CN115992272A

CN115992272A - 用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物及一体式试剂盒

Info

Publication number: CN115992272A
Application number: CN202211264600.XA
Authority: CN
Inventors: 赵怀; 赵志敬; 华灿忠; 李青青; 楼鑫雨
Original assignee: Hangzhou Lifereal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Lifereal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2022-10-17
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2042-10-17
Also published as: CN115992272B

Abstract

本申请涉及一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物及一体式试剂盒。所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3~18所示；所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22~55所示。所述组合物采用巢式引物探针的设计，确保检测的准确性、灵敏度。包括所述组合物的一体式试剂盒配合其他检测试剂实现一次上样即可全封闭性同时提取、检测结核分枝杆菌及其多种耐药基因，且保证高特异性、高时效的目的，同时该试剂盒易保存。

Description

用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物及一体式试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物及一体式试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，是引起结核病的病原体。该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见，主要表现为低热、胸痛，乏力等全身性症状和咳嗽、有痰、咯血等呼吸道症状。结核病是一种古老的疾病，全球广泛分布，是细菌感染性疾病致死的首位原因。抗结核药物是抵抗结核病的重要武器。然而，由于抗结核治疗的不规范以及免疫抑制剂的滥用，使得耐药结核病频繁发生。

结核耐药性的确定成为解决该困境的首要条件，其检测方法主要有以下几种：(1)传统药敏试验：通过培养3-4周，获得足量的结核杆菌后进行多种药物测试，但周期长，且过程中易污染。(2)高通量测序法：需要对样本进行核酸提取，建库,测序等步骤，后续进行序列拼接等数据处理，对仪器设备的要求较高，测序成本大，检测时间长。(3)杂交检测法：采用PCR-反向斑点杂交检测结核分枝杆菌中的耐药基因突变情况，对样本进行核酸提取，PCR扩增后获得产物，再进行探针的杂交分析，需要进行额外的杂交，洗膜，显色等复杂操作，检测时间较长。(4)PCR检测法：常规的荧光PCR技术通量低，需增加检测产品种类才能满足多种耐药基因检测需求，对操作人员的技术要求较高。

综上，上述检测方法存在以下缺点：传统药敏试验，至少需要3-4周的培养来获得足够的结核杆菌来进行多种浓度的药物筛选，操作复杂且周期长，患者不能及时准确用药。测序法需要的仪器设备要求高，通常需要专业的测序公司服务，检测成本高，检测时间同样较长，数据分析对检测人员的技术要求门槛高。杂交检测法相较于常规的PCR操作外还需要进行额外的杂交，洗膜，显色等复杂操作，操作较复杂。荧光PCR法作为成熟的结核耐药基因检测技术，相较于上述方法具有早期诊断、灵敏高和特异性强等特点。

常规的核酸检测采用实时荧光PCR方法，操作技能要求严格，需经专业培训。结核杆菌样本核酸提取较为麻烦、耗时，根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4-5小时，而且绝大多数PCR检测试剂只有4通道，除去质控基因外仅能检测3个靶标，而这种情况下，仅能分析3个位点。而结核耐药性涉及多基因多位点检测，需要进行多管的荧光PCR检测。故而易操作的结核耐药性的多管多重基因检测在临床应用上也迫切需要。

基于微流控技术的实时荧光PCR即时检测(point-of-care testing,POCT)是目前国际基因检测的前端技术之一，将核酸提取与实时荧光基因检测通过微流控卡盒相结合，实现了样本到基因检测结果的全封闭自动输出，极大推动了POCT分子诊断领域的突破性发展。以美国Cepheid公司，罗氏公司，生物梅里埃公司为首的国际公司纷纷推出了分子POCT仪器和一体化荧光卡式试剂盒，已经开始在欧美分子检测市场快速占领市场。但其高成本限制了在经济欠发达地区的推广应用。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物，以及包括所述组合物的一体式试剂盒，所述一体式试剂盒为分子POCT的多管多重基因检测装置，其对同一样本进行核酸提取和预扩增后，预扩增产物分流至多个(如8个)腔室内进行多重扩增，进而对结核分枝杆菌及其多种耐药基进行检测，检测结果准确、高效且试剂盒易保存。

为此，本申请第一方面提供了一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物，所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；

其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物包括8组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因进行第一次PCR扩增的引物组；8组所述的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3～18所示；

