CN114657286B - 一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及检测方法，涉及生物检测技术领域。本发明可实现通过一次反应同时检测多种不同类型的呼吸道病原体，检测全面、效率高、特异性好、灵敏度高。本发明方法操作简便，克服了常规单重荧光PCR单孔单检的繁琐步骤，可应用于高通量病原体筛查，对呼吸道感染性疾病的临床诊断和防控具有重要的现实意义。

Description

一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道感染是致病性微生物侵入呼吸道并进行繁殖导致的疾病，是全球范围内的常见病和多发病，严重威胁着人类健康和生活质量，给人类造成了严重的疾病负担，特别是对于儿童的生命健康构成了极大的威胁。目前的研究表明呼吸道感染的临床症状包括发热、咳嗽、鼻塞、流鼻涕、咽喉肿痛、头痛、畏寒和疲劳等。有时还会出现继发性支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。不同呼吸道病原体感染所致的临床症状存在相似性，对于不同病原体的感染，其防控策略和治疗方法不尽相同。因此对于呼吸道病原体的早期快速诊断，对疾病的治疗、控制以及防预都具有重要的现实意义。
呼吸道病原体来源极为复杂，包括病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物，常见的有肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒、腺病毒、嗜肺军团菌、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型等，超过80％的病例由病毒感染引起，而重症及死亡病例则主要归因于细菌的感染。呼吸道病感染症状复杂、发病急骤，通过早期症状无法准确诊断疾病。因此，在感染早期，快速、准确的进行鉴别和诊断，是呼吸道感染防控的重点。
临床上呼吸道感染的检测和诊断，主要依靠流行病学资料、临床表现和实验室检查。由于不同呼吸道病原体感染症状非常类似，因此常规的分离培养法和免疫检测法等，由于耗时长、灵敏性不足以及对操作的器械、环境和操作人员技术能力的要求较高，很难在疾病发生的早期进行大规模的筛查诊断以及提供准确及时的信息，进而会影响行政及医疗部门对疾病流行的控制。
目前，对于呼吸道病原体的诊断，核酸检测诊断是最灵敏快捷的方法。目前应用于呼吸道病原体的检测方法有PCR、多重PCR、荧光PCR、多重荧光PCR、巢式PCR和生物芯片等。基于PCR反应的核酸诊断方法是目前最常用的试验方法。但是，对于不同的病原体，PCR检测需要不同的特异性引物，采用不同的反应体系和反应程序。因此如果要同时进行多重病原体的筛选则工作量巨大且耗时长久。高通量大样本的快速筛查成为了临床病原监测和诊断的趋势。
多重PCR是一种能够通过在同一PCR反应管中同时加上多重病原微生物的特异性引物，同时进行多种基因的检测的技术。但是由于多重PCR技术存在多重引物相互影响，可能降低检测的灵敏性和特异性。在应对多重病原体感染时，容易出现结果混淆，而且检测往往需要与电泳、测序、杂交等技术相联系才能获得较可信的结果，可能耗时更长，数据分析也比较复杂。目前市场上大多数的多重PCR检测，往往局限在某一种病毒或者遗传病的分型，而很少通用于新发突发传染病的诊断以及大规模的病原体筛查。
因此，提供一种具有广泛适用性的、通量高、特异性好、灵敏性强的大规模病原体的检测方法，可以帮助疾病控制人员了解疾病发生的情况以及早确定感染病原。对于呼吸道病原体的诊断，具有重要的现实意义。鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测12种呼吸道病原体的多重实时荧光PCR引物探针组合、试剂盒及检测方法。本发明可实现一次反应同时检测多种不同类型的呼吸道病原体，检测全面、效率高、特异性好、灵敏度高，解决了现有技术中单重荧光PCR需要单孔单检，步骤繁琐的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
在一个方面，本发明提供了一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合，包括：用于新型冠状病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；用于甲型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；用于乙型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；用于呼吸道合胞病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示；用于腺病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，探针序列如SEQ IDNo.15和SEQ ID No.16所示；用于副流感病毒1型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，探针序列如SEQ ID No.19所示；用于副流感病毒2型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示，探针序列如SEQ ID No.22所示；用于副流感病毒3型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示，探针序列如SEQ IDNo.25所示；用于嗜肺军团菌检测的上下游引物序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示，探针序列如SEQ ID No.28所示；用于肺炎支原体检测的上下游引物序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示，上下游探针序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；用于肺炎衣原体检测的上下游引物序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示，探针序列如SEQ ID No.35所示；用于肺炎链球菌检测的上下游引物序列如SEQ ID No.36和SEQ ID No.37所示，探针序列如SEQ ID No.38所示。
本发明提供了可同时检测12种呼吸道病原体的PCR引物和探针组合，可实现同时检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)和副流感病毒3型(PIV3)、嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)和肺炎链球菌(SP)。
在一个实施方案中，所述引物探针组合还包括用于扩增内参基因的上核糖核酸酶P(Ribonuclease P，RNase P)是人体各组织器官细胞中普遍存在的一种酶，对于人源性样本的RNA检测，RNase P可以作为内标使用，监测样本采集与实验过程的准确性。
在一个实施方案中，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX和CY5中的任一种，所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
