CN111961745A - 用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒 - Google Patents

用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒。本发明的方法包括分别构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系和第二检测体系的步骤，每种检测体系中分别包含针对不同真菌设计的引物和探针，利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌及其类型。本发明的方法可一次性检测多达12种真菌，大大提高了检测效率和灵敏度。

Description

用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及皮肤真菌检测领域，具体地涉及用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒。
背景技术
皮肤癣菌是所有真菌中数量最多、分布最广的一类，能够侵入人和动物的角化组织，感染皮肤、头发和指(趾)甲的角质细胞，是皮肤癣菌病的主要病原体。皮肤癣菌可以分为3个种属：表皮癣菌属、小孢子菌属和毛癣菌属。
念珠菌是一种机会致病菌，超过1/4的正常人口腔、消化道、皮肤和生殖道黏膜等部位可检测到念珠菌，白色念珠菌是引起皮肤念珠菌病最常见的病原体，常常引起念珠菌性间擦诊、念珠菌性甲沟炎和甲床炎，以及念珠菌性肉芽肿等。
目前传统的鉴定皮肤真菌主要是形态学的方法：显微镜下直接观察和真菌培养。然而，直接镜检缺乏特异性，而真菌培养的周期往往较长，需2-4周。这些限制都可以通过分子诊断技术来解决。
目前相对最为先进、也最有发展前景的是分子生物学方法，即PCR，聚合酶链式反应方法。传统的PCR技术虽具有较高的灵敏度，但特异度低，因外源污染等问题容易造成假阳性结果。实时荧光定量PCR技术能够在极短的时间内检测出组织中极微量的真菌DNA，具有较高的灵敏度和特异性。此类技术已被用于检测多种真菌。例如，中国专利申请CN104450936 A公开了一种检测常见致病真菌的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，其独立设计特异性的引物与TaqMan探针，建立一种荧光PCR检测方法能够同时检测15种临床常见致病真菌，其中包括8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉。虽然该方法能够同时检测15种真菌，但是并不能区分真菌的具体类型。
在中国专利申请CN 110551840 A中还公开了用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。其中，核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的特定引物和探针。通过这些引物和探针建立了检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子菌、耳念珠菌等至少9种侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对上述检测目标基因组同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。然而，该方法的真菌检测种类仍然有限，仍需要能够检测更多数量，并同时检测其具体类型的方法。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供能够检测更多真菌的方法和试剂盒。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其包括以下步骤：
(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由扩增和熔解曲线获得Ct值和Tm值，并基于Ct值和Tm值检测样品中的真菌及其类型；
其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述多通道荧光PCR为四通道荧光PCR，且第一检测体系对应的真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌和紫色毛癣菌；第二检测体系对应的真菌选自苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述第一检测体系或所述第二检测体系中各探针的荧光报告基团不同，且分别选自FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的任意一种，和荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse中的任意一种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述探针与来源于至少两种真菌基因的Tm值之差为2-10℃。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ IDNo.1-2、4-5、7-8所示的序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.12、15、18所示的序列，所述第二寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ IDNo.10-11、13-14和16-17所示的序列。
本发明第二方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，该试剂盒被设计为能够用于多通道荧光PCR检测，其包括：
用于构建第一检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
用于构建第二检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其中，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其中，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.1-2、4-5、7-8所示的序列；和/或所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.12、15、18所示的序列，所述第二寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.10-11、13-14和16-17所示的序列。
