CN109355437A - 一种呼吸道病原体多重检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，基于多重PCR技术，采用荧光能量共振转移通过熔解温度范围判定检测结果，可用于定性同时检测16种呼吸道病原体，包括12种RNA病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒‑1/‑2/‑3型、冠状病毒OC43型、冠状病毒229E型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)以及2种细菌(肺炎支原体和百日咳鲍特菌)，具有检测灵敏度高，灵敏度甚至可高达1个拷贝/反应；特异性好，取样部位相同致病机理相似的非本试剂盒检测范围的病原体结果都为阴性；操作时间短且操作简单，结果清晰易判读等优点，可用于一个反应体系单管快速检测16种呼吸道病原体。
Description
技术领域
本发明涉及呼吸道病原体的检测试剂盒，具体涉及一种呼吸道病原体多重检测试剂盒。
背景技术
急性呼吸道感染是成年人和儿童中最普遍的感染性疾病。呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染包括流涕、结膜炎、咽炎、窦炎等症状。病毒和细菌都能引起急性上呼吸道感染，由于病原体种类繁多，给诊断带来巨大挑战。目前呼吸道病原体检测的主要方法包括：病原体分离培养法、免疫法和分子检测法等。
病原体分离培养是呼吸道病原体检测方法的金标准，特异性高，但是灵敏度低，培养条件要求高并且易出现假阴性。免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且往往不可用于疾病的早期诊断。
常用的呼吸道病原体分子检测手段有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。单重PCR是最早建立的PCR方法，只针对单个DNA模板进行检测，因此只能检测一种病原体，而目前市面上采用多重PCR方法的产品，目前仅能同时检测少数几种病原体，并且操作时间较长，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种灵敏度高、通量高、可靠性强、操作时间短且操作便捷的呼吸道病原体多重检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：本发明的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，用于检测十六种呼吸道病原体，包括扩增引物组、特异引物组和探针：
所述扩增引物组由以下引物组成，其中
用于扩增呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F1：5’-TCCCATAATATACAAGTATTATCTC-3’；
R1：5’-AACCCAGTGAATTTATGATTAGC-3’；
用于扩增腺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F2：5’-GACATGACCTTCGAGGTGGACCCCA-3’或
5’-GACATGACTTTTGAGGTGGATCCCA-3’；
R2：5’-TTATGTGGTGGCGTTGCCGGC-3’或
5’-TTACGTGGTAGCGTTACCGGC-3’；
用于扩增人偏肺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-CAAAGAGGCAAGAAAAACAAT-3’；
R3：5’-GCCTGGCTCTTCTGACTGTG-3’；
用于扩增呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F4：5’-TGTGGTATGCTATTAATCACTG-3’；
R4：5’-GGAGCCACTTCTCCCATCTC-3’；
用于扩增甲型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F5：5’-TCAGGCCCCCTCAAAGCC-3’；
R5：5’-GGCACGGTGAGCGTGAA-3’；
用于扩增乙型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F6：5’-ATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTG-3’；
R6：5’-GCATCTTTTGTTTTTTATCCATTC-3’；
用于扩增百日咳鲍特菌目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F7：5’-GGCATCAAGCACCGCTTTAC-3’；
R7：5’-CGGTGTTGGGAGTTCTG-3’；
用于扩增鼻病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F8：5’-GCCTGCGTGGCTGCC-3’；
R8：5’-CCTGCGTGGCGGCC-3’；
用于扩增肺炎支原体目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F9：5’-GCAGACGGTCGGGGAT-3’；
R9：5’-CGAACCAGGTGAGGT-3’；
用于扩增副流感病毒-1型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F10：5’-AGCCCTAGCAGACCTGAAG-3’；
R10：5’-ATAGGGGTCTGATGCCCAGT-3’；
用于扩增副流感病毒-2型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F11：5’-AGTTCCTCGTCCTGGAGTCA-3’；
R11：5’-TGATGCAGTTAGCAGGGC-3’；
用于扩增副流感病毒-3型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F12：5’-GCACAACTCATCCAACAGCC-3’；
R12：5’-GTCTTGGGCTTGGATTCGGA-3’；
用于扩增博卡病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F13：5’-CAAGCCTGACGTCTGCACT-3’；
R13：5’-CTAGCAGCGGAAGCCCAT-3’；
用于扩增冠状病毒OC43型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F14：5’-ATGTCGGTTTCGTTGAGGCT-3’；
R14：5’-GCAGTGGAGGCAACACTT-3’；
用于扩增冠状病毒229E型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F15：5’-CTGCAACCGTGTGACACTTG-3’；
R15：5’-TCGGCATGCCCTAAAACCAT-3’；
用于扩增甲型H1N1流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F16：5’-GGACAGTCAGTGGTTTCC-3’；
