CN110093435B - 小麦ssr分子标记引物及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了小麦SSR分子标记引物及其筛选方法，SSR分子标记引物可用于鉴定小麦赤霉病抗性相关基因，所述SSR分子标记引物包括编号为Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157、Xssrp201或Xssrp19的SSR分子标记引物中的1‑7对引物；其筛选方法包括，从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和赤霉病高抗品种，用SSR分子标记引物进行多态性初步筛选，再通过小麦赤霉病高抗品种与普通小麦的RIL株系进行多态性复筛。本发明发现了新的小麦抗赤霉病SSR分子标记引物，整合到已发表的分子遗传图谱上，提高了遗传图谱密度，大大利于小麦抗赤霉病育种。

Description

小麦SSR分子标记引物及其筛选方法

技术领域

本发明涉及小麦遗传育种领域，尤其涉及一种小麦SSR分子标记引物及其筛选方法。

背景技术

小麦赤霉病(FHB)主要是由小麦感染禾谷镰刀菌引起的。它多发生在温暖湿热的地区。由于近十年来空气污染带来的全球气候变暖，小麦赤霉病的受害面积逐年扩大，使得小麦产量降低。在我国，小麦作为仅次于水稻的主要粮食作物,历年种植面积为全国耕地总面积的22-30％和粮食作物总面积的20-27％,分布遍及全国各省(市、区)。小麦赤霉病在我国长江中下游和华南冬麦区及东北东部春麦区尤为严重，近年在黄河流域及其它地区也偶有发生。近年来，小麦赤霉病在国内有向北方麦区扩展的趋势，我国有三分之二的省份发生赤霉病，严重流行时，受害面积超过700万公顷。

培育赤霉病抗性品种是目前防治小麦赤霉病危害的最有效的手段之一。导致小麦赤霉病发生发展的因素很多。环境和病原菌的不同，都会影响到对赤霉病抗性的评价结果。如遇到少雨天气，采用田间鉴定就有可能会出现假抗病性。并且这种方法的周期较长，不容易做重复鉴定。所以就同时需要其他的方法进行辅助。毒素鉴定法就补充了田间鉴定的缺陷。它的结果还可以反证田间鉴定的结果。

由于小麦赤霉病抗性具有典型的数量性状特征，受多基因控制，易受环境影响，早期世代很难对其进行选择。此外，许多抗赤霉病种质的农艺性状较差，地区适应性较强，利用传统育种方法培育抗性品种费时费力可能也得不到预期的结果，分子标记及其辅助选择育种，为小麦育种提供了一条有效的途径。利用分子标记，可直接对品系的基因型进行选择。它可以大大减弱环境条件对结果的影响。并且它的周期短，可在播种后数天对幼苗进行检测。这将大大节省，培育植株中所浪费的人力，财力和物力。

利用DNA分子标记技术，可较好地探明其抗性QTL的位点，进行小麦抗赤霉病的辅助选择育种。利用分子标记鉴定，具有准确、快速的特点。通过目标性状相关分子标记的辅助选择结合与综合性状优良的小麦品种回交，可望打破性状的不良连锁，从而培育出抗赤霉病优质丰产小麦新品种。SSR和DArT标记具有丰富遗传变异的特点，在小麦的基因作图和关联分析中广泛应用的分子标记。其中，SSR标记是根据基因组中微卫星两端的相对保守序列设计的特异引物，PCR扩增稳定，检测技术简单且成熟，较适合用于分子标记基因定位和辅助育种选择

但是，现有技术中，抗赤霉病较好的品种，农艺性状不佳。而且由于不良基因连锁的影响，直接用其与丰产性好的品种杂交，难以获得理想的抗赤霉病同时又丰产、优质小麦新品种。因此，创造新的赤霉病抗源，对小麦抗赤霉病育种具有很重要的意义。科学家们在小麦近缘物种中筛选，但一直没有突破性进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦SSR分子标记引物及其筛选方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供的小麦SSR分子标记引物及其筛选方法是这样实现的：

一种远缘杂交小麦的SSR分子标记引物，所述引物包括Xssrp19、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157及Xssrp201，各引物所对应的序列为：Xssrp19：正向ACATCATCAACTATGCCGAACA