本发明的方法或试剂盒能够一次性同时检测多达12种不同的皮肤真菌，覆盖临床上95％的皮肤真菌，并且检测时间短、检出时间不超过2小时。另外，检测灵敏度得到大大提高。
附图说明
图1：465-510通道：体系1中的白色念珠菌阳性峰值。
图2：465-510通道：体系2中苯海姆节皮菌和疣状毛癣菌的阳性峰值。
图3：533-580通道：体系1中指(趾)间毛癣菌、须癣毛癣菌和断发癣菌的阳性峰值。
图4：533-580通道：体系2中奥氏小孢子菌和犬小孢子菌的阳性峰值。
图5：533-610通道：体系1中红色毛癣菌、苏丹毛癣菌和紫色毛藓菌的阳性峰值。
图6：533-610通道：体系2中絮状表皮癣菌的阳性峰值。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中“严格条件”是指以比能够检测更大的程度(例如背景测定值的平均+背景测定值的标准误差×2以上的测定值)与其目标序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，根据进行杂交的环境不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出对引物为100％互补性的目标序列。在某些实施方案中，严格条件是指5×SSC，50％甲酰胺和42℃下的核酸杂交条件。在某些实施方案中，严格条件是指高严格条件，即对于长度为至少100个核苷酸的序列，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5×SSC、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24/小时。材料最终使用0.2×SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
皮肤真菌是所有真菌中数量最多、分布最广的一类真菌，并且与人类的多种疾病的发生存在相关性。因此检测这些真菌具有重要意义。目前基于核酸的分子检测手段多数只针对其中的某一种真菌进行检测。虽然最近也公开了可以同时检测多种真菌的报告，但这些方法或者只能检测多种真菌是否存在而不能区分具体属于何种真菌，或者检测的真菌数量有限。另一方面，与人类皮肤相关疾病的皮肤真菌种类众多，现有方法不能同时或在一次性检测中全部检出这些真菌。本发明在对众多的皮肤真菌进行分析后，通过对这些真菌进行合理分组，并进一步针对分组后的真菌设计特定的引物和探针，利用这些引物和探针能够一次性同时检测多达12种皮肤真菌，具有极高的灵敏度和特异性。
[检测方法]
本发明的第一方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其主要包括以下步骤：
(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；和
(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌及其类型。
已知在同时检测时，特别在同时检测相似或相近真菌时，如果待测真菌数量增加，则这些待测真菌之间的区分难度以及待测真菌与样本中的其他菌之间的区分难度会成倍增加。为了能够一次性检测尽可能多的皮肤真菌，发明人构建了两种不同检测体系，即，第一检测体系和第二检测体系。在检测时两个检测体系同时进行可一次性检测多达12种常见真菌。
本发明的第一检测体系和第二检测体系均为用于多通道荧光PCR检测的检测体系。两者除了其中的引物和探针不同，从而能够检测不同的真菌之外，两个检测体系中的其他成分或配方，如缓冲液、dNTP和离子及其浓度等可以相同，并且两种检测体系中的其他成分或配方可由本领域技术人员根据需要而自由调整。下面本文仅详细说明两种检测体系中的引物和探针。
本发明的第一检测体系中包含与荧光PCR检测仪器的通道相对应的一个或多个寡核苷酸组。为了与后面所述的第二检测体系中的寡核苷酸组相区分，将第一检测体系中的寡核苷酸组称为“第一寡核苷酸组”。每个第一寡核苷酸组由针对一个通道而设计的一对引物和一条探针。由于本发明的方法为基于多通道荧光PCR的方法，因此，第一检测体系中一般包含多个第一寡核苷酸组。第一寡核苷酸组的数量一般等于或小于荧光PCR仪器中的通道数量。
本发明的第一寡核苷酸组中的探针是指能够与目标真菌的基因组中的特定序列在适于杂交的条件下(例如严格条件下)互补结合的寡核苷酸分子，其通常包含特定的碱基序列和标记物基团。本发明的碱基序列为特定序列。一般而言，本发明的碱基序列能够与至少一种目标真菌基因组中的特定区域互补结合。优选地，本发明的碱基序列能够与至少1种的目标真菌(优选地，两种以上的目标真菌同一属内不同种的真菌)的基因组中的特定区域互补结合，并且碱基序列与不同真菌基因组中的特定区域的互补率(即，配对碱基数占全部碱基数的百分比)。例如，在第一寡核苷酸中的探针能够与两种不同真菌的基因特定区域互补结合的情况下，与一种真菌基因的互补率为100％，即完全配对，而与另一种真菌基因的互补率为80％以上，优选85％以上，还优选99％以下，更优选95％以下，进一步优选为90％。通过控制互补率在特定范围内，进而可以使同一探针与不同真菌基因的Tm值之差在能够区分的范围。由此在相同条件下，基于Tm值并结合Ct值能够检测更多种真菌。如果探针与不同真菌基因的互补率相同，则两者的Tm值相同，则不能实现更多种真菌的检测。如果探针与不同真菌的基因的互补率过低，则检测特异性变低，甚至无法实现本发明的目的。同一探针与不同真菌基团的Tm值之差一般为2-10℃，例如，2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃。
本发明中，在探针只与一种真菌的基因的特定区域在严格条件下互补结合的情况下，特定区域一般为该真菌特有的区域，即只在该真菌的基团组内才有的区域。在探针能够与两种以上的真菌的基因的特定区域在严格条件下互补结合的情况下，特定区域一般选择真菌的相对保守区，优选在同一属内相对保守的区域，此时特定区域为该真菌所属的属内特有的区域，并且该区域在不同种之间具有序列差异。