R16：5’-CCCATCCACTAACAGGGCAG-3’；
用于扩增内部质控品目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F17：5’-GCAATGCAAGGTCTCCT-3’；
R17：5’-GGAAGATCAATACATAAAG-3’；
所述特异引物组由以下引物组成，其中
用于使呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F1’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTC-3’；
R1’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATGCCTAATGGTCCGCTGGATGACAGAAGTTGATCTTTGTT-3’；
用于使腺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F2’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTGCACAGCCICACCGC-3’或
5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGAGTGCAICAGCCCICAICGC-3’；
R2’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACCAATCGCAATCGTGGCGCAGGTAIACGGIITCGATGACGCC-3’或
5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGCCCAATCGCAATCGTGGCGTGCGCAGGTAIACIGIITCGATGAIGCC-3’；
用于使人偏肺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F3’：5’-GTGGCAGGGCGCTACAAGTCAGAGGCCTTCAGCACCAG-3’；
R3’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGACCAGAAGTGAACGCATCTGCACCTACACATAATAAAATTATIGGTGTGT-3’；
用于使呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F4’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGTTAGGAAGGGAAGACACTATAAAGATACTT-3’；
R4’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGGAGAGTGGTCAGGATTGGCCCATTAGCTTTAACATGATATCCAGCATCTTT-3’；
用于使甲型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F5’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTTGAGGCTCTGATGGAITGGCT-3’；
R5’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACACGGCAGGTCCGGTATCAGTTGCTTCGGTATCAGTTGCTTCGAGGTGACAIGATTGGTCTTGTCTTT-3’；
用于使乙型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F6’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTCATTIACAGAAGATGGAGAAGGCA-3’；
R6’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGCTCGCCATCACACGTCTCGCTGTTGACCATCTCGACAGTGTAATTTTTCTGCTAGTTCTGCTT-3’；
用于使百日咳鲍特菌目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F7’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCGAACGCTTCATCCAGTCGG-3’；
R7’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGTAGTCAGGCACGCGTAAGCCCACTCACGCAAGG-3’；
用于使鼻病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F8’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCICGTGTGCTCIITITGAITCCTCCGG-3’；
R8’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATGTCCTTGGGTCCCTCTTGGGCTCCIIIGTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGG-3’；
用于使肺炎支原体目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F9’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGCCCCIATCGCCCTC-3’；
R9’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATTGCGTCAAGTTGCTTATCAATGTTGAGCGTAAGATGGACCAGGGCGAAGTACGITTCAAACGG-3’；
用于使副流感病毒-1型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F10’：5’-CAGGATGTGTTAGACTACCTTCATTATCAATTGGT-3’；
R10’：5’-GATGCAATATATGCGTATTCATCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGC-3’；
用于使副流感病毒-2型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F11’：5’-CAGGACTATGAAAACCATTTACCTAAGTGATGG-3’；
R11’：5’-AATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGTTGT-3’；
用于使副流感病毒-3型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F12’：5’-CCATCTGTTGGACCAGGGATATACTACAAA-3’；
