KR101149437B1 - 벼흰잎마름병균의 유전자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 레이스 판별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼흰잎마름병을 일으키는 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )의 유전체에 존재하는 특정 유전자 마커, 마커에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용하여 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 유전적 다형성을 판별하는 방법을 제공한다.

벼흰잎마름병, 유전자 마커, 멀티플렉스 PCR, 레이스

Description

벼흰잎마름병균의 유전자 마커, 이에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용한 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 레이스 판별 방법{Genetic markers for Xanthomonas oryzae pv.oryzae, primers for the markers, and method for detecting and discriminating Xanthomonas oryzae pv.oryzae}

본 발명은 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 유전적 다형성 판별에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 벼흰잎마름병을 일으키는 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )의 유전체에 존재하는 특정 유전자 마커, 마커에 특이적인 프라이머, 및 이를 이용하여 벼흰잎마름병 감염 여부 및 감염 균주의 유전적 다형성을 판별하는 방법에 관한 것이다.

벼흰잎마름병은 벼흰잎마름병원균인 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)에 의해 발병하는 세균병으로 주로 잎에 발생되며, 피해 양상은 광합성 부족에 의한 임실률 및 등숙률 저하에 의한 수량 감소 및 품질 저하를 가져온다. 벼흰잎마름병은 우리나라는 물론 아시아, 아프리카, 라틴아메리카, 호주 등 대부분의 벼 재배지역에서 발생되고 있으며, 특히 동남아시아 지역에서 피해가 매우 심한 병으로 알려져 있다.

현재 벼 재배지역의 벼흰잎마름병원균의 존재 여부 확인을 통한 병 발생 예찰은 논물이나 식물체를 대상으로 박테리오파지의 밀도분석을 통하여 하고 있으나 이러한 방법은 많은 시간과 수고를 요한다.

한편, 같은 식물병원균 내에서의 분화형 또는 변종 중에서 기준 품종에 대한 기생성이 다른 것을 칭하는 레이스(race)의 판별을 위해서는 벼 품종을 대상으로 한 병원성 검정을 수행하고 있다.

현재, 우리나라에서는 일본판별품종을 우리나라 판별품종으로 대체하여 레이스를 검정하고 있으며 그 결과 5개의 레이스(K1,K2, K3, K4, K5)가 있음이 보고되었다.

현재 수행되고 있는 벼흰잎마름병원균의 병원형 (레이스) 판별은 분자생물학적 방법을 이용한 유전적 다형성 혹은 특성을 분석한 것이 아니라 식물체 (벼)에 대한 병원성 검정을 통한 벼와의 병원성 상관관계에 의해 1985년에 정립된 개념이며 이는 일본에서 정립된 판별체계를 국내 벼품종으로 대체하여 수립한 체계이다. 이로 인하여 유전형과 병원형이 서로 일치하지 않는 결과를 초래하였고, 검정에 따른 시간과 비용이 많이 발생하였다.

일본, 미국 등에서는 벼흰잎마름병원균의 유전학적 분류를 위해 유전자 마커를 개발하고 PCR(polymerase chain reaction)과 같은 분자생물학적 방법으로 실제적인 적용을 하여 벼흰잎마름병원균의 유전적 차이 및 레이스를 구분하였다. 그러나 이러한 기존의 개발된 유전자 마커들은 지리적 차이와 같은 다양한 원인으로 국내 벼흰잎마름병원균에는 적용이 불가능함을 확인하였다.