本发明的第一寡核苷酸组中的探针的标记物基团包含荧光报告基团和荧光猝灭基团。这些基团在探针中的位置和连接方式在本领域内是已知的。作为荧光报告基团，其实例包括但不限于FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5和HEX，本发明可自由地使用其中的任意一种。作为荧光猝灭基团，其实例包括但不限于BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ和Eclipse，本发明可以自由地使用其中的任意一种。在不影响本发明目的的情况下，本发明可以自由地组合使用上述荧光报告基团和荧光猝灭基团。在不同第一寡核苷酸组中的探针之间的荧光报告基团不同，优选这些荧光报告基团能够在特定条件下发出不同的光。
本发明中，第一寡核苷酸组包含由正向引物和反向引物组成的一对引物(或引物对)。正向引物和反向引物分别位于对应的探针两侧。在第一寡核苷酸用于检测一种真菌的情况下，与正向引物或反向引物互补的区域一般为该目标真菌基因内特异的区域。在第一寡核苷酸用于检测两种以上真菌的情况下，与正向引物或反向引物互补的区域一般为两种以上的真菌所在属的基因内的特有区域。
本发明中，第二寡核苷酸组中的探针和引物除了与不同真菌的基因区域互补结合外，其余设计与第一寡核苷核组的中探针和引物类型相同。
在某些实施方案中，本发明使用具有四个通道的荧光PCR检测仪器，此时，本发明的第一检测体系中可包含例如三种不同的第一寡核苷酸组。在三种不同的第一寡核苷酸组中共存在三种不同探针和三对不同引物。三种不同探针中至少有一种探针能够与两种以上的不同真菌，优选同一属内的两种以上真菌的基因在严格条件下互补结合。另外两种探针可以分别只与单一一种真菌的基因结合，也可以分别与两种以上的真菌基因结合，还可以是一种探针只与一种真菌的基因结合，而另一种探针与两种以上的真菌的基因结合。三对不同引物分别用于扩增至少三种不同真菌，优选更多种真菌的基因。类似地，本发明的第二检测体系可包含例如三种不同的第二寡核苷酸组和三对不同的引物。在三种不同的第二寡核苷酸组中共存在三种不同的探针。三种不同探针中至少有一种探针能够与两种以上的不同真菌，优选同一属内的两种以上真菌的基因在严格条件下互补结合。另外两种探针可以分别只与单一一种真菌的基因结合，也可以分别与两种以上的真菌基因结合，还可以是一种探针只与一种真菌的基因结合，而另一种探针与两种以上的真菌的基因结合。三对不同引物分别用于扩增至少三种不同真菌，优选更多种真菌的基因。
需要说明的是，本发明的第一检测体系与第二检测体系分别针对多种不同的真菌，但第一检测体系对应的真菌组与第二检测体系对应的真菌组中不存在相同的真菌。即，当第一检测体系设计为能够检测某一真菌例如白色念珠菌时，则第二检测体系设计为不能检测该真菌。也就是说，待检测的目标真菌只能在第一检测体系或第二检测体系中被检测，而不能同时在两个检测体系中被检测，并当在第一检测体系被检测时，则该真菌不会对第二检测体系的检测产生干扰或者至少不会实质性影响第二检测体系的检测。
本发明的方法能够一次性检测更多的真菌种类。在某些实施方案中，本发明的方法可以检测的真菌包括白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌。
[试剂盒]
本发明的第二方面，提供一种用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，该试剂盒被设计为能够用于多通道荧光PCR检测，从而可使本发明的试剂盒能够实施本发明第一方面所述的方法。本发明的试剂盒包括：
用于构建第一检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；和
用于构建第二检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组。
本发明的试剂盒第一寡核苷酸组第二寡核苷酸组与第一方面的方法中的相同，在此不再赘述。
除了上述第一寡核苷酸组和第二寡核苷酸且外，本发明还可进一步包含质控组分。例如，阳性质控和内部质控等。
除了寡核苷酸组之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸组)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
实施例1
本实施例为针对12种常见皮肤真菌而开发的检测试剂盒。本实施例的试剂盒包含一个内部质控(IC)用于区分真阴性和由于核酸降解、PCR抑制、操作失误造成的假阴性。还提供了阳性质控(PC)可以在每次检测时使用。表1示出了本实施例试剂盒的各种组分。该试剂盒为50测试/盒。
表1十二项皮肤真菌检测试剂盒组份
Figure BDA0002663081770000121
其中，PCR反应液1中包含表2所示的引物和探针。PCR反应液2包含表3所示的引物和探针。阳性质控1和2，以及内部质控的序列信息如表4。其中，内部质控为M13噬菌体。
表2
Figure BDA0002663081770000122
表3
Figure BDA0002663081770000123
Figure BDA0002663081770000131
表4
Figure BDA0002663081770000132
Figure BDA0002663081770000141
实施例2
本实施例为12种常见皮肤真菌的检测例。
一、样本
本实施例可以使用指甲、头发和皮肤作为样本。
样本要求如下：
1)确保从指甲、皮肤和头发的感染部位和/或区域采集样本，以确定病原体；
2)提取DNA时，每种类型的样本所需的样本量如表5所示；
3)避免取大块的指甲，以及指甲染血的部分(可能导致PCR反应抑制)
除使用新鲜的指甲样本外，石蜡包埋的指甲样本也可以检测。
表5提取DNA时每种类型样本的样本量
Figure BDA0002663081770000142
溶液A：10×TNE缓冲液，40％SDS，1mol/L DTT，10mg/ml PK
二、检验方法
1、核酸提取
获取样本后，使用核酸提取试剂对样本进行核酸提取。
2、配制反应体系
从实施例1试剂盒中取出PCR反应液1和2、稀释液，室温下融化，震荡混匀后短暂离心，和反应酶一起置于冰上。对于每份样本，都需配制反应混合液1和反应混合液2。反应混合液1和2分别按照表6和表7来进行配制。配制完成后，充分混匀，按照20μl/份分装至PCR反应孔中，反应板需置于冰上。
表6检测体系1的配制
组份 体积(1×) 体积(10×)
PCR mix 1 10μl 100μl
Taq polymerase 1.5μl 15μl
Dilution buffer 8.5μl 85μl
总体积 20μl 200μl