所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物包括9组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组；9组所述的引物探针组中的引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22～55所示，且每条探针的5’端均修饰有荧光报告基团，3’端均修饰有荧光淬灭基团。

本申请中，所述用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物采用巢式引物探针的设计，确保检测的准确性、灵敏度。

本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。

本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。

在一些实施方式中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中还包括一组针对内标基因的引物组，所述针对内标基因的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～2所示。

在一些实施方式中，所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中还包括一组用于对内标基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组，其中的引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19～21所示，且探针的5’端均修饰有荧光报告基团，3’端均修饰有荧光淬灭基团。

本申请中，通过设置内标基因可以监测采样情况以及监测全流程的检测过程，以确保检测过程的准确性。本申请中，所选用的内参基因为RnaseP。

在一些具体实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX和Cy5中的任意一种；所述荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1和BHQ2中的任意一种。

本申请中，所述组合物用于检测的结核分枝杆菌的基因为IS6110基因片段和IS1081基因片段，用于检测的6种耐药基因分别为rpoB基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rspL基因和gyrA基因。

本申请中，上述的6中耐药基因分别为针对利福平(rifampicin，RFP)、异烟肼(Isoniazid，INH)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)、链霉素(Streptomycin，STM)、莫西沙星(moxifloxacin，MFX)和左氧氟沙星(levofloxacin，LFX)的耐药基因突变，具体如下：

本申请所述组合物能够对上述结核分枝杆菌的IS6110基因片段和IS1081基因片段，以及结核分枝杆菌的耐药基因rpoB基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rspL基因和gyrA基因进行多管多重检测；具体地，所述组合物中用于第一次PCR扩增的引物组合物具体包括如下引物序列：

针对内标基因(RNaseP)的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列分别如如SEQ IDNO:1-2所示；

针对IS6110基因片段的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示；

针对IS1081基因片段的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示；

针对rpoB基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示；

针对katG基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9-10所示；

针对inhA基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-12所示；

针对embB基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13-14所示；

针对rspL基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15-16所示；

针对gyrA基因的引物组中的上、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17-18所示；

本申请中，由于耐药基因rpoB基因上需要检测3耐药突变位点，因此针对耐药基因rpoB基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增时设计了两组引物探针组，分别用于扩增耐药基因rpoB1基因和耐药基因rpoB2基因；因此所述组合物中用于第二次PCR扩增的引物探针组合物具体包括如下引物和探针序列：

针对内标基因(RNaseP)的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQID NO:19-21所示；

针对IS6110基因片段的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:22-24所示；

针对IS1081基因片段的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:25-27所示；

针对rpoB1基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:28-31所示；针对rpoB2基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:28-29和32-34所示；

针对katG基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35-38所示；

针对inhA基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:39-42所示；

针对embB基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:43-46所示；

针对rspL基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:47-50所示；

针对gyrA基因的引物探针组中上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:51-55所示。

本申请所述组合物的检测对象覆盖了结核分枝杆菌的IS6110基因片段和IS1081基因片段，以及结核分枝杆菌的耐药基因rpoB基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rspL基因和gyrA基因，覆盖范围广，可以为临床治疗的有效实施提供更为可靠的依据。

本申请第二方面提供了一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的一体式试剂盒，其包括如本申请第一方面所述的组合物。

本申请所提供的一体式试剂盒检测解决了核酸检测的技术门槛问题，只需要手工加样过程，而后的核酸提取检测均由机器完成，一方面省去了实验人员核酸提取的复杂操作，另一方面机器自动化使得多基因检验结果的可靠性大大提高。

在一些实施方式中，所述一体式试剂盒上用旋转柱塞封闭隔离的各腔室中分别存放有裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、第一次PCR试剂、稀释液、封闭剂和第二次PCR试剂；所述第一次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第一次PCR扩增的引物组合物(上述的9组引物组)，所述第二次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第二次PCR扩增的引物探针组合物(上述的10组引物探针组)。

在一些实施方式中，用于存放所述洗液1和洗液2的腔室分别为2～3个。在一些具体实施方式中，用于存放所述洗液1和洗液2的腔室分别为2个。

本申请中，通过上述能够对样本内释放的核酸中的杂质充分去除。

在一些实施方式中，用于存放所述第二次PCR试剂的腔室为5～8个，且所述9组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组被分配于不同腔室(如，管)内。