反向CGCCTTTAGATCCCACCC

Xssrp 81：正向CGAGGGTCAAACGCAAAG

反向ATCTCCGACGACGAGGGTG

Xssrp91：正向CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC

反向GCCGTGGACTTCCATTTCT

Xssrp97：正向CTGAAAGGAGCAACATAT

反向TAAACAACCAAGGAAGAA

Xssrp138：正向GGAGCGGAATGGATAAATAA

反向GGAAGGAAACGCAGGAGA

Xssrp157：正向GTCGTGCTTGCGTTAGAT

反向GACTTGGAATGGAGGTTG

Xssrp201：正向TTGCCACGAAGTGATTGC

反向TTGGATGATGCCCTGACC。

可选的，所述引物的退火温度分别为：

Xssrp19：55℃

Xssrp 81：60℃

Xssrp91：50℃

Xssrp97：55℃

Xssrp138：50℃

Xssrp157：55℃

Xssrp201：55℃。

可选的，小麦的远缘品种是小黑麦。

可选的，Xssrp19、Xssrp81、Xssrp138位于染色体7A上，Xssrp91、Xssrp97、Xssrp157和Xssrp138位于染色体3BS上。

SSR分子标记引物的筛选方法，包括：

A、从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和赤霉病高抗品种；

B、通过小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种对201对SSR分子标记引物进行多态性初步筛选；

C、通过小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通小麦的RIL株系对初步筛选出的SSR分子标记引物进行多态性复筛，对复筛出的SSR分子标记引物进行分子连锁图谱构建。

可选的，所述的小麦远缘物种包括小黑麦、小偃麦和小赖麦。

可选的，所述步骤A包括：(1)小麦开花时，采用单花滴注法进行赤霉病接种鉴定，接种后21d，调查接种穗的病小穗数；用EXCEL计算每个品种的病情指数；参照江苏省农科院制定的单花滴注接种等级划分标准进行等级划分；(2)同时对小麦进行室内毒素鉴定，使用赤霉菌粗毒素处理小麦幼苗并计算根长抑制率、芽长抑制率和细胞损伤度，检测不同品种小麦对于赤霉菌粗毒素的抗性；(3)根据间单花滴注赤霉病抗性鉴定和室内毒素鉴定结果进行系统比较和相关性统计分析，确定赤霉病高抗品种和赤霉病高感品种；

所述步骤B包括：提取赤霉病高抗品种和赤霉病高感品种各品种小麦的DNA；分别用201对SSR分子标记引物对上述各品种小麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，初步筛选出具有多态性的SSR分子标记引物；

所述步骤C包括：提取小麦赤霉病高抗品种、普通小麦以及上述高抗品种与普通小麦的RIL株系各品种小麦的DNA；分别用步骤B筛查出的SSR分子标记引物对上述各品种小麦的DNA进行PCR扩增，然后进行电泳分析，复筛出具有多态性的SSR分子标记引物，应用Joinmap4.0软件构建其分子连锁图谱。

可选的，所述PCR反应体系为：25ul，其中10X buffer 2.5ul，25mM Mg2+1.5ul，2.5mMdNTPs 0.2ul，正向引物和反向引物各1ul，Taq酶(5U/ul)0.2ul，模板DNA 2.5ul，补水至25ul；

所述PCR扩增反应参数为94℃预变性5min后，94℃变性1min,50～60℃退火1min,72℃延伸1min，循环34次，最后72℃延伸8min，在4℃下保存；

PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后，凝胶用0.2％硝酸银溶液浸泡震荡10min后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相。

可选的，所述PCR扩增使用仪器为在Biometra公司的T1型PCR扩增仪。

SSR分子标记引物可用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性的相关基因。

本发明提供的7对SSR引物，分别初步整合到已发表的分子遗传图谱上，可以增加已有的分子标记密度，提高遗传图谱密度，有利于小麦抗赤霉病育种。

附图说明

图1是本发明提供的P138作为引物的PCR扩增图；

图2是本发明提供的P187作为引物的PCR扩增图；

图3是本发明提供的7对SSR引物中Xssrp91作为引物的PCR扩增图；

图4是本发明提供的7对SSR引物中Xssrp201作为引物的PCR扩增图；

图5是本发明构建的小麦3BS染色体的遗传图谱连锁群；

图6是本发明构建的小麦7A染色体的遗传图谱连锁群。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的一种用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性相关基因的SSR分子标记引物序列，所述引物序列如表二中Xssrp19、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157及Xssrp201所示序列。