在一个具体实施方案中，所述腺病毒的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述嗜肺军团菌的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述新型冠状病毒的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述甲型流感病毒的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述呼吸道合胞病毒的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒1型的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒2型的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒3型的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述肺炎支原体的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1，所述肺炎衣原体的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述肺炎链球菌的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述内标基因的探针的5’端标记有ROX，3’端标记有淬灭基团BHQ2。
在另一个方面，本发明提供了一种同时检测12种呼吸道病原体的试剂盒，包括前述的引物探针组合；优选地，所述试剂盒还包括病原体阳性标质控品、阴性质控品和荧光定量PCR检测试剂。
在一个实施方案中，所述病原体阳性质控品为含有12种呼吸道病原体检测靶标序列的质粒DNA，所述阴性质控品为含有人上皮细胞的细胞培养液。
在一个实施方案中，所述荧光定量PCR检测试剂还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、RNase free H2O。
在一个实施方案中，所述试剂盒中，各引物的浓度为50-100μmol/L；各探针的浓度为50-100μmol/L。
在一个实施方案中，所述试剂盒的检测样本为人咽拭子或者鼻拭子。
本发明的试剂盒在检测本发明所提及的12种呼吸道病原体中的应用，所述的应用不以疾病的诊断和/或治疗为目的。
在另一个方面，本发明提供了一种非疾病诊断目的的用于检测12种呼吸道病原体的荧光定量PCR方法，所述方法包括在荧光定量PCR扩增中使用前述述的引物探针组合或使用前述的试剂盒进行检测。
在一个实施方案中，本发明PCR反应为四管四重实时荧光PCR反应，具体地，新型冠状病毒、腺病毒、嗜肺军团菌和内标的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应，命名为组1；甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内标的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应，命名为组2；副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型和内标的引物和探针为一组在一个管内进行扩增反应，命名为组3；肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌和内标的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应，命名为组4。因每组中3种待测病原体与内参基因在一个体系中扩增，需要避免不同引物/探针之间互相产生影响、交叉反应等，防止出现假阳性；需要优化反应条件，保障反应体系内各个扩增反应共同扩增。各组反应经过验证，相互之间不发生交叉反应，其检测灵敏度高，特异性强。本发明还需考虑12种病原体的扩增条件要一致，因此设计引物和探针的难度就更大。此外，还需考虑每组中每种病原体探针的报告基团的荧光发射最大波长处于不同的光谱范围，以区分每种病原体的探针。在实际实验中，需根据反应的扩增曲线进行引物和探针浓度、反应程序的适当调整，直至扩增出最佳扩增曲线。
在一个实施方案中，PCR扩增反应的条件为：45-50℃20min，1个循环；95-98℃20min，1个循环；95-98℃15s，50-60℃30s，35-45个循环，在退火延伸阶段读取荧光。
在一个实施方案中，所述方法具体包括以下步骤：
(a)从样品中提取病原体RNA/DNA，作为模板，同时设置阴性对照、阳性对照；
(b)利用本发明上述引物和探针组合进行荧光定量PCR扩增(RT-qPCR)；
(c)收集荧光信号，选择荧光基团的荧光检测模式(荧光模式设为FAM/NONE、VIC/NONE、ROX/NONE和CY5/NONE四重标记模式)，基线调整取3-15个循环的荧光信号，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线；
(d)结果判定：阳性结果判定：待测样本扩增曲线呈典型S型曲线，且目标基因通道FAM或VIC或CY5的Ct≤40，判为阳性。实验灰区：如果目标基因通道扩增曲线有对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，应对样本进行重新提取后复检。若复检结果若有明显的对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，则判定结果为阳性；若无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，则判定结果为阴性。阴性结果判定：目的基因通道Ct＞40或扩增曲线无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，样本低于检测限，判定对应目标结果为阴性。
本发明检测方法实现一次采样，一次PCR分析同时检测12种病原体的目的，极大降低了检测的工作量和成本。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过设计获得12种呼吸道病原体实时荧光PCR检测引物和探针组合，结合了实时荧光定量PCR技术灵敏可靠的优势以及微阵列技术同时检测多种基因表达量的优势。
本发明经过优化的实时定量PCR体系，在相同的PCR反应条件下保证阵列内不同反应管内的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应差不多的灵敏度、特异性和可重复性。
本发明提供的多重实时荧光PCR阵列试剂盒可以检测出呼吸道病原体的最低浓度都可以达到500copies/mL，说明本发明提供的试剂盒具有非常好的灵敏度，可为灵敏、快速早期诊断呼吸道病原体感染提供可靠的实验证据。本发明的试剂盒在检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体和肺炎链球菌时，无假阳性反应。说明本发明提供的试剂盒具有非常好的特异性，可为早期诊断呼吸道病原体感染提供可靠的实验证据。