在一些具体实施方式中，用于存放所述第二次PCR试剂的腔室为8个，且所述9组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组被分配于上述8个腔室(如，管)内。同时，为了确保检测结果的准确性，上述8个腔室内还分别均包括一组针对内标基因的引物探针组。值得注意的是，为了能够对检测结果进行有效区分，同一腔室内所包含的多条探针上所标记的荧光基团互不相同。

在一些实施方式中，所述旋转柱塞上设置有多个不同的液体流道，每个液体流道分别在旋转柱塞旋转至不同角度下连通目的腔室。

本申请中，所述试剂盒盒体上也设置有不同的液体流道，旋转柱塞上的液体流道内凹形成与盒体上的流道对称匹配的通路，即两者共同形成移液通路。

本申请通过上述设置，可以通过旋转柱塞旋转将相应的液体驱动至目的腔室内。

在一些实施方式中，所述一体式试剂盒上设置有活塞，通过所述活塞的移动能驱动所述一体式试剂盒内的液体流动或在腔室内混合。

有关本申请中所述一体式试剂盒的具体结构可以参见申请人先前申请的专利CN114015567A-一种基于旋转柱塞的气动一体式PCR检测试剂盒及其检测方法。其中专利CN114015567A中的储液仓相当于本申请中的腔室，专利CN114015567A中的混合仓相当于本申请中的混合腔室，专利CN114015567A中的气压驱动模块相当于本申请中的活塞。

在一些实施方式中，所述裂解液中包括1～1000mM的乙酸-乙酸钠，0.1～10wt％的聚乙二醇8000，0.1～10M的异硫氰酸胍，0.1～10wt％的吐温-20和0.1～5wt％的月桂基硫酸钠；且所述裂解液的pH值为3.0～7.0。

在一些具体实施方式中，所述裂解液中包括100mM的乙酸-乙酸钠，1wt％的聚乙二醇8000，3.5M的异硫氰酸胍，5wt％的吐温-20和0.5wt％的月桂基硫酸钠；且所述裂解液的pH值为5.0。

本申请中，所述裂解液用于破坏样本中结核分枝杆菌的结构，进而充分释放出样本内的核酸，且具体采用上述配比裂解液的理解效果更优。同时本申请所述裂解液中不含蛋白酶K，使产品无需-20℃保存，因此更易于保存。

在一些实施方式中，所述洗液1和洗液2相同或不同，各自独立地包括1～500mM的Tris-HCl，10～500mM的NaCl，0.1～10wt％的聚乙二醇8000和0～10wt％的异丙醇；且所述洗液1和洗液2的pH值各自独立地为7.0～9.0。

在一些具体实施方式中，所述洗液1中包括100mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，2wt％的聚乙二醇8000和5wt％的异丙醇；且所述洗液1的pH值为8.0。

在一些具体实施方式中，所述洗液2中包括10mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，2wt％的聚乙二醇8000和5wt％的异丙醇；且所述洗液2的pH值为8.0。

本申请中，所述洗液中的醇类含量极低，运输安全且可起到消泡作用(活塞推动液体时产生的气泡)。

在一些实施方式中，所述洗脱液中包括0～20mM的Tris-HCl和0～50mM的MgCl₂，且所述洗脱液的pH值为8.0～9.5。

在一些具体实施方式中，所述洗脱液中包括10mM的Tris-HCl和5mM MgCl₂，且所述洗脱液的pH值为9.0。

本申请中，所述洗脱液用于用于将所述磁珠与核酸分离，进而将清洗纯化后的核酸释放。

在一些实施方式中，所述第一次PCR试剂中包括1～50mM的Tris-HCl，10～150mM的KCl，0.5～2.5wt％的海藻糖，0.01～0.2wt％的聚氧乙烯月桂醚(Bri-j23)，0.1～0.5wt％的防腐剂，200～300uM的dNTP，2～5U的Tth酶和所述引物组合物，且所述第一次PCR试剂中所述引物组合物中每条引物的含量为0.05～0.1uM；所述第一次PCR试剂的pH值为7.5～9.5。

在一些具体实施方式中，所述第一次PCR试剂中包括10mM的Tris-HCl，70mM的KCl，2.5wt％的海藻糖，0.01wt％的月桂醇聚氧乙烯醚，0.1wt％的Proclin-300(防腐剂)，200uM的dNTP，2U的Tth酶和所述引物组合物；且所述冻干试剂中所述引物组合物中每条引物的含量为0.05uM；所述第一次PCR试剂的pH值为8.5。

