CN110831433A

CN110831433A - ToLCNDV抗性甜瓜植物

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Publication number: CN110831433A
Application number: CN201880025878.7A
Authority: CN
Inventors: J·A·利萨萨武鲁查韦斯; J·斯科涅茨卡; D·贝隆多纳
Original assignee: Nunhems BV
Current assignee: Nunhems BV
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2038-04-19
Also published as: US20200040355A1; US11111502B2; US20210324405A1; IL270015A; AU2018254753A1; CA3057745A1; CN110831433B; US20240122144A1; US11832572B2; ZA201907574B; IL270015B1; IL270015B2; AU2018254753B2; EP3612018A1

Abstract

本发明涉及ToLCNDV抗性甜瓜植物，在其基因组中包含一个或两个渗入片段。

Description

ToLCNDV抗性甜瓜植物

本申请涉及栽培对番茄卷叶新德里病毒(tomato leaf curl New Dehli virus，ToLCNDV)感染具有抗性的甜瓜植物(Cucumis melo)。抗性甜瓜植物在11号染色体和/或12号染色体上具有基因组渗入(introgression)片段。11号染色体上的渗入片段包含以隐性方式赋予对ToLCNDV抗性的QTL。12号染色体上的渗入片段包含以部分显性方式赋予对ToLCNDV抗性的QTL。两个QTL一起导致栽培的甜瓜植物显示很少症状(平均疾病评分为至少8)、甚至没有症状(平均疾病评分为9)。还公开了用于鉴定包含那些渗入片段的植物或植物部分的标记物以及用于鉴定或产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法。

番茄卷曲新德里病毒(ToLCNDV)被分类为属于双生病毒科(Geminiviridae)的双生病毒。ToLCNDV具有由称为DNA A和DNA B的两个单链DNA分子组成的两分基因组(Saez等人,2016,Annals of Applied Biology)。

1995年在印度最初发现ToLCNDV感染番茄(Solanum lycopersicum)植物。后来发现ToLCNDV还感染其他茄科(Solanacea)物种的植物，如Solanum melongena(茄子)、红辣椒(Capsicum spp.)和Solanum tuberosum(马铃薯)。2012年在西班牙发现ToLCNDV感染了葫芦科物种(西葫芦、吉罗西葫芦(Cucurbita pepo var.giromontiina))，2015年在突尼斯将该病毒鉴定为甜瓜、黄瓜和西葫芦的病源。同时，已证明了许多葫芦科(Curcubitacea)物种的感染，如：Benincasa hispida(冬瓜)、Citrullus lanatus(西瓜)、Cucumis melo(甜瓜)、Cucumis melo var.flexuosus(蛇瓜)、Cucumis sativus(黄瓜)、Cucurbita moschata(南瓜)、Cucurbita pepo(西葫芦)、Cucurbita pepo var.giromontiina(吉罗西葫芦)、Lagenaria siceraria(葫芦)、Luffa cylindrica(丝瓜)、Morordica charantia(苦瓜)。还报道了杂草(例如旱莲座(Eclipta prostrata)-菊科)和其他农作物的感染，如Hibiscuscannabinus(洋麻-锦葵科)和Carica papaya(番木瓜-番荔枝科)。在地中海地区，该疾病确实发生在意大利(西西里)、西班牙和突尼斯的各种农作物中。在亚洲国家，已在孟加拉国、印度、印度尼西亚、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡、台湾和泰国的不同农作物中证明了感染。尚无关于ToLCNDV地理分布的进一步信息，但从今天的观察来看，该病毒显然似乎在地理上向其他农作物中进一步传播。

疾病症状通常包括叶子上的黄色花叶病、叶卷曲、叶脉肿胀和植物发育迟缓的表型表现。幼小植物被ToLCNDV感染后，葫芦科植物表现为生长受阻、果实产量降低或抑制。还报道了果实显示出果皮粗糙和纵向开裂。因此，ToLCNDV在多种重要作物物种中造成经济损失，是一种严重的威胁。ToLCNDV对植物的感染通过韧皮部吸粉虱(Bemisia tabaci)传播病毒而持续发生(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO RS2015/114,2016/024,2016/040,Entry date 2015-06)。

已表明在丝瓜中，对ToLCNDV的抗性由单个显性基因控制(Islam等人,2010,Euphytica 174(1):83-89)。

在番茄中，通过沉默病毒基因已经产生了对ToLCNDV抗性的转基因植物(Varma&Praveen,2006,ISB News Report)。

已经开发了通过将受感染的夏南瓜(zucchini)植物的汁液机械传递到其他葫芦科(甜瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、柑橘属(Citrullus)、葫芦属(Lagenaria))的未感染植物来传播ToLCNDV的测定法。鉴定了ToLCNDV抗性的五个甜瓜亚种田间品系(Cucumismelo subsp.agrestis)(亚种agrestis var.momordica:Mom-KhaInd/Kharbuja、Mom-PI124Ind/PI124112、Mom-PI124Ind/PI414723和亚种agrestis野生型:Ag-WM9Ind/WM9、Ag-WM7Ind/WM7)(Lopez等人,2015,Euphytica 204(3),679-691)。没有通过使用天然粉虱感染系统确认这些品系(accessions)的抗性。

Saez等人，2016年，第214-216页(2016年葫芦科会议论文集，第Xl届EUCARPIA葫芦科遗传学和育种会议，2016年7月24-28日，波兰华沙)描述了甜瓜亚种田间品系(C.melosubsp.agrestis accession)WM-7对ToLCNDV的抗性以3：1的耐受性：易感性比率在F2群中分离，表明WM-7中存在单个显性抗性基因。如Lopez等人2015同上所述，使用机械接种，而不是通过粉虱媒介的自然感染。在后来的出版物中(Saez等人,14July 2017,Plant CellReport,DOI 10.1007/s00299-017-2175-3)，对WM-7的抗性进行了定位并发现由11号染色体上的显性QTL赋予。