삭제

이에 본 발명자들은 종래에 수행되었던 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 동 균주의 유전적 차이를 확인하는데 따른 고비용 및 저효율의 단점을 극복하기 위해, 새로운 유전자 마커를 개발하고 이를 이용한 분자생물학적 분석 방법으로 신속하고 정확하게 벼흰잎마름병원균의 식물체(벼) 감염 여부 및 유전적 다형성을 확인하기 위해 벼흰잎마름병원균 유전체 해독정보로부터 벼흰잎마름병원균 종내 특이적 다형성을 나타낼 것으로 예측되는 다양한 유전자들에 대한 분자생물학적 사전 분석연구를 수행하였다. 이러한 선행 연구결과를 바탕으로 최종 3종의 유전자 마커를 선발하고 이에 대한 특이적 프라이머를 개발하여 이를 이용한 멀티플렉스-PCR 분석을 통한 벼흰잎마름병원균의 검출 및 판별 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 각각 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 세 가지 유전자 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열 각각에 대하여 특이적인 세 쌍의 프라이머를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 벼흰잎마름병원균의 감염 여부를 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대해 각각 특이적인 세 쌍의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR에 의해 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대해 각각 특이적인 세 쌍의 프라이머를 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스 판별 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 각각 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 세 가지 유전자 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열 각각에 대하여 특이적인 세 쌍의 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대하여 각각 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 벼흰잎마름병원균의 감염 여부를 판단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대해 각각 특이적인 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR에 의해 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하는 방법을 제공한다. 즉, 본 발명에서는, 서열 번호 1, 2, 3의 3개의 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 함께 사용하는 멀티플렉스 PCR에 의해 벼 시료에서 상기 3개의 유전자를 동시에 검출하는 것을 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대해 각각 특이적인 세 쌍의 프라이머를 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스 판별 키트를 제공한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

일 태양에 따라, 본 발명은 각각 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열을 포함하는 벼흰잎마름병원균의 유전자 마커 세 가지를 제공한다.

이들 세 가지 유전자 마커는 벼흰잎마름병원균 유전체 해독정보로부터 벼흰잎마름병원균 종내 특이적 다형성을 나타낼 것으로 예측되는 다양한 유전자들에 대한 분자생물학적 사전 분석연구를 수행하여 그 연구결과를 바탕으로 선발된 것으로, 이들은 XOO0606 유전자(XorII 베리-쇼트-리페어 엔도뉴클레아제(very-short-patch-repair endonuclease ))(서열 번호 1), XOO4247 유전자 (데옥시구아노신트라이포스페이트 트라이포스포하이드롤라제(deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase); dgt) (서열 번호 2), XOO0079 유전자 (hpaA)(서열 번호 3) 이다.

다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 염기 서열 각각에 대해 특이적인 세 쌍의 프라이머를 제공한다.

서열 번호 1의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머는 하기와 같다.

XOO0606-F : 5'-caatacagacacgcaaccag-3'(서열 번호 4)

XOO0606-R : 5'-ggtcaaggatgttcctaagc-3'(서열 번호 5)

서열 번호 4와 5의 프라이머쌍은 서열 번호 1의 염기 서열을 주형으로 한 PCR에서 427 bp의 생성물이 얻어지도록 한다.

서열 번호 2의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머는 하기와 같다.

XOO4247-F : 5'-acagaggtagccgaatcaac-3'(서열 번호 6)

XOO4247-R : 5'-gtctggatctaaccgacttc-3'(서열 번호 7)

서열 번호 6과 7의 프라이머쌍은 서열 번호 2의 염기 서열을 주형으로 한 PCR에서 529 ~ 2800 bp의 생성물이 얻어지도록 한다.

서열 번호 3의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머는 하기와 같다.

XOO0079-F : 5'-atgccgatcaccatgccgat-3'(서열 번호 8)

XOO0079-R : 5'-cctgccttggagcgccaccgt-3'(서열 번호 9)

서열 번호 8과 9의 프라이머쌍은 서열 번호 3의 염기 서열을 주형으로 한 PCR에서 327 bp의 생성물이 얻어지도록 한다.

상기 프라이머들은 당업계에 공지된 합성 기술에 의해 얻을 수 있다.

다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용한 PCR에 의해 벼흰잎마름병원균의 감염 여부를 판단하는 방법을 제공한다.

먼저 벼 시료를 준비한 후, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열에 대하여 특이적인 프라이머를 이용하여 벼 시료에서 PCR을 진행한다. 바람직하게는, 프라이머로, 서열 번호 4와 5, 서열 번호 6과 7, 및 서열 번호 8과 9로 이루어진 세 쌍의 프라이머 중 어느 한 쌍의 프라이머를 이용할 수 있다. PCR이 끝난 후에는 전기영동에 의해 PCR 생성물을 확인한다.

PCR은 당업계에 공지된 PCR 기법에 의해 수행될 수 있다.

본 방법에 따라 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 생성물을 확인하여, 이용된 프라이머쌍에 의해 증폭된 PCR 산물이 확인될 경우, 벼의 감염이 확인된다.