本申请中，所述Tth酶一种来源于嗜热菌Thermus thermophilus HB8的热稳定的DNA聚合酶，该酶同时具有反转录酶活性与聚合酶活性，能够用于一步法检测。

在一些实施方式中，所述第二次PCR试剂中包括1～50mM的Tris-HCl，10～150mM的KCl，0.5～2.5wt％的海藻糖，0.01～0.2wt％的聚氧乙烯月桂醚，0.1～0.5wt％的防腐剂，200～300uM的dNTP，2～5U的Tth酶和所述引物探针组合物；且所述冻干试剂中所述引物探针组合物中每条引物的含量为0.1～0.15uM，每条探针的含量为0.05～0.1uM；所述第二次PCR试剂的pH值为7.5～9.5。

在一些具体实施方式中，所述第二次PCR试剂中包括10mM的Tris-HCl，70mM的KCl，2.5wt％的海藻糖，0.01wt％的月桂醇聚氧乙烯醚，0.1wt％的Proclin-300(防腐剂)，200uM的dNTP，2U的Tth酶和所述引物探针组合物；且所述冻干试剂中所述引物探针组合物中每条引物的含量为0.1uM，每条探针的含量为0.05uM；所述第二次PCR试剂的pH值为8.5。

本申请中，用于存放第二次PCR试剂的不同腔室内所存放的第二次PCR试剂中除了相应的针对结核分枝杆菌及其耐药基因的引物探针组不同外，其他组成均完全相同。

本申请中，所述第一次PCR试剂和第二次PCR试剂均未添加MgCl₂，避免反应液的快速质变，因此本申请的一体式试剂盒可以在2～8℃保存。同时，本申请通过采用上述组成的第一次PCR试剂和第二次PCR试剂能够对样本中结核分枝杆菌及其耐药基因进行特异性有效扩增，检测结果准确可靠。

在一些实施方式中，所述稀释液中包括括0～20mM的Tris-HCl和0～50mM的MgCl₂，且所述稀释液的pH值为8.0～9.5。

在一些具体实施方式中，所述稀释液中包括10mM的Tris-HCl和5mM的MgCl₂，且所述稀释液的pH值为8.8。

本申请中，所述稀释液用于稀释第一次扩增产物，稀释后的第一次扩增产物分别流加至存放有第二次PCR试剂的不同腔室内。

本申请中的洗脱液和稀释液中均包括MgCl₂，因此MgCl₂可以不添加于第一次PCR试剂和第二次PCR试剂中，进而避免PCR试剂的快速质变。

在一些实施方式中，所述封闭剂的密度<1.0，粘度<20W CS。

本申请中，所述封闭剂存在于专门的腔室内，封闭剂用于封闭隔离，在第二次PCR反应的混合液(也即稀释后的第一次扩增产物)进入存放有第二次PCR试剂的不同腔室后，封闭剂将被填充到上述各腔室液体的上方，以使各腔室能相互独立反应。因此，所述封闭剂应具有良好化学稳定性，疏水性，且封闭剂的密度<1.0，粘度<20W CS。

在一些具体实施方式中，所述封闭剂为硅油。本申请中的所述封闭材料还可以是类似硅油，硅基物或其它高分子物质。

在一些实施方式中，利用所述一体式试剂盒对样本进行检测的过程如下：

样本与磁珠添加至混合腔室后，将裂解液驱动至所述混合腔室内进而释放出样本内的核酸并吸附至所述磁珠上；然后依次驱动洗液1、洗液2和洗脱液至所述混合腔室内完成磁珠上核酸的清洗和洗脱获得核酸模板；

所述核酸模板流动至存放有第一次PCR试剂的腔室内进行第一次PCR扩增获得第一次扩增产物，所述第一次扩增产物与稀释液混合后分别流动至到存放有第二次PCR试剂的多个不同腔室内，之后在所述存放有第二次PCR试剂的多个不同腔室内的液体上方流加封闭剂后进行第二次PCR扩增，获得扩增曲线；

对多个不同腔室内的所述扩增曲线进行分析，并作出判断。

本申请中，获得核酸模板的过程中，对磁珠上的核酸进行清洗和洗脱的过程中可以通过配套仪器的磁缸对磁珠进行固定和释放。另外，将不同液体(如裂解液、洗液1、洗液2和洗脱液)驱动至混合腔室内可以通过活塞推动力以及柱塞和卡盒上的移液通路来实现。

