CN106011306A - 检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及相关应用 - Google Patents

检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及相关应用，试剂盒中包含一组检测结核分枝杆菌耐药基因的探针，探针包括如SEQ ID No.1~SEQ ID No.136所示序列的任意一个或多个，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因；本发明应用多重实施荧光PCR技术，利用小沟结合物（MGB）和锁核酸（LNA）双重标记的荧光探针，实现了短时高效结核分枝杆菌耐药基因检测的目的，大大提高了临床耐药检测效率，为结核病防治提供了强有力的检测方法和工具。

Description

检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及相关应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及相关应用。
背景技术
结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WHO估计，全球有约20亿人感染结核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。雪上加霜的是，近今年全球耐药结核流行情况非常严峻，WHO在“2013年全球结核报告”指出每年多耐药结核(MDR-TB)新发病例约450000例并且有170000例将死于MDR-TB感染。最新的WHO/IUATLD统计：所有新发病例，10.2％的患者至少耐受一种抗结核药物，而MDR-TB为1.1％。
我国是世界上22个结核病高负担国家之一，同时也是MDR/XDR-TB高负担国家之一；每年新增100万结核病例，其中10万为MDR-TB，占了全球的四分之一。《2010年中国结核分歧杆菌流行病抽样调查统计》报道：我国结核分歧杆菌耐药率高达42.1％，多耐药率(MDR-TB)6.8％，更恐怖的是泛耐药率达到2.1％。结核分歧杆菌在我国肆虐，跟我国的实际国情：抗生素乱用、结核耐药的监控失衡和医疗水平息息相关。
随着对结核分枝杆菌耐药的研究，尽管其耐药机制比较复杂。相关基因突变成为化疗失败的主要原因。利福平耐药发生主要与rpoB基因81个碱基范围内突变相关，其中以511、513、516、526、531基因突变最为常见。约90％以上异烟肼耐药与katG、inhA和ahpC基因突变有关，其中的katG S315N/T、inhA-15C-T和ahpC-10C-T和-9G-A为主要耐药位点。embB基因306位密码子突变是乙胺丁醇产生耐药的主要分子机制。链霉素耐药产生主要是由于结核分枝杆菌核糖体S12蛋白编码基因rpsl突变所致，rpsl常见位点为43和88位密码子突变。喹诺酮类药物耐药突变位点主要为gyrA基因90和94位密码产生突变。耐卷曲霉素、阿米卡星和卡那霉素突变主要为16s rRNA基因突变，以1401和1402位点突变最为常见。
结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物药敏试验，但传统的在固体培养基上进行的药物敏感试验周期长、敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。因此，研发一种能够快速检测耐药基因多点突变的方法及相关的试剂盒对促进结核病的防治具有重大意义。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种能够快速检测耐药基因多点突变的方法及相关的探针和试剂盒。
本发明提供了一组检测结核分枝杆菌耐药基因的探针，包括如SEQ ID No.1～SEQID No.136所示序列的任意一个或多个，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。采用DNA小沟结合物MGB(CDPI3)和锁核酸同时标记探针。探针包括以下几部分：1)报告基团：位于DNA序列的5’-端，荧光基团可以是FAM、HEX、VIC、ROX、JOE的等报告基团中任何一种；2)探针DNA序列，与基因突变和基因多态性结合的序列，序列长度为8～18个bp；3)锁核酸(LNA)修饰：探针DNA序列上1～4个碱基采用锁核酸修饰，其目的是提高探针于模板的杂交温度；4)探针DNA序列3’-末端连接焠灭基团(NFQ)和小沟结合物MGB，这些基团可以为BHQ、DABCYL和MGB等。该探针组为如下表1中(1)～(136)中的所示序列探针中的至少一个(其中大写字母标记的表示为“LNA修饰”)：
表1探针序列表
表1续
表1续
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，每个探针序列均有若干碱基采用锁核酸修饰，探针3'-端还标记有小沟结合物MGB。
优选地，每个探针序列上有1-4个碱基采用锁核酸修饰。
优选地，每个探针3'-端标记有3个CDPI小沟结合物MGB。
上述任一所述的探针中，所述的rpoB基因为耐利福平耐药基因；所述katG基因、inhA基因和ahpC基因为耐异烟肼耐药基因；rpsl基因为耐链霉素基因；embB基因为耐乙胺丁醇基因；gyrA基因为耐喹诺酮类的基因；rrs为耐卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素基因。
rpoB基因突变为531TCG-TTG、526CAC-AAC、526CAC-TAC、526CAC-GAC、516GAC-AAC、516GAC-TAC和511CTG-CCG。
katG基因突变为：katG 315AGC-ACC和315AGC-AAC；inhA突变为-15C-T；ahpC突变为-10C-T和-9G-A突变。
rpsl基因突变为：43AAG-AGG和88AAG-AGG。Rrs突变为第1401位A-G、第1402位C-T和1484位G-T突变。
embB基因突变为：第306密码子ATG-ATA、ATG-ATT、ATG-ATC、ATG-GTG、ATG-CTG和ATG-TTG。
gyrA基因突变：位90GCG-GTG、94GAC-GGC、94GAC-CAC、94GAC-TAC和94GAC-GCC。
探针(1)～(42)位检测rpoB基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(2)～(9)中任一探针为检测rpoB基因531TCG-TTG突变荧光探针，(1)野生型探针。