다른 태양에 따라, 본 발명에서는, 서열 번호 1, 2, 3의 3개의 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 함께 사용하는 멀티플렉스 PCR에 의해 벼 시료에서 상기 3개의 유전자를 동시에 검출하는 것을 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하는 방법을 제공한다. 프라이머에 대한 설명은 위와 동일하다.

본 방법은 바람직하게는, 서열 번호 4와 5, 서열 번호 6과 7, 및 서열 번호 8과 9로 이루어진 세 쌍의 프라이머를 함께 이용하여 벼 시료에서 멀티플렉스 PCR을 진행하는 단계와; 전기영동에 의해 PCR 생성물을 확인하는 단계;를 포함한다.

멀티플렉스 PCR이란 여러 염기 서열을 다수의 프라이머쌍을 이용하여 1개의 반응 튜브내에서 PCR 반응시키는 것을 말한다.

멀티플렉스 PCR의 반응 조건은 당업자가 용이하게 선택하여 이용할 수 있을 것이다.

본 방법에 따라 벼 시료를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시할 경우, 벼흰잎마름병원균으로 감염된 벼의 경우 상기 세 쌍의 프라이머 중 적어도 한 쌍의 프라이머로 증폭된 생성물이 존재하게 되므로 감염 여부를 쉽게 확인할 수 있다.

또한, 본 방법에 따라 상기 세 쌍의 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시할 경우, 약 300bp의 증폭 산물은 모든 벼흰잎마름병원균들에서 동일하게 존재하며, 그 이상 크기의 증폭 산물들은 (450bp ~ 2,800bp)은 K1, K2 레이스에서 주로 존재하여 기존 판별체계보다 세분화된 판별이 가능하며, 국내 우점종으로 확인된 99% 이상의 K3(a)레이스는 3종의 유전자 마커 중 오직 하나의 마커인 XOO0079(327 bp)만이 존재하므로, 이러한 증폭 산물의 비교에 의해 레이스의 판별이 가능하다.

다른 태양에 따라, 본 발명은 서열 번호 1 내지 3의 서열에 대해 각각 특이적인 세 쌍의 프라이머를 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스 판별 키트를 제공한다.

본 발명 키트는 바람직하게는, 서열 번호 4와 5, 서열 번호 6과 7, 및 서열 번호 8과 9의 프라이머 쌍들을 포함하며, 이에 더하여 PCR 반응, 전기 영동 등에 필요한 추가의 시약을 더 포함할 수 있다.

세계 3대 식량작물은 벼, 밀, 옥수수인데 이중 우리나라 등 아시아권에서는 벼가 가장 중요하게 여겨지고 있다. 그러나 벼는 생장단계에서 여러 가지 병에 걸리는데 그 중 피해를 가장 많이 일으키는 것이 벼흰잎마름병균이고, 그 다음이 도열병이다. 특이할 만 한 점은 지구온난화의 영향으로 최근에 우리나라 벼재배에 있어 가장 많은 피해를 일으키는 병이 도열병에서 벼흰잎마름병으로 그 발생 빈도가 역전되었는데 작년 통계에 의하면 우리나라에서 벼흰잎마름병으로 인한 피해액은 연간 1,000억 원 정도로 추정되고 있다. 또한 벼흰잎마름병원균의 레이스 분포가 변화하고 발생지역이 점차 확산되고 있으며 지구온난화의 영향 등으로 발생시기도 앞당겨지고 있다. 그러나 기존에 개발된 약제(테람, 훼나진, 솔라자 액상수화제 등)에 의한 방제는 그 효과가 미미한 실정이기 때문에 실제적인 벼흰잎마름병원균의 방제는 불가능한 상황이다. 이를 극복하기 위한 방안으로 본 발명에 의해 개발된 유전자 마커를 이용하여 벼 재배 지역의 벼흰잎마름병원균 감염 여부 확인과 동시에 유전적 다형성 (레이스) 판별을 신속하고 정확하게 수행한다면 병 발생의 조기 예찰이 가능하며 이를 통한 피해의 최소화를 이룰 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 한편, 하기의 실시예에서 특별히 언급되지 아니한 분자생물학적 실험기법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989)을 참조하였다.

실시예

실시예 1. 벼흰잎마름병원균의 배양

수집된 벼흰잎마름병원균을 영양 브로쓰(Nutrient broth) (0.3% 소고기 추출물(beef extract), 0.5 % 펩톤) 액체 배지에 접종하여 28℃ 인큐베이터에서 2일간 정치 배양하였다. 유전적 다형성 분석에 사용된 균주는 표 1에 정리하였다.

