CN102127591A - 家兔须癣毛癣菌鉴定方法 - Google Patents

Abstract

须癣毛癣菌是家兔最为常见的皮肤癣菌病致病菌，本发明公开了用于鉴定须癣毛癣菌特异性引物序列，通过利用这对引物序列，通过PCR扩增，可特异性鉴定出须癣毛癣菌，速度快，可靠性高，为家兔癣菌病诊断和兔场癣菌病净化奠定理论基础，并提供技术性指导。

Description

家兔须癣毛癣菌鉴定方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，主要涉及聚合酶链反应试验中的引物在检测、鉴定须癣毛癣菌中的用途。使用这些引物能够检测家兔皮肤常发皮肤癣菌病的动态变化，并为家兔皮肤癣菌病诊断、治疗和兔场癣菌病净化奠定理论基础，并提供技术性指导。

背景技术

随着广谱抗生素、皮质类固醇、免疫抑制剂和介入治疗等的普遍应用，以及饲养宠物和旅游活动的普及，一些通常对人和动物无害的真菌在机体免疫力减弱时侵入体内，引起条件致病性真菌病和系统性真菌感染的现象日益多见。

家兔的皮肤真菌病是一种发病率高、传染性强、难治愈的人畜共患传染病。在家畜中主要感染兔、犬、猫，主要侵害家兔皮毛，出现皮屑、结痂、脱毛、渗出、毛囊炎及痒感等症状，不仅影响家兔生长发育，降低饲料报酬率和抵抗力，而且严重影响家兔的皮毛质量及易继发其他疾病导致死亡，给养兔业带来巨大经济损失。另外，本病还可感染人，常造成人的体癣、头癣和手癣，极大地影响了人们的身体健康。家兔皮肤真菌病病原有须癣毛癣菌，即石膏样毛癣菌，絮状表皮癣菌，石膏样小孢子菌，黄癣菌(许兰氏原型)及念珠菌属的热带念珠菌等，其中以须癣毛癣菌最常见，从生长形态上I型，III型，V型，给鉴定带来一定的难度。

多年来，传统的鉴别菌种的方法主要依靠真菌培养物的菌落形态及真菌菌丝的显微镜观察及一些生理、生化、免疫学方法。镜检虽然快速、经济，但缺乏种特异性，敏感性低。体外培养消耗时间较长，一般需要10-15天，并且易受外界因素的影响发生表型特征的改变，需要多年的实践经验和技术。近年来，分子生物学技术以其敏感度高、快速、简便的优点运用到真菌鉴定中，它不仅能检测出活的致病菌，而且也能检测出死亡的和难以培养的真菌。另外，因病原体的基因型比形态特征更具特异性及精确性，不会受外界影响因素的变化而改变。

目前，针对皮肤真菌的治疗，已开发了很多新的药物，由于许多新的广谱药物有各自不同的抗菌谱，有些新的唑类药物甚至在亲缘关系相近的某些皮肤癣菌中仍呈现不同的最小抑菌浓度。另外，由于生态环境的不同，不同菌株都处于一个动态的改变过程中，其治疗方案就必须针对特定病原菌，根据病原学，有针对性选择抗真菌药物。

鉴于以上原因，非常有必要建立一个快速、简便的鉴定方法，能够在家兔皮癣菌在兔场流行之前采取有效措施进行防控，在引进种兔时进行皮肤癣菌病的快速检验、检疫，在兔场皮癣菌净化提供有效监测手段。

在疾病诊断方法，研究人员已经使用以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术，并成功检测了受感染动物病原体。在家兔皮肤癣菌病诊断方面，有基于病原菌核糖体RNA基因区的ITS，设计引物，使用PCR技术和测序分析技术加以鉴别、诊断，有利用随机引物进行皮肤真菌基因组DNA扩增，进行多态性分析，达到鉴别诊断的目的，但是这些方法在临床实践中，成本高，实际操作和分析手段对操作人员要求较高，在临床上难以推广应用。

本发明的DNA序列来自病原菌的基因组未知功能序列，在GenBank序列比对中未发现与之同源性高的序列，设计的特异性引物，通过PCR可有效区别于其它病原菌，从而达到鉴别、鉴定的目的，本发明鉴定、检测方法操作简单，快速，特异性强。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组检验家兔须癣毛癣菌的核苷酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供家兔须癣毛癣菌鉴定方法。

为实现以上目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了鉴定须癣毛癣菌的特异性引物序列和扩增产物的序列。特异性引物对包括正向引物序列SEQ ID NO：1所述的碱基序列，反向引物序列SEQ ID NO：2，以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的互补序列，扩增产物序列的互补序列。

