CN104818273A - 水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻高抗白叶枯病基因特异性标记，该标记为Xa7GSM；其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还同时公开了PCR扩展所用的引物，正向引物5’CCTGCTCGAGCTAATCCAAATC 3’，反向引物5’GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3’。上述水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的用途是：用于水稻Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。

Description

水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用

技术领域

本发明涉及1个高效抗水稻白叶枯病的基因的DNA标记及其在育种中的应用，属于分子遗传育种领域。

背景技术

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo.)所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20～30％，严重时可达50％，甚至绝收。发掘和利用抗病基因是防治水稻白叶枯病的最有效方法。迄今，国际上在水稻中已鉴定了近40个抗白叶枯病基因(国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn)，但是只有少数几个兼具全生育期、广谱、持久等良好的抗病特性，真正能有效地用于水稻抗白叶枯病的育种和生产的基因并不多。目前，育种家们通过分子标记辅助选择(molecular assisted selectoin，MAS)，已利用Xa4、Xa21和Xa23选育出了许多抗病恢复系品种，如IR26、IR28、IR30、IR32、IR36、IR50、IR54等。国内大面积种植的杂交稻中大多含有Xa4基因，不过长期大面积地使用单一抗源已经导致了新致病菌株的进化，杂交稻抗病的持久性得不到保证。因此，如何利用新的抗病基因，尽快提高杂交稻的抗病性是育种中急待解决的问题。

水稻Xa7基因是一个高抗、广谱、持久的抗白叶枯病基因，对多个菲律宾生理小种都具有全生育期的抗性，是水稻抗病育种中一个较为理想的抗源。Xa7基因源于孟加拉稻种DV85和DV86，国际水稻所将DV85与IR24回交，构建了含Xa7的近等基因系IRBB7；我国一个强优恢复系水稻品种“镇恢084”以91-2156为母本，与由DV85选育的抗病品系R19杂交而成，该品种也带有Xa7基因。因此，利用MAS等现代育种技术，将Xa7基因导入主栽的杂交稻恢复系中，有望大大提高我国水稻的抗病性和生产安全。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用，本发明能用于Xa7基因的精准的鉴定及其在水稻育种中应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻高抗白叶枯病基因特异性标记(即，水稻抗白叶枯病基因Xa7特异性的DNA标记)，该标记为Xa7GSM；其对应的核苷酸序列为SEQID NO：1(来自水稻品种——IRBB7)。

作为本发明的水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的改进：基于PCR技术时，PCR扩展引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′；

Xa7GSM：

正向引物5’CCTGCTCGAGCTAATCCAAATC 3’，

反向引物5’GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3’。

本发明还提供了上述水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的用途：用于水稻Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。

由于Xa7基因还没有被克隆，没有办法设计基因功能标记。发明人利用“图位克隆”技术对Xa7基因进行了精细定位，并构建了水稻IRBB7(含Xa7)和IR24(不含Xa7的等基因系)的基因组文库，通过测序和序列比对开发了一个与Xa7基因紧密连锁的特异性分子标记，在Xa7遗传育种中可以比较快速、精确的鉴定Xa7基因，大大提高基因转育的效率。

发明人在发明过程中，

首先，在已将Xa7基因定位于水稻第6染色体的50kb间基础上，分别构建了水稻抗病品种IRBB7(含Xa7)与其近等基因系感病品种IR24(不含Xa7)的基因组文库，利用Xa7基因定位区间的分子标记，筛选到了覆盖定位区间序列的跨叠BAC克隆，并对这些BAC克隆进行了高通量测序。通过比对IRBB7和IR24中Xa7基因定位区间的序列，在IRBB7中发现了一些差异序列，在IR24中相应基因组位置则没有存在。将这些序列在国际权威的生物学NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，在现有的水稻DNA数据中没有搜索到相同或相似的序列，表明在IRBB7中这些序列是新发现的水稻基因组序列。