WO2017/114848描述了定位于11号染色体的赋予甜瓜亚种田间酸味供体(称为H-MLCND-32)ToLCNDV耐性的QTL，其是隐性的。包含QTL的两个系(RIL-69和RIL-82)的混合物保藏在登录号NCIMB 42506下。根据表5，QTL必须位于SEQ ID NO：7(Melon_sbg_33761_74)和SEQ ID NO：16(Melon_sbg_16835_17)之间的子区域中，因为RIL-30具有抗性表型，但缺少SEQ ID NO：1(Melon_sbg_617_42)至6(Melon_sbg_60684_74)的供体SNP标记物。发现三个SNP具有最可预测表型的价值，即Melon_sbg_33761_74(SEQ ID NO：7)、Melon_sbg_2720_78(SEQ ID NO：8)和Melon_sbg_14207_58(SEQ ID NO：9)(参见第13页，第29-30行和图2)。描述了供体在症状水平上是不同的，例如7株植物中，4株无症状，2株有中等泛黄症状，1株有完全症状(表1)。

通过机械汁液传播筛选测定法已经筛选了对ToLCNDV具有抗性的各种南瓜属物种(西葫芦(C.pepo)、南瓜(C.Moschata)、笋瓜(C.Maxima)、兄弟葫芦(C.Fraternal)、黑籽南瓜(C.Ficifolia))。在用ToLCNDV进行机械感染后，发现4个南瓜品系(PI 604506、PI381814、Nigerian local、Kurokawa)在机械感染ToLCNDV后显示出低症状。但是，在粉虱感染后只在其中两个品系(PI 604506、PI 381814)才能重现这一结果，这表明对ToLCNDV的抗性不仅应在人工条件下进行测试，而且还应使用天然存在的粉虱感染系统进行测试(Saez等人,2016,Annals of Applied Biology)。因此，尚不清楚当通过粉虱传递病毒时，被鉴定为对ToLCNDV感染具有抗性的品系在自然生长条件下是否具有抗性。

对控制作物植物ToLCNDV感染的尝试包括通过施用杀虫剂控制媒介(粉虱)以及栽培技术的适应，包括使用无病毒的作物材料(移植)、建立无作物期、杂草管理(消除被病毒感染的杂草)和破坏田间被感染的植物。然而，由于与该疾病相关的复杂流行病学因素，这些尝试并不总是有效的(Saez等人,2016,Annals of Applied Biology)。

因此，需要建立进一步的措施以减少ToLCNDV感染、减少进一步病毒传播到其他地理区域以及传播到其他作物。ToLCNDV抗性品种的育种对于控制该疾病至关重要。

本发明的目的是提供用于控制栽培的甜瓜植物中ToLCNDV感染的措施。

本发明公开了对ToLCNDV感染具有抗性或甚至高度抗性的栽培的甜瓜植物细胞和甜瓜植物。

众所周知，ToLCNDV确实会感染葫芦科(Curcubitaceae)的多种植物物种，包括甜瓜。还众所周知，ToLCNDV通过植物吸吮害虫烟粉虱(Bemisia tabaci)(粉虱)从感染的植物持续地传播到未感染的植物。已经证明ToLCNDV从一种作物物种传递到不同作物物种，或者甚至从杂草物种传递到作物物种。粉虱可以从控制区域以外甚至从不同的物种吸取ToLCNDV，并将其传递到控制区域内生长的甜瓜植物中。因此，粉虱媒介控制对于预防ToLCNDV感染效果有限。ToLCNDV抗性甜瓜植物的优势在于，即使在甜瓜植物生长地区周围的植物被ToLCNDV感染，这些ToLCNDV抗性甜瓜植物也能耐受ToLCNDV的感染而不会造成重大产量损失。

本发明人发现了ToLCNDV抗性甜瓜甜味亚种(C.melo subsp.melo)的供体品系，其从法国获得，但根据描述，其起源于印度西部，并且发明人使用西班牙ToLCNDV株的粉虱感染进行耐药表型分型，绘制了分离群体中的抗性图谱。鉴定了两个数量性状位点(QTL)，一个位于11号染色体(QTL11)上，一个位于12号染色体(QTL12)上，并将其从供体品系渗入原种(elite)Piel de Sapo瓜系和原种Galia瓜系。根据布达佩斯条约，Nunhems B.V.于2016年8月10日将包含纯合形式的QTL11和QTL12渗入的Piel de Sapo系的种子以保藏号NCIMB42625保藏。在这些种子中，存在本文提供的单核苷酸多态性(SNP)标记物(SNP_01至SNP_07)的供体基因型。供体本身不均匀，果实很长(伸长)，果实直径窄，白利糖度低。它还具有其他负面特征，如花梗在成熟时附着力非常弱、果实的保质期非常短等，即它不是农艺价值的品系。通过从供体鉴定QTL11和/或QTL12并将其传递到栽培的甜瓜，现在可以使高农艺价值的栽培甜瓜品种和栽培品种(具有均匀的特性，并且具有高白利糖度和良好保质期的可销售果实)具有对ToLCNDV的抗性，因此，有可能在ToLCNDV感染地区栽培这些甜瓜品种，而不会造成产量损失。