探针(11)～(15)中任一探针为检测rpoB基因526CAC-AAC突变荧光探针，(10)野生型探针。
探针(16)～(22)中任一探针为检测rpoB基因526CAC-TAC突变荧光探针，(10)野生型探针。
探针(23)～(28)中任一探针为检测rpoB基因526CAC-GAC突变荧光探针，(10)野生型探针。
探针(30)～(32)中任一探针为检测rpoB基因516GAC-AAC突变荧光探针，(29)野生型探针。
探针(33)～(36)中任一探针为检测rpoB基因516GAC-AAC突变荧光探针，(29)野生型探针。
探针(38)～(42)中任一探针为检测rpoB基因511CTG-CCG突变荧光探针，(37)野生型探针。
探针(43)～(49)位检测katG基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(44)～(45)中任一探针为检测katG基因315AGC-ACC突变荧光探针，(43)野生型探针。
探针(46)～(47)中任一探针为检测katG基因315AGC-AAC突变荧光探针，(43)野生型探针。
探针(50)～(56)位检测inhA基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。探针(51)～(56)中任一探针为检inhA基因-15C-T突变荧光探针，(50)野生型探针。
探针(57)～(65)位检测ahpC基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(58)～(61)中任一探针为检测ahpC基因-10C-T突变荧光探针，(57)野生型探针。
探针(62)～(65)中任一探针为检测ahpC基因-9G-A突变荧光探针，(57)野生型探针。
探针(66)～(87)位检测embB基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(67)～(71)中任一探针为检测embB基因306ATG-ATA突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(72)～(77)中任一探针为检测embB基因306ATG-ATT突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(78)～(83)中任一探针为检测embB基因306ATG-ATC突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(86)为检测embB基因306ATG-GTG突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(87)为检测embB基因306ATG-CTG突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(88)为检测embB基因306ATG-TTG突变荧光探针，(66)野生型探针。
探针(88)～(97)位检测rpsl基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(89)～(92)中任一探针为检测rpsl基因43AAG-AGG突变荧光探针，(88)野生型探针。
探针(94)～(97)中任一探针为检测rpsl基因88AAG-AGG突变荧光探针，(93)野生型探针。
探针(98)～(114)位检测rrs基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(99)～(104)中任一探针为检测rrs基因1401A-G突变荧光探针，(98)野生型探针。
探针(105)～(109)中任一探针为检测rrs基因1401A-G突变荧光探针，(98)野生型探针。
探针(111)～(114)中任一探针为检测rrs基因1401A-G突变荧光探针，(110)野生型探针。
探针(115)～(136)位检测gyrA基因突变探针，探针为MGB和LNA双重标记的荧光探针。
探针(116)～(120)中任一探针为检测gyrA基因90GCG-GTG突变荧光探针，(115)野生型探针。
探针(122)～(126)中任一探针为检测gyrA基因94GAC-GGC突变荧光探针，(121)野生型探针。
探针(127)～(129)中任一探针为检测gyrA基因90GAC-CAC突变荧光探针，(121)野生型探针。
探针(130)～(132)中任一探针为检测gyrA基因90GAC-TAC突变荧光探针，(121)野生型探针。
探针(133)～(136)中任一探针为检测gyrA基因90GAC-GCC突变荧光探针，(121)野生型探针。
另一方面，本发明还提供一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒，试剂盒包括上述的探针，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
试剂盒还包括如下所示的引物对：
如SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示序列组成的引物对，为扩增rpoB基因片段的引物对；
如SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示序列组成的引物对，为扩增katG基因片段的引物对；
如SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示序列组成的引物对，为扩增inhA基因片段的引物对；
如SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示序列组成的引物对，为扩增ahpC基因片段的引物对；
如SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示序列组成的引物对，为扩增embB基因片段的引物对；
如SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示序列组成的引物对，为扩增rpsl基因片段的引物对；
如SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示序列组成的引物对，为扩增rrs基因片段的引物对；
如SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示序列组成的引物对，为扩增gyrA基因片段的引物对。
具体序列如下表2所示：
表2引物序列表
本发明还提供了一种检测样品中结核分枝杆菌耐药突变的方法，包括如下步骤：
步骤一，荧光PCR体系的建立：