基于实时荧光PCR阵列方法，极大的提升了检测的灵敏性、稳定性以及检测的线性范围，尤其是封闭的反应以及实时检测不仅避免了操作误差、环境污染，还极大的减少了扩增后鉴定需要的测序、杂交、电泳等繁琐步骤。检测方法简单、省时省力、适用面广、使用方便，使一次PCR反应可以同时快速检出12种呼吸道病原体，以实现多重实时荧光PCR检测多种病原体的集成化和高通量。
本发明应用多重实时荧光PCR阵列进行呼吸道病原体感染诊断和确定感染源，有助于疾病控制部门了解疾病发生的情况，对呼吸道感染临床防控具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为组1体系特异性试验结果(其中，A曲线为腺病毒阳性结果；B曲线为嗜肺军团菌阳性结果；C曲线为新型冠状病毒阳性结果)；
图2为组2体系特异性试验结果(其中，A曲线为甲型流感病毒阳性结果；B曲线为呼吸道合胞病毒阳性结果；C曲线为乙型流感病毒阳性结果)；
图3为组3体系特异性试验结果(其中，A曲线为副流感病毒1阳性结果；B曲线为副流感病毒2型阳性结果；C曲线为副流感病毒3型阳性结果)；
图4为组4体系特异性试验结果(其中，A曲线为肺炎支原体型阳性结果；B曲线为肺炎衣原体阳性结果；C曲线为肺炎链球菌阳性结果)；
图5为组1中的腺病毒的重复性试验结果；
图6为组1中的嗜肺军团菌的重复性试验结果；
图7为组1中的内标的重复性试验结果；
图8为组1中的新型冠状病毒的重复性试验结果；
图9为组2中的甲型流感病毒的重复性试验结果；
图10为组2中的呼吸道合胞病毒的重复性试验结果；
图11为组2中的内标的重复性试验结果；
图12为组2中的乙型流感病毒的重复性试验结果；
图13为组3中的副流感病毒1型的重复性试验结果；
图14为组3中的副流感病毒2型的重复性试验结果；
图15为组3中的内标的重复性试验结果；
图16为组3中的副流感病毒3型的重复性试验结果；
图17为组4中的肺炎支原体的重复性试验结果；
图18为组4中的肺炎衣原体的重复性试验结果；
图19为组4中的内标的重复性试验结果；
图20为组4中的肺炎链球菌的重复性试验结果；
图21示出了对比例1中实时荧光PCR反应的重复性试验结果；
图22示出了对比例2中实时荧光PCR反应的重复性试验结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
1.标本和样品的准备：
构建含有靶序列的重组质粒作为呼吸道病原体检测的阳性质控品用于所建立体系的重复性验证；以新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌的真实样本用于特异性和检测限的验证；以含有人上皮细胞的细胞培养液作为阴性质控品，提取真实样本的DNA/RNA待用。
检测样品由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，鼻拭子、咽拭子。采集方法如下：①鼻拭子：用采样拭子沿下鼻道的底部向后缓缓深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周(如遇反射性咳嗽，应稍留片刻)，然后缓缓取出拭子，迅速将拭子放入采样管中(内含2～3mL采样液)，尾部弃去，旋紧管盖并密封，备用；②咽拭子：用采样拭子在咽后壁和双侧扁桃体适度用力擦拭来回擦拭至少3次，应避免触及舌部。采样后迅速将拭子放入采样管(内含2-3mL采样液)，尾部弃去，旋紧管盖并密封，备用。
样品DNA/RNA提取：样品DNA/RNA提取参照DNA/RNA共提取试剂盒(磁珠法)说明书进行。提取后的DNA/RNA可立刻进行检测或储存于-80℃冰箱用于后续检测。
2.引物和探针的设计：
从GenBank数据库中下载所选择的12种病原体的特异核酸序列，根据引物探针的设计原则，利用Primer Express 3.01和Oligo 6.0等生物学软件相结合设计引物和探针，并通过BLAST比对验证每对引物探针的特异性。内标引物探针参考美国疾病控制与预防中心设计。在探针序列5’端标记FAM或VIC或ROX或CY5作为荧光基团，在探针序列3’端标记BHQ1或BHQ2作为淬灭基团
3.引物和探针的筛选：
以“2.引物和探针的设计”步骤中设计的多组引物和探针分别检测阳性质控品与阴性参考品的质粒，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物和探针组合。
表1.引物和探针序列
Figure BDA0003582675470000071
Figure BDA0003582675470000081
4.引物和探针浓度的优化：
在反应体系中其他组分不变的情况下，采用方阵法优化引物、探针浓度。
5.反应体系的优化：
本发明采用PCR体系和一步法RT-PCR体系，根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：50℃逆转录20min，1个循环；95℃20min，1个循环；最后95℃15s，54℃30s，45个循环,在45个循环的退火阶段读取荧光。
6.反应体系建立：
Figure BDA0003582675470000082
Figure BDA0003582675470000091
Figure BDA0003582675470000092
试剂盒的待检样品是鼻拭子、咽拭子等标本。
结合优化的PCR反应条件和反应体系，试剂盒的结果判定如下：
(1)阳性结果判定：待测样本扩增曲线呈典型S型曲线，且目标基因通道FAM或VIC或CY5的Ct≤40，判为阳性。
(2)实验灰区：如果目标基因通道扩增曲线有对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，应对样本进行重新提取后复检。若复检结果若有明显的对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，则判定结果为阳性；若无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，则判定结果为阴性。
(3)阴性结果判定：目的基因通道Ct＞40或扩增曲线无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，样本低于检测限，判定对应目标结果为阴性。
本发明提供的多重实时荧光PCR阵列试剂盒可以检测出呼吸道病原体的最低检测限都可达500copies/mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。可为灵敏、快速早期诊断呼吸道病原体感染提供可靠的实验证据。
实施例2
一种同时检测12种呼吸道病原体的PCR阵列试剂盒，试剂盒由以下试剂成分组成：反应缓冲液、反应酶，SEQ ID No.1～SEQ ID No.41所示的引物和探针组合，RNase freeH2O，阳性质控品，阴性质控品。
另外，试剂盒中还包括96孔检测板和一份使用说明书。
试剂盒的具体使用方法如下：
96孔检测板的装配。先提前配制好反应体系，然后再平分加入八连管每孔中(方便加样和减少孔之间的误差)，-20℃备用。引物和探针混合液的成分如下：反应缓冲液、反应酶、引物、探针和RNase free H2O。
多重实时荧光PCR总反应体系：根据DNA/RNA提取试剂盒要求提取病原体核酸作为检测样品，每个样品按列加样同时进行12种病原体检测。加完样后，轻轻盖好八连管至完全闭合，离心混匀，放入ABI 7500Real Time PCR System进行扩增检测。上机设定程序，反应条件如下：50℃逆转录20min，1个循环；95℃3min，1个循环；最后95℃15s，54℃30s，45个循环，在45个循环的退火阶段读取荧光。