“甜瓜植物细胞”或“甜瓜植物”或“栽培的甜瓜植物或细胞”在本领域中也称为甜瓜(muskmelon)植物细胞或甜瓜(muskmelon)植物，在本发明的上下文中，其应理解为源自甜瓜(Cucumis melo)物种的植物细胞或属于甜瓜物种的植物。甜瓜可以分为：罗马甜瓜(C.melo var.Cantalupensis)、无臭甜瓜(C.melo var.Inodorous)和网纹甜瓜(C.melovar.Reticulatus)。罗马甜瓜也称为有棱甜瓜，主要呈圆形，具有突出的肋，几乎没有网纹。大多数具有橙色、甜的果肉，通常很香。与欧洲哈密瓜相反，北美“哈密瓜”不是这种类型，而是真正的甜瓜。无臭甜瓜(或冬季甜瓜)可细分为不同类型，如蜜瓜(Honeydew melon)、Pielde Sapo、糖甜瓜(sugar melon)、日本甜瓜等。网纹甜瓜是真正的甜瓜，具有网状果皮(网状)，包括Galia甜瓜、Sharlyn甜瓜和北美哈密瓜。

栽培的甜瓜和甜瓜野生近缘物是二倍体，具有12对同源染色体，编号为1至12。

在本发明的上下文中，“抗性”或“对其具有抗性”应被理解为是特定病原体的宿主物种的植物，因此其可以被给定病原体感染，但是其中所述植物包含遗传元件(例如，渗入片段)，所述遗传元件使得与缺少该遗传元件的易感植物相比，感染后病原体在植物中的生长和/或传播减少。在本发明的上下文中，“抗性”或“对其具有抗性”特别是指对ToLCNDV具有抗性的植物细胞或植物。抗性是一个相对术语，可以涵盖由病原体感染触发的植物细胞或植物中的一系列(不同)反应。植物细胞或植物的这些反应的作用可以通过各种手段来测量。通常，通过定义植物细胞或植物中出现的症状水平来测量该作用。通常将一个品系的几株植物(例如10或更多)的平均症状(平均疾病评分)与对照品系或品种，优选易感对照品系或品种的几株植物的平均症状(平均疾病评分)进行比较。因此，在一个时间点对一个品系或品种的至少10株或更多株个体植物进行评分，并计算平均疾病评分。关于本发明，根据ToLCNDV感染后进行的表型观察，应用以下公知的症状水平(或疾病评分)：

1＝死亡植物；

2＝严重花叶病和卷曲、萎黄和生长降低，无法恢复；

3＝强花叶病和卷曲、萎黄和生长降低，无法恢复；

4＝卷曲和花叶病、萎黄、无或轻微生长降低，无法恢复；

5＝卷曲和花叶病、萎黄、无生长降低，上部植物区的轻微恢复；

6＝轻微卷曲、花叶病和萎黄、无生长降低，中上部植物恢复；

7＝轻微卷曲、花叶病和萎黄、无生长降低，症状仅出现在下部植物区；

8＝弱花叶病；

9＝无症状。

为了确定症状水平(或疾病评分)，优选用ToLCNDV感染幼小植物。幼小植物优选是伸展第一片真叶的年龄的植物，优选播种后约12-15天。优选通过饲喂携带病毒的媒介(烟粉虱(Bemisia))来进行感染。为了此目的，使植物在最佳或接近最佳条件下发芽和生长。优选例如在感染后30天(或更晚，例如感染后31、32、33、34、35天)至少一次确定症状水平。任选地，在感染后的不同时间点两次或甚至三次确定症状水平，以证实结果，例如，在ToLCNDV感染后约15、20或25天进行第一次评分，在ToLCNDV感染后约30天(或更晚，例如感染后31、32、33、34、35天)进行第二次评分。另参见实施例。在每个时间点针对每个品系或品种计算平均疾病评分。一方面，如果植物品系或品种的平均疾病评分为7.0或更高，而在相同条件下生长并以相同方式感染时，易感的对照品系或品种(如Gandalf或Vedantrais品种)具有4.0或以下、3.0或以下或2.0或以下的平均疾病评分，则认为其对ToLCNDV感染具有“抗性”。在另一方面，如果植物品系或品种的平均疾病评分为8.0或更高，优选其平均疾病评分为9.0，而在相同条件下生长并以相同方式感染时，易感的对照品系或品种，如Gandalf(或Gandalf F1,Nunhems)或Vedantrais品种具有4.0或以下、3.0或以下或2.0或以下的平均疾病评分，则认为其对ToLCNDV感染具有“高度抗性”。

已经观察到，将位于相同野生甜瓜植物供体的11号染色体(包含QTL11)和12号染色体(包含QTL12)上的特定片段渗入到栽培的甜瓜植物中，赋予栽培的甜瓜植物或由其衍生的细胞对ToLCNDV感染的抗性。虽然11号染色体上的片段需要以纯合形式存在才能赋予抗性，但12号染色体上的片段仅以杂合状态存在就足以赋予ToLCNDV抗性，这表明11号染色体上的片段以隐性方式赋予抗性，而12号染色体上的片段以部分显性方式赋予对ToLCNDV感染的抗性。在11号和12号染色体上鉴定出单核苷酸多态性(SNP)，其与赋予ToLCNDV抗性的11号和12号染色体片段紧密连锁。抗性供体(即渗入片段的核苷酸)的SNP基因型以纯合形式存在于保藏的种子中，即，对于SNP_01至SNP_04(与QTL11连锁)以及对于SNP_05至SNP_07(与QTL12连锁)，供体基因型以纯合形式存在。因此，SNP可用于测试植物细胞、植物组织、植物部分包含QTL11或QTL12的渗入片段的存在和/或标记物辅助选择(MAS)中，以将QTL传递到其他原种甜瓜品系或品种中。SNP还可以用于选择包含比保藏的种子中存在的片段小的渗入片段的植物，从而较小的子片段保留QTL。或者，SNP可用于鉴定包含QTL11和/或QTL12的其他供体，并将这些QTL渗入栽培的甜瓜中。