上述用于鉴定远缘杂交小麦赤霉病抗性相关基因的SSR分子标记引物的筛选方法包括如下步骤：

步骤101、从小麦远缘物种中确定赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种；本实施例采用的小麦远缘物种是二体异附加系小黑麦7个品种，小偃麦5个品种及小赖麦6个品种(具体命名见表1)。

该步骤通过如下方式实现：(一)上述各个品种小麦赤霉病抗性的鉴定:

(1)小麦开花时，采用单花滴注法进行赤霉病接种鉴定，接种后21d，调查接种穗的病小穗数。用EXCEL计算每个品种的病情指数。参照江苏省农科院制定的单花滴注接种等级划分标准进行等级划分；

(2)同时对小麦进行室内毒素鉴定，使用赤霉菌粗毒素处理小麦幼苗并计算根长抑制率、芽长抑制率和细胞损伤度，检测不同品种小麦对于赤霉菌粗毒素的抗性；

(3)根据间单花滴注赤霉病抗性鉴定和室内毒素鉴定结果进行系统比较和相关性统计分析。从中选出高抗池，高感池以进行下一步的发明。

结果表明，在小偃麦类型、小黑麦类型、小赖麦类型这三个品种间的抗赤霉病行存在显著差异：小黑麦类型的小麦品种基本都属于抗性品种(R型)，只是存在高抗和抗的区别；小赖麦类型的小麦品种基本都属于易感品种(S型)，只是高感与感的区别；而小偃麦类型的小麦品种抗性居中。说明黑麦是赤霉病的较好抗源，可与普通小麦构建群系用于初级分子连锁图谱的构建。如表一所示，小麦品种及编制的代码表，从中选出B1、B3、B5这3个品种组成高抗池，C1、C5、C6这3个品种组成高感池。

表1小麦品种及编制的代码表

步骤102、提取小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种DNA；

用CTAB法分别提取高抗品种(B1、B3、B5)、高感品种(C1、C5、C6)各品种小麦的DNA。

步骤103、，以所述小麦赤霉病高感品种和小麦赤霉病高抗品种DNA为模板，分别使用201对SSR引物对其进行PCR扩增；

201对SSR引物通过参考已经对小麦赤霉病抗性进行SSR分子标记的相关报道及应用引物设计软件Primer Premier 5.0结合GenBank数据库信息设计。

PCR反应体系为25ul，其中10X buffer 2.5ul，25mM Mg2+1.5ul，2.5mMdNTPs0.2ul，正向引物和反向引物各1ul，Taq酶(5U/ul)0.2ul，模板DNA2.5ul，补水至25ul；

PCR扩增参数为94℃预变性5min后，94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸1min，循环34次，最后72℃延伸8min，4℃下保存；在Biometra公司的T1型PCR扩增仪上进行PCR扩增。

步骤104、PCR扩增产物进行电泳分析

PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后，凝胶用0.2％硝酸银溶液浸泡震荡10min后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相，筛选出具有多态性的28对SSR引物。如图1、图2所示，图1为引物P138PCR扩增后的电泳图，标号为1、2、3分别代表高抗品种B1、B3、B5为模板的PCR扩增结果，标号为4、5、6分别代表高感品种C1、C5、C6为模板的PCR扩增结果，从图中可以看到，以高抗品种B1、B3、B5为模板，有扩增出产物，而以高感品种C1、C5、C6为模板，没有扩增出与高抗品种扩增产物相同分子量的产物，说明引物P138具有多态性，28对引物中其他27对引物结果与图1相同。图2是引物P187PCR扩增后的电泳图，标号为1、2、3分别代表高抗品种B1、B3、B5为模板的PCR扩增结果，标号为4、5、6分别代表高感品种C1、C5、C6为模板的PCR扩增结果，从图中可以看到，不论以高抗品种B1、B3、B5为模板，还是以高感品种C1、C5、C6为模板，均有扩增出相同分子量的产物，说明引物P187不具有多态性。