本发明还提供了一种用于鉴定家兔须癣毛癣菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取待测癣菌DNA，或者提取待检测家兔皮肤毛样DNA；

(2)特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

(3)以(1)的DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增；

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/L引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55-60℃30s，延伸72℃100s，35个循环；72℃延伸8-10min。

(4)PCR产物扩增的产物经0.8-1％琼脂糖凝胶电泳、荧光显色后，通过目测或与标准样品比较扩增片段大小达到鉴定须癣毛癣菌的目的。

当扩增产物为单一DNA片段，大小为1580bp，判定为须癣毛癣菌；

当DNA条带数为0，判定为无须癣毛癣菌感染。

下列实施例和附图对本发明作进一步说明，可以用于以下典型实验方案达到发明内容的目的，本发明的实施例并不限于此，凡依照本发明公开序列和引物进行的PCR所做的修改、优化的实施内容，均属于本发明的保护范围。

附图说明：

图1以须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株基因组DNA为样本，鉴定须癣毛癣菌。泳道样品：1：DNAMarker：4500，3000，1200，800，500，200bp；2：犬小孢子菌标准菌株；3：絮状表皮癣菌标准菌株；4：石膏小孢子菌标准菌株；5：须癣毛癣菌标准菌株；6：空白对照；7：兔基因组DNA。

图2以须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株和临床株基因组DNA为样本，鉴定须癣毛癣菌。泳道样品：1：DNAMarker：4500，3000，1200，800，500，200bp；2：须癣毛癣菌标准菌株；3-8：须癣毛癣菌临床菌株；9：犬小孢子菌标准菌株；10-11：犬小孢子菌临床菌株；12：絮状表皮癣菌标准菌株；13-15：絮状表皮癣菌临床菌株；16：石 膏小孢子菌标准菌株；17：石膏小孢子菌临床菌株；18：空白对照；19：兔基因组DNA。

图3以5个家兔皮肤毛样为样本，提取基因组DNA，鉴定须癣毛癣菌。泳道样品：1：DNAMarker：4500，3000，1200，800，500，200bp；2：须癣毛癣菌标准菌株；3：兔基因组DNA；4-8：兔临床毛样DNA；9：空白对照。

具体实施方式：

实施例1：

所选菌株：须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株各一株。将 上述菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，采用尿素法提取基因组DNA，具体操作如下：

尿素提取法。0.05-0.1g研磨好的菌丝样品加入1mL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/LTris-HCl pH 8.0，62.5mmol/LNaCl、1％SDS)，摇匀，12000r/min离心5min，吸取上清液，上清液12000r/min再次离心5min；将上清液移入另一新管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，用力振荡数次混匀，12000r/min离心5min；取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置30min，12000r/min离心15min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥30min，溶于50ul双蒸水中，-20℃保存备用。

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增：

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃100s，35个循环；72℃延伸8min。

取PCR产物各5ul，0.8％琼脂糖电泳，在凝胶成像分析仪上观察，图1结果表明该特异性引物能特异性扩增出须癣毛癣菌，为大小1580bp单一条带，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。

实施例2：

所选菌株：须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准株以及部分临床分离株。上述菌株只是作为实验材料，也可选择其他分离株，对本发明实施没有影响。

将上述菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，提取基因组DNA，具体操作如下：

0.05-0.1g研磨好的菌丝样品(100mmol/L Tris-HCl pH9.0，40mmol/L EDTA pH8.0)，振荡混匀，加入100μL 10％SDS，300μL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状，50℃保温1h，每隔几分钟振荡混匀1次，冷却至室温，加入300μL预冷的3mol/LNaAc(pH5.2)溶液，混匀，然后冰浴15min，11000r/min离心15min；取上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min；取上清，取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置20min，12000r/min离心15min；弃上清液， 倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥30min，溶于50μL双蒸水中，-20℃保存备用。

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增：

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃100s，35个循环，72℃延伸10min。

取PCR产物各5ul，0.8％琼脂糖电泳，荧光显色后，在凝胶成像分析仪通过目测与标准样品比较扩增片段大小达到鉴定须癣毛癣菌的目的。

结果：从图2所示，该特异性引物能特异性扩增出须癣毛癣菌标准菌株和临床菌株，为大小约1500bp单一条带，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌标准菌株及临床菌株和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。结果判定：当扩增产物为单一DNA片段，大小为1580bp，判定为须癣毛癣菌；当DNA条带数为0，判定为无须癣毛癣菌。

