基配对原 则的碱基对，或由于核苷酸插入或缺失形成的泡状结构或环状结构，或核酸双 链的单链切口，或核酸双链的单链缺口。

进一步地，所述单链核酸酶选自S1核酸酶(S1 Nuclease)、绿豆芽核酸酶 (MungBean Nuclease)、P1核酸酶(P1 Nuclease)、BAL 31核酸酶(BAL 31 Nuclease)、核糖核酸酶A(Ribonuclease A)、芹菜核酸酶(CEL I Nuclease) 中的任意一种或多种。

进一步地，所述灭活处理的温度为90-98℃。

在本发明中对核酸检测的方法不作严格限制，例如，可以选择本领域常规 的依赖于核酸扩增方法的检测技术或不依赖于核酸扩增方法的检测技术，具体 地，依赖于核酸扩增方法的检测技术包括基于热循环核酸扩增技术或基于恒温 核酸扩增技术，不依赖于核酸扩增方法的检测技术包括与免疫学相关的技术 (ELISA)或与纳米材料学(侧流层析试纸条)相关的技术；优选地，利用 RCA扩增反应对单链核酸酶处理过的酶切产物进行核酸检测，在该检测中， 被特异性探针保护的片段结合在RCA环形模板上，作为引物启动RCA反应，phi29DNA聚合酶催化RCA反应，产生冗长的单链DNA，荧光染料SBGR II 结合在DNA单链上产生荧光信号。

本发明通过选择本领域常规的等温扩增核酸检测方法，避免了使用价格昂 贵的高端仪器设备，甚至可以与裸眼可视化检测方法相结合，从而大大地降低 检测成本。

本发明实施例具有如下优点：

本发明检测方法通过选择特异性的核酸探针和单链核酸酶，可以将非目标 的干扰核酸片段完全降解掉，获得待检测的目标片段，从而保证检测结果的高 度准确性；并通过选择本领域常规的等温扩增核酸检测方法结合，避免了使用 价格昂贵的高端仪器设备，甚至可以与裸眼可视化检测方法相结合，从而大大 地降低检测成本；此外，本发明检测方法操作简单，而且操作步骤和作用条件 比较简单，且能够实现多样本同时检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下 面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创 造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例采用RCA方法检测结核分枝杆菌耐药菌株的检测原 理图；

图2为本发明实施例中提供的本发明检测方法针对不同样品得到的RCA 荧光曲线。

图中：①特异性核酸探针；②待检测的核酸片段；③特异性核酸探针与目 标片段形成的完全互补的杂交体系；④特异性核酸探针与非目标片段形成的含 有非完全互补的杂交体系；⑤单链核酸酶；⑥特异性核酸探针和目标片段形成 的完全互补杂交双链；⑦特异性探针和非目标片段形成的非完全互补杂交双链 被单链核酸酶完全水解成为核苷酸单体；⑧RCA环形模板；⑨phi29 DNA聚 合酶；⑩荧光染料SYBR Green II。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由 本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的 实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。

实施例

结核分枝杆菌利福平耐药主要是由rpoB基因单点突变所导致，其中531 位密码子突变是主要的突变位点；本实例利用高特异性检测试剂结合滚环扩增 技术(Rollingcircle amplification，RCA)确定临床样本中结核分枝杆菌的耐药 情况；

1.验证临床样本中的结核分枝杆菌利福平耐药相关基因

收集患者痰液64份，使用N-乙酰-L-半胱氨酸将其液化，加入增强液(结 核分枝杆菌核酸提取试剂自带)和DTT，混合均匀；利用结核分枝杆菌核酸 提取试剂(厦门致善生物科技股份有限公司)和核酸提取仪(Lad-Aid 824s、 厦门致善生物科技股份有限公司)提取结核分枝杆菌基因组。

对提取到的结核分枝杆菌基因组进行基因测序；测序用引物如下所示。

上游引物：5'-TGACCGAAGAAGACGTCGTG-3'；

下游引物：5'-CGGTCAGGTACACGATCTCG-3'；

利用BLAST在线软件，将基因测序结果与标准菌株核酸序列(Genbank， rpoBgene,gene ID:888164)进行同源性对比；测序结果表明，在64份临床样 本中，9株为非耐药菌株，55株为耐药菌株，其中22株耐药菌株基因特征为 rpoB基因531位密码子发生突变；保存9株非耐药菌株和基因特征为rpoB基 因531发生突变的22株耐药菌株，一共31份临床样本中提取的基因组样品用 于后续实验。