在每个循环退火延伸结束时收集荧光信号，荧光模式设为FAM/NONE、VIC/NONE、ROX/NONE和CY5/NONE四重标记模式。
结果分析：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
试剂盒的质量控制如下：
阴性对照：FAM、VIC、CY5通道结果均为阴性，无Ct值；ROX通道(内标)为阳性，且Ct值≤40。
阳性对照：FAM、VIC、CY5通道结果均为阳性，且Ct值≤40。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
结果判定如下：
(1)阳性结果判定：待测样本扩增曲线呈典型S型曲线，且目标基因通道FAM或VIC或CY5的Ct≤40，判为阳性。
(2)实验灰区：如果目标基因通道扩增曲线有对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，应对样本进行重新提取后复检。若复检结果若有明显的对数增长期，且40＜Ct≤45，内标对照Ct≤40，则判定结果为阳性；若无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，则判定结果为阴性。
(3)阴性结果判定：目的基因通道Ct＞40或扩增曲线无明显对数增长期，内标对照Ct≤40，样本低于检测限，判定对应目标结果为阴性。
实施例3.试剂盒的性能评价
3.1灵敏度试验：
分别以1000copies/mL，500copies/mL，250copies/mL和100copies/mL的新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体和肺炎链球菌的核酸为模板，并设阴性对照，按上述反应体系和反应条件进行多重实时荧光PCR反应，以95％的检出率确定为该方法的检测灵敏度。
表2. 12种呼吸道病原体检测方法检测限分析
Figure BDA0003582675470000111
Figure BDA0003582675470000121
结果表明(表2)：对于新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体和肺炎链球菌，本发明方法的检测灵敏度都能达到500copies/mL，其中腺病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体的检测能达到250copies/mL。
3.2特异性试验：
为了评价多重实时荧光PCR阵列检测的特异性，用建立好的多重实时荧光PCR体系，分别加入肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒、腺病毒、嗜肺军团菌、新型冠状病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的核酸模板，每块板均设阴性对照，以确定反应特异性。
表3. 12种呼吸道病原体的引物和探针特异性分析
Figure BDA0003582675470000122
注：N，阴性对照。
结果显示(表3)，各组体系除相对应的探针有阳性结果，其他样品及阴性对照检测结果为阴性，表明该方法建立的引物和探针具有良好的特异性。
图1-图4为各组体系特异性试验结果。
3.3重复性试验：
分别以104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL的腺病毒、嗜肺军团菌、新型冠状病毒、内标重组质粒标准品混合物为模板，104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL的甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒、内标重组质粒标准品混合物为模板，分别以104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL的副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、内标重组质粒标准品混合物为模板，104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL的肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、内标重组质粒标准品混合物为模板，利用本发明所建立的方法检测，每个浓度重复3次，进行组内重复性分析；选取3个不同时间，利用上述不同浓度的质粒标准品混合物为模板利用本发明所建立的方法检测，进行组间重复性分析，计算变异系数，分析该方法的重复性。同时设立阴性对照。
表4. 12种呼吸道病原体重复性验证
Figure BDA0003582675470000131
Figure BDA0003582675470000141
结果表明(表4)：不同浓度模板检测的组内和组间变异系数均小于3％，由此结果可知本发明有很好的重复性
图5-图20为各病原体的重复性试验结果。
对比例
在本发明的研究过程中，对使用的引物和探针进行了大量的筛选，本发明的探针和引物是从中选出的最优组合。
以下对比例提供了使用其他引物和探针组合进行四重实时荧光PCR反应的重复性试验结果。
对比例1
将肺炎支原体(肺支)、肺炎衣原体(肺衣)、肺炎链球菌(肺链)和内标的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应，与本发明其他条件相同，所加样本相同，唯一区别在于采用不同的探针和引物序列(具体序列未示出)。图21示出了实时荧光PCR反应的重复性试验结果。结果表明与本发明相比，对比例1试验重复性不好。
对比例2
副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型和内标的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应，与本发明其他条件相同，所加样本相同，唯一区别在于采用不同的探针和引物序列(具体序列未示出)。图22示出了实时荧光PCR反应的重复性试验结果。结果表明与本发明相比，对比例2试验重复性不好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合、试剂盒及检测方法
<130> PA22000838
<160> 41
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaagtgcaa gaagacgatt 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caatactttg aatagtagaa gtct 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caacatactg ttggtctaca agacg 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctactaaccg tggtcgaatc g 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtcatgtct attgccaatc cat 23