因此，本发明在一方面涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物(或植物部分)，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中所述渗入片段包含介于SNP_01和SNP_04之间的供体植物序列(针对11号染色体上的片段)，优选介于SNP_02和SNP_04之间的针对11号染色体上的片段，或者任选地介于SNP_03和SNP_04之间；或者任选地，介于SNP_01和SNP_03之间，或者介于SNP_02和SNP_03之间，或者介于SNP_01和SNP_02之间；和/或介于SNP_05和SNP_07之间的针对12号染色体上的片段，任选地介于SNP_05和SNP_06之间，或介于SNP_06和SNP_07之间。赋予ToLCNDV抗性的QTL存在于渗入片段上，如通过本文所述的抗性测定法所测定的。

一方面，本发明涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物(或植物部分)，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中所述渗入片段赋予ToLCNDV抗性，并且所述渗入片段可检测到(包含)以下SNP中的一个或多个(或全部)的供体植物的SNP基因型：SNP_01、SNP_02、SNP_03和/或SNP_04，和任选地介于SNP_01和SNP_04之间的针对11号染色体上片段的任何SNP；和/或其中渗入片段赋予ToLCNDV抗性，并且渗入片段可检测到(包含)以下SNP中的一个或多个(或全部)的供体植物的SNP基因型：SNP_05、SNP_06和/或SNP_07，和任选地介于SNP_05和SNP_07之间的针对12号染色体上片段的任何SNP。赋予ToLCNDV抗性的QTL存在于渗入片段上，如通过本文所述的抗性测定法所测定的。

在一方面，SNP_01、SNP_02、SNP_03和/或SNP_04的SNP基因型是QTL11的渗入供体的SNP基因型，即SEQ ID NO：1的核苷酸101上的腺嘌呤(A)(SNP_01)、SEQ ID NO：2的核苷酸101上的鸟嘌呤(G)(SNP_02)、SEQ ID NO：3的核苷酸101上的胸腺嘧啶(T)(SNP_03)、SEQ IDNO：4的核苷酸101上的胸腺嘧啶(T)(SNP_04)。

一方面，植物、植物部分或植物细胞包含QTL11并且至少包含SNP_03的SNP供体基因型，因为该SNP与ToLCNDV抗性QTL11最显著相关。在另一方面，植物、植物部分或植物细胞至少包含SNP_03和SNP_04、或至少包含SNP_03和SNP_02的SNP供体基因型。任选地，植物、植物部分或植物细胞包含QTL11并且包含SNP_01、SNP_02和SNP_03的SNP供体基因型；或包含SNP_02、SNP_03和SNP_04的SNP供体基因型。一方面，植物、植物部分或植物细胞包含QTL11，其包含全部四个SNP(SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04)的SNP供体基因型。

一方面，SNP_05、SNP_06和/或SNP_07的SNP基因型是QTL12渗入供体的SNP基因型，即SEQ ID NO：5的核苷酸101上的C(胞嘧啶)(SNP_05)和/SEQ ID NO：6的核苷酸101上的鸟嘌呤(G)(SNP_06)，和任选地SEQ ID NO：7的核苷酸101上的胸腺嘧啶(T)(SNP_07)。一方面，植物、植物部分或植物细胞包含QTL12并且至少包含SNP_06的SNP供体基因型，因为该SNP与ToLCNDV抗性QTL12最显著相关。在另一方面，植物、植物部分或植物细胞至少包含SNP_05和SNP_06的SNP供体基因型，或至少包含SNP_06和SNP_07的SNP供体基因型。任选地，植物、植物部分或植物细胞包含QTL12，并且包含SNP_05和SNP_06的SNP供体基因型，任选地还可包含SNP_07。

当在本文中提及在“介于”两个SNP(单核苷酸多态性)之间包含供体染色体序列或供体序列(和QTL)的渗入片段时，一方面，这包括两个SNP本身之一或两者也来自抗性供体(即具有供体核苷酸)的情况。因此，对于11号染色体上的QTL，SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04可能都具有抗性供体基因型。或者仅SNP_01和SNP_02可能具有抗性供体基因型；或者仅SNP_02和SNP_03可能具有抗性供体基因型；或者仅SNP_03和SNP_04可能具有抗性供体基因型。或者仅单个SNP，即仅SNP_01、或仅SNP_02或仅SNP_03、或仅SNP_04具有抗性供体基因型。因此，不具有抗性供体基因型的SNP具有其他基因型，即受体基因型。SNP的受体基因型可以是其他3个核苷酸中的任何一个，即对于SNP_01，受体基因型可以是胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。

因此，例如当指出关于12号染色体上的QTL的渗入片段介于SNP_05和SNP_06之间时，SNP_05和SNP_06可以都具有抗性供体基因型。或者仅单个SNP，即仅SNP_05或仅SNP_06可具有抗性供体基因型。任选地，SNP_07也可以具有抗性供体基因型。

并非本文提供的所有SNP都需要具有抗性供体基因型的原因是，来自供体的包含QTL的渗入片段可以小于渗入的染色体片段，例如在保藏的种子中，但该片段仍包含QTL11或QTL12。尽管如此，通过表型、和/或通过将该片段传递到易感植物上从而传递ToLCNDV抗性表型、或通过对SNP标记物之间的区域进行测序以鉴定供体片段、或本领域技术人员已知的其他方法，如用更多的SNP标记物使区域饱和、等位性测试、鉴定因果基因等，可以识别出植物含有渗入片段(包含QTL11或12)。

因此，可以使用多种方法的组合来表明QTL11或QTL 12存在于植物细胞或植物中，即使所有连锁的SNP不是都存在供体SNP基因型。当将QTL11传递到易感品系或品种中时，其赋予至少7.0的平均ToLCNDV抗性，并且是隐性的。当将QTL12传递到易感品系或品种中时，其赋予至少5.0或6.0的平均ToLCNDV抗性，并且是部分显性的。当两个QTL在栽培植物中组合以表达它们的表型时，获得的平均ToLCNDV抗性评分为至少8.0或至少为9.0。