表7检测体系2的配制
组份 体积(1×) 体积(10×)
PCR mix 2 10μl 100μl
Taq polymerase 1.5μl 15μl
Dilution buffer 8.5μl 85μl
总体积 20μl 200μl
3、加样
1)从实施例1试剂盒中取出阳性质控1和2，室温下融化，混匀后短暂离心。取出已提取好的核酸样本，融化。
2)向含20μl反应混合液的反应孔中，添加5μl的核酸样本。
a.阴性对照反应孔：向反应混合液中添加5μl的稀释液
b.阳性对照反应孔：向反应混合液中添加5μl的阳性质控
3)将反应孔封好，短暂离心。尽量避免反应孔中有气泡。
4、上机
本发明的方法可以使用的仪器包括：
Figure BDA0002663081770000152
480II(LC480 II；Roche)
Figure BDA0002663081770000153
Q(RGQ；QIAGEN)
CFX96(Bio-Rad)
Magnetic Induction Cycler(Mic qPCR cycler；Bio molecular systems)
1)按照表8设置荧光通道，按照表9设置PCR反应程序。
2)将封好的反应板放入PCR仪中，运行PCR程序。
表8不同PCR仪器的荧光通道设置
Figure BDA0002663081770000151
Figure BDA0002663081770000161
表9 PCR反应程序设置
Figure BDA0002663081770000162
三、数据分析
以罗氏LC480为例：
程序运行结束以后，首先选择2nd derivative分析方法，可以自动确定Ct值，然后，通过Tm calling分析方法，来读取Tm值。
1、质控品
在分析临床样本的检测结果之前，必须首先分析所有质控的检测结果，从而保证数据的可靠性。要确认DNA提取(IC)和PCR程序(IC和PC)，所有质控的Ct值必须在规定的可接受范围内(Ct值±2，见表10)。IC的Ct值很大程度上取决于样本的基质、DNA提取过程以及多种病原体的存在。然而，IC的阳性信号必须在阴性样本中检测到，但Ct值可能是多变的。
表10阳性质控和内部质控的Ct值和Tm值
Figure BDA0002663081770000163
Figure BDA0002663081770000171
Ct值取决于所设定的阈值，Ct值可以有+/-2Ct的差异。
2、样本
待程序运行完成后，通过Tm calling分析可以自动得出熔解峰的Tm值，以阴性对照作为荧光信号背景，比对不同PCR反应管(mix 1、mix2)是否存在特异峰，根据表11和表12进行病原体判读，所有真菌的Tm值参考表11和表12。
表11实施例1的检测试剂盒所能检测真菌的Tm值(PCR mix 1)
Figure BDA0002663081770000172
表12实施例1的检测试剂盒所能检测真菌的Tm值(PCR mix2)
Figure BDA0002663081770000173
3、实验结果
实验结果可以根据表13(mix1)和表14(mix2)来进行更加详细的判断。如果在任何检测通道都没有检测到扩增信号，那说明样本可能存在反应抑制或者某个操作步骤有误等。
表13 PCR mix1中的熔解曲线实验结果分析
Figure BDA0002663081770000181
表14 PCR mix2中的熔解曲线实验结果分析
Figure BDA0002663081770000182
备注：+表示阳性，-表示阴性，+/-表示可为阳性或阴性。
实施例3
本实施例为试剂盒的性能测试例。
通过20个重复实验中，检出率大于等于95％作为最低检测限的确定方法。结果如表15和表16所示：
表15最低检测限结果
Figure BDA0002663081770000183
Figure BDA0002663081770000191
表16特异性结果
病原体类别 检测结果
犬小孢子菌 犬小孢子菌
铁锈色小孢子菌 犬小孢子菌
奥氏小孢子菌 奥氏小孢子菌
絮状表皮癣菌 絮状表皮癣菌
指(趾)间毛癣菌 指(趾)间毛癣菌
断发毛癣菌 断发毛癣菌
马毛藓菌 断发毛癣菌
须癣毛癣菌 须癣毛癣菌
许兰毛癣菌 须癣毛癣菌
须藓毛藓菌变种 须癣毛癣菌
红色毛癣菌 红色毛癣菌/苏丹毛癣菌
紫色毛癣菌 紫色毛癣菌
苏丹毛癣菌 红色毛癣菌/苏丹毛癣菌
疣状毛癣菌 疣状毛癣菌
苯海姆节皮菌 苯海姆节皮菌
柱状毛孢子菌 苯海姆节皮菌
猴头毛孢子菌 苯海姆节皮菌
N gypsae /
马毛藓菌 /
库克小孢子菌 /
土生毛藓菌 /
猴毛藓菌 /
新型隐球菌 /
酿酒酵母 /
白色念珠菌 白色念珠菌
近平滑假丝酵母 /
烟曲霉 /
近平滑假丝酵母 /
尖孢镰刀菌 /
多育赛多孢 /
产黄青霉 /
马尔尼菲青霉 /
米根霉 /
短帚霉 /
柱顶孢霉 /
金葡 /
铜绿假单胞菌 /
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> 用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒
<130> BH2000301-1
<141> 2020-09-02
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtccatttgg gtgctaagaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaggtttgcg aagactacaa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgtcggtttt gttaaaaaag ggtt 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
accgccccat tcttgtctac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctacttcttg cgtcgcttta 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cggcgagcct ctctttagtg gcta 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
