CN102888399B - 鉴定水稻高抗白叶枯病基因的sts分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该STS分子标记引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向引物：5’GGGAGAAATTGGCCCCAGTTAGAGAA3’，反向引物：5’ GCTTCACTTGATCACTGCTGTTTG3’。本发明还同时公开了该STS分子标记的用途：用于对水稻抗白叶枯病Xa7基因的辅助选择育种或者用于克隆Xa7基因。
Description
技术领域
本发明涉及一个高抗、广谱、持久抗水稻白叶枯病的基因的分子标记及其在育种中的应用，属于分子遗传育种领域。
背景技术
水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo.）所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20～30％，严重时可达50％，甚至绝收，同时稻米品质也会受到影响。自20世纪50年代以来，水稻白叶枯病发病范围逐渐扩大，开始遍布世界各大水稻产区（Mew，1987）。目前，国内大面积种植的杂交稻对白叶枯病的抗性比较差，主要原因是三系杂交稻中野败型、矮败型、冈型、D型、印水型和红莲型等不育系都不抗白叶枯病，而恢复系的抗性又大多源于Xa4基因，长期大面积地使用单一抗源导致了新致病菌株的进化，使得生产上仅利用Xa4的水稻品种逐渐表现出感病，抗病的持久性得不到保证（章琦，2009）。因此，如何利用新的抗病基因，尽快提高杂交稻的抗病性是育种中急待解决的问题。
迄今，从水稻中鉴定的抗白叶枯病基因已经有30多个（章琦，2005；刘丙新，2010），其中24个为显性基因，9个为隐性基因，为抗病基因的利用和开发提供了极好的遗传资源。目前，已有7个抗白叶枯病基因被克隆，分别是Xa21（Song，1995）、Xa1（Yoshimura，1998）、xa5（Iyer，2004）、Xa3（或Xa26；Sun，2004）、Xa27（Chu，2006）、xa13（Chu，2006）和Xa23（王春连，2006；张小红，2008）。Xa21编码一个LRR（Leucine rich repeats）类受体激酶的膜蛋白；Xa1编码一个NBS-LRR型蛋白，氨基端含一个核苷酸结合位点NBS（nucleotide binding site），而羧基端含一个LRR结构域；Xa3与Xa26被证明是同一个基因，编码一个LRR类受体蛋白激酶，包括胞外的LRR结构、一个跨膜区和胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域；xa5编码一个通用转录因子（general transcription factors）TFⅡA的γ亚基（即OsTFⅡAγ5）；xa13、Xa23和Xa27各自编码一类新的蛋白。由此可见，这些基因的功能各异，抗病的机理和途径也多不相同，特别是Xa27和xa13两个基因的抗性都是由启动子突变导致的，这为水稻抗病机制的多样性开辟了新的视野。
已鉴定的Xa基因的抗病性具有各自特点，它们一般不受发育的调控，但有些基因（如Xa3、Xa21）只在成株期发挥抗病的作用；有些基因具有广谱的抗性（如Xa7、Xa21、Xa23），而有些基因（如Xa1）则只对一种或几种生理小种有抗性（Niño-Liu，2006）。所以，尽管抗白叶枯病基因的数目已达到30多个，但是只有少数Xa基因兼具全生育期、广谱、持久等良好的抗病特性；而且，凭借现有的技术只有显性抗病基因（如Xa4、Xa21、Xa23）才能用于杂交稻的生产，而xa5、xa13等隐性基因目前还无法在杂交稻的抗病育种中应用（刘丙新，2010）。因此，真正能有效地用于水稻抗白叶枯病的育种和生产的基因并不多。