R12’：5’-GGCAAAATAATATTTCTCGGGTATGGAGGTCTTGAACATCCAACCCAGTTGTGTTGCAG-3’；
用于使博卡病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F13’：5’-ACCTAAACGAATCTTGTAATAGGCACCTAICCAATTC-3’；
R13’：5’-CGCAATCAATATAAATTCTTAACAGTAAACAGTGCATTAACCATTCACTAC-3’；
用于使冠状病毒OC43型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F14’：5’-CCCAGAGACCTTGACCACAACTTTGGAAGT-3’；
R14’：5’-GCAGGTGTTGTGGCCAATGGTGTTAAAGCTAAAGGC TATC-3’；
用于使冠状病毒229E型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F15’：5’-CTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAA-3’；
R15’：5’-GCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTT TAAAAC-3’；
用于使甲型H1N1流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F16’：5’-CGAACCTTCAACTTTAACAGTCCTATATTCGACTTACGA-3’；
R16’：5’-TCAAGCTTACAATTAGCAGGCATCTTAGCCAGGACCTATTACGCACATTCATGC-3’；
用于使内部质控品目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F17’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTTTGAATGGCCGGCGTCTATTAG-3’；
R17’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGCAGCTTCTGGGAGAAGACCACGCAGCAAACTCCGGCATCTA-3’；
所述检测探针组包括以下检测探针，其中：
与呼吸道合胞病毒A型或副流感病毒-1型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P1：5’-GGACCATTAGGCATG-3’；
与腺病毒或副流感病毒-2型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P2：5’-CCACGATTGCGATTGG-3’；
与人偏肺病毒或副流感病毒-3型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P3：5’-AGATGCGTTCACTTCTGGTCTA-3’；
与呼吸道合胞病毒B型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P4：5’-GCCAATCCTGACCACTCTCCTAGT-3’；
与甲型流感病毒或博卡病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P5：5’-GAAGCAACTGATACCGGACCTGC-3’；
与乙型流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P6：5’-CGAGATGGTCAACAGCGAGACGTGCGATGGCGAGCTA-3’；
与冠状病毒OC43型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P7：5’-CCGCTAATCCACGTAACGACCTG-3’；
与百日咳鲍特菌探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P8：5’-CGTGCCTGACTACTAGT-3’；
与鼻病毒或冠状病毒229E型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P9：5’-CCAAGAGGACCCAAGGACA-3’；
与肺炎支原体探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P10：5’-GTCTTACGCTCAACATTGATAAGCAACTTGACGCAATG-3’；
与检测甲型H1N1流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P11：5’-GCTACCACTCAATTAGTATTACTACCT-3’；
与内部质控品探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P12：5’-TCACGAGCTACAGCAGGT-3’；
所述试剂盒的使用方法为：从待测样品中提取核酸为模板，利用所述扩增引物组中的所有引物，进行RT-PCR预扩增；
以上述RT-PCR预扩增产物为模板，利用所述特异引物组中的所有引物和所述检测探针组中的所有探针，通过以下PCR扩增程序进行实时荧光定量PCR：
阶段一：95℃预变性2分钟；94℃变性15秒、55℃退火15秒、72℃延伸15秒，该过程10个循环；阶段二：94℃变性15秒、50℃退火15秒、72℃延伸15秒，该过程23个循环；阶段三：95℃变性2分钟；40℃进行熔解准备90秒；设置1℃/s速度从40℃升温90℃实现熔解程序，在此过程中选用FAM、ROX和Cy5荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光信号并判定结果。
上述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括RT-PCR反应液、DNA聚合酶、内部质控品和阳性质控品。
上述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其中，所述内部质控品为噬菌体MS2，所述阳性质控品为含有所述十六种呼吸道病原体中任意四种病原体的目标DNA片段的核酸片段或质粒。
上述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括由FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素组成的颜色补偿试剂组，所述颜色补偿试剂组的使用方法为：分别使用FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素进行实时荧光定量PCR：95℃2分钟；40℃90秒；以1℃/s速度从40℃升温90℃，在此过程中选用与荧光素对应荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光并得到由FAM、ROX和Cy5组成的颜色补偿文件；
在进行样品结果分析时，选用所述颜色补偿文件进行颜色补偿，以去除结果判断时荧光信号间出现的荧光干扰。