attcttgtct acctcacccg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcgctttacg ctattcatta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cggaggacag acaccaagga aaattct 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gccccattct tgtctacctt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ctacttcttg cgtcgcttta 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cgctctcccc ccggagagtc gtccg 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
acgcccattc ttgtctactg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tcgctttacg ctattcatta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
cagcgctcgc cggaggatta ct 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ctccataggt ggttcagtct 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tcgctttacg ctattcatta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ctcttggttc cggcatcgat gaag 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cagtgttacg gtacatgggt 20
<210> 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gcgattagga ttaggaagag 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cggttctgag ggtggcggta ctaa 24
<210> 22
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
atgtcattac cagcttcatt tgacttaact ccagaagacg ctaaattgtt attagctgcc 60
aacgtccatt tgggtgctaa gaacgttcaa gttcacaaca aaccatatgt ttacaaaacc 120
agaccagatg gtatgaacat catcaacatt ggtaaaactt gggaaaaaat tgttttggct 180
gccagaatca ttgctgctgt tccaaacgct tctgatgttg ctgtttgttc ttcaagaact 240
ttcggtcaaa gagctgtttt gaaatttgct gctcacactg gtgctactgc cattgctggt 300
agattcactc caggtaactt taccaattat atcactcgtt cattcaaaga accaagatta 360
gttgttgtta ctgacccaag aaccgatgct caagccatca aagaatcatc ttatgttaac 420
attccagtta ttgccttgac tgacatggac tctccatctg aatacgttga tgttgccatt 480
ccatgtaaca acaaaggtaa acactctatt ggtttaatct ggtggttgct tgctagagaa 540
gtcttgagat taagaggtat tatcccagac agaactaccg aatggtcagt tatgccagat 600
ttgtacttct acagagaccc agaagaaatt gaacaaaatg ccgtcgaaga agctaaaact 660
gaagaagttg aagaagctcc agttgctgaa gctgaaaccg aatggactgg tgaaactgaa 720
gatgttgatt gggctgattc tggtgctacc ccagctgctg aagatgctgc tgcttctaac 780
tggtaa 786
<210> 23
<211> 639
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ccttccgtag gtgaacctgc ggaaggatca ttagcgcgca ggccggaggc tggcccccca 60
cgatagggcc aaacgtccgt caggggtgag cagatgtgcg ccggccgtac cgccccattc 120
ttgtctacat tactcggttg cctcggcggg ccgcgctctc ccaggagagc cgttcggcga 180
gcctctcttt agtggctaaa cgctggaccg cgcccgccgg aggacagacg caaaaaaatt 240
ctttcagaag agctgtcagt ctgagcgtta gcaagcaaaa atcagttaaa actttcaaca 300
acggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa 360
ttgcagaatt ccgtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccccct ggcattccgg 420
ggggcatgcc tgttcgagcg tcatttcagc ccctcaagcc cggcttgtgt gatggacgac 480
cgtccggcgc ccccgtcttt gggggtgcgg gacgcgcccg aaaagcagtg gccaggccgc 540
gattccggct tcctaggcga atgggcaaca aaccagcgcc tccaggaccg gccgccctgg 600
cctcaaaatc tgttttatac ttatcaggtg acctcgatc 639