1)实时荧光PCR反应体系1：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(137-138)为引物扩增样本中结核分枝杆菌rpoB片段；探针(1)或探针(29)为野生型探针；探针(2)～(9)中选择任一条检测rpob 531；探针(11)～(15)、探针(16)～(22)和探针(22)～(28)中分别任选一条检测rpoB 516突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
2)实时荧光PCR反应体系2：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(137-138)为引物扩增样本中结核分枝杆菌rpoB片段；探针(10)或探针(37)为野生型探针；探针(38)～(42)中选择任一条检测rpob 511突变；探针(30)～(32)和探针(33)～(36)中分别任选一条检测rpoB 526突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
3)实时荧光PCR反应体系3：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(139-140)为引物扩增样本中结核分枝杆菌katG片段；探针(43)为野生型探针；探针(44)～(45)中选择任一条检测katG 315 AGC-ACC突变；探针(46)～(49)任选一条检测katG 315AGC-AAC突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
4)实时荧光PCR反应体系4：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(141-144)为引物扩增样本中结核分枝杆菌inhA和ahpC基因片段；探针(50)或探针(57)为野生型探针；探针(51)～(56)中选择任一条检测inhA-15C-T突变；探针(58)～(61)和探针(62)～(65)中分别任选一条检测ahpC-10C-T和-9G-A突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
5)实时荧光PCR反应体系5：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(145-146)为引物扩增样本中结核分枝杆菌embB片段；探针(66)为野生型探针；探针(67)～(71)中选择任一条检测embB 306ATG-ATA突变；探针(72)～(77)和探针(78)～(83)中分别任选一条检测embB 306ATG-ATT和ATG-ATC突变；探针(85)、(86)和(87)分别检测embB 306ATG-GTG、ATG-CTG和ATG-TTG。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
6)实时荧光PCR反应体系6：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(147-148)为引物扩增样本中结核分枝杆菌rpsl片段；探针(88)或探针(93)为野生型探针；探针(89)～(92)中选择任一条检测rpsl 43AAG-AGG突变；探针(94)～(97)任选一条检测检测rpsl88AAG-AGG突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
7)实时荧光PCR反应体系7：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(149-150)为引物扩增样本中结核分枝杆菌rrs片段；探针(98)、或探针(105)、或探针(110)为野生型探针；探针(99)～(105)中选择任一条检测rrs 1401A-G突变；探针(106)～(109)中任选一条检测rrs基因1402C-T突变；探针(110)～(114)中任选一条检测rrs1484G-T突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
8)实时荧光PCR反应体系8：以样本中DNA为模板，以寡核苷酸序列(151-152)为引物扩增样本中结核分枝杆菌gyrA片段；探针(115)或探针(121)为野生型探针；探针(116)～(120)中选择任一条检测gyrA90 GCG-GTG突变；探针(122)～(126)、探针(127)～(129)、探针(130)～(132)和探针(133)～(136)中分别任选一条用于分别检测gyrA94 GAC-GGC、GAC-CAC、GAC-TAC和GAC-GCC突变。检测突变的探针采用5’-端荧光基因A标记，探针序列中有1～3个碱基采用锁核酸修饰，同时3’-团MGB修饰。野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰。
上述实时荧光PCR反应体系1检测rpoB基因531和516突变；
上述实时荧光PCR反应体系2检测rpoB基因526和511突变；
上述实时荧光PCR反应体系3检测katG基因315AGC-ACC和315AGC-AAC突变；
上述实时荧光PCR反应体系4检测inhA基因-15C-T，ahpC基因-10C-T和-9G-A突变；
上述实时荧光PCR反应体系5检测embB基因306突变；
上述实时荧光PCR反应体系6检测rpsl基因88和43突变；
上述实时荧光PCR反应体系7检测rrs基因1401、1402和1484突变；
上述实时荧光PCR反应体系8检测gyrA基因90和94突变；
步骤二，将实时荧光PCR反应体系1～8分别进行实施荧光PCR定量扩增，得到各个体系的扩增曲线，分别记为曲线1～曲线8。
步骤三，结果分析：
1)如果曲线1中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因531和/或516突变；
2)如果曲线2中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因526和/或511突变；
3)如果曲线3中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在katG基因315突变；
4)如果曲线4中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在inhA-15C-T或/和ahpC-10C-T和/或基ahpC-9G/A突变。
5)如果曲线5中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在embB306突变；
