CN106967837A - 一种7q11.23缺失的检测方法 - Google Patents

一种7q11.23缺失的检测方法 Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明涉及一种基于限量dNTP竞争性PCR和HRM检测7q11.23缺失的方法，所述的方法以CFTR基因为参考基因，检测BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1基因拷贝数。本发明还提供该方法涉及的引物组合、试剂盒等。其优点表现在：可在同一个反应条件下进行，可在一个PCR仪上同时检测，从PCR扩增到HRM检测仅需79min，缩短了检测周期。PCR扩增后不需要进行开管操作，减少了操作步骤和可能出现的污染。本发明选择了合适的基因，设计了恰当的引物序列，PCR反应体系和程序设置合理。本发明的方法具有很高的准确率，在7q11.23微缺失检测及大规模人群筛查中具有极大优势。

Description

一种7q11.23缺失的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种7q11.23缺失的检测方法。
背景技术
Williams–Beuren综合征[OMIM 194050]是一种遗传性精神发育迟滞性疾病，在活产婴儿当中发病率为1/7500。Williams–Beuren综合征是由7号染色体长臂11.23(7q11.23)区域的基因微缺失引起的，缺失长度约为1.5Mb～1.8Mb。其中96％的患者ELN基因缺失。根据临床表现与特征，可对该综合征病人作初步诊断，而对7q11.23缺失片段的检测是该病确诊的重要依据。
最早用于7q11.23缺失片段检测的方法是荧光原位杂交法(FISH)，该方法试验周期短、效果直观可见，但需要良好的实验设备与技术。目前最常用的7q11.23缺失的分子诊断方法有针对全基因组的高通量检测法和用于检测特定CNV目标的核酸扩增法，不同方法的可靠性、操作难易度及经济性等指标均不尽相同。全基因组基因芯片和下一代测序技术是目前最常用的高通量检测方法，这些方法可以对全基因组的拷贝数变异情况进行检测，有利于发现新的变异情况，但较高的成本限制了其应用范围。qPCR、MLPA等核酸扩增检测法，可以针对疑似缺失的某一段基因序列设计探针和引物，适用于7q11.23缺失等常见的、经典的拷贝数变异疾病。
中国专利文献CN103207274A公开了一种胎儿7号染色体异常疾病的筛查试剂盒，它包括检测孕妇血清或尿液PLGF水平的试剂。中国专利文献CN106319079A公开了一种利用限量dNTP竞争性PCR结合HRM技术检测22q11.2拷贝数缺失的方法。但是关于本发明的7q11.23缺失的检测方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测7q11.23缺失的引物组合。
本发明的再一的目的是，提供一种检测7q11.23缺失的引物组合的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种检测7q11.23缺失的试剂盒
本发明的第四个目的是，提供一种检测7q11.23缺失的试剂盒的使用方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于HRM分析法检测7q11.23缺失的引物组合，其用于检测CFTR、BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1五个基因：CFTR的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CFTR的下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；BAZ1B的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，BAZ1B的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；CLIP2的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，CLIP2的下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；ELN的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，ELN的下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；LIMK1的上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，LIMK1的下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的引物组合在制备检测7q11.23缺失的试剂盒中的应用。
所述的引物组合在制备诊断Williams–Beuren综合征的试剂盒中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测7q11.23缺失的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒基于限量dNTP竞争性PCR和HRM检测7q11.23缺失，所述的试剂盒含有以CFTR基因为参考基因，检测BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1基因拷贝数的试剂。
所述的试剂盒中的引物分别为：CFTR的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，CFTR的下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；BAZ1B的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，BAZ1B的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；CLIP2的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，CLIP2的下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；ELN的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，ELN的下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；LIMK1的上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，LIMK1的下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。
所述的试剂盒包括镁离子、dNTP、Klentaq酶、LCgreen染料、参考基因引物对、目标基因引物对。
所述的试剂盒包括镁离子2mM，dNTP 6.25μM，Klentaq酶0.4U，LCgreen染料1μL，参考基因引物对0.25μM，目标基因引物对0.5μM。