2.设计特异性检测核酸探针

针对利福平耐药的突变位点，利用在线软件 (http://www.tahepna.com/tool2.aspflag＝6)设计特异性探针；特异性探针与结 核分枝杆菌野生型菌株rpoB基因531位密码子TCG完全互补，具体序列为 5'-ACTGTCGGCGCT-3'。特异性探针完全由肽核苷酸(Peptide nucleic acid， PNA)组成；特异性探针由杭州泰禾生物技术有限公司合成，纯度为99％；利 用ddH2O稀释到工作浓度。

3.制备RCA环形单链模板

1)设计RCA单链模板：

单链模板中待检测的核酸序列与非耐药结核分枝杆菌序列完全互补；RCA 单链模板和splint sequence(SP)的核苷酸序列见表1；

表1 RCA单链模板和SP的核苷酸序列

表格中斜线粗线部分为待检测序列。

2)环化RCA单链模板：

利用T4 DNA连接酶将RCA单链模板环化，形成RCA环形模板；环化 体系：20μL，包含1×环化缓冲液(66mM Tris-HCl(ph7.6)，6.6mM MgCl2， 10mM DTT，0.1mM ATP)，体系中其他各成分如表2所示；

环化条件：16℃、2h；95℃、20min；

表2 RCA锁式探针环化体系(20μL)

3)纯化RCA环形模板：

利用核酸外切酶Ⅲ水解环化产物，得到高纯度的RCA环化模板；酶切体 系：20μL，包括酶切反应缓冲液1×(50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM MgCl2，1mM DTT)，核酸外切酶Ⅲ200U，底物浓度250nM。酶切反应条 件：37℃、12h，95℃、20min。

4.利用RCA反应鉴定结核分枝杆菌利福平耐药菌株和非耐药菌株，具体 检测原理如图1所示：

①特异性探针与结核分枝杆菌利福平耐药基因杂交：利用结核分枝杆菌标 准菌株H37Rv作为参考菌株；将参考菌株和临床耐药菌株分别进行PCR反应， 获取待检测菌株利福平耐药决定区的片段；将提取/纯化的结核杆菌基因组与 特异性PNA探针进行杂交；杂交体系为100μL，PNA探针浓度为600nM， PCR产物为150nM；杂交条件为：95℃、10min；75℃、10min；55℃、10min； 35℃、10min；15℃、10min；

其中，PCR反应涉及到的引物为：

上游引物：5'-CCGCAGACGTTGATCAACAT-3'；

下游引物：5'-TACACCGACAGCGAGCC-3'；

PCR反应体系为50μL，包括PCR Mix 1×(Taq DNA聚合酶2.5U，dNTP s各0.8mM，Mg²⁺5mM)、上游引物200nM、下游引物200nM、结核分枝杆 菌基因组60-100ng；反应条件：95℃，5min、40个循环(95℃30s、60℃30s、 72℃30s)、72℃10min。

实验中使用Thermo Fisher Scientific公司的PCR纯化试剂盒对上述PCR 产物进行纯化；

②特异性探针的保护：酶切体系为20μL，体系中杂交产物浓度分别为150 nM，核酸外切酶CELⅠ为2μL；酶切条件：45℃20min，55℃50min；其 中CEL I酶切反应所涉及到的缓冲液浓度为1×22mM Tris-acetate pH 7.9；孵 育温度37℃，10mM醋酸镁，132mM醋酸钾，0.1％(v/v)Tween 20，1mM DTT。

③升温至90℃将核酸外切酶CELⅠ灭活；

④RCA检测：将步骤③中获取的灭火后的CEL I酶切产物进行RCA反应； RCA反应体系为100μL，CEL I酶切产物的体积分别为0.25μL；RCA反应体 系中各成分浓度如表3所示：1×phi29反应缓冲液组分分别为：33mM Tris-acetate pH 7.9在温度37℃条件下，10mM醋酸镁，66mM醋酸钾，0.1％ (v/v)Tween 20，1mM DTT；

