CN111944920B

CN111944920B - 一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的InDel标记及其应用

Info

Publication number: CN111944920B
Application number: CN202010860733.8A
Authority: CN
Inventors: 王平勇; 徐志红; 徐永阳; 赵光伟; 贺玉花; 孔维虎; 张健; 付楠
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111944920A

Abstract

本发明提供了用于甜瓜抗疫病基因MePhyto辅助选择的分子标记MeInDel‑9；本发明还提供了上述分子标记在甜瓜育种、品种鉴定以及制备相应试剂盒中的应用。

Description

一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的InDel标记及其应用

技术领域

本申请属于农业分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的InDel标记及其相应引物，检测方法和应用。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)的一种重要的水果型蔬菜作物。我国已连续多年成为世界上甜瓜种植面积和产量最大的国家。根据联合国粮农组织(FAO)统计，2018年我国甜瓜播种面积为538万亩，产量1279万吨，位居世界首位。甜瓜种质资源多样，具有丰富的遗传多样性，据考证至少有3000份。

甜瓜疫病是由疫霉菌引起的一种具有毁灭性的土传病害，在我国的甜瓜产区，尤其是广东、广西、海南等南方高温高湿地区发生严重，该病的发病周期短，传播速度快，一旦发病就很难治愈，对产业构成严重威胁，成为影响甜瓜种植业发展的主要障碍之一。虽然通过化学、物理、农业等防治措施可以在一定程度上减轻疫病所造成的危害，但是这些方法并不能从根本上解决问题，甚至还会对环境造成破坏，而采用抗疫病品种是一种经济、有效、环保的防治手段。

目前，有关甜瓜抗疫病相关研究较少，主要原因是缺乏高抗疫病的种质资源，还未有抗疫病基因被定位或克隆，也没有与抗病基因紧密连锁的分子标记被报道(目前报道的甜瓜分子标记基本集中于农艺性状、抗白粉病等方面)。分子标记辅助选择育种是现代分子育种的常规手段，该技术是利用与决定特定性状基因紧密连锁的分子标记，通过检测标记的基因型进而确定功能基因是否存在，可大大加速育种进程，节约育种成本，显著缩短育种周期。在聚合育种方面，分子标记辅助选择的优势更加明显。因此，在培育抗疫病甜瓜品种的过程中，开发有效的分子标记具有十分重要的意义。

发明内容

为开发甜瓜疫病相关分子标记以简化甜瓜育种和优化甜瓜品种，发明人采用以甜瓜抗疫病材料ZQK9作为父本，高感材料E31作为母本，两亲本杂交获得F₁群体，然后F₁代自交获得F₂群体，回交获得BC₁P₁和BC₁P₂群体。利用在田间感病甜瓜植株中分离的疫霉菌菌株，采用灌根接种法对两个亲本及各个单株进行抗病性鉴定，从而进行遗传分析。结果表明，甜瓜抗病材料ZQK9对疫病的抗性符合单显性基因的遗传模式，其抗性可能由一个显性基因控制。采用全基因组重测序(Whole Genome Resequencing,WGR)和混合分组分析法(BulkedSegregation Analysis，BSA法)相结合的方法，利用F₂群体进行基因初步定位。通过标记筛选及定位分析，得出一个位于甜瓜12号染色体上的InDel标记MeInDel-9与抗病基因紧密连锁。

一方面，本发明提供了用于甜瓜抗疫病基因MePhyto辅助选择的分子标记MeInDel-9，其引物序列为：

MeInDel-9F：5’-TGGCGTACGTGATGACTCT-3’(SEQ ID NO.1)

MeInDel-9R：5’-AGGTTTCCAATCTGCGGGA-3’(SEQ ID NO.2)。

另一方面，本发明提供了上述分子标记在甜瓜育种中的应用。

进一步地，育种中使用以下方法筛选甜瓜植株：

(1)采用CTAB法提取叶片DNA；

(2)PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl DNA工作液，1μl 10×Buffer缓冲液，0.4μl dNTPs，0.2μl DNA聚合酶，正、反向引物各0.2μl，用7μl ddH₂O将总体积补齐至10μl。