当IS6110基因片段或IS1081基因片段的扩增曲线呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤35，判为结核分枝杆菌。

耐药基因检测结果分析的前提是IS6110基因片段或IS1081基因片段的扩增曲线呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤30；在满足上述前提条件下，若相应耐药基因的野生型和突变型检测靶标的Ct差异≤4，则判定为耐药基因未突变，否则判定为耐药基因突变，即结核分枝杆菌中对相应药物具有耐受性。

本申请的一体式试剂盒结合巢式PCR检测方法及针对结核分枝杆菌及其耐药基因的特异性引物、探针，实现一次上样即可全封闭性同时提取、检测结核分枝杆菌及其多种耐药基因且保证高特异性、高时效的目的，克服了现有多重结核耐药基因检测技术操作复杂、时效性差、成本高的技术困境。

本申请的有益技术效果为：本申请所述用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物采用巢式引物探针的设计，确保检测的准确性、灵敏度。同时包括所述组合物的一体式试剂盒具有如下优势：1)采用全封闭式设计：1台全自动医用PCR分析仪(巢式)设备，少量实验室基础小设备就能完成复杂的核酸检测实验，微流控试剂盒自动化控制与多重抗污染结构设计采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭试剂盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室，大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求；2)极简操作：样本直接加入试剂盒内即可自动进行核酸提取，PCR扩增，荧光收集及数据分析，无需像常规核酸检测技术那样需要PCR实验室和专业技术人员进行核酸提取及手工PCR扩增体系的配制、提取核酸的加样、扩增基因的检测、荧光数据的分析和实验结果的判定；真正实现从样本到结果输出的自动化，帮助条件有限地区实现快速的核酸检测；以手工操作时间2-5分钟，上机70-90分钟出结果，核酸提取与扩增一体化技术设计及自动判断软件，真正实现从样本处理到结果报告的全自动化，大大降低了对检验人员专业技能的要求，适合于医院的辅助诊断；3)冷藏保存：2-8℃冷藏保存，无需常规的-20℃冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存；4)高通量检测：稳定检出多个靶标基因，便于比较和判断。

附图说明

图1为实施例2中采用的一体式试剂盒的外观图。

图2为实施例2中采用的一体式试剂盒背部示意图。

具体实施方式

为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1：组合物的设计

通过对结核分枝杆菌(IS6110基因片段和IS1081基因片段)及其耐药基因(rpoB基因、katG基因、inhA基因、embB基因、rspL基因和gyrA基因)进行分析和研究，设计了所述的组合物。其中组合物中用于第一次PCR扩增的引物组合物中各引物的核苷酸序列如表1所示，用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中各引物和探针的核苷酸序列如表2所示。

表1：用于第一次PCR扩增的引物组合物中各引物的核苷酸序列

表2：用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中各引物和探针的核苷酸序列

实施例2：一体式试剂盒的设计

本实施例中所采用的一体式试剂盒的外观如图1所示，其背面图如图2所示。该试剂盒的各腔室内所存放的试剂的组成如下：

裂解液：100mM乙酸-乙酸钠，1wt％聚乙二醇8000，3.5M异硫氰酸胍，5wt％吐温-20，0.5wt％月桂基硫酸钠，pH＝5.0；

洗液1：100mM Tris-HCl，100mM NaCl，2wt％聚乙二醇8000，5wt％异丙醇，pH＝8.0；

洗液2：10mM Tris-HCl，100mM NaCl，2wt％聚乙二醇8000，5wt％异丙醇，pH＝8.0；

洗脱液：10mM Tris-HCl，5mM MgCl₂，pH＝9.0；

第一次PCR试剂：10mM Tris-HCl(pH＝8.5)，70mM KCl，5mM MgCl₂，2.5％甘露醇，0.01％Bri-j23，0.1％Proclin-300，200uM dNTP，2U Tth酶，每条引物0.05uM(添加的引物见表1)；

第二次PCR试剂：10mM Tris-HCl(pH＝8.5)，70mM KCl，5mM MgCl₂，2.5％甘露醇，0.01％Bri-j35，0.1％Proclin-300，200uM dNTP，2U Tth酶，每条引物0.1uM，每条探针0.05uM(各管内添加的引物和探针见表2)；