所述的试剂盒包含操作说明书，所述的操作说明书记载有以下内容：PCR扩增体系：扩增反应体积为10μL，包括镁离子2mM，dNTP 6.25μM，Klentaq酶0.4U，LCgreen染料1μL，参考基因引物对0.25μM，任意一种目标基因引物对0.5μM，以及1μL基因组DNA样品；PCR扩增条件：95℃预变性5min，然后进行40个反应循环，每个循环包括95℃、10s的变性，和69℃、30s的退火延伸，扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行；HRM分析：PCR反应结束后，在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行65℃～90℃的缓慢程序升温，温度每上升0.3℃记录一次荧光信号，荧光信号随温度的变化即形成高分辨率熔解曲线。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：所述的使用方法包括以下步骤：先进行限量dNTP竞争性PCR反应，再进行HRM分析。
PCR反应的扩增条件为：95℃预变性5min，然后进行40个反应循环，每个循环包括95℃、10s的变性，和69℃、30s的退火延伸，扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行。
本发明优点在于：
1、本发明建立了一种基于限量dNTP竞争性PCR和HRM的7q11.23缺失检测方法。该方法通过分析端粒端、着丝粒端和中间共四个基因的拷贝数变异情况，判断该染色体区域的缺失情况。
2、本发明的方法针对四种目标基因的检测可以在同一个反应条件下进行，因此可以在一个PCR仪上同时检测，从PCR扩增到HRM检测仅需79min，缩短了检测周期。
3、由于在PCR过程中已加入荧光染料，因此PCR扩增后不需要进行开管操作，整个扩增和熔解过程都在闭管环境下，且可以在同一台仪器中进行，减少了操作步骤和可能出现的污染。
4、本发明的方法仅需要常规PCR组分和饱和荧光染料，不需要特殊的仪器和技术，大大缩减了生产和使用成本。
5、本发明选择了合适的基因，设计了恰当的引物序列，PCR反应体系和程序设置合理。采用本发明的方法与Affymetrix基因芯片的检测结果进行比对，证明该方法具有很高的准确率，在7q11.23微缺失检测及大规模人群筛查中具有极大优势。
附图说明
附图1是多重PCR反应产物的高分辨率熔解曲线负导数图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1检测方法
一、材料与仪器
Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪(qiagen)，Klentaq酶(Ab Peptides)，LCgreen荧光染料(BioFire Defense)，引物(上海生工生物)，Williams–Beuren综合征病人血液DNA提取样本(7q11.23长片段缺失)，健康人血液DNA提取样本(7q11.23未发生缺失)。
二、方法
1、引物设计：在7q11.23易发生缺失区域选择四个基因，分别位于该区域的近端粒端(BAZ1B)、近着丝粒端(CLIP2)和中间(ELN、LIMK1)。针对这四个基因为目标基因分别设计引物，使之能够特异性地扩增出58～88bp的扩增子。同时以7q11.23区域之外稳定的2拷贝基因CFTR作为对照基因设计引物，扩增子长度为54bp。所有引物的Tm值均在57.4～65.8℃之间，对照基因CFTR的扩增子Tm值与目标基因扩增子Tm值相差至少约8℃(表1)。
2、PCR扩增体系：扩增反应体积为10μL，包括镁离子2mM，dNTP 6.25μM，Klentaq酶0.4U，LCgreen染料1μL，参考基因引物对0.25μM，任意一种目标基因引物对0.5μM，以及1μL基因组DNA样品。
3、PCR扩增条件：针对所有目标基因的扩增采用相同的条件，95℃预变性5min，然后进行40个反应循环，每个循环包括95℃、10s的变性，和69℃、30s的退火延伸，扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行。
4、HRM分析：针对所有目标基因的HRM分析采用相同的条件，PCR反应结束后，在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行65℃～90℃的缓慢程序升温，温度每上升0.3℃记录一次荧光信号，荧光信号随温度的变化即形成高分辨率熔解曲线。以参考基因的熔解峰为标准对熔解曲线进行归一化处理，即可通过目标基因熔解峰的高度得出样本的拷贝数变异情况(图1)。
三、结果
本发明利用限量dNTP竞争性PCR和HRM建立了一种用于检测7q11.23染色体片段缺失的检测方法。本方法通过对7q11.23易缺失区域不同位置的四个基因：BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1的拷贝数情况进行分析，从而得到整个片段的拷贝数变异结果。在同一个体系中，由于参考基因扩增子与目标基因扩增子Tm值的差异，两种熔解曲线峰会分布在不同的温度区间。同时由于dNTP相对于引物是不足量的，PCR反应会将消耗掉所有dNTP。如果样本中的7q11.23片段发生缺失，即从2拷贝转变为1拷贝，同时进行的两个PCR反应对dNTP的竞争力就会发生变化，扩增产物的比例就会发生改变，从而造成熔解峰的高度和宽度发生变化。如图1，A、B、C、D分别为15个健康人DNA样本和15个Williams–Beuren综合征病人DNA样本BAZ1B、CLIP2、ELN、LIMK1四个基因的拷贝数变异分析结果。从图中可以看出，待测基因为2拷贝(曲线1)的样本和1拷贝(曲线2)的样本能够很明显的分开，分别对应健康人样本和病人样本。将本实验结果与Affymetrix基因芯片结果进行对照，准确率为100％。
表1
实施例2检测方法的验证
分别使用实施例1的检测方法、Affymetrix基因芯片同时对未知7q11.23是否缺失的血液DNA提取样本进行检测分析，并进行临床观察，结果进行对照，准确率100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120> 一种7q11.23缺失的检测方法
<130> /
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcacggtttt ccagttttcc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cactaagttc cactccctcc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctggcctg gtttggtct 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgagcttccc ggattgctg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acggagacct cttcacgcta c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctcaatgtg ctgctgcttc 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gggctggatt ccatgacctc ccc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggctctgcc gacccttctg tagc 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgccctccct tagacctcca 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctgaagccaa cagcatcctc tg 22