[표1]

번호	균주	레이스	번호	균주	레이스	번호	균주	레이스
1	KACC10331	(K1)	34	HB 02024	(K3)	67	HB 03091	(K3)
2	KACC10878	(K1)	35	HB 02038	(K3)	68	HB 04000	(K3)
3	KACC10859	(K1)	36	HB 02041	(K3)	69	HB 04002	(K3)
4	KACC10380	(K1)	37	HB 03002	(K3)	70	HB 04007	(K3)
5	HB 01013	(K1)	38	HB 03009	(K3)	71	HB 04009	(K3)
6	HB 02010	(K1)	39	HB 03010	(K3)	72	HB 04012	(K3)
7	HB 02022	(K1)	40	HB 03013	(K3)	73	HB 04015	(K3)
8	HB 02027	(K1)	41	HB 03014	(K3)	74	HB 04021	(K3)
9	HB 02028	(K1)	42	HB 03029	(K3)	75	HB 04022	(K3)
10	HB 02033	(K1)	43	HB 03034	(K3)	76	HB 04023	(K3)
11	HB 02045	(K1)	44	HB 03035	(K3)	77	HB 04024	(K3)
12	HB 03011	(K1)	45	HB 03042	(K3)	78	HB 04030	(K3)
13	HB 03087	(K1)	46	HB 03045	(K3)	79	HB 04031	(K3)
14	HB 04006	(K1)	47	HB 03046	(K3)	80	HB 04050	(K3)
15	HB 04027	(K1)	48	HB 03047	(K3)	81	HB 04052	(K3)
16	HB 04068	(K1)	49	HB 03050	(K3)	82	HB 0102	(K3a)
17	KACC 10382	(K2)	50	HB 03054	(K3)	83	HB 0103	(K3a)
18	HB 01014	(K2)	51	HB 03055	(K3)	84	HB 0109	(K3a)
19	HB 02030	(K2)	52	HB 03058	(K3)	85	HB 03032	(K3a)
20	HB 03026	(K2)	53	HB 03059	(K3)	86	HB 04045	(K4)
21	HB 03028	(K2)	54	HB 03060	(K3)	87	HB 04034	(K5)
22	HB 04046	(K2)	55	HB 03061	(K3)	88	HB 04037	(K5)
23	HB 04048	(K2)	56	HB 03063	(K3)	89	HB 04039	(K5)
24	HB 04059	(K2)	57	HB 03065	(K3)	90	HB 04040	(K5)
25	HB 04032	(K2)	58	HB 03067	(K3)	91	HB 04044	(K5)
26	HB 04049	(K2)	59	HB 03071	(K3)	92	HB 04047	(K5)
27	HB 01015	(K3)	60	HB 03072	(K3)	93	HB 04054	(K5)
28	HB 01001	(K3)	61	HB 03074	(K3)	94	HB 04058	(K5)
29	HB 01002	(K3)	62	HB 03076	(K3)	95	HB 04071	(K5)
30	HB 01003	(K3)	63	HB 03077	(K3)
31	HB 01005	(K3)	64	HB 03079	(K3)
32	HB 02003	(K3)	65	HB 03084	(K3)
33	HB 02019	(K3)	66	HB 03086	(K3)

실시예 2. 벼흰잎마름병원균 검출 및 판별을 위한 특이적 프라이머 제작

벼흰잎마름병원균의 유전체 정보로부터 멀티플렉스-PCR 분석용 특이 프라이머 제작을 위해 3종 (XOO0079, XOO0606, XOO4247)의 유전자 마커를 선발하였다 (도1). 선발된 각각의 유전자 내의 염기서열을 바탕으로 PCR을 위한 특이적 프라이머 3쌍을 제작하였다 (도 2).