稀释液：10mM Tris-HCl，5mM MgCl₂，pH8.8；

封闭剂：硅油

一体式试剂盒装配：将上述各试剂分装至图1所示的一体式试剂盒的各腔室内即可。

实施例3：一体式试剂盒的设计

试剂盒的各腔室内所存放的试剂的组成基本同实施例2，不同之处在于，第一次PCR试剂(冻干试剂)中每条引物的含量为0.1uM；第二次PCR试剂(冻干试剂)中每条引物的含量为0.15uM，每条探针0.1uM。

实施例4：一体式试剂盒的设计

试剂盒的各腔室内所存放的试剂的组成基本同实施例2，不同之处在于，第一次PCR试剂(冻干试剂)中每条引物的含量为0.03uM；第二次PCR试剂(冻干试剂)中每条引物的含量为0.05uM，每条探针0.03uM。

实施例5：样本采集、处理和检测痰液样本：吸取4mL 4％NaOH和1mL痰液样本并吹打混匀后室温放置30分钟，彻底液化后待用；

肺泡灌洗液样本：吸取4mL 4％NaOH和1mL痰液样本并吹打混匀后室温放置30分钟，彻底液化后待用；

拭子样本：在放置拭子的容器中添加1-2mL生理盐水或胍盐类类灭活保存液(如容器中已有则不用)，涡旋振荡1-2min充分混匀后取上清待测。

采用一体式试剂盒进行检测的流程：

1.检测前准备：

(1)仪器准备：请根据仪器手册的要求操作机器。打开全自动医用PCR分析仪(巢式)电源。仪器自检完毕后待用。

(2)程序确认：如果第一次使用此试剂盒时，请在仪器操作界面点击【新建实验】

[New Experiment]，界面转换后点击【扫描二维码】[Scan QR code]，扫描试剂盒外包装侧面的二维码，待程序新建成功后(如果仪器内已存有该程序，执行此步骤不会产生干扰)，退出此界面。部分仪器已经内置该程序，就不需要再新建程序，即不需要此步骤。

(3)试剂准备：取出检测所用的一体式试剂盒、磁珠，室温下复温。磁珠在使用前请充分振荡混匀。

2.样本检测：

(1)打开卡盒的盖子，再打开封口膜，加入200μL样本。再加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)，用移液器分吹打试剂混匀，后盖紧盖子。

(2)在主界面选择【快速运行】/Rapid Run。单击[检测名称]/[Detect Name]列的扫描图标。将检测卡上的条形码与仪器的扫描仪对齐，扫描条码以加载测试程序。然后单击样本信息列并输入样本信息。

(3)软件提示出现后，选择一个通道，将一体式试剂盒插入待运行的检测通道，按紧。

(4)点击仪器开始检测，软件显示运行界面。

3.数据分析：

检测完成后，数据出来后，在屏上选择【分析数据】/Analysis，仪器将直接对结果进行分析并自动判断待测样本的定性检测结果。

4.结果分析：

(1)检测程序运行结束后，适用仪器自动报告检测结果。

(2)结果显示靶标基因(FAM/HEX/ROX)、内部质控(Cy5)的检测结果。

(3)内标基因(Cy5)结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤35，判为检测合格。

(4)IS6110或IS1081结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤35，判为结核阳性。

(5)耐药基因检测结果分析的前提：IS6110或IS1081结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤30；相应耐药基因的野生型和突变型的检测靶标的Ct差异≤4，则判定为耐药基因未突变，否则判定为耐药基因突变。

实施例6：准确性验证

为验证本申请实施例2中所设计组装的一体式试剂盒针对结核分枝杆菌及其耐药基因检测的准确性，采用实施例2的一体式试剂盒和实施例3中的检测方法对20个耐药菌株样本质控品进行检测，来确认准确性。其中20个经药敏检测和测序鉴定的样本如表3所示，各样本的检测结果如表4所示。

表3

表4：样本检测结果

从表4可知，实施例2中的一体式试剂盒对上述20个样本进行检测，鉴定出9个结核耐药菌株，1个结核非耐药菌株，10个非结核菌株，符合预期，证明本申请一体式试剂盒的准确性和有效性。