综上所述，本发明呼吸道病原体多重检测试剂盒，基于多重PCR技术，采用荧光能量共振转移通过熔解温度范围判定检测结果，可用于定性检测16种呼吸道病原体，包括12种RNA病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒-1/-2/-3型、冠状病毒OC43型、冠状病毒229E型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)以及2种细菌(肺炎支原体和百日咳鲍特菌)，具有检测灵敏度高，灵敏度甚至可高达1个拷贝/反应；特异性好，取样部位相同致病机理相似的非本试剂盒检测范围的病原体结果都为阴性；操作时间短且操作简单，结果清晰易判读等优点，可用于一个反应体系单管快速检测16种呼吸道病原体。
附图说明
图1是实施例2中反应体系1在FAM通道检测出的阴性对照和扩增质控1的熔解曲线图；
图2是实施例2中反应体系2在FAM通道检测出的阴性对照和扩增质控2的熔解曲线图；
图3是实施例2中反应体系1和反应体系2在Cy5通道检测出的样本的熔解曲线图；
图4是实施例2中反应体系1和反应体系2在ROX通道检测出的样本的熔解曲线图；
图5是实施例7中颜色补偿文件关闭时，Cy5通道的熔解曲线；
图6是实施例7中颜色补偿文件开启时，Cy5通道的熔解曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所述试剂原料除非注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。
实施例1一种用于检测十六种呼吸道病原体的试剂盒
十六种呼吸道病原体包括12种RNA病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒-1/-2/-3型、冠状病毒OC43型、冠状病毒229E型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)以及2种细菌(肺炎支原体和百日咳鲍特菌)。
该试剂盒包括
(1)扩增引物组，包括下表所示引物，用于预扩增对应病原体目标DNA片段
(2)特异引物组，包括下表所示引物，用于使对应病原体的目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记
(3)检测探针组，包括下表所示检测探针，该检测探针能与对应病原体目标DNA片段所携带的探针检测序列特异性结合
(4)内部质控品：噬菌体MS2；
(5)阳性质控品：含有上述十六种呼吸道病原体中任意四种病原体的目标DNA片段的核酸片段或质粒。
实施例2一种检测十六种呼吸道病原体的方法
上述十六种呼吸道病原体包括12种RNA病毒(甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型H1N1流感病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒-1/-2/-3型、冠状病毒OC43型、冠状病毒229E型、鼻病毒和人偏肺病毒)，2种DNA病毒(腺病毒和博卡病毒)以及2种细菌(肺炎支原体和百日咳鲍特菌)。
使用的检测试剂盒为本发明实施例1所述的试剂盒。
待测样本：9个不同来源的、已知是否感染呼吸道病原体(在上述十六种呼吸道病原体之内)的样本组织，样本编号为1-9。
检测方法：
(1)样本处理：每200μl样本加5μl内部质控品，之后提取核酸；
(2)阴性对照：200μl保存液加5μl内部质控品，之后与样本进行同样的处理；
(3)RT-PCR预扩增反应：将扩增引物组与RT-PCR反应液(购自TIANGEN公司，货号为KT201)按1：1体积比混合均匀，按15μl/份分装到PCR反应管中；取10μl样本1-10的核酸、阴性对照和阳性质控品分别放入PCR管中，进行一步法RT-PCR反应，程序如下：
(4)按照下表设置荧光通道
| 检测通道 | 激发波长 | 检测波长 |
| FAM | 465nm | 510nm |
| ROX | 465nm | 610nm |
| Cy5 | 465nm | 660nm |
同一样本、阴性对照和阳性质控品的RT-PCR预扩增反应产物分别配制成最终体积均为25μl反应体系1和反应体系2：
反应体系1由5μlRT-PCR预扩增反应产物、最终浓度为1.0mM MgCl2、10mMTris-HClpH 8.5、40mM KCl的缓冲液组分、100μM的每种dNTP、1.05U DNA聚合酶、60nM的每个F1’-F9’和F17’引物、40nM的每个R1’-R9’和R17’引物和14个100nM P1-P5、P8-P10、P12以及P13检测探针组成；
反应体系2由5μl RT-PCR预扩增反应产物、最终浓度为1.0mM MgCl2、10mM Tris-HCl pH 8.5、40mM KCl的缓冲液组分、100μM的每种dNTP、1.05UDNA聚合酶、60nM的每个F10’-F17’引物、40nM的每个R10’-R17’引物和11个200nM P1-P3、P5、P7、P9、P11、P12以及P14检测探针组成。
将上述配制好的反应体系1和反应体系2放入实时荧光定量PCR，程序如下：
下表是十六种病原体对应的Tm值
实时荧光定量PCR的检测结果按照下表的规则进行判读：
其中：+表示存在特异性峰，-表示不存在特异性峰，+/-表示存在特异性峰或不存在特异性峰。
反应体系1的ROX和/或Cy5存在特异性峰，且反应体系2的ROX和/或Cy5存在特异性峰，比对上表判定其病原体阳性。
反应体系1的ROX和/或Cy5存在特异性峰，而反应体系2的ROX及Cy5无特异性峰，则查看反应体系2的FAM通道是否存在扩增质控2。存在扩增质控2，则比对上表判定其病原体阳性；否则，需重复该样本实验。
反应体系1的ROX及Cy5无特异性峰，而反应体系2的ROX和/或Cy5存在特异性峰，则查看反应体系1的FAM通道是否存在扩增质控1。存在扩增质控1，则比对上表判定其病原体阳性；否则需重复该样本实验。
反应体系1的ROX及Cy5与反应体系2的ROX及Cy5都无特异性峰，则判定FAM是否存在阴性对照、扩增质控1和扩增质控2。如果同时存在，表明样本为阴性；否则需重复该样本实验。
根据以上判读规则，从图1和图2可以得知，反应体系1和反应体系2在FAM通道同时出现了阴性对照和扩增质控的负峰，说明本次实验有效；
从图3中可以得知，Cy5通道检测结果显示：病原体从左至右出现的波峰依次是冠状病毒OC43、百日咳鲍特菌、鼻病毒、肺炎支原体和甲型H1N1流感病毒；
从图4中可以得知，ROX通道检测检索显示：病原体从左至右出现的波峰依次是呼吸道合胞病毒A型和甲型流感病毒混合病原体、腺病毒、副流感病毒-3型、乙型流感病毒。
综上，本次检测的结果为：1号样本为乙型流感病毒，2号样本为呼吸道合胞病毒A型和甲型流感病毒混合感染样本，3号样本为腺病毒，4号样本为冠状病毒OC43，5号样本为百日咳鲍特菌，6号样本为副流感病毒-3型，7号样本为鼻病毒，8号样本为肺炎支原体，9号样本为甲型H1N1流感病毒，检测出的病原体类型均与已知病原体相符。
整个检测过程为2.5个小时，与市面上采用多重PCR方法相比，由于市面上的检测试剂盒仅能检测4-5种病原体，若超出检测范围的话，则需换另一种试剂盒检测，所花的时间就要翻倍，而本发明一次能同时检测十六种病原体，从通量上来说，大大缩短了操作时间；检测结果清晰易判读，完全由软件判读，减少人为干扰的误差
实施例3一种检测十六种呼吸道病原体的方法