(3)扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min。

(4)扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。

进一步地，筛选在苗期进行。

另一方面，本发明提供了上述分子标记在甜瓜品种鉴定中的应用。

另一方面，本发明提供了一种甜瓜抗疫病筛选试剂盒，包含引物对：

MeInDel-9F：5’-TGGCGTACGTGATGACTCT-3’(SEQ ID NO.1)

MeInDel-9R：5’-AGGTTTCCAATCTGCGGGA-3’(SEQ ID NO.2)。

进一步地，试剂盒还包含PCR试剂。

另一方面，本发明提供了上述分子标记在制备甜瓜育种或品种检测的试剂或试剂盒中的应用。

本申请中所述的甜瓜疫病是指辣椒疫霉菌引起的，以叶、茎、果实处暗绿色、青白色、黄褐色斑点为特征的甜瓜病害。

本申请中的PCR试剂本领域技术人员可以根据分子生物学常识常规选用，包括但不限于聚合酶、dNTP、镁离子、缓冲液等，本领域技术人员可以单独购买/制造试剂或者购买市售的试剂包或试剂组合。

附图说明

图1：MeInDel-9标记在双亲、抗感池以及F₂群体中随机挑选的抗病和感病单株中的扩增结果。图中，M：DNA marker；1：抗病亲本ZQK9基因型；2：感病亲本E31基因型；3：F₁基因型；4：抗病混池基因型；5：感病混池基因型；6-15：F₂群体中10株抗病单株；16-25：F₂群体中10株感病单株。

图2：甜瓜抗疫病基因MePhyto的连锁遗传图谱。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明

一、材料方法

1.供试甜瓜材料：本发明以本实验室选育的感病品种E31作为母本(P₁)，以抗病品种ZQK9作为父本(P₂)，利用两个亲本配制得到F₁、BC₁P₁、BC₁P₂和F₂群体。

供试菌株：本实验所用菌株是由从海南发病甜瓜植株上分离得到的，经鉴定为辣椒疫霉菌。

2.分析方法

(1)苗期抗病性分析：抗病性鉴定采用灌根接种法，待幼苗长至两叶一心期时，在距幼苗根部约1cm处，扎一1cm深的孔，将1ml浓度为10⁶个/m1的饱子悬浮液注入孔内，接种温度为25℃，接种后保持湿润状态，10天后分0-5级进行病情调查。其分级标准采用灌根接种法进行接菌，接菌10d后对植株的抗病情况进行调查并分为0-5级，分级标准如下：

0级：无症状；

1级：幼苗茎基部出现水渍状褐色病斑，轻微缢缩，植株不倒伏，不萎蔫；

2级：幼苗茎基部缢缩，褐色病斑未超过子叶，植株倒伏，子叶不萎蔫，真叶不萎蔫；

3级：幼苗茎部褐色病斑超过子叶，子叶萎蔫，真叶不萎蔫；

4级：幼苗茎部褐色病斑蔓延至全株，子叶干枯，真叶萎蔫，生长点不萎蔫；

5级：植株枯萎死亡。

病情指数(Disease index，DI)计算方法如下：

公式中：DI表示病情指数；s表示各级病情指数的代表数值；n表示各发病级别的植株数；N表示调查的植株总数；S表示最高病情级别的代表数值。

根据病情指数划分抗性水平：

免疫(I):病情指数为0；

高抗(HR):病情指数为0<DI≤10；

抗病(R):病情指数10<DI≤30；

中抗(MR):病情指数30<DI≤50；

感病(S):病情指数50<DI≤70；

高感(HS):病情指数70<DI≤100

根据该标准，我们将单株症状为0-1级的定为抗病，2-5级定为感病。对各世代群体用卡方检验进行分离比适合度测验，确定品种抗性的遗传模式。

(2)DNA提取和抗感池构建：甜瓜基因组的提取采用CTAB法。采用WGR+BSA相结合的方法进行初定位，具体方法是在F₂分离群体中随机选取15株极端抗病植株和15株极端感病植株，分别提取DNA，然后将15株抗病植株的DNA等量混合构建成抗病池，将15株感病植株的DNA等量混合构建成感病池。对两个亲本DNA混池和两个F₂群体极端混池进行全基因组重测序，通过分析亲本间SNP差异位点与抗感表型的相关性确定抗病基因候选区域，即基因的初定位区间。利用在初定位区间内筛选初的InDel位点开发分子标记，通过扩大F₂群体进行进一步定位。