实施例7

依次采用实施例3和4中提供的试剂盒对实施例8中的20个耐药菌株样本质控品进行检测，检测结果分别如表5和6所示。

表5：实施例3中试剂盒的样本检测结果

表6：实施例4中试剂盒的样本检测结果

从表5可知，采用实施例3中试剂盒对20个样本质控品进行检测时，引物探针浓度在最佳浓度基础上调高之后，CT值仅有略微减小，但检测成本增加明显。

从表6可知，采用实施例4中试剂盒对20个样本质控品进行检测时，引物探针浓度在最佳浓度基础上降低之后，样本2的抗性未检出，出现假阴性结果。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的组合物，其特征在于，所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；

其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物包括8组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因进行第一次PCR扩增的引物组；8组所述的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3~18所示；

所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物包括9组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组；9组所述的引物探针组中的引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22~55所示，且每条探针的5’端均修饰有荧光报告基团，3’端均修饰有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中还包括一组针对内标基因的引物组，所述针对内标基因的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~2所示；和/或

所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中还包括一组用于对内标基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组，其中的引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:19~21所示，且探针的5’端均修饰有荧光报告基团，3’端均修饰有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于检测的结核分枝杆菌的基因为IS6110基因片段和IS1081基因片段，用于检测的6种耐药基因分别为rpoB基因、katG基因、inhA 基因、embB基因、rspL基因和gyrA基因。

4.一种用于结核分枝杆菌及其耐药基因检测的一体式试剂盒，其包括如权利要求1-3中任意一项所述的组合物。

5.根据权利要求4所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述一体式试剂盒上用旋转柱塞封闭隔离的各腔室中分别存放有裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、第一次PCR试剂、稀释液、封闭剂和第二次PCR试剂；所述第一次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第一次PCR扩增的引物组合物，所述第二次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；优选地，用于存放所述洗液1和洗液2的腔室分别为2~3个；进一步优选地，用于存放所述第二次PCR试剂的腔室为5~8个，且所述9组分别用于对待检测的结核分枝杆菌及其6种耐药基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组被分配于不同腔室内。

6.根据权利要求5所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述旋转柱塞上设置有多个不同的液体流道，每个液体流道分别在旋转柱塞旋转至不同角度下连通目的腔室。

7.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述一体式试剂盒上设置有活塞，通过所述活塞的移动能促使所述一体式试剂盒内的液体流动或在腔室内混合。

8.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述裂解液中包括1~1000 mM的乙酸-乙酸钠，0.1~10wt%的聚乙二醇8000，0.1~10 M的异硫氰酸胍，0.1~10wt% 的吐温-20和0.1~5wt%的月桂基硫酸钠；且所述裂解液的pH值为3.0~7.0。

9.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述洗液1和洗液2相同或不同，各自独立地包括1~500mM的Tris-HCl，10~500mM的NaCl，0.1~10 wt% 的聚乙二醇8000和0~10wt%的异丙醇；且所述洗液1和洗液2的pH值各自独立地为7.0~9.0。

10.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中包括0~20mM的Tris-HCl和0~50mM的MgCl₂，且所述洗脱液的pH值为8.0~9.5；

所述稀释液中包括0~20mM的Tris-HCl和0~50mM的MgCl₂，且所述稀释液的pH值为8.0~9.5；

所述封闭剂的密度<1.0，粘度<20W CS；优选地，所述封闭剂为硅油。

11. 根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述第一次PCR试剂中包括1~50mM的Tris-HCl，10~150mM的KCl，0.5~2.5wt%的海藻糖，0.01~0.2wt%的聚氧乙烯月桂醚，0.1~0.5wt%的防腐剂，200~300uM的dNTP，2~5U 的Tth酶和所述引物组合物，且所述第一次PCR试剂中所述引物组合物中每条引物的含量为0.05~0.1 uM；所述第一次PCR试剂的pH值为7.5~9.5。

12. 根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述第二次PCR试剂中包括1~50mM的Tris-HCl，10~150mM的KCl，0.5~2.5wt%的海藻糖，0.01~0.2wt%的聚氧乙烯月桂醚，0.1~0.5wt%的防腐剂，200~300uM的dNTP，2~5U 的Tth酶和所述引物探针组合物，且所述第二次PCR试剂中所述引物探针组合物中每条引物的含量为0.1~0.15 uM，每条探针的含量为0.05~0.1 uM；所述第二次PCR试剂的pH值为7.5~9.5。

13.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，利用所述一体式试剂盒对样本进行检测的过程如下：

对多个不同腔室内的所述扩增曲线进行分析，并作出判断。