现在Xa基因的育种应用主要还是集中在杂交水稻品种的抗性改良上，育种工作者们已经利用Xa4、Xa21和Xa23选育出了许多抗病恢复系品种，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54以及具有IR系统亲缘的测64-7和桂99等恢复系都携有Xa4基因（章琦，2009）；彭应财等（2003）利用分子标记辅助选择（molecular assisted selectoin，MAS）技术把Xa21导入强优恢复系辐恢838中，选育出抗病恢复系中恢218；曹立勇等（2003）应用MAS技术育成了携有Xa21的R8006 和R1176两个恢复系品种，并配出杂交组合中优6号、中优1176等；罗彦长等（2005）以IRBB21为供体与广亲和恢复系4183杂交和多次回交，逐代用分子标记辅助选择，育成的新恢复系4183即有抗病性，又保持了广亲和、恢复性及优良的经济性状。李进波等（2006）以含Xa23的CBB23为抗源，与优良杂交稻亲本9311和1826杂交，利用与Xa23紧密连锁的分子标记辅助选择，选育出了21个抗性株系。此外，保持系中的抗白叶枯病育种应用也有不少成功的例子，如林荔辉等（2004）用IRBB21与保持系珍汕97B杂交、回交，结合MAS 技术获得了6个珍汕97B的Xa21导入系；季芝娟等（2007）利用CBB23与保持系嘉红B杂交，再将Xa23基因转育到野败型不育系紫兴05A中，育成了农艺性状稳定、败育彻底、抗病不育系中嘉A。在两系不育系的白叶枯病抗性改良中，罗彦长等（2003）以IRBB21为供体，以感病光敏核不育系3418S为受体，利用MAS技术从BC3F2中选育出携有Xa21基因的抗病光敏核不育系；罗彦长等（2005）还用籼型低温敏不育系399S与IRBB21杂交并回交，逐代用分子标记检测，聚合Xa21和低温敏核不育系基因，育成了抗白叶枯病的籼型低温敏核不育系3178S。
水稻Xa7基因源于孟加拉稻种DV85（Sidhu et al.，1978），是一个具有广谱抗性的显性抗白叶枯病基因，对多个菲律宾生理小种都具有全生育期的抗性（Porter et al.，2003）。国际水稻所已将Xa7基因转育到了IR24中，构建了其近等基因系IRBB7。Vera Cruz等（2000）通过对水稻抗病品种IRBB4（Xa4）、IRBB7和IRBB10（Xa10）三年白叶枯病的监测，发现IRBB7比IRBB4、IRBB10具有更强、更持久的抗性；大田区试也表明Xa7的抗性能保持十多年（White et al.，2009）。最新的研究还发现，与Xa3、Xa4、xa5、Xa10等基因不同，在高温条件下Xa7基因能更有效地限制白叶枯病菌的生长，而一般情况下高温是有利于细胞的生长的，这可能是Xa7比其它Xa基因的抗性更持久的原因之一（Webb et al.，2010）。而且，与Xa7基因对应AvrXa7不仅是引发水稻中Xa7抗病反应的无毒因子，也是PXO86、PXO85等白叶枯菌株中重要的毒力因子，对维持白叶枯病菌的适应性具有重要作用，所以白叶枯病菌中AvrXa7的稳定存在也是Xa7基因能提供持久抗性的原因之一（Niño-Liu，2006）。由此可见，Xa7基因将是水稻的抗病育种中一个更加理想的抗源。为了克隆Xa7基因，Porter等（2003）曾利用IRBB7将Xa7定位在水稻第6号染色体的M1和M3两个分子标记间，遗传距离为2.7cM；在此基础上，Chen等（2008）又将Xa7锁定在GDSSR02和RM20593两个分子标记间，物理距离为118.5kb。尽管如此，Xa7基因至今还没有被克隆。
发明内容
本发明要解决的技术问题是开发一个高抗、广谱、持久的抗白叶枯病基因Xa7的分子标记，其能用于Xa7基因的鉴定及辅助选择育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一个与白叶枯病抗性基因Xa7紧密连锁的STS（sequence tagged site）分子标记----鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记，该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1（即，序列表中的NO1，来自水稻品种——镇恢084）。
作为本发明的鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记（即，白叶枯病抗性基因Xa7分子标记）的改进：是基于PCR技术，PCR扩展引物（STS分子标记引物）为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