实施例3：

所选菌株：须癣毛癣菌标准株一株，临床家兔皮肤毛样5个样本。上述菌株只是作为实验材料，也可选择其他分离株，对本发明实施没有影响。

将须癣毛癣菌标准菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.05-0.1g于1.5ml Eppendorf管中，采用氯化苄法提取基因组DNA，临床毛样采用氯化苄法提取基因组DNA，具体操作如下：

0.05-0.1g研磨好的菌丝样品、0.01-0.1g家兔皮肤毛样(100mmol/L Tris-HCl pH9.0，40mmol/L EDTA pH8.0)，振荡混匀，加入100μL 10％SDS，300μL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状，50℃保温1h，每隔几分钟振荡混匀1次，冷却至室温，加入300μL预冷的3mol/L NaAc(pH5.2)溶液，混匀，然后冰浴15min，11000r/min离心15min；取上清液，加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，12000r/min离心5min；取上清，取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置20-60min，12000r/min离心15-30min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥10-30min，溶于50μL双蒸水中，-20℃保存备用。

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增：

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。

反应条件：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃100s，35个循环；72℃延伸10min。

取PCR产物各5ul，1％琼脂糖电泳，在凝胶成像分析仪上观察，结果见图3。结果表明5个临床样(4-7泳道)有4个扩增产物为单一DNA片段，大小为1580bp，判定为须癣毛癣菌，1个(8泳道)DNA条带数为0，判定为非须癣毛癣菌。将5个毛样接种PDA平板，28℃培养2-7天，挑取菌丝体，通过形态学、生物学验证，结果表明4-7泳道毛样被感染的癣菌为须癣毛癣菌，8泳道分离到絮状表皮癣菌，结果同PCR结果一致。

实施例4：

所选菌株：须癣毛癣菌标准株一株，临床家兔皮肤毛样7个样本。将须癣毛癣菌标准菌株接种于真菌选择性琼脂培养基(大豆胨1％，葡萄糖4％，琼脂1.8％，氯霉素0.005％，放线菌酮0.05％)的菌丝体接种于150ml真菌选择性液体培养基，28℃培养10-15天，挑取菌丝体于研钵中，液氮研磨，将磨碎的菌丝体0.1g于1.5ml Eppendorf管中，采用尿素法提取基因组DNA，临床毛样采用尿素法提取基因组DNA，具体操作如下：

尿素提取法。0.05-0.1g研磨好的菌丝样品、0.01-0.1g家兔皮肤毛样(加入1mL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，62.5mmol/LNaCl、1％SDS)，摇匀，12000r/min离心5min，吸取上清液，上清液12000r/min再次离心5min；将上清液移入另一新管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，用力振荡数次混匀，12000r/min离心5min；取上清到一新管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)，-20℃放置30min，12000r/min离心15min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70％无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥30min，溶于50ul双蒸水中，-20℃保存备用。

特异性引物对：人工合成正向引物序列SEQ ID NO：1和反向引物序列SEQ ID NO：2。

采集健康家兔血1ml，用全血基因组DNA提取试剂盒提取家兔基因组DNA，作为PCR反应阴性对照样本，具体操作可参考所购相关试剂盒说明书。

以上述DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增：

PCR 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol/LdNTP 1μL，25mmol/L Mg²⁺1μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10mmol/l引物各1μL，模板(基因组DNA)1μL，不足部分用双蒸水补足。

反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃100s，35个循环，72℃延伸10min。

取PCR产物各5ul，0.8％琼脂糖电泳，在凝胶成像分析仪上观察，结果表明7个临床样均为须癣毛癣菌，。将7个毛样接种PDA平板，28℃培养2-7天，挑取菌丝体，通过形态学、生物学验证，结果表明皮肤毛样被感染的癣菌为须癣毛癣菌，结果同PCR结果一致。

Claims (1)

1.本发明提供了一种快速鉴定家兔须癣毛癣菌的分子生物学方法，其特征是：

A.用于鉴定须癣毛癣菌的寡核苷酸引物对，即正向引物序列SEQ ID NO：1(5’-TCAAGGTCCTACAATTACGCCCATA-3’)和反向引物序列SEQ ID NO：2(5’-AATACATCCTCCTACCGGGTCC-3’)及其反向序列；

B.用于鉴定须癣毛癣菌的长度为1580bp的核苷酸序列及其反向序列；

C.一种鉴定须癣毛癣菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测菌或家兔皮肤毛样DNA；

(2)以(1)DNA为模板，使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物进行PCR扩增；

(3)通过目测PCR产物凝胶电泳后显色结果，来鉴定须癣毛癣菌：

扩增条带为大小1580bp单一条带，判定为须癣毛癣菌，絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌、犬小孢子菌和兔基因组DNA、空白对照无扩增片段。 

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