6)如果曲线6中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpsl基因43和/或88基因突变；
7)如果曲线7中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rrs1401或/和rrs1402或/和1484基因突变；
8)如果曲线8中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在gyrA90或/和94基因突变；
上述探针5’-端荧光基团A和B为常见染料FAM、JOE、VIC和HEX中的一种；3’-端为带有焠灭基团及小沟结合物(MGB)；所述探针序列上有1～3个碱基被锁核酸修饰。
荧光基团：
1)所述探针5’-端荧光基团A为常见荧光基团，具体为FAM；
2)所述探针3’-端带有焠灭基团及小沟结合物，具体可以为MGB基团；
3)所述探针序列中含有1～3个碱基采用锁核酸修饰；
荧光PCT体系：上述荧光PCR体系中，还包含实时荧光PCR缓冲液、dUTP、dTTP、dATP、dCTP、dGTP、Mg2+、Hotstart Taq DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基酶。
荧光PCR扩增程序为：50度2分钟；95度10分钟；95度25秒，58度60秒，共42循环；58度60秒为荧光采集步骤。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本发明应用多重实施荧光PCR技术，利用小沟结合物(MGB)和锁核酸(LNA)双重标记的荧光探针，实现了短时高效结核分枝杆菌耐药基因检测的目的，大大提高了临床耐药检测效率，为结核病防治提供了强有力的检测方法和工具。
附图说明
图1为实施例一中体系1中加入rpoB 531 TCG>TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突变DNA的FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图2为实施例一中体系2中加入rpoB 526 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/或511 CTG-CCG突变DNA的FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图3为实施例一中体系3中加入katG 315突变模板，FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图4为实施例一中体系4中加入inhA-15C-T或/和ahpC-10C-T和/或基ahpC-9G/A突变DNA的FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图5为实施例一中体系5中加入embB 306突变DNA的FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图6为实施例一中体系6中加入rpsl基因43和/或88基因突变DNA，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图7为实施例一中体系7中加入rrs1401或/和rrs1402或/和1484基因突变DNA，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
图8为实施例一中体系8中，gyrA 90或/和94基因突变，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一组检测结核分枝杆菌耐药基因的探针，包括如SEQ ID No.1～SEQID No.136所示序列的任意一个或多个，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。同时提供了相应的试剂盒，并提供了利用上述探针检测结核分枝杆菌是否发生耐药性突变的方法。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
1、材料：
材料名称 公司
Hotstart Taq polymerase 上海默礼生物医药科技有限公司
Mg2+ 上海默礼生物医药科技有限公司
PCR buffer 上海默礼生物医药科技有限公司
dUTP mix(dA、dG、dC、dU) 上海默礼生物医药科技有限公司
2、样品和标准品准备：
样本制备
接受来自临床的痰液样本，按照临床处理规范处理。加入痰液10倍体积的1mol/L氢氧化钠(v/v＝1:10)振摇液化30-60min，12 000r/min离心2min，富集沉淀(可多富集几次)，待用；向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，100℃煮10min；瞬时离心以去除管盖内壁的水珠；向管中加入20μl Proteinase K溶液，混匀。加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
标准品制备：上述突变标准品质粒由上海生工合成，将质粒梯度稀释备用。
探针和引物的设计和合成，探针设计参见下表3，引物设计参见表2。
表3探针设计
备注：探针序列中，大写碱基为LNA修饰的碱基。
探针合成和标记：针对rpoB、katG、inhA、ahpC、embB、rpsl、rrs和gyrA基因突变的探针，5’-端采用FAM标记，序列中有1～2个碱基采用锁核酸(LNA)修饰，3’-端采用带有非荧光焠灭基团的小沟结合物MGB标记。
3、荧光PCR检测结核分枝杆菌多耐药位点
1)扩增模板：含有上述基因突变的质粒，稀释至10000copies/ml备用。
2)各个荧光PCR检测体系：
荧光PCR检测体系1：探针(1)为野生型探针，5’-端标记VIC，探针序列第4、第六和第八个碱基LNA修饰，3’-MGB；探针(9)、(32)和(36)分别检测rpoB 531TCG>TTG、516GAC-AAC和GAC-TAC，探针序列都选用5’-FAM，序列中1～2个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(137)和(138)。