使用的检测试剂盒为本发明实施例1所述的试剂盒；
待测样品：分别保存在样本保存液中的十六种病原体全病毒或全细菌核酸，取其中一种，利用梯度稀释制成5个样品；
将上述5个样品，按照实施例2中的检测方法进行检测，并依次检测16种病原体，根据阳性率大于等于95％时判定为对应病原体的检出限，通过使用Bio-Rad公司的QX200TMDroplet Digital TMPCR获得的绝对拷贝数来计算检出限)，下表为所测试的十六种病原体的检出限：
| 病原体 | 拷贝数/ml | 拷贝数/反应 |
| 呼吸道合胞病毒A型 | 558 | 19 |
| 腺病毒 | 45 | 2 |
| 人偏肺病毒 | 400 | 13 |
| 呼吸道合胞病毒B型 | 34 | 1 |
| 甲型流感病毒 | 413 | 14 |
| 乙型流感病毒 | 160 | 5 |
| 百日咳鲍特菌 | 99 | 3 |
| 鼻病毒 | 205 | 7 |
| 肺炎支原体 | 678 | 23 |
| 副流感病毒-1型 | 323 | 11 |
| 副流感病毒-2型 | 360 | 12 |
| 副流感病毒-3型 | 837 | 28 |
| 博卡病毒 | 480 | 16 |
| 冠状病毒OC43型 | 349 | 12 |
| 冠状病毒229E型 | 266 | 9 |
| 甲型H1N1流感病毒 | 349 | 12 |
通过上表的检出限数值可见，本发明试剂盒的灵敏度非常高，灵敏度最高的病原体(呼吸道合胞病毒B型)甚至可高达一个反应仅需1个拷贝的检出限。。
实施例4一种检测十六种呼吸道病原体的方法
使用的检测试剂盒为本发明实施例1所述的试剂盒；
选择多种非本试剂盒所能检测的取样部位相同致病机理相似的病原体作为样品，涵盖病原体既有细菌也有病毒。按照实施例2中的检测方法进行检测，均没有检测出阳性信号，由此可见，本发明试剂盒的特异性较好。
实施例5一种检测十六种呼吸道病原体的方法
使用的检测试剂盒为本发明实施例1所述的试剂盒；
根据文献资料设计混合感染样本(模拟临床样本感染量设置高浓度和低浓度)如下表：
上述样品按照实施例2中的检测方法进行检测，得到的检测结果表明：采用本发明试剂盒可在上表病原体混合感染样本中同时准确检测出对应的不同浓度的两种混合感染的病原体，由此说明本发明试剂盒对临床的混合病原体感染样本具有与单重感染检出等同的检测能力。
实施例6一种检测十六种呼吸道病原体的方法
为了研究存在于鼻咽拭子中的或者可能在样本处理过程中引入的物质对于检测的干扰性，使用以下物质对本发明试剂盒进行测试：人类血液、人粘膜蛋白、人类基因组DNA、盐水喷鼻剂(含防腐剂)、鼻用皮肤类固醇、抗病毒药物、抗生素、抗菌药和样本保存液等，按照实施例2中的检测方法进行检测，均未发现上述干扰物质会对本试剂盒的检测结果产生影响。
实施例7一种检测十六种呼吸道病原体的方法
本发明试剂盒还包括由FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素组成的颜色补偿试剂组，颜色补偿试剂组的使用方法为：分别使用FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素进行实时荧光定量PCR：95℃2分钟；40℃90秒；以1℃/s速度从40℃升温90℃，在此过程中选用与荧光素对应荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光并得到由FAM、ROX和Cy5组成的颜色补偿文件；
在进行样品结果分析时，选用上述颜色补偿文件进行颜色补偿，以去除结果判断时荧光信号间出现的荧光干扰。
通过图5和图6的对比可以发现，颜色补偿文件的开启，对Cy5通道而言，可以有效去除ROX通道的熔解曲线对其的干扰。即如图5所示，ROX通道在74℃左右有熔解峰，如果没有颜色补偿文件，则在Cy5通道该熔解峰也会出现，造成假阳性峰，干扰结果的判断。通过颜色补偿文件可以快速去掉该种形式的假阳性干扰(如图6所示)，结果干净清晰明了，减少结果判读为了排除干扰进行的双通道切换操作，降低人为因素对结果的干扰，增加了检测结果的准确性。
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 一种呼吸道病原体多重检测试剂盒
<130> 180831JN
<160> 86
<170> PatentIn version 3.3
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gcaatgcaag gtctcct 17
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<213> 人工合成
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagacat gcctaatggt ccgctggatg acagaagttg 60
atctttgtt 69
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gtggcagggc gctacgtaca aggagtgcai cagcccicai cgc 43
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gatgacgcc 69
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<213> 人工合成
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iitcgatgai gcc 73
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<213> 人工合成
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagatag accagaagtg aacgcatctg cacctacaca 60
taataaaatt atiggtgtgt 80
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<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgtaca agggttagga agggaagaca ctataaagat actt 54
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagaact aggagagtgg tcaggattgg cccattagct 60
ttaacatgat atccagcatc ttt 83
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<212> DNA
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gtggcagggc gctacgtaca agcttgaggc tctgatggai tggct 45
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagacac ggcaggtccg gtatcagttg cttcggtatc 60