当将QTL12递送到已经具有一定水平的ToLCNDV抗性的甜瓜植物中时，其将平均抗性水平提高1或2分，因此，例如如果受体植物的平均抗性水平为7.0，则引入QTL12将使抗性水平增加到至少8.0或9.0。

因此，一方面，包含11号染色体上的渗入片段的甜瓜植物的SNP基因型是抗性供体基因型，即，一方面，以下四个11号染色体上的SNP中的至少一个、任选地至少两个、任选地所有三个或任选地所有四个具有抗性供体的基因型，如下表所示。由于11号染色体上的渗入片段需要以纯合形式赋予ToLCNDV抗性表型，因此SNP基因型以纯合形式显示。

在另一方面，包含12号染色体上的渗入片段的甜瓜植物的SNP基因型是抗性供体基因型，即，在一方面，选自SNP_05、SNP_06和SNP_07的12号染色体上的至少一个、任选地至少两个SNP具有抗性供体的基因型，如下表1所示。任选地，所有三个SNP具有抗性供体基因型，如下表1所示。尽管12号染色体上的渗入片段不需要以纯合形式赋予ToLCNDV抗性表型，但是纯合形式是优选的。因此，SNP基因型以纯合形式显示。

应注意，SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04以此顺序物理位于11号染色体上，12号染色体上的SNP_05、SNP_06和SNP_07也是如此。因此，渗入片段可包含与QTL11连锁的所有四个SNP标记物的供体SNP基因型和/或与QTL12连锁的所有三个SNP标记物的供体SNP基因型(如在本文中保藏的种子中)，或较小的片段，由此一个或多个SNP标记物不存在。如下文进一步描述，甚至可以缺失全部或除一个以外的全部供体SNP标记物，而QTL11或QTL12仍存在于一个渗入片段上。

表1：

包含本文提供的SNP的核苷酸序列(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7)是抗性供体的核苷酸序列，即它们包含供体SNP核苷酸。因此，一方面，本发明涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物(或植物部分)，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中对于11号染色体的片段，渗入片段赋予ToLCNDV抗性，并且该渗入片段可检测到(包含)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的核苷酸101上的腺嘌呤或在与SEQ ID NO：1具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的腺嘌呤；和/或可检测到(包含)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的核苷酸101上的鸟嘌呤或在与SEQ ID NO：2具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的鸟嘌呤；和/或可检测到(包含)SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3的核苷酸101上的胸腺嘧啶或在与SEQ ID NO：3具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶；和/或可检测到(包含)SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：4的核苷酸101上的胸腺嘧啶或在与SEQ ID NO：4具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶；和/或其中对于12号染色体的片段，渗入片段赋予ToLCNDV抗性，并且该渗入片段可检测到(包含)SEQID NO：5或SEQ ID NO：5的核苷酸101上的胞嘧啶或在与SEQ ID NO：5具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胞嘧啶；和/或可检测到(包含)SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6的核苷酸101上的鸟嘌呤或在与SEQ ID NO：6具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的鸟嘌呤；和/或可检测到(包含)SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：7的核苷酸101上的胸腺嘧啶或在与SEQ ID NO：7具有实质的的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶。渗入片段上存在赋予ToLCNDV抗性的QTL。

在一方面，仅11号染色体上的QTL或仅12号染色体上的QTL渗入栽培的甜瓜。11号染色体上的QTL对ToLCNDV抗性的作用(纯合形式时)比12号染色体上的QTL更好。11号染色体上的QTL赋予栽培的甜瓜平均ToLCNDV抗性评分为至少7.0，相比之下，缺少QTL的对照品系或品种(如ToLCNDV易感品种)的平均评分为4.0或更小或3.0或更小。

另一方面，12号染色体上的QTL在杂合形式时也赋予ToLCNDV抗性。12号染色体上的QTL赋予栽培的甜瓜平均ToLCNDV抗性评分为至少5.0或6.0，相比之下，缺少QTL的对照品系或品种(如ToLCNDV易感品种)的评分为4.0或更小或3.0或更小。

在另一方面，两个QTL(11号染色体上的QTL和12号染色体上的QTL)都渗入栽培的甜瓜中。一方面，至少11号染色体上的QTL是纯合形式。在另一方面，两个QTL均为纯合形式。两个QTL均以纯合形式存在，提供了最高的平均抗性评分，为至少8.0，优选为9.0(无症状)。

供体的平均评分为9.0(无症状)。当然，平均评分为9.0的其他供体也可能包含QTL11和/或QTL12。本文提供的SNP标记物可用于筛选存在QTL11和QTL12的此类供体。

在另一方面，与QTL连锁的一个或多个、或甚至全部、或除一个之外的全部SNP可以来自受体，例如，易感甜瓜植物，而SNP之间的区域来自抗性供体并且赋予ToLCNDV抗性，即，赋予抗性的供体片段位于SNP标记物之间。例如，植物可以包含渗入片段，该渗入片段包含介于SNP_03和SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列(携带QTL11)，一方面该植物包含SEQ ID NO：3的核苷酸101上的胞嘧啶(C)和SEQ ID NO：4的核苷酸101上的胞嘧啶(C)，即受体核苷酸，而不是供体。因此，一方面，仅仅这两个SNP之间的区域(整个区域或其部分)来自供体，而SNP_03和SNP_04来自受体，其具有SEQ ID NO：3的核苷酸101上的胞嘧啶(C)和SEQ ID NO：4的核苷酸101上的胞嘧啶(C)。其他SNP对也是如此。