体系中加入模板含有rpoB 531 TCG>TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系2：探针(10)为野生型探针，探针(15)、(22)、(26)和(40)检测rpoB基因526CAC-AAC、CAC-TAC、CAC-GAC和511 CTG-CCG突变。探针(10)5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；探针(15)、(22)、(26)和(40)都选用5’-FAM，序列中1～2个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(137)和(138)。
体系中加入模板含有rpoB 516 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/或511CTG-CCG突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系3：探针(43)为野生型探针，探针(44)和(49)检测katG AGC-ACC和AGC-AAC突变。探针(43)5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；探针(44)和(49)都选用5’-FAM，序列中1个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(139)和(40)。
体系中加入模板含有katG AGC-ACC和/或AGC-AAC突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系4：探针(57)为野生型探针，探针(52)检测inhA-15C-T突变，探针(60)和(65)检测ahpC-10C-T和-9G-A。野生型探针5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；探针(52)、(65)和(60)都选用5’-FAM，序列中1～2个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(141)～(144)。
体系中加入模板含有inhA-15C-T和/或ahpC-10C-T和/或-9G-A突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系5：探针(84)为野生型探针，探针(69)、(77)、(78)、(87)、(85)和(86)检测embB306突变。野生型探针5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；检测突变探针都选用5’-FAM，序列中有1个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(145)和(146)。
体系中加入模板含有embB306突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系6：探针(88)为野生型探针，探针(89)和(98)检测rpsl43AAG-AGG和88AAG-AGG突变。野生型探针5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；检测突变探针都选用5’-FAM，序列中有1个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(147)和(148)。
体系中加入模板含有rpsl43AAG-AGG和/或88AAG-AGG突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系7：探针(98)为野生型探针，探针(99)、(107)和(11)检测rrs1401A-G、1402C-T和1484G-T突变。野生型探针5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；检测突变探针都选用5’-FAM，序列中有1个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(149)和(150)。
体系中加入模板含有rrs1401A-G和/或1402C-T和/或1484G-T突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
荧光PCR检测体系8：探针(121)为野生型探针，探针(118)、(124)、(129)、(132)和(135)检测gyrA90GCG-GTG、94GAC-GGC、CAC、TAC和GCC突变。野生型探针5’-3’端分别标记有5’-端标记VIC，探针序列中有碱基LNA修饰，3’-MGB；检测突变探针都选用5’-FAM，序列中有1个碱基LNA修饰，3’-末端MGB修饰；引物体系为(145)和(146)。
体系中加入模板含有gyrA90GCG-GTG和/或94GAC-GGC和/或CAC和/或TAC和/或GCC突变DNA。模板的浓度为10000copies/ml。
3)各反应体系中，引物和探针浓度为0.15mM。
4)PCR体系：10×MOLE Hotstart Taq DNA聚合酶Buffer 3μl，5×Enhance Buffer6μl，dUTP/dNTP mix终浓度为0.2mM，MOLE Hotstart Taq DNA聚合酶终浓度为0.05U/μl，UNG酶为0.001U/μl，模板5μl，剩余部分加水补足至30μl。
5)反应程序，与ABI 7500荧光PCR仪器上进行；程序为50度2分钟；95度10分钟；95度25秒，58度60秒，共42循环；58度60秒为荧光采集步骤。
6)结果判断标准：
体系1中加入rpoB 531 TCG>TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突变DNA，观察到FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因531和/或516突变；见图1。
体系2中，加入rpoB 516 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/或511 CTG-CCG突变DNA，观察到FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因526和/或511突变；见图2。
体系3中加入katG 315突变模板，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在katG基因315突变；见图3。
体系4中加入inhA-15C-T或/和ahpC-10C-T和/或基ahpC-9G/A突变DNA，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在inhA-15C-T或/和ahpC-10C-T和/或基ahpC-9G/A突变。见图4。