(3)InDel引物的分析：

本发明所使用的分子标记是根据已公布的甜瓜基因组(Version 3.5.1,http://cucurbitgenomics.org/)12号染色体的核苷酸序列设计的。

PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl DNA工作液，1μl 10×Buffer缓冲液，0.4μldNTPs，0.2μl DNA聚合酶，正、反向引物各0.2μl，用7μl ddH₂O将总体积补齐至10μl。

扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min；扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察。

(4)遗传连锁分析和抗病基因的定位：通过筛选可找到在双亲、抗感池间具有多态性的引物，利用获得的多态性引物分析F₂群体的基因型，并结合F₂单株田间的抗病性鉴定结果，利用JoinMap4.0软件绘制抗病基因的连锁遗传图谱。

二、结果与分析

1.抗病性鉴定结果

苗期接种鉴定结果表明，甜瓜抗病材料ZQK9的所有单株未发病，感病材料E31所有单株均表现为高度感病。F₁和BC₁P₂两个群体的所有单株全部表现为抗病。F₂群体中抗病植株有373株，感病植株有124株，经X²检验符合3:1的分离比例(X²＝{3:1}＝0.00067<3.84，p＝0.05)。BC₁P₁群体中抗病和感病植株的分离比经X²检验符合1:1的分离比例(X²＝{1:1}＝2.49<3.84，p＝0.05)，这些结果表明ZQK9对甜瓜疫霉菌的抗性是由1对显性基因控制的。

2.连锁标记的筛选与基因定位

本发明采用混合分组分析法对所设计的InDel引物进行筛选，发现InDel引物MeInDel-9在双亲、抗感池间具有多态性。该引物所扩增出的条带清晰，在父母本间的差异明显(图2)。

利用该标记对F₂群体的497个单株的基因型进行扩增后，统计后用JoinMap4.0软件进行分析，结果显示标记MeInDel-9与抗病基因的遗传距离分别为0.3cM。

3.MeInDel-9标记的应用

如表1所示利用该标记对前期鉴定的20个甜瓜材料进行鉴定，发现该标记可以准确鉴定出抗病和感病材料。

表1 MeInDel-9标记的应用

三、结论

本发明采用灌根接种法对甜瓜抗疫病材料ZQK9和高度感病材料E31及其构建的F₁、F₂、BC₁P₁、BC₁P₂群体进行抗病性鉴定，通过分析发现ZQK9对甜瓜疫霉菌的抗性符合单基因显性遗传模式。通过引物筛选以及对F₂群体的基因型进行分析，发现位于12号染色体上的分子标记MeInDel-9与抗病基因紧密连锁。根据连锁遗传图谱显示，标记MeInDel-9与抗病基因的遗传距离分别为0.3cM。本发明的分子标记可用于甜瓜分子标记辅助育种，通过苗期筛选即可对抗病植株进行选择，可节约成本，提高选择效率，大大加速育种进程。

序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一种与甜瓜抗疫病基因紧密连锁的InDel标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tggcgtacgt gatgactct 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aggtttccaa tctgcggga 19

Claims

1.筛选甜瓜抗疫病植株的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）采用CTAB法提取样本的叶片DNA；

（2）构建PCR扩增体系；PCR扩增体系总体积为10μl，包括1μl DNA工作液，1μl 10×Buffer缓冲液，0.4μl dNTPs，0.2μl DNA聚合酶，MeInDel-9F和MeInDel-9R引物各0.2μl，用7μl ddH₂O将总体积补齐至10μl；其中MeInDel-9F和MeInDel-9R引物序列为：

MeInDel-9F：5’-TGGCGTACGTGATGACTCT-3’

MeInDel-9R：5’-AGGTTTCCAATCTGCGGGA-3’；

（3）PCR扩增，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min；

（4）扩增产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相；

（5）如果扩增产物与抗病亲本ZQK9有相同的条带，则样本为抗病植株；如果扩增产物与感病亲本E31有相同的条带，则样本为感病植株。