agttgcttcg aggtgacaig attggtcttg tcttt 95
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgtaca agtcattiac agaagatgga gaaggca 47
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<212> DNA
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagatag ctcgccatca cacgtctcgc tgttgaccat 60
ctcgacagtg taatttttct gctagttctg ctt 93
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gattagccgc attcagggg 79
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggacgcgcca gcaagatcca atctagacat tgcgtcaagt tgcttatcaa tgttgagcgt 60
aagatggacc agggcgaagt acgittcaaa cgg 93
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gatgcaatat atgcgtattc atcaaactta atcactcaag gatgtgc 47
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ccatctgttg gaccagggat atactacaaa 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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acctaaacga atcttgtaat aggcacctai ccaattc 37
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cccagagacc ttgaccacaa ctttggaagt 30
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taccgataat tcgata 16
Claims (4)
1.一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测十六种呼吸道病原体，包括扩增引物组、特异引物组和探针：
所述扩增引物组由以下引物组成，其中
用于扩增呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F1：5’-TCCCATAATATACAAGTATTATCTC-3’；
R1：5’-AACCCAGTGAATTTATGATTAGC-3’；
用于扩增腺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F2：5’-GACATGACCTTCGAGGTGGACCCCA-3’或
5’-GACATGACTTTTGAGGTGGATCCCA-3’；
R2：5’-TTATGTGGTGGCGTTGCCGGC-3’或
5’-TTACGTGGTAGCGTTACCGGC-3’；
用于扩增人偏肺病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-CAAAGAGGCAAGAAAAACAAT-3’；
R3：5’-GCCTGGCTCTTCTGACTGTG-3’；
用于扩增呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F4：5’-TGTGGTATGCTATTAATCACTG-3’；
R4：5’-GGAGCCACTTCTCCCATCTC-3’；
用于扩增甲型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F5：5’-TCAGGCCCCCTCAAAGCC-3’；
R5：5’-GGCACGGTGAGCGTGAA-3’；
用于扩增乙型流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F6：5’-ATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTG-3’；
R6：5’-GCATCTTTTGTTTTTTATCCATTC-3’；
用于扩增百日咳鲍特菌目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F7：5’-GGCATCAAGCACCGCTTTAC-3’；
R7：5’-CGGTGTTGGGAGTTCTG-3’；
用于扩增鼻病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F8：5’-GCCTGCGTGGCTGCC-3’；
R8：5’-CCTGCGTGGCGGCC-3’；
用于扩增肺炎支原体目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F9：5’-GCAGACGGTCGGGGAT-3’；
R9：5’-CGAACCAGGTGAGGT-3’；
用于扩增副流感病毒-1型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F10：5’-AGCCCTAGCAGACCTGAAG-3’；
R10：5’-ATAGGGGTCTGATGCCCAGT-3’；
用于扩增副流感病毒-2型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F11：5’-AGTTCCTCGTCCTGGAGTCA-3’；
R11：5’-TGATGCAGTTAGCAGGGC-3’；
用于扩增副流感病毒-3型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F12：5’-GCACAACTCATCCAACAGCC-3’；
R12：5’-GTCTTGGGCTTGGATTCGGA-3’；
用于扩增博卡病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F13：5’-CAAGCCTGACGTCTGCACT-3’；
R13：5’-CTAGCAGCGGAAGCCCAT-3’；
用于扩增冠状病毒OC43型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F14：5’-ATGTCGGTTTCGTTGAGGCT-3’；
R14：5’-GCAGTGGAGGCAACACTT-3’；
用于扩增冠状病毒229E型目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F15：5’-CTGCAACCGTGTGACACTTG-3’；
R15：5’-TCGGCATGCCCTAAAACCAT-3’；
用于扩增甲型H1N1流感病毒目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F16：5’-GGACAGTCAGTGGTTTCC-3’；