一方面，在本发明的栽培甜瓜植物、植物部分或植物细胞中至少SNP_04来自抗性供体并且具有供体基因型，即渗入片段包含QTL 11和SEQ ID NO：4。

在另一方面，在本发明的栽培甜瓜植物、植物部分或植物细胞中至少SNP_06来自抗性供体并且具有供体基因型，即渗入片段包含QTL12和SEQ ID NO：6。

在本发明的一个优选的实施方案中，来自供体植物11号染色体的渗入片段赋予根据本发明的甜瓜植物细胞或根据本发明的甜瓜植物ToLCNDV抗性，所述渗入片段包含介于SNP_01和SNP_04之间、或介于SNP_01和SNP_03之间、或介于SNP_01和SNP_02之间、或介于SNP_02和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间、或介于SNP_03和SNP_04之间、或优选介于SNP_02和SNP_04之间的供体植物的序列(包含QTL11)。

在本发明的一个优选的实施方案中，来自供体植物12号染色体的渗入片段赋予根据本发明的甜瓜植物细胞或根据本发明的甜瓜植物ToLCNDV抗性，所述渗入片段包含介于SNP_05和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间的供体植物的序列(包含QTL12)。

优选地，根据本发明的甜瓜植物细胞源自栽培的甜瓜植物，或者根据本发明的甜瓜植物是栽培的甜瓜植物。

与本发明相关的“供体植物细胞”或“供体植物”是指对ToLCNDV具有抗性的甜瓜植物细胞或甜瓜植物，优选具有至少9.0的平均抗性评分。同样地，术语来自供体植物或细胞的DNA片段或渗入片段将意指对ToLCNDV具有抗性的甜瓜植物的11号染色体或12号染色体的片段，由此当将该片段传递到ToLCNDV易感的甜瓜植物中时赋予ToLCNDV抗性。在本发明的一个实施方案中，供体植物是甜瓜的野生物种或野生品系。在本发明的一个实施方案中，来自供体植物细胞或植物的DNA片段或渗入片段获得自、或可获得自或存在于保藏在NCIMB42625下的种子生长的植物、或从保藏在NCIMB 42625下的种子生长的植物获得的后代、或与保藏在NCIMB 42625下的种子生长的植物杂交获得的植物。如所提到的，保藏的种子是栽培的甜瓜(Piel de Sapo)种子，其中渗入了来自平均疾病评分为9.0的供体植物的QTL 11和QTL12。

可以从各种来源获得供体甜瓜植物。本领域技术人员知道如何检测ToLCNDV抗性供体植物的其他来源。为了检测ToLCNDV抗性供体植物的这种来源，原则上可以通过如Lopez等人(2015,Euphytica 204(3),679-691)所述的机械方法或通过粉虱的病毒传播用ToLCNDV感染甜瓜植物。优选地，在本发明的上下文中，感染是通过粉虱感染发生的。然后可以选择与易感对照相比表现症状水平降低的植物，并将其用作赋予ToLCNDV抗性的基因组片段或序列的来源。在本文的“一般方法”中给出了如何用ToLCNDV感染甜瓜植物的优选方法和测定被感染植物症状水平的方法。

在本发明的上下文中，供体植物的平均症状水平优选等于或高于8.0，最优选等于或高于9.0。一方面，供体植物包含与表3所示的供体SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04相同的SNP基因型。一方面，供体植物包含与表3所示的供体SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04以及SNP_05、SNP_06和任选地SNP_07相同的SNP基因型。优选地，SNP供体基因型是纯合的。

与本发明相关的“回交(recurrent)植物细胞”或“回交植物”或“受体植物”应理解为对ToLCNDV感染敏感(在本文中与易感同义使用)或不具有抗性的甜瓜植物细胞或甜瓜植物。可以通过观察ToLCNDV感染后的症状水平来确定植物是否对ToLCNDV敏感或不具抗性。回交植物的平均症状水平优选等于或低于4.0、等于或低于3.0，更优选等于或低于2.0。症状水平和如何用ToLCNDV感染甜瓜植物的方法在本文其他地方描述，因此在此适用。在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的回交甜瓜植物细胞源自栽培的甜瓜植物，或者根据本发明的回交甜瓜植物是栽培的甜瓜植物。优选地，其是原种品系、育种系或品种。

“渗入片段”是指通过杂交或传统育种技术已被引入到相同或相关物种的另一植物中的染色体片段、染色体部分或区域。片段从供体植物向回交植物中的渗入在供体和回交植物之间的杂交后代中引入了表型，该表型原本不存在于回交植物中。关于本发明，从供体植物递送到回交植物的表型是ToLCNDV抗性，特别是平均疾病评分为7.0或更高、8.0或更高或9.0或更高。为了将片段渗入特定的原种品系或品种中，可以在第一杂交步骤之后进行，例如与目标原种系或品种一次或多次反交(backcrossing)。如本文所理解的，渗入可以意指ToLCNDV抗性供体植物与ToLCNDV非抗性回交植物的第一次杂交，以及与受体植物杂交获得的其中渗入了ToLCNDV抗性的ToLCNDV抗性植物进一步地一次或多次回交。在这种情况下，渗入片段是育种方法的结果，所述育种方法是指“渗入”(如反交)受体品种或育种系或原种系。因此，将ToLCNDV抗性渗入回交植物中是人工指导的技术过程。特别地，本文的渗入是指人工育种过程或方法。本文提供的一种或多种或全部分子标记物可以用于该过程。所得的植物，即包含一个或两个来自供体的渗入片段的栽培品系或品种也是人工的、自然界中不存在的。