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctggctccc tctaagcgga ratcgc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcctctacta tctcttccac cg 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgatgctcat gaccaaaatg g 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaattctgg cagatgaaac taaggtg 27
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caaaatcaga tgtaagccgc tc 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgatttatat tgcatgctgt tcatt 25
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccatagaatg acacaatggc ttcctagaga 30
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcaccagtcc tcttacacgc acatc 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gccattggtg gtttctacca ctt 23
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgcaaagacc cccgctcatg tactccga 28
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctgagtcca ggtctgg 17
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agtttatgta aaaggctcaa ggtatt 26
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
catacatcaa tccctaacca agatg 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ttcaatccga atcctggg 18
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccatttacgt aagtgccgga a 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgtcgcatat tcttcaatt 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aatcgcataa gctgatcaga ca 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ccaaccgaaa ctaaacctct 20
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcttttatga gggattacta cttagaga 28
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctggatgccc aacaacatgc tgcaaatcac act 33
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gcttgcaaat gtcataagc 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccttaagcga ttgctacc 18
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctggaacgga tggcacatcg tta 23
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tggtcgtgca cggactaaca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ttccgaatat aggttaccac 20
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgacgtgaaa ggcatgttca atgcg 25
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
caagaaccca aacaccac 18
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggatgggctg ctgcaaacca 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtcgaccagt ctacatcgag taa 23
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tactgcggta gatcgaccta tccagggc 28
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
acgcaatcaa gcagtagaac ca 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
tcgagcgtaa caattccacc t 21
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tggcgaatac gcttaataca cggag 25
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
agattaggac ctgctagcg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gagcggcagt atccataagt 20
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
atctgacatg aaggctccgc gcg 23

Claims (10)

1.一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合，其特征在于，包括：
用于新型冠状病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
用于甲型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
用于乙型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
用于呼吸道合胞病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示；