R16：5’-CCCATCCACTAACAGGGCAG-3’；
用于扩增内部质控品目标DNA片段的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F17：5’-GCAATGCAAGGTCTCCT-3’；
R17：5’-GGAAGATCAATACATAAAG-3’；
所述特异引物组由以下引物组成，其中
用于使呼吸道合胞病毒A型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F1’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTC-3’；
R1’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATGCCTAATGGTCCGCTGGATGACAGAAGTTGATCTTTGTT-3’；
用于使腺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F2’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTGCACAGCCICACCGC-3’或
5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGAGTGCAICAGCCCICAICGC-3’；
R2’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACCAATCGCAATCGTGGCGCAGGTAIACGGIITCGATGACGCC-3’或
5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGCCCAATCGCAATCGTGGCGTGCGCAGGTAIACIGIITCGATGAIGCC-3’；
用于使人偏肺病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F3’：5’-GTGGCAGGGCGCTACAAGTCAGAGGCCTTCAGCACCAG-3’；
R3’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGACCAGAAGTGAACGCATCTGCACCTACACATAATAAAATTATIGGTGTGT-3’；
用于使呼吸道合胞病毒B型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F4’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGTTAGGAAGGGAAGACACTATAAAGATACTT-3’；
R4’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGGAGAGTGGTCAGGATTGGCCCATTAGCTTTAACATGATATCCAGCATCTTT-3’；
用于使甲型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F5’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCTTGAGGCTCTGATGGAITGGCT-3’；
R5’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACACGGCAGGTCCGGTATCAGTTGCTTCGGTATCAGTTGCTTCGAGGTGACAIGATTGGTCTTGTCTTT-3’；
用于使乙型流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F6’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTCATTIACAGAAGATGGAGAAGGCA-3’；
R6’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATAGCTCGCCATCACACGTCTCGCTGTTGACCATCTCGACAGTGTAATTTTTCTGCTAGTTCTGCTT-3’；
用于使百日咳鲍特菌目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F7’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCGAACGCTTCATCCAGTCGG-3’；
R7’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAACTAGTAGTCAGGCACGCGTAAGCCCACTCACGCAAGG-3’；
用于使鼻病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F8’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGCCICGTGTGCTCIITITGAITCCTCCGG-3’；
R8’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGATGTCCTTGGGTCCCTCTTGGGCTCCIIIGTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGG-3’；
用于使肺炎支原体目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F9’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGGGCCCCIATCGCCCTC-3’；
R9’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGACATTGCGTCAAGTTGCTTATCAATGTTGAGCGTAAGATGGACCAGGGCGAAGTACGITTCAAACGG-3’；
用于使副流感病毒-1型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F10’：5’-CAGGATGTGTTAGACTACCTTCATTATCAATTGGT-3’；
R10’：5’-GATGCAATATATGCGTATTCATCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGC-3’；
用于使副流感病毒-2型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F11’：5’-CAGGACTATGAAAACCATTTACCTAAGTGATGG-3’；
R11’：5’-AATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGTTGT-3’；
用于使副流感病毒-3型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F12’：5’-CCATCTGTTGGACCAGGGATATACTACAAA-3’；