<210> 28
<211> 637
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
ggaaggatca ttaacgcgca ggccggaggc tggcccccca cgatagggac cgacgttcca 60
tcaggggtga gcagacgtgc gccggccgta cgcccccatt cttgtctacc tcacccggtt 120
gcctcggcgg gccgcgctcc ccctgccagg gagagccgtc cggcgggccc cttctggggg 180
cctcgagccg gaccgcgccc gccggaggac agacaccaag gaaaattctc tgaagggctg 240
tcagtctgag cgtttagcaa gcacaatcag ttaaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 300
tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattccgt 360
gaatcataga atctttgaac gcacattgcg ccctctggca ttccgggggg catgcctgtt 420
cgagcgtcat ttcaacccct caagcccggc ttgtgtgatg gacgaccgtc cggcccctcc 480
cttcgggggc gggacgcgcc cgaaaagcag tggccaggcc gcgattccgg cttcctgggc 540
gaatgggcag ccaaaccagc gccctcagga ccggccgccc tggccccaat ctttatatat 600
atatatatat atatatatct ttcaggtgac ctcgatc 637
<210> 25
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
attaacgcgc agagtcgaag gtggcccccg aagctcttcc gtctcccccc gggcctcccg 60
gggaggttgc gggcggcgag gggtgcctcc ggccgcacgc ccattcttgt ctactgaccc 120
ggttgcctcg gcgggccgcg cctgctgtgc tacagcggcc gttcgggggg gacgcctgag 180
ggggactctt gtttcctagg ccacgccccg ggcagcgctc gccggaggat tactctggaa 240
aacacactct tgaaagaaca taccgtctga gcgagcaacg caaatcagtt aaaactttca 300
acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 360
gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cctggcattc 420
cggggggcat gcctgttcga gcgtcatttc aacccctcaa gcccggcttg tgtgatggac 480
gaccgtcccc cctccccagt aaccacccac cgcttagggg ggtgggaggg agggggacgc 540
gcccgaaaag cagtggtcag gccgcgattc cggctcctgg gcgaatggga cataccaccg 600
cctccaggac cggccggcag gctggcctaa cgcaccatgt attattcagg ttgactcgga 660
tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaag aaaaccaacc 720
<210> 26
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
attaacgcgc agagtcgaag gtggcccccg aagctcttcc gtctcccccc gggcctcccg 60
gggaggttgc gggcggcgag gggtgcctcc ggccgcacgc ccattcttgt ctactgaccc 120
ggttgcctcg gcgggccgcg cctgctgtgc tacagcggcc gttcgggggg gacgcctgag 180
ggggactctt gtttcctagg ccacgccccg ggcagcgctc gccggaggat tactctggaa 240
aacacactct tgaaagaaca taccgtctga gcgagcaacg caaatcagtt aaaactttca 300
acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 360
gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cctggcattc 420
cggggggcat gcctgttcga gcgtcatttc aacccctcaa gcccggcttg tgtgatggac 480
gaccgtcccc cctccccagt aaccacccac cgcttagggg ggtgggaggg agggggacgc 540
gcccgaaaag cagtggtcag gccgcgattc cggctcctgg gcgaatggga cataccaccg 600
cctccaggac cggccggcag gctggcctaa cgcaccatgt attattcagg ttgactcgga 660
tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaag aaaaccaacc 720
<210> 27
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgcgcaggc cgcagtcggc ccgtccccct 60
tctctctgaa tgctggacgg tgtcgccggc cacacgccca ttcttgtcta cactacccgg 120