正向引物：5’ GGGAGAAATTGGCCCCAGTTAGAGAA 3’，
反向引物：5’ GCTTCACTTGATCACTGCTGTTTG 3’ 。
本发明还同时提供了上述白叶枯病抗性基因Xa7的分子标记的用途：用于水稻抗白叶枯病Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。
发明人在发明过程中：
首先，按照现有技术，利用一个带Xa7基因的籼型强优恢复系“镇恢084”水稻品种与感病品种“成恢448”，构建了F2分离群体，通过SSR、InDel等DNA分子标记对群体中2700个感病单株的分析，将Xa7基因精细定位在水稻第6染色体的50kb物理区间内。为克隆Xa7基因，构建了水稻镇恢084基因组Fosmid文库，利用定位PCR分子标记筛选到了覆盖定位区间序列的跨叠克隆，并对其中4个Fosmid克隆进行了测序，发现在Xa7基因定位区间内，水稻镇恢084的序列与已知的粳稻日本晴（Nipponbare）和籼稻9311序列差异很大，有许多DNA插入或缺失的变异。
然后，本发明利用以上序列的差异性，开发了一个新的与Xa7基因紧密连锁的STS分子标记，用于检测Xa7基因位点，利用该标记我们已将Xa7基因成功地转育到了珍汕97、龙特甫、协特青等水稻品种中，明显增强了这些品种对白叶枯病的抗性。
本发明的具体技术内容如下：在Xa7基因定位区间内，比较镇恢084分别与已公布的日本晴和9311的基因组序列，发现一个位点在镇恢084中缺失了一段约220bp的序列（图1），在缺失序列的两端设计PCR引物，对镇恢084、日本晴和9311的基因组进行PCR扩增，其PCR产物在电泳中可检测到两种大小不同的条带，镇恢084的条带大小为306 bp（basepair），日本晴和9311的条带均为531 bp，这两种条带在1%琼脂糖凝胶电泳中具有很好的多态性（图2）。该STS标记与Xa7基因紧密连锁，方法简单快捷，能分析待测水稻品种是否含有Xa7基因位点，在Xa7遗传育种中可以大大提高基因转育的效率。
利用本发明检测出某个水稻品种内是否含有“Xa7基因位点”的最终目的是，确认在被测定水稻品种中是否含有Xa7基因。 目前由于还没有克隆Xa7基因，也没有报道用于鉴定Xa7基因的紧密连锁的分子标记。一般现在可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa7基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、温度等也比较严格，不适合大面积的鉴定和应用。
本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，用于Xa7基因的辅助选择育种，同时为克隆Xa7基因奠定了良好的基础。
我们对Xa7基因进行了精细定位，将该基因确定在水稻第6染色体的50kb物理区间内，并构建了水稻镇恢084（含Xa7）基因组Fosmid文库，筛选出了建跨叠克隆，通过测序获得了该区间的DNA全序列，发现其中有一些特异性的DNA序列，这些序列只有在含Xa7基因的水稻品种中存在。因此，利用这些序列开发分子标记，在Xa7遗传育种中可以比较快速、精确的鉴定Xa7基因，大大提高基因转育的效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1水稻镇恢084、日本晴和9311的STS标记序列Alignment分析图；
“虚线”表示碱基缺失；
图2水稻镇恢084、日本晴和9311的STS标记电泳分析图；
图2中：M，marker；1，镇恢084；2，日本晴；3，9311
图3各种含Xa7和不含Xa7基因水稻品种的STS标记电泳分析图；
图3中：M: marker; 1-4: 含Xa7基因的水稻品种，DV85、DV86、IRBB7和镇恢084；5-23：不含Xa7基因的水稻品种，IR24、IRBB1、IRBB8、IRBB9、IRBB13、IRBB56、成恢448、云村稻、扎昌龙、沈农1033、黑壳子粳、巴香占、韭菜青、Norin8、TP309、W11、DongJin、中花11、浙辐802。
具体实施方式