用于腺病毒检测的上下游引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，探针序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示；
用于副流感病毒1型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，探针序列如SEQ ID No.19所示；
用于副流感病毒2型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示，探针序列如SEQ ID No.22所示；
用于副流感病毒3型检测的上下游引物序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示，探针序列如SEQ ID No.25所示；
用于嗜肺军团菌检测的上下游引物序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示，探针序列如SEQ ID No.28所示；
用于肺炎支原体检测的上下游引物序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示，上下游探针序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；
用于肺炎衣原体检测的上下游引物序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示，探针序列如SEQ ID No.35所示；
用于肺炎链球菌检测的上下游引物序列如SEQ ID No.36和SEQ ID No.37所示，探针序列如SEQ ID No.38所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括用于扩增内参基因的上下游引物和探针；所述扩增内参基因的上下游引物的序列如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示，探针序列如SEQ ID No.41所示。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX和CY5中的任一种，所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述腺病毒的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述嗜肺军团菌的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述新型冠状病毒的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述甲型流感病毒的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述呼吸道合胞病毒的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述乙型流感病毒的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒1型的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒2型的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述副流感病毒3型的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述肺炎支原体的探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1，所述肺炎衣原体的探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述肺炎链球菌的探针的5’端标记有CY5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述内参基因的探针的5’端标记有ROX，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
5.一种同时检测12种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合；所述试剂盒还包括病原体阳性质控品、阴性质控品和荧光定量PCR检测试剂；所述病原体阳性质控品为含有12种呼吸道病原体检测靶标序列的质粒DNA，所述阴性质控品为含有人上皮细胞的细胞培养液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测试剂还包括PCR反应缓冲液、反应酶、dNTPs、MgCl2、RNase free H2O。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物的浓度为50-100 μmol/L；各探针的浓度为50-100 μmol/L。
8.一种非疾病诊断目的的用于检测12种呼吸道病原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括在荧光定量PCR扩增中使用权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合或使用权利要求5-7中任一项所述的试剂盒进行检测。
9.根据权利要求8所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测方法为四管四重实时荧光PCR反应，其中，新型冠状病毒、腺病毒、嗜肺军团菌和内参基因的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应；甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和内参基因的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应；副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型和内参基因的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应；肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌和内参基因的引物和探针为一组，在一个管内进行扩增反应。
10.根据权利要求8或9所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，PCR扩增反应的条件为：45-50℃ 20 min，1个循环；95-98℃ 20 min，1个循环；95-98℃ 15 s，50-60℃ 30 s，35-45个循环，在退火延伸阶段读取荧光。
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《22种呼吸道病原体核酸多重联检试剂盒检测效能评估》;罗琴等;《疾病监测》;20210916;第37卷(第1期);第132-138页 *

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CN114657286A (zh) 2022-06-24

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