然后，由于以上序列在Xa7基因的定位区间内，与Xa7基因紧密连锁，甚至有可能是Xa7基因序列的一部分。因此，本发明利用以上序列中的1个位点，开发了1个新的DNA标记，用于精确的检测Xa7基因，并利用这个标记成功将Xa7基因转育到了浙江省主栽杂交稻的父本恢复系品种“密阳46”中，明显增强了这个品种对白叶枯病的抗性。

本发明的具体技术内容如下：根据以上在水稻IRBB7中发现的1个新DNA序列，分别设计PCR引物，开发出1个对应的DNA标记Xa7GSM。用这个标记的引物，对水稻IRBB7(含Xa7)和IR24(不含Xa7)的基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，在IRBB7的PCR产物中可分别检测到315bp(如SEQ ID NO：1所示)的条带，而IR24的PCR产物中检测不到无相应的条带(图1)。表明标记Xa7GSM与Xa7基因具有很高的一致性，能精确的分析待测水稻品种是否含有Xa7基因，在Xa7遗传育种中可以大大提高基因转育的效率。

利用本发明检测出某个水稻品种内是否含有“Xa7基因位点”的最终目的是：确认在被测定水稻品种中是否含有Xa7基因。目前由于还没有克隆Xa7基因，也没有报道用于鉴定Xa7基因的紧密连锁的分子标记。一般现在可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa7基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、温度等也比较严格，不适合大面积的鉴定和应用。

本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，用于Xa7基因的辅助选择育种，同时为克隆Xa7基因奠定了良好的基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为IRBB7和IR24的Xa7GSM标记分析图；

图1中：Marker，DL2000(TaKaRa公司)；Xa7GSM，为本发明开发的Xa7基因DNA标记；RM20591，国际水稻研究所开发的公认分子标记，且位于Xa7基因定位区间内，该标记的序列在IRBB7和IR24都存在，在此作为实验对照。

图2为各种含Xa7和不含Xa7水稻品种的Xa7GSM标记检测图；

图2中：Marker，DL2000(TaKaRa公司)；含Xa7基因的水稻品种：IRBB7(对照)、DV85、DV86、和镇恢084；不含Xa7基因的水稻品种：日本晴、中花11、TP309、9311、浙辐802、成恢448、沈农1033。

图3转育Xa7基因的密阳46的Xa7GSM标记检测图；

图3中：Marker，DL2000(TaKaRa公司)；IRBB7，对照；密阳46，不含Xa7的密阳46；密阳46(Xa7)，转育Xa7基因的密阳46。

图4转育Xa7基因的密阳46的白叶枯病抗性鉴定图；

图4中：横坐标P1～P10，国际公认用来鉴定水稻白叶枯病抗性的10个不同白叶枯病原菌；纵坐标，水稻叶片侵染白叶枯病菌后病斑的长度(单位cm)，病斑越短表明抗病性越强。

备注说明：上述P1～P10所对应的白叶枯病原菌分别是：PXO61、PXO86、PXO79、PXO71、PXO112、PXO99、PXO280、PXO145、PXO87、PXO124。

具体实施方式

实施例1、

1、引物合成：委托Life Technologies公司合成Xa7GSM标记的引物，引物序列为：

5’CCTGCTCGAGCTAATCCAAATC 3’和5’GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3’。

2、DNA提取：以水稻的叶片为材料提取基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种，本案例采用的是Panaud等(Mol Gen Genet,1996,252:597-607)报道的方法。

3、PCR扩增：在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、两条引物各0.25μM、2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN公司)、用ddH₂O定容到20μl，充分混匀。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。本发明采用的热循环仪为Biometra公司的T3000型。

4、PCR产物的电泳：用1×TAE电泳液制备浓度为1％(质量％)的琼脂糖凝胶，取步骤3所得的PCR产物10μl，与1μl 10×Loading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，在100V恒压下电泳30分钟。用溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)。

6、电泳图谱分析：在紫外透射仪上，用305nm波段观察凝胶上的电泳条带，通过比对DNA mrker判断电泳条带的大小。以IRBB7的基因组DNA进行PCR扩增后，标记Xa7GSM电泳条带的大小为315bp(图1上半部)，其序列为SEQ ID NO.1；以IR24的基因组DNA进行PCR扩增后，标记Xa7GSM电泳无相应的条带(图1上半部)。