实施例1、
1、引物设计：根据镇恢084的Fosmid克隆序列，在镇恢084与日本晴基因组的差异序列两端设计一对PCR引物，序列为
正向引物：5’ GGGAGAAATTGGCCCCAGTTAGAGAA 3’，
反向引物：5’ GCTTCACTTGATCACTGCTGTTTG 3’。
引物可委托Invitrogen公司合成。
2、DNA提取：以水稻的叶片为材料提取基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种。本发现采用的是陈文岳等（中国水稻科学，2005，19：561-563）报道的一种水稻DNA简易提取法。
3、PCR扩增：在0.2 ml的PCR扩增专用薄壁管中，加入20 ng水稻DNA、正反向引物各0.25 μM、4种dNTP（dCTP、dGTP、dATP、dTTP，）各100μM、1×PCR Buffer、1个酶活力单位的Taq DNA聚合酶，用去离子水定容到20 μl，充分混匀。本发明使用的上述PCR试剂（包括dNTP、PCR Buffer、Taq DNA聚合酶等）为TaKaRa公司产品。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。本发明采用的热循环仪为Biometra公司的T3000型。
镇恢084的PCR扩展的产物为306 bp，即SEQ ID NO：1所示。
日本晴或9311的PCR扩展的产物为531 bp，序列如下（为已知序列）：
1 GGGAGAAATT GGCCCCAGTT AGAGAATAAA CAGATATAAG TAGAATCTAC AGAGAAATTG
61 AGCAGTACTC CCTTCGTTTC GAAATGTTTG ACACCGTTGA CTTTTTAGCA CATATTTGAC
121 TGTTCGTCTT ATTTAAAAAC TTTTATGAAA TATGTAAAAT TATATACCTA CATAAAAATA
181 TATTTAACAA TGAATTAAAT GATATGAAAA GAATTAATAA TTACAAATAA GACGAACGAT
241 CAAACATGTG CTAAAAAAAT TAACGGCGTC AAACATTTCG AAACGGAGAG AGTATAACAT
301 AATTGTCATT GAGCCATTGA CTGGTCTCGA TAGATCCAAC GTGGAGTACA CGAGTTGACC
361 GTTGAGCAAA TTAAATCTTC TATAAAAAAG CTTTGTATAT TGCAAACAAG CTCGACGCTG
421 TTAACTGGGA CGCTTTCATA GTTGGATAAT TTTAGAACAG ATGCCATCAC CGGGACCAAA
481 GACAAGTCGC AATCTAGCAA ACCTGGGCAA ACAGCAGTGA TCAAGTGAAG C
4、PCR产物的电泳：用1×TAE电泳液制备浓度为1%（W/V）的琼脂糖凝胶（即，1×TAE电泳液1升中加入10g的琼脂糖凝胶），将步骤3所得的20 μl PCR产物与2 μl 10× Loading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，以DNA Marker 100bp DNA Ladder（TaKaRa公司）作为分子量对照，在100 V恒压下电泳30分钟。用溴化乙锭（Ethidiumbromide，EB）对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆》（冷泉港实验室出版社，第三版）。
5、电泳图谱分析：在紫外透射仪上，用305 nm波段观察凝胶上的电泳条带，通过比对DNA mrker判断电泳条带的大小。
镇恢084的条带大小为306 bp（base pair），日本晴和9311的条带均为531 bp，这两种条带在1%琼脂糖凝胶电泳中具有很好的多态性（图2）。
为了证明本发明的正确性，发明人设置了如下对比试验：
实验1、