筛选出的具有多态性的28对SSR引物如表二所示：

表2有多态性的28对SSR引物序列表

步骤105、以筛选出的28对SSR引物，以普通小麦和小麦赤霉病高抗品种RIL株系DNA为模板进行PCR扩增；

黑麦/豫麦2号杂交构建RIL株系，有多态性的28对SSR引物对133个RIL株系DNA进行复筛。

PCR反应体系为25ul，其中10X buffer 2.5ul，25mM Mg2+1.5ul，2.5mMdNTPs0.2ul，正向引物和反向引物各1ul，Taq酶(5U/ul)0.2ul，模板DNA2.5ul，补水至25ul；

PCR扩增参数为94℃预变性5min后，94℃变性1min,60℃退火1min,72℃延伸1min，循环34次，最后72℃延伸8min，4℃下保存；在Biometra公司的T1型PCR扩增仪上进行PCR扩增。

步骤106、PCR扩增产物进行电泳分析；

PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳完成后凝胶用0.2％硝酸银溶液浸泡震荡10min后用蒸馏水洗涤2次，然后在紫外透射仪上照相。根据电泳结果，参照小麦赤霉病高抗品种和普通小麦的扩增结果，筛选出RIL株系的扩增结果呈现多态性的SSR分子标记引物，共有7对引物，分别是Xssrp19、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157及Xssrp201，如图3和图4所示，图中1为高抗(母本)，2为高感(父本)，3～13为随机RIL系，筛选的7对SSR引物如表三所示：

表3用于分子链锁作图的7对SSR引物序列表

步骤107、应用Joinmap4.0软件构建遗传图谱。

上述7个引物，其中有4个分别初步整合到已发表的3BS上的分子遗传图谱，3个初步整合到7A上，如图5和图6所示。

利用Zhou et al和Shen et al发表的定位于3BS上的SSR标记Xgwm389、Xgwm493、Xgwm533、XBarc147、XBarc131、XBarc238、XBarc217.3、XCS-SSR7、XCS-SSR20在群体中进行基因分型，建立3BS赤霉病抗性QTL区域以SSR标记为基础的初级连锁图。本发明在3BS上增加了4个SSR标记，分别命名为Xssrp91、Xssrp97、Xssrp201和Xssrp157。如图5所示，Xssrp201位于Xbrc131外侧2.6cM处，Xssrp91位于Xbrc131外侧2.6cM处5.7cM处，Xssrp97位于Xssrp91和XCS-SSR7之间距离XCS-SSR73.0cM，Xssrp157在Xgwm493和Xbarc147之间靠近Xgwm4930.7cM的位置。

Nicho1son(2000)利用抗赤霉病品种Tritieummaeha为染色体供体的单体系列，定位了B1、4A和7A染色体与抗赤基因有关。本发明在7A染色体上增加了3个SSR标记分别命名为Xssrp19、Xssrp81、Xssrp138。如图6所示，Xssrp81在Xwmc168-7A外侧0.2cM处，Xssrp138在Xwmc479内侧0.2cM处，Xssrp19在Xssrp138和Xwmc479-7A之间距离Xwmc479-7A0.6Cm。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.SSR分子标记引物用于鉴定小麦赤霉病抗性的用途，所述SSR分子标记引物包括编号为Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrp138、Xssrp157、Xssrp201或Xssrp19的SSR分子标记引物中的1-7对引物，各所述编号所对应的序列为：

Xssrp 81： 正向 CGAGGGTCAAACGCAAAG

反向 ATCTCCGACGACGAGGGTG

Xssrp 91： 正向 CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC

反向 GCCGTGGACTTCCATTTCT

Xssrp 97： 正向 CTGAAAGGAGCAACATAT

反向 TAAACAACCAAGGAAGAA

Xssrp138： 正向 GGAGCGGAATGGATAAATAA

反向 GGAAGGAAACGCAGGAGA

Xssrp157： 正向 GTCGTGCTTGCGTTAGAT

反向 GACTTGGAATGGAGGTTG

Xssrp201： 正向 TTGCCACGAAGTGATTGC

反向 TTGGATGATGCCCTGACC

Xssrp 19： 正向 ACATCATCAACTATGCCGAACA

反向 CGCCTTTAGATCCCACCC。

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