备注说明：为了证明不是由于其它原因而导致IR24品种的PCR扩增有问题，因此，在Xa7基因定位区间内，选了一个国际上公认的水稻SSR标记RM20591进行PCR扩增和图谱分析，所得结果如图1下半部所示。根据此图1下半部内容，我们得知：IRBB7和IR24都能扩增到条带，因此IR24的PCR扩增是没有问题的。

为了证明本发明的正确性，发明人设置了如下验证试验：

实验1、

以水稻IRBB7作为对照，分别将事先已知含Xa7基因的水稻品种：DV85、DV86和镇恢084，和事先已知不含Xa7基因的感病水稻品种：日本晴、中花11、TP309、9311、浙辐802、成恢448、沈农1033，按照实施例1所述的方法进行检测，最终结果如下(图2)：

事先已知含Xa7基因位点的水稻品种：镇恢084、DV85、DV86，所得的电泳条带均为315bp。

而事先已知不含Xa7基因位点的水稻品种：日本晴、中花11、TP309、9311、浙辐802、成恢448、沈农1033，电泳无相应的条带。

实施例2、

已知浙江省主栽杂交稻的父本恢复系“密阳46”不含Xa7基因(图3)，对白叶枯病的抗性较差(图4)。为了改良该水稻品种的抗病性，发明人将IRBB7与“密阳46”杂交，得到的F₁代再与“密阳46”进行多次回交。但是在每一次的回交后中都只有一部分单株带有Xa7基因，必须选择含有Xa7基因的单株继续进行回交，才能确保Xa7基因在长期的选育中不会丢掉。因此，利用本发明的标记Xa7GSM对每代植株进行了检测，选出扩增出315bp条带的单株，即含有Xa7基因的植株，用于下一轮的回交，成功将Xa7基因转育到了水稻“密阳46”中(图3)。通过水稻白叶枯病菌的抗性鉴定，也表明转育了Xa7基因的“密阳46”显著性增强了抗病性(图4)。

对比例1、

将实施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’CCTGCTCGAGCTAATCCATAAG 3’，

反向引物5’GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3’。

对比例2、

将实施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’CCTGCTCGAGCTAATCCATAAG 3’，

反向引物5’GATACTGTCATTCTTCACCCTCCT 3’。

利用上述2个对比例所得引物如同实验1所述进行试验，所得结果为：

对比例1：IRBB7、DV85、DV86和镇恢084电泳均无315bp条带出现。

对比例2：IRBB7、DV85、DV86和镇恢084电泳均无315bp条带出现。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江师范大学

 

<120> 水稻高抗白叶枯病基因特异性标记及其应用

 

<160> 1

 

 

<210> 1

<211> 315

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

 

<400> 1

cctgctcgag ctaatccaaa tccaacacat acgccgttaa gcagagtcat tccaagagcg      60

agaacagaaa actcactcgg attatactga acattaggtt ttctgtcaaa tatacagctg      120

caaggtgcag ctatttttct cacacaaatc gttttattat ttactccagg gtctccagtt      180

gacaactgat ttacaaatta cgaggtgagc acgccagatt actattgcgc cggaacaaac      240

tacaagccga acaagatacc taaaaaggcc attatgctca gaaccagcag ccagaccgtg      300

aagaatgaca gtatc                                                       315

 

 

Claims (3)

1.水稻高抗白叶枯病基因特异性标记，其特征是：该标记为Xa7GSM；其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的水稻高抗白叶枯病基因特异性标记，其特征是：PCR扩展的引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，

正向引物5’CCTGCTCGAGCTAATCCAAATC 3’，

反向引物5’GATACTGTCATTCTTCACGGTCTG 3’。

3.如权利要求1或2所述的水稻高抗白叶枯病基因特异性标记的用途，其特征是：用于水稻Xa7基因的辅助选择育种，或者用于克隆Xa7基因。