渗入片段可以很大，例如，甚至是染色体的一半，但优选较小，如约15Mb(兆碱基)或更小、如约10Mb或更小、约9Mb或更小、约8Mb或更小、约7Mb或更小、约6Mb或更小、约5Mb或更小、约4Mb或或更小、约3.5或3Mb或更小、约2Mb或更小、约1Mb(等于1,000,000碱基或更小)或约0.9Mb(等于900,000碱基对)或更小，如0.8Mb、0.7Mb、0.6Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb或更小。

SNP_01和SNP_04之间的物理距离约为1.16Mb，SNP_05和SNP_06之间的物理距离约为0.88Mb，SNP_05和SNP_07之间的物理距离约为3.4Mb。因此，一方面，渗入片段包含本文其他地方指示的物理区域，其包含一个或多个SNP或其保留QTL的其子区域。

渗入片段可以源自例如野生甜瓜植物或野生甜瓜品系或甜瓜或地方品种的野生近缘物(供体)。野生甜瓜植物或野生甜瓜品系或甜瓜植物或地方品种的野生近缘物可用于将供体基因组的片段渗入栽培的甜瓜的基因组中，以产生具有良好农艺特性的原种系和品种。因此，这种栽培的甜瓜植物具有“栽培甜瓜的基因组”，但是在其基因组中包含供体的片段，例如相关甜瓜基因组的渗入片段，如甜瓜田间亚种(Cucumis melo ssp.Agrestis)、甜瓜甜味亚种(C.melo ssp.Melo)、甜瓜酸味亚种(C.melo ssp.Acidulous)、C.Callosus、C.Trigonus、C.picrocarpus或其他野生甜瓜或甜瓜野生近缘物。可以理解，术语“渗入片段”从不包括完整的染色体，而仅包括染色体的一部分。因此，携带渗入的染色体还包括回交(受体)甜瓜植物的一部分或部分，以及供体甜瓜植物的另外部分。

一方面，本发明的供体植物不是由Lopez等人,2015,Euphytica 204(3),679-691鉴定的ToLCNDV抗性的五个甜瓜亚种田间品系(亚种agrestis var.momordica:Mom-KhaInd/Kharbuja、Mom-PI124Ind/PI124112、Mom-PI124Ind/PI414723和亚种agrestis野生型:Ag-WM9Ind/WM9、Ag-WM7Ind/WM7)之一。

在另一方面，本发明的供体植物不是属于田间亚种(缩写为“ssp”或“subsp.”)的品系，即其不是甜瓜亚种田间品系(Cucumis melo ssp agrestis accession)，特别是在一个方面，供体不是甜瓜亚种田间酸味品系(Cucumis melo ssp agrestis var.acidulousaccession)。一方面，抗性供体是甜瓜亚种甜味品系(Cucumis melo ssp.meloaccession)。

术语“育种”在本文中包括育种者已知的杂交、反交、自交、选择、双单倍体生产、胚拯救、原生质体融合、标记物辅助选择、突变育种等(即除遗传修饰/转化/转基因方法以外的方法)，例如，通过这些方法可以获得、鉴定、产生和/或传递重组的11号染色体或12染色体。

在本发明的一个优选实施方案中，渗入片段源自野生甜瓜属植物或野生甜瓜属种或地方品种，最优选地，该渗入片段源自甜瓜甜味亚种(Cumcuis melo ssp melo)，其具有以下特征中的一项或多项：低白利糖度或低TSS百分比(可溶性固体总量，例如小于6％可溶性固体总量或小于5.5％TSS)、花梗在果实成熟时的附着非常弱(尺度为非常弱、弱、中等、强、非常强，参见TG/104/5 Rev.,UPOV Code:CUCUM_MEL中的UPOV特征39，可在网站UPOV.int上找到)、非常短的果实保质期(尺度为非常短、短、中等、长、非常长；参见TG/104/5 Rev.,UPOV Code:CUCUM_MEL中的UPOV特征68，可在网站UPOV.int上找到)。

“植物品种”是已知最低等级的同一植物分类单元中的一组植物，这些植物(无论是否满足承认植物育种者权利的条件)可以根据某个基因型或基因型组合引起的特征表达进行定义，可以通过表达这些特征中的至少一个而与任何其他植物组区分开，并可以视为一个实体，因为它可以无任何变化地增殖。因此，即使它们是同一种类，术语“植物品种”也不能用来表示一组植物，即使它们都以一个或两个基因座或基因的存在为特征(或由这些特定基因座或基因产生的表型特征)，但就其他位点或基因而言，它们之间可能会存在巨大差异。

“F1、F2、F3等”指在两个亲本植物或亲本系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或系杂交产生的种子生长的植物称为F1世代。自交Fl植物产生F2世代，等等。

“F1杂合”植物(或F1杂合种子)是从两个近交亲本系杂交获得的世代。因此，F1杂合种子是F1杂合植物从其生长的种子。由于杂合优势，F1杂合更有活力且产量更高。近交系在基因组大多数基因座上是基本上纯合的。

“植物系”或“育种系”是指植物及其后代。如本文所用，术语“近交系”是指已经反复自交并且几乎是纯合的植物系。因此，“近交系”或“亲本系”是指已经经历了几代(例如至少5、6、7或更多)近交繁殖的植物，从而产生具有高均匀性的植物系。

“均匀性”或“均匀”涉及植物系或品种的遗传和表型特征。近交系由于是由几个世代近交繁殖产生，因而在遗传上高度均匀。同样，由这种近交系产生的F1杂合子在其基因型和表型特征和性能方面高度均匀。

在本发明的上下文中，“甜瓜植物的11号染色体”应理解为由ICuGI(国际葫芦科基因组计划)分配的属于甜瓜基因组11号染色体或优选地由melonomics.net分配为11号染色体的支架、片段、区域、标记物和核酸序列。在melonomics.net上，可以针对Old Melonomics(v3.5)的甜瓜基因组支架或针对甜瓜基因组版本CM3.5.1或CM3.6.1(New Melonomicsv4.0)进行BLAST序列。