실시예 3. 벼흰잎마름병원균 검출 및 판별용 특이적 프라이머를 이용한 멀티플렉스-PCR

실시예 1에서 배양된 95 균주의 벼흰잎마름병원균과 실시예 2에서 제작된 특이 프라이머를 사용하여 멀티플렉스-PCR을 수행하였다. PCR 증폭반응은 PTC-225 써멀사이클러(thermalcycler) (MJ research, USA)를 사용하여 실시하였으며, 반응은 프로-핫 스타트(Pro-Hot Start) PCR 마스터 믹스(Master Mix) (TNT research, Korea)에 5 pmole의 XOO0079-F, XOO0079-R, XOO0606-F, XOO0606-R 프라이머 및 15 pmole의 XOO4247-F, XOO4247-R 프라이머와 각각의 배양된 세포 1㎕를 첨가하여 총량이 20㎕가 되게 하여 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 15 초, 62℃ 15초, 72℃ 30초로 20회 반응하였다. 반응 후 PCR 증폭산물을 1% 농도의 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티듐 브로마이드에 착색시켜 UV 상에서 확인하였다. 3종의 특이 유전자 마커유래 프라이머를 이용하여 95점의 벼흰잎마름병원균에 대한 멀티플렉스-PCR 분석을 수행한 결과 약 300bp의 증폭 산물은 모든 벼흰잎마름병원균들에서 동일하게 존재하는 것을 확인하였고, 그 이상 크기의 증폭 산물들은 (450bp ~ 3,000bp)은 K1, K2 에서 주로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 현재 국내 우점종으로 확인된 99% 이상의 K3(a)레이스는 3종의 유전자 마커 중 오직 하나의 마커만이 존재하는 것을 확인하였다 (도 3).

실시예 4. 벼흰잎마름병원균 검출 및 판별용 프라이머의 특이성 분석

실시예 2에서 제작된 프라이머의 벼흰잎마름병원균에 대한 특이적 증폭을 확인하기 위해 벼흰잎마름병원균 (6균주)과 다른 잔토모나스(Xanthomonas ) 속 세균 (27균주, 표2)을 대상으로 PCR 증폭반응을 실시예 3과 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 수행결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 벼흰잎마름병원균에서만 특이적 증폭 산물이 확인되었으며 기타 다른 세균에서는 유사한 양상의 증폭 산물을 확인할 수 없었다.

[표 2]

번호	균주명	번호	균주명
1	Xanthomonas translucens vauterin	18	Xanthomonas campestris pv. campestris
2	Xanthomonas translucens pv. phleipratensis	19	Xanthomonas campestris pv. aurantifolii
3	Xanthomonas translucens pv. hordei	20	Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria
4	Xanthomonas translucens pv. cerealis	21	Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum
5	Xanthomonas translucens pv . translucens	22	Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
6	Xanthomonas theicola	23	Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum
7	Xanthomonas sesami	24	Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae
8	Xanthomonas fragariae	25	Xanthomonas axonopodis pv. citri
9	Xanthomonas cucurbitae	26	Xanthomonas axonopodis pv. citri
10	Xanthomonas codiaei vauterin	27	Xanthomonas axonopodis pv. begoniae
11	Xanthomonas cassavae	28	anthomonas oryzae pv. oryzae
12	Xanthomonas cempestris pv . malvacearum	29	Xanthomonas oryzae pv. oryzae
13	Xanthomonas campestris pv . juglandis	30	Xanthomonas oryzae pv. oryzae
14	Xanthomonas campestris pv. glycines	31	Xanthomonas oryzae pv. oryzae
15	Xanthomonas campestris pv. glycines	32	Xanthomonas oryzae pv. oryzae
16	Xanthomonas campestris pv. campestris	33	Xanthomonas oryzae pv. oryzae
17	Xanthomonas arboricola pv. poinsettiicola

실시예 5. 벼흰잎마름병원균 감염 식물시료(벼)로부터 벼흰잎마름병원균 직접 검출 및 판별

벼로부터 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 균 분리 및 핵산(genomic DNA)추출 등과 같은 추가적인 작업 없이 보다 신속하게 확인하기 위해 벼흰잎마름병원균에 감염된 벼 시료를 대상으로 PCR 분석을 수행하였다. 감염된 벼잎과 건전잎의 약 0.5cm 정도를 1.5ml 튜브에 넣고 멸균 증류수 약 300㎕ 첨가하여 침전시킨 후 약 10분간 정치하였다. 10분간 정치한 후 300㎕의 침전물 중 5㎕의 시료를 반응액에 첨가하여 실시예 3과 동일한 조건으로 PCR 증폭반응을 수행하였다. PCR 증폭반응 수행결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 감염된 벼잎에서만 증폭 산물이 확인되었고, 건전잎에서는 확인할 수 없었다.