ttgcctcggc gggccgcgcc ccctaggctg cagtgtcgct gcagcgtctc gggggggccg 180
ttcgggggat ggagaaggat gccccggcgg ggttgatcgc tcccccaccc ctggacagcg 240
ctcgccgaag gagtgattct cagaaattct acgaaatctc cataggtggt tcagtctgag 300
cgttggcaag caaaaaccag tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ccggcatcga 360
tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattccgtg aatcatcgaa 420
tctttgaacg cacattgcgc cctctggtat tccggggggc atgcctgttc gagcgtcatt 480
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attccgggcc cctgggcgaa tgggcaacaa aaccagcgcc ttcaggaccg gccggctctc 660
tggccctagt ttccgtcggg aggacgaaag ggggcgaccc ctctctcccc tccgcattca 720
ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagcggagga 780

Claims (10)

1.一种用于一次性检测多种皮肤真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建用于多通道荧光PCR检测的第一检测体系的步骤，其中第一检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(2)构建用于多通道荧光PCR检测的第二检测体系的步骤，其中第二检测体系包含多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
(3)利用第一检测体系和第二检测体系分别进行多重荧光PCR，由熔解曲线获得Tm值，并基于Tm值检测样品中的真菌类型；
其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多通道荧光PCR为四通道荧光PCR，且第一检测体系对应的真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌和紫色毛癣菌；第二检测体系对应的真菌选自苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一检测体系或所述第二检测体系内各探针的荧光报告基团不同，且分别选自FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的任意一种，和荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ、Eclipse中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或
所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于1到3种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述探针与来源于1到3种真菌基因的Tm值之差为2-10℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.1-2、4-5、7-8所示的序列。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.12、15、18所示的序列，所述第二寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.10-11、13-14和16-17所示的序列。
8.一种用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒被设计为能够用于多通道荧光PCR检测，其包括：
用于构建第一检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第一寡核苷酸组，且每个第一寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
用于构建第二检测体系的多个由一对引物和一条探针组成的第二寡核苷酸组，且每个第二寡核苷酸组设计为能够利用一个通道同时检测由至少一种真菌组成的一个真菌组；
其中，所述多种皮肤真菌选自白色念珠菌、指(趾)间毛癣菌、断发癣菌、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、苏丹毛癣菌、紫色毛癣菌、苯海姆节皮菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、奥氏小孢子菌和絮状表皮癣菌，且第一检测体系的真菌组和第二检测体系的真菌组不存在相同的真菌。
9.根据权利要求8所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其特征在于，所述第一检测体系中至少一种第一寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同；和/或
所述第二检测体系中至少一种第二寡核苷酸组的探针被设计为能够与来源于至少两种真菌的基因互补结合，并且该探针与不同真菌的基因的互补率不同。
10.根据权利要求8所述的用于一次性检测多种皮肤真菌的试剂盒，其特征在于，所述第一寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.3、6和9所示的序列，所述第一寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.1-2、4-5、7-8所示的序列；和/或
所述第二寡核苷酸组中探针的序列选自SEQ ID No.12、15、18所示的序列，所述第二寡核苷酸组中引物的序列选自SEQ ID No.10-11、13-14和16-17所示的序列。
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