以镇恢084做为对照，分别将事先已知含Xa7基因的水稻品种：IRBB7、DV85和DV86，和事先已知不含Xa7基因位点的水稻品种：IR24、IRBB1、IRBB8、IRBB9、IRBB13、IRBB56、成恢448、云村稻、扎昌龙、沈农1033、黑壳子粳、巴香占、韭菜青、Norin8、TP309、W11、DongJin、中花11、浙辐802，按照实施例1所述的方法进行检测，最终结果如下：
事先已知含Xa7基因位点的水稻品种：IRBB7、DV85、DV86，所得的电泳条带与对照镇恢084的一致。
而事先已知不含Xa7基因位点的水稻品种：IR24、IRBB1、IRBB8、IRBB9、IRBB13、IRBB56、成恢448、云村稻、扎昌龙、沈农1033、黑壳子粳、巴香占、韭菜青、Norin8、TP309、W11、DongJin、中花11、浙辐802，所得的电泳条带都比对照大，而且大小非常一致，与日本晴的531 bp非常接近，表明这段序列在水稻中比较保守，含Xa7的水稻品种在这段序列中发生了大片段的缺失，是非常特殊的情况，可以直接用来鉴定Xa7基因。
实施例2、
已知水稻品种“珍汕97、龙特甫、协特青”不含Xa7基因，对白叶枯病菌菲律宾小种PXO86不具有抗性。将这三个水稻品种分别多次与抗白叶枯病稻种IRBB7（含Xa7基因）回交，并利用本发明所述的分子标记进行辅助性地选择，将Xa7基因成功地转育到了这个品种中，明显增强了其对白叶枯病的抗性。以其中一个品种珍汕97为例，具体过程如下：
用含有Xa7基因的水稻品种IRBB7做父本，与母本品种珍汕97进行杂交，得到的F1代与轮回亲本珍汕97进行多次回交，将Xa7基因转育到珍汕97中去；由于，回交的后代会发生分离，群体中只有一部分个体带Xa7基因，必须选择含有Xa7基因的植株继续进行回交，因此利用这个STS分子标记对回交后代进行分析，当电泳的条带为306 bp时，表明该植株中含有Xa7基因，这就能迅速找出含Xa7的植株进行下一轮的回交，从而缩短了转育时间，而且选择的可靠性高。
验证实验：
选用上述实施例2检测得知含有Xa7基因（即，所得电泳的条带为306bp）的植株共90株，具体为下述情形的植株各选择10株：
以珍汕97为母本，所得的F1代与轮回亲本珍汕97回交4次，
以珍汕97为母本，所得的F1代与轮回亲本珍汕97回交5次，
以珍汕97为母本，所得的F1代与轮回亲本珍汕97回交6次，
以龙特甫为母本，所得的F1代与轮回亲本龙特甫回交4次，
以龙特甫为母本，所得的F1代与轮回亲本龙特甫回交5次，
以龙特甫为母本，所得的F1代与轮回亲本龙特甫回交6次，
以协特青为母本，所得的F1代与轮回亲本协特青回交4次，
以协特青为母本，所得的F1代与轮回亲本协特青回交5次，
以协特青为母本，所得的F1代与轮回亲本协特青回交6次，
将上述90株植株进行白叶枯病抗性分析，采用剪叶法（Kauffman etal., 1973）接种白叶枯病菌菲律宾小种PXO86。接种体制备方法：将菌株接种在PDA培养基（马铃薯300 g/L，葡萄糖30 g/L，琼脂15g/L）上，于28 ℃恒温培养箱中培养3-4 d，用蒸馏水从培养基上洗下菌落，并稀释成浓度为9×108 cfu/mL的细菌悬浮液。接种20天后，测量叶片的病斑长度， 结果该90株植株的病斑长度都在2～3厘米，感病对照植株的病斑长度为15～20厘米。从而证明：该90株植株都获得对白叶枯病菌PXO86的抗性，因此均含有Xa7基因。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记，其特征是：该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记，其特征是：所述STS分子标记引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
正向引物：5’ GGGAGAAATTGGCCCCAGTTAGAGAA 3’，
反向引物：5’ GCTTCACTTGATCACTGCTGTTTG 3’。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定水稻高抗白叶枯病基因的STS分子标记的用途，其特征是：用于鉴定在被测水稻品种中是否含有Xa7基因。
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