R12’：5’-GGCAAAATAATATTTCTCGGGTATGGAGGTCTTGAACATCCAACCCAGTTGTGTTGCAG-3’；
用于使博卡病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F13’：5’-ACCTAAACGAATCTTGTAATAGGCACCTAICCAATTC-3’；
R13’：5’-CGCAATCAATATAAATTCTTAACAGTAAACAGTGCATTAACCATTCACTAC-3’；
用于使冠状病毒OC43型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F14’：5’-CCCAGAGACCTTGACCACAACTTTGGAAGT-3’；
R14’：5’-GCAGGTGTTGTGGCCAATGGTGTTAAAGCTAAAGGC TATC-3’；
用于使冠状病毒229E型目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F15’：5’-CTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTGAA-3’；
R15’：5’-GCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTT TAAAAC-3’；
用于使甲型H1N1流感病毒目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F16’：5’-CGAACCTTCAACTTTAACAGTCCTATATTCGACTTACGA-3’；
R16’：5’-TCAAGCTTACAATTAGCAGGCATCTTAGCCAGGACCTATTACGCACATTCATGC-3’；
用于使内部质控品目标DNA片段携带特异性探针检测序列和内部荧光标记的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
F17’：5’-GTGGCAGGGCGCTACGTACAAGTTTGAATGGCCGGCGTCTATTAG-3’；
R17’：5’-GGACGCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGCAGCTTCTGGGAGAAGACCACGCAGCAAACTCCGGCATCTA-3’；
所述检测探针组包括以下检测探针，其中：
与呼吸道合胞病毒A型或副流感病毒-1型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P1：5’-GGACCATTAGGCATG-3’；
与腺病毒或副流感病毒-2型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P2：5’-CCACGATTGCGATTGG-3’；
与人偏肺病毒或副流感病毒-3型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P3：5’-AGATGCGTTCACTTCTGGTCTA-3’；
与呼吸道合胞病毒B型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P4：5’-GCCAATCCTGACCACTCTCCTAGT-3’；
与甲型流感病毒或博卡病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P5：5’-GAAGCAACTGATACCGGACCTGC-3’；
与乙型流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P6：5’-CGAGATGGTCAACAGCGAGACGTGCGATGGCGAGCTA-3’；
与冠状病毒OC43型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P7：5’-CCGCTAATCCACGTAACGACCTG-3’；
与百日咳鲍特菌探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P8：5’-CGTGCCTGACTACTAGT-3’；
与鼻病毒或冠状病毒229E型探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P9：5’-CCAAGAGGACCCAAGGACA-3’；
与肺炎支原体探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P10：5’-GTCTTACGCTCAACATTGATAAGCAACTTGACGCAATG-3’；
与检测甲型H1N1流感病毒探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P11：5’-GCTACCACTCAATTAGTATTACTACCT-3’；
与内部质控品探针检测序列特异性结合的探针核苷酸序列如下所示：
P12：5’-TCACGAGCTACAGCAGGT-3’；
所述试剂盒的使用方法为：从待测样品中提取核酸为模板，利用所述扩增引物组中的所有引物，进行RT-PCR预扩增；
以上述RT-PCR预扩增产物为模板，利用所述特异引物组中的所有引物和所述检测探针组中的所有探针，通过以下PCT扩增程序进行实时荧光定量PCR：
95℃预变性2分钟；94℃变性15秒、55℃退火15秒、72℃延伸15秒，10个循环；94℃变性15秒、50℃退火15秒、72℃延伸15秒，23个循环；95℃变性2分钟；40℃进行熔解准备90秒；以1℃/s速度从40℃升温90℃进行熔解程序，在此过程中选用FAM、ROX和Cy5荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光并判定结果。
2.如权利要求1所述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR反应液、DNA聚合酶、内部质控品和阳性质控品。
3.如权利要求2所述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述内部质控品为噬菌体MS2，所述阳性质控品为含有所述十六种呼吸道病原体中任意四种病原体的目标DNA片段的核酸片段或质粒。
4.如权利要求1至3任一项所述的一种呼吸道病原体多重检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括由FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素组成的颜色补偿试剂组，所述颜色补偿试剂组的使用方法为：分别使用FAM荧光素、ROX荧光素和Cy5荧光素进行实时荧光定量PCR：95℃2分钟；40℃90秒；以1℃/s速度从40℃升温90℃，在此过程中选用与荧光素对应荧光检测通道进行荧光检测，收集荧光并得到由FAM、ROX和Cy5组成的颜色补偿文件；
在进行样品结果分析时，选用所述颜色补偿文件进行颜色补偿，以去除结果判断时荧光信号间出现的荧光干扰。
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