体系5中加入embB 306突变DNA，FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在embB 306突变；见图5。
体系6中，加入rpsl基因43和/或88基因突变DNA，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpsl基因43和/或88基因突变；见图6。
体系7中，加入rrs1401或/和rrs1402或/和1484基因突变DNA，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在rrs1401或/和rrs1402或/和1484基因突变；见图7。
体系8中，gyrA 90或/和94基因突变，有FAM荧光基团的“S”扩增曲线，且Ct值<42，则样品中存在gyrA 90或/和94基因突变。见图8。
上述实施例表明，应用本发明的方法可以快速检测结核分枝杆菌多个耐药位点。由此可见，本发明应用多重实施荧光PCR技术，利用小沟结合物(MGB)和锁核酸(LNA)双重标记的荧光探针，实现了短时高效结核分枝杆菌耐药基因检测的目的，大大提高了临床耐药检测效率，为结核病防治提供了强有力的检测方法和工具。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一组检测结核分枝杆菌耐药基因的探针，其特征在于，包括如SEQ ID No.1~SEQ IDNo.136所示序列的任意一个或多个，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，每个探针序列均有若干碱基采用锁核酸修饰，探针3'-端还标记有小沟结合物MGB。
3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，由如SEQ ID No.1~SEQ ID No.136所示序列的探针组成。
4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，每个探针序列上有1-4个碱基采用锁核酸修饰。
5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，每个探针3'-端标记有3个CDPI小沟结合物MGB。
6.一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5任意一项所述的探针，所述基因为rpoB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下所示的引物对：
如SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示序列组成的引物对；
如SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示序列组成的引物对。
8.一种检测结核分枝杆菌是否发生耐药性突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，荧光PCR体系的建立
实时荧光PCR反应体系1：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌rpoB片段；以SEQ ID No.1序列所示的探针或SEQ ID No.29序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.2~SEQ IDNo.9序列所示的探针中选择任一条检测rpoB 531；在如SEQ ID No.11~SEQ ID No.15、SEQID No.16~SEQ ID No.22以及SEQ ID No.23~SEQ ID No.28序列所示的探针中分别任选一条检测rpoB 516突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系2：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.137和SEQ ID No.138所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌rpoB片段；以SEQ ID No.10序列所示的探针或SEQ ID No.37序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.38~SEQ IDNo.42序列所示的探针中选择任一条检测rpoB 511突变；在如SEQ ID No.30~SEQ ID No.32和SEQ ID No.33~SEQ ID No.36 序列所示的探针中分别任选一条检测rpoB 526突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系3：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.139和SEQ ID No.140所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌katG片段；以SEQ ID No.43序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.44~SEQ ID No.45序列所示的探针中选择任一条检测katG 315 AGC-ACC突变；在如SEQ ID No.46~SEQ ID No.49序列所示的探针中任选一条检测katG 315 AGC-AAC突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系4：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.141和SEQ ID No.142所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌inhA基因片段；以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.143和SEQ ID No.144所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌ahpC基因片段；以SEQ ID No.50或SEQ ID No.57序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.51~SEQ ID