제1도는 벼흰잎마름병원균 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331) 유전체에서 분리한 hpaA (XOO0079), XorII 베리-쇼트-패치-리페어 엔도뉴클레아제(very-short-patch-repair endonuclease ) (XOO0606), 데옥시구아노신트라이포스페이트 트라이포스포하이드롤라제(deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase (XOO4247) 유전자 염기서열임.

제2도는 벼흰잎마름병원균의 특이적 검출 및 판별을 위해 Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331의 XOO0079, XOO0606, XOO4247 유전자 부위에서 제작된 프라이머임.

제3도는 95 균주의 벼흰잎마름병원균을 제작된 검출 및 판별 특이 프라이머를 사용하여 멀티플렉스-PCR 분석을 수행한 사진임.

* 도면 기호에 대한 설명

K1, K2, K3, K4, K5 : 국내 벼흰잎마름병원균의 레이스

제4도는 벼흰잎마름병원균 및 기타 다른 잔토모나스 속 세균들을 대상으로 멀티플렉스-PCR 분석을 수행한 사진임.

* 도면 기호에 대한 설명

잔토모나드(xanthomonads) : 잔토모나스 속 세균 (27종), xoo : 벼흰잎마름병원균

제5도는 벼흰잎마름병원균 감염 여부를 확인하기 위한 증류수 침전법 (좌) 및 멀티플렉스-PCR 분석을 수행한 사진 (우)임.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Genetic markers for Xanthomonas oryzae pv.oryaze, primers for the markers, and method for detecting and discriminating Xanthomonas oryzae pv.oryzae <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 411 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <220> <221> gene <222> (1)..(411) <400> 1 atgactgacc gattgtcccc cgagcgtcgt cgctatctga tgcagcaggt aagaagtaag 60 aacacgcggc ccgagaaggc ggtgcgctct ctactgcata gcattggcta ccgcttccga 120 ctgcaccgca aagacttgcc tggaactccc gatatcgtgt ttccgagccg gcgcttagtg 180 ttgttcgtgc atggctgctt ctggcacggt catgggtgtc ggatcggaca actaccgaaa 240 tcgcgcctcg actactggag tccgaagatc gaggccaatc gagctcgcga tcagcgaaag 300 gaagccgctt tggccgcaga aggctggcgc gttgccgttg tctggcagtg cgagctgagc 360 gatctcggcg ctttggaggc acggcttagg aacatccttg acccgagcta a 411 <210> 2 <211> 1455 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <220> <221> gene <222> (1)..(1455) <400> 2 atgagaaaca aagaaggcga ccttttaggt cgccttcttt gttttgtgtg ggttacgatc 60 acgcttcggg aaaagcacaa gggaagggaa ggcatgtatc aaacactgct tactaatgag 120 cgcttgcgtc caagctcgcg ggggaaagag agcattgcgc aggaagttga gagcgatcgc 180 tcccgtgtgc tgtactcggc atcgttccga aggctacaac gtaagacgca ggttttccct 240 ctagaagaca atgctgctgt gcgtactcga ctcacacatt cgttagaggt agcccatgtt 300 ggtcgctttc tcgctacaag cgtaattcag cgagtctctg agaaagggct tatagctagc 360 tggggtctgg atctaaccga cttcaaacat gctttcgttg tcacagttga ggttgcatgt 420 cttctgcatg atattggtaa tccgccattc gggcattttg gtgaggctgc catagctaag 480 tggtttacaa aatgcagtgc gaaaaattcc tatttcaatg attttacagg ttttgacggg 540 aacccccagg gattccgtat tgtaactaag ctgaatggtt ccgacggttt gaccgggatg 600 aatctgacgt tatcacagct ggcctcaacg ctgaaatatc cttcaactcc ttcagaaaag 660 agtcgttata agaaatttgg cgcctttttt accgagcaag aagcactcaa ggatgttaga 720 gataaatttt cccttcggcc cgagcagcga catcctctgg cttatctaat ggaggctgct 780 gacgatatct gctattgcct cagtgacatt gaggatggtg tagaaaaacg tctactcact 840 catgataagt ttattgatga gttgatgtcc gaggttgatt cggctacctc tgtaaagctt 900 atcgttgaag ctacaaggga ctcagcgaga gctgcgtcga aagttgatga gacggtagcc 960 tttcgtagtg ctctcgtgag gcggtttgtt gcggcggctg cctctaatta tgtggatgag 1020 catgaagaaa