实验中所有组分的添加均在4℃冰盒进行，所有组分混合均匀后移入96- 孔酶标板中；

利用酶标仪采集RCA反应的荧光信号；激发波长为480nm，发射波长为 530nm；反应温度为37℃，反应时间为1h；

表3 CELⅠ酶切产物RCA扩增体系

④检测结果：

利用上述方法对空白(空白对照未加入任何扩增引物)，阳性对照(合成 的核酸序列“AGCGCCGACAGT”，与非耐药结核分枝杆菌rpoB基因序列完 全互补)和阴性对照(合成的核酸序列“AGCGCCAACAGT”，与耐药结核分 枝杆菌rpoB基因序列完全互补)分别得到RCA荧光曲线，以及得到临床样本 中结核分枝杆菌耐药菌株和非耐药菌株的RCA荧光曲线；得到的荧光曲线如 图2所示；由图2可知，非耐药结核分枝杆菌能够扩增RCA，结核分枝杆菌 利福平耐药酶切片段没有扩增；

采用上述方法分别对上述31份临床样本进行实验验证，结果见表4；

表4临床分离菌株验证实验结果

实验结果处理依据按照如下表5及处理方法进行：

表5临床分离菌株验证实验结果归纳表

真实性指标

灵敏度(真阳性率)＝A/(A+C)×100％··············(1)

特异度(真阴性率)＝D/(B+D)×100％··············(2)

假阳性率＝B/(B+D)×100％··················(3)

假阴性率＝C/(A+C)×100％··················(4)

粗一致率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％··············(5)

调整一致率＝1/4{[A/(A+B)+A/(A+C)+D/(C+D)+D/(B+D)]×100％}··(6)

约登指数＝A/(A+C)+D/(B+D)–1·················(7)

预示值指标

阳性试验的预示值＝A/(A+B)×100％··············(8)

阴性试验的预示值＝D/(C+D)×100％··············(9)。

基于表4实验结果得到的真实性指标：灵敏度为100％、特异度为95.45％、 假阳性率为4.55％、假阴性率为0％、粗一致率为96.77％、调整一致率为96.365、 约登指数为95.45％。

基于表4实验结果得到的预测值指标：阳性试验的预示值为90％、阴性试 验的预示值为100％。

利用SPSS25.0软件对基因测序和本方法对临床样本的检测结果进行卡方 分析，比较两种方法的相关性；统计结果显示χ2＝26.632，p＜0.001；上述分 析数据说明了该方法具有较好的准确性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种结核分枝杆菌耐药菌株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将核酸探针与从待检测结合分枝杆菌中提取的结核分枝杆菌耐药相关基因组分别添加至缓冲液中进行杂交处理，所述核酸探针包含与已知的结核分枝杆菌耐药菌株的基因突变位点完全互补的核酸片段，且所述核酸探针能够与所述待检测结核分枝杆菌耐药相关基因组形成杂交核酸双链；

(b)杂交处理后，向反应体系中添加单链核酸酶进行酶切反应，然后进行灭活处理；

(c)对灭活处理后的产物进行核酸检测，并根据检测结果确定结核分枝杆菌是否为耐药菌株。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述核酸探针为核苷酸单链，且核苷酸个数为10-30个。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述核酸探针由脱氧核苷酸、核苷酸和核苷酸衍生物中的任意一种或多种构成。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述核苷酸衍生物包括锁核苷酸、肽核苷酸、硫代核苷酸、双脱氧核苷酸、2’-甲氧基核苷酸和2’-卤代核苷酸。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待检测结核分枝杆菌耐药菌株的基因突变位点选自rpoB、KatG、inhA、embB和gyrA中的任意一种。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述单链核酸酶是能够降解核酸单链或杂交核酸双链中非双链结构的核酸酶。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述非双链结构为不符合A:T、A:U和G:C标准碱基配对原则的碱基对，或由于核苷酸插入或缺失形成的泡状结构或环状结构，或核酸双链的单链切口，或核酸双链的单链缺口。

8.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，所述单链核酸酶选自S1核酸酶、绿豆芽核酸酶、P1核酸酶、BAL 31核酸酶、核糖核酸酶A和芹菜核酸酶中的任意一种或多种。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述灭活处理的温度为90-98℃。

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