Claims (10)

1.一种用于HRM分析法检测7q11.23缺失的引物组合，其特征在于，其用于检测CFTR、BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1五个基因，
CFTR的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，
CFTR的下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；
BAZ1B的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，
BAZ1B的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；
CLIP2的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，
CLIP2的下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；
ELN的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，
ELN的下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；
LIMK1的上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，
LIMK1的下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合在制备检测7q11.23缺失的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述的引物组合在制备诊断Williams–Beuren综合征的试剂盒中的应用。
4.一种检测7q11.23缺失的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒基于限量dNTP竞争性PCR和HRM检测7q11.23缺失，所述的试剂盒含有以CFTR基因为参考基因，检测BAZ1B、CLIP2、ELN和LIMK1基因拷贝数的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中的引物分别为：
CFTR的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，
CFTR的下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；
BAZ1B的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，
BAZ1B的下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；
CLIP2的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，
CLIP2的下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示；
ELN的上游引物的序列如SEQ ID NO:7所示，
ELN的下游引物的序列如SEQ ID NO:8所示；
LIMK1的上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示，
LIMK1的下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括镁离子、dNTP、Klentaq酶、LCgreen染料、参考基因引物对、目标基因引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括镁离子2mM，dNTP6.25μM，Klentaq酶0.4U，LCgreen染料1μL，参考基因引物对0.25μM，目标基因引物对0.5μM。
8.根据权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含操作说明书，所述的操作说明书记载有以下内容：PCR扩增体系：扩增反应体积为10μL，包括镁离子2mM，dNTP 6.25μM，Klentaq酶0.4U，LCgreen染料1μL，参考基因引物对0.25μM，任意一种目标基因引物对0.5μM，以及1μL基因组DNA样品；PCR扩增条件：95℃预变性5min，然后进行40个反应循环，每个循环包括95℃、10s的变性，和69℃、30s的退火延伸，扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行；HRM分析：PCR反应结束后，在荧光定量PCR分析仪内对反应体系进行65℃～90℃的缓慢程序升温，温度每上升0.3℃记录一次荧光信号，荧光信号随温度的变化即形成高分辨率熔解曲线。
9.根据权利要求4-7任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的使用方法包括以下步骤：先进行限量dNTP竞争性PCR反应，再进行HRM分析。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，PCR反应的扩增条件为：95℃预变性5min，然后进行40个反应循环，每个循环包括95℃、10s的变性，和69℃、30s的退火延伸，扩增反应在荧光定量PCR分析仪内进行。
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