No.56序列所示的探针中选择任一条检测inhA -15 C-T突变；在如SEQ ID No.58~SEQ ID No.61和SEQ ID No.62~SEQ ID No.65 序列所示的探针中分别任选一条检测ahpC -10C-T和-9G-A突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系5：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.145和SEQ ID No.146所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌embB基因片段；以SEQ IDNo.66序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.67~SEQ ID No.71序列所示的探针中选择任一条检测embB 306 ATG-ATA突变；在如SEQ ID No.72~SEQ ID No.77和SEQ IDNo.78~SEQ ID No.83 序列所示的探针中分别任选一条检测embB 306 ATG-ATT和ATG-ATC突变；利用如SEQ ID No.85、SEQ ID No.86和SEQ ID No.87序列所示的探针中分别检测embB 306 ATG-GTG、ATG-CTG和ATG-TTG；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系6：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.147和SEQ ID No.148所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌rpsl片段；以SEQ ID No.88或SEQ ID No.93序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.89~SEQ ID No.92序列所示的探针中任选一条检测rpsl 43AAG-AGG突变；在如SEQ ID No.94~SEQ ID No.97序列所示的探针中任选一条检测rpsl 88AAG-AGG突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系7：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.149和SEQ ID No.150所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌rrs基因片段；以SEQ IDNo.98、SEQ ID No.105或SEQ ID No.110序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.99~SEQ ID No.105序列所示的探针中任选一条检测rrs 1401A-G突变；在如SEQ ID No.106~SEQ ID No.109序列所示的探针中任选一条检测rrs基因1402C-T突变；在如SEQ ID No.110~SEQ ID No.114序列所示的探针中任选一条检测rrs基因1484G-T突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
实时荧光PCR反应体系8：以检测样本中DNA为模板，以SEQ ID No.151和SEQ ID No.152所示序列组成的引物对为引物扩增检测样本中结核分枝杆菌gyrA基因片段；以SEQ IDNo.115或SEQ ID No.121序列所示的探针为野生型探针；在如SEQ ID No.116~SEQ IDNo.120序列所示的探针中任选一条检测gyrA基因 90 GCG-GTG突变；在如SEQ ID No.122~SEQ ID No.126序列所示的探针中任选一条检测gyrA基因94 GAC-GGC突变；在如SEQ IDNo.127~SEQ ID No.129序列所示的探针中任选一条检测gyrA基因94 GAC-CAC突变；在如SEQ ID No.130~SEQ ID No.132序列所示的探针中任选一条检测gyrA基因94 GAC-TAC突变；在如SEQ ID No.133~SEQ ID No.136序列所示的探针中任选一条检测gyrA基因94 GAC-GCC突变；检测突变的探针采用5'-端荧光基因A标记，探针序列中有1~3个碱基采用锁核酸修饰，同时3'-团MGB修饰；野生型探针采用荧光基因B、LNA和MGB修饰；
步骤二，获得实时荧光PCR定量扩增曲线
将所述步骤一实时荧光PCR反应体系1~8分别进行实时荧光PCR定量扩增，得到各个体系的扩增曲线，分别为曲线1~曲线8；
步骤三，结果分析
如果曲线1中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因531和/或516突变；
如果曲线2中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpoB基因526和/或511突变；
如果曲线3中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在katG基因315突变；
如果曲线4中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在inhA-15C-T或/和ahpC-10C-T和/或基ahpC-9G/A突变；
如果曲线5中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在embB 306突变；
如果曲线6中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rpsl基因43和/或88基因突变；
如果曲线7中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在rrs1401或/和rrs1402或/和1484基因突变；
如果曲线8中有A荧光基团的荧光扩增“S”曲线，且Ct值<42，则样品中存在gyrA 90或/和94基因突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述探针5'-端荧光基团A和B为FAM、JOE、VIC和HEX中的一种。
10.利用如权利要求8或9所述的方法检测结核分枝杆菌是否发生耐药性突变在非诊断和治疗目领域的应用。
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