ttatgtccgg aagcctgcaa gaggtgatcc aagaagatag tgagtatggc 1080 cttcttttga cggctattaa gaaggttgtg cgaaataatg tgtatacgga tccatccatt 1140 caatctctgg agttatcggg atatgcggcg atcacgggac ttctagatcg ctttggaatt 1200 ttgttggaag ttccaaggga gaaatttctt tgcttgttgg ctcctggtgc aaggatcgcg 1260 ggctatgacg tcgagaaacg attggtcgat tttattgcag ggaggcacgt ttcaacctac 1320 aggcaagcgg tcgaatcttg taatgatgac gacgagtctt ggcatcgggc ccacctaatc 1380 gttgactata tttccggtat gactgattcg tttgctatgg agatgcataa gattttgggt 1440 ggaacaaagt ggtga 1455 <210> 3 <211> 828 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <220> <221> gene <222> (1)..(828) <400> 3 atgatccgtc gcatctcgcc cggtcccttg cagccctcgg tttccaccga gcatggcggc 60 tcgcatcacc atgccgatca ccatgccgat gcggcaagca ccagcgcagg gtcgcctgcc 120 gacattgcgg caagagcaac ccgtctgcgc cctgctccac cgcgcaggcg acgacgcggg 180 aaccggtcgc tggacggcca cgaggatgaa ttcgacgcca acgagcagga agagatcgaa 240 gccaaacgcg agtgcgcact gcgcggacgg gtaagcgtgg cgatcgctcc ggcccagagc 300 cgggagcatg gccagagcga ccagcacggc ggtgaccgca acacgcatac cgacgacacg 360 caggccggtc cgtggcacgg tggcgctcca aggcaggtga ccgacagcat acgcacgtgc 420 atcgacgcga ttctcaatcg ctacgtggcc aggcgcgacg ccgatccagt ggccaagcga 480 gacgcgctgg ctgctgcgct tgtcgaactg cgcgccatcg gcgtttcgca tcctgccgtc 540 gccccgttga ctgagacggt ctggaggttg atgcgcgagc atctgagctc gtacgacaag 600 gccaccgcgg cggaaaacct gcagaccttg cggacccgat tactggagtt gatgccatcc 660 gagttggaac cggtgccagc gctacgcaat tttcatctac tgcttccact gatattgctg 720 aatgcggaaa aaccgcgcag acaggtcgat cgtagacatg ccatcacacg tctgaacaca 780 cttctgattg agcaaccaga acaggcggct caggaggttc gcccatga 828 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 4 caatacagac acgcaaccag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 5 ggtcaaggat gttcctaagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 6 acagaggtag ccgaatcaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 7 gtctggatct aaccgacttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 8 atgccgatca ccatgccgat 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 9 cctgccttgg agcgccaccg t 21

Claims (9)

1. 서열 번호 1, 2, 3의 3개의 유전자에 각각 특이적인 프라이머를 함께 사용하는 멀티플렉스 PCR에 의해 벼 시료에서 상기 3개의 유전자를 동시에 검출하는 것을 포함하는, 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하는 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 프라이머는 서열 번호 4와 5의 프라이머쌍, 서열 번호 6과 7의 프라이머쌍, 및 서열 번호 8과 9의 프라이머쌍으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 3개의 유전자를 동시에 검출하는 것은,

   서열 번호 4와 5, 서열 번호 6과 7, 및 서열 번호 8과 9의 세 쌍의 프라이머를 함께 사용하여 벼 시료에서 멀티플렉스 PCR을 진행하는 단계와;

   전기영동에 의해 PCR 생성물을 확인하는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 서열 번호 1, 2, 3의 3개의 유전자에 각각 특이적인 3쌍의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벼 시료에서 벼흰잎마름병원균의 감염 여부 및 레이스를 동시에 판별하기 위한 키트.
5. 제4항에 있어서,

   상기 프라이머는 서열 번호 4와 5의 프라이머쌍, 서열 번호 6과 7의 프라이머쌍, 및 서열 번호 8과 9의 프라이머쌍으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 키트.
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