“直系同源11号染色体”是指供体植物的11号染色体，其部分可以渗入栽培的甜瓜11号染色体。

在本发明的上下文中，“甜瓜植物的12号染色体”应理解为由ICuGI(国际葫芦科基因组计划)分配的属于甜瓜基因组12号染色体或优选地由melonomics.net分配为12号染色体的支架、片段、区域、标记物和核酸序列。

“直系同源12号染色体”是指供体植物的12号染色体，其部分可以渗入栽培的甜瓜12号染色体中。

“ICuGI”在本文中是指由国际葫芦科基因组计划(International CucurbitGenomics Initiative)发布的甜瓜数据，其公开了例如甜瓜的遗传图谱(http://www.icugi.org/cgi-bin/cmap/map set_info？species acc＝CM),但已于2017年5月更新，可以在cucurbitgenomics.org上找到。除ICuCI数据外的其他信息，包括其他标记物和图谱信息，可从Diaz等人(2015,Mol Breeding 35,188)以及相应文章在线版本中包含的其他数据获得。

melonomics.net的支架CM3.5_scaffold00052对应于11号染色体(OldMelonomics v3.5)。melonomics.net的支架CM3.5_scaffold00004对应于12号染色体(OldMelonomics v3.5)。如果针对melonomics.net数据库公开的甜瓜基因组序列(OldMelonomics v3.5)BLAST本文提供的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任何序列，则显示与支架的比对。如果针对CM3.6.1基因组或CM3.5.1基因组(New Melonomics v4.0)BLAST本文提供的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：7中的任一，则显示染色体和与基因组染色体部分的比对。

“栽培的甜瓜植物”是指由人栽培并具有良好农艺特性的甜瓜植物，即甜瓜物种的品种、育种系或栽培品种，特别是生产具有良好尺寸和质量和均匀性的可食用和可销售的果实的甜瓜植物；优选地，这种植物不是“野生甜瓜植物”，所述野生甜瓜植物与栽培植物相比，通常具有更差的产量和更差的农艺特性，并且在野生种群中自然生长。“野生甜瓜植物”包括例如生态型、PI(植物引种)系、地方品种或野生品系或物种的野生近缘物。

在本发明的上下文中，“SNP(＝单核苷酸多态性)”应理解为在基因组中的特定位置上出现的单核苷酸的变异。SNP是两个植物之间基因组中给定位置上的单核苷酸变异。如果具有ToLCNDV抗性的野生甜瓜植物(供体植物)在特定单个位置相应的序列中显示的核苷酸与栽培的甜瓜植物在相同位置的相应核苷酸不同，则该位置定义了野生甜瓜与栽培甜瓜之间的SNP。如果供体植物在特定位置具有四个可能的核苷酸(A、C、T或G)之一，当栽培植物在相同的相应序列位置具有其余三个可能的核苷酸之一时，就会产生SNP。因此，在包含来自供体的渗入片段的栽培甜瓜植物中，可以容易地确定SNP的单核苷酸是来自供体还是来自栽培甜瓜(受体)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_01”(或者，其可命名为“mME72223”)理解为在SEQID NO：1中位置101上的SNP。SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1实质上相同的序列可以在例如ICuGI数据集或在melonomics.net上的11号染色体上找到。可以在表2中找到SNP_01在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_01的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、进一步更优选与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少98％同一性、特别优选与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下在SEQ ID NO：1中101位的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：1具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：1的101位具有“A”(腺嘌呤)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_01的特征在于回交植物在SEQ ID NO：1的101位具有C、G或T。一方面，回交植物在SEQ ID NO：1的101位具有G。在本发明的一个实施方案中，SNP_01的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ ID NO：1的101位上具有“A”，而回交植物在SEQ ID NO：1中的101位上具有G、或在SEQ ID NO：1中的101位上具有C或在SEQ ID NO：1中的101位上具有T(或在与SEQ ID NO：1具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_02”(或者其可命名为“mME72233”)理解为是在SEQ ID NO：2中的101位上的SNP。SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2实质的相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的11号染色体上找到。表2中可以找到SNP_02在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_02的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、更优选与SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少98％同一性、特别地与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下，SEQ ID NO：2中101位的核苷酸与在回交植物中相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的这种序列被称为与SEQ ID NO：2具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：2的101位上具有“G”(鸟嘌呤)。在本发明的一个优选的实施方案中，SNP_02的特征在于回交植物在SEQ ID NO：2的101位上具有C、A或T。一方面，回交植物在SEQ ID NO：2的101位上具有“A”。在本发明的一个实施方案中，SNP_02的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自供体植物的渗入片段在SEQ ID NO：2的101位上具有“G”，而回交植物在SEQ ID NO：2的101位上具有“A”，或在SEQ ID NO：2的101位上具有C或在SEQ ID NO：2的101位上具有T(或在与SEQ ID NO：2具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_03”(或者可以命名为“mME72238”)理解为在SEQID NO：3中的101位上的SNP。SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3实质的相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的11号染色体上找到。在表2中可以找到SNP_03在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_03的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、更优选与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少98％同一性、特别优选地与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下SEQ ID NO：3中的101位上的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：3具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：3具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：3的101位上具有“T”(胸腺嘧啶)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_03的特征在于回交植物在SEQ ID NO：3的101位上具有C、A或G。一方面，回交植物在SEQ ID NO：3的101位上具有C。在本发明的一个实施方案中，SNP_03的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ IDNO：3的101位上具有“T”，而回交植物在SEQ ID NO：3的101位上具有C，或在SEQ ID NO：3的101位上具有A或在SEQ ID NO：3的101位上具有G(或在与SEQ ID NO：3具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_04”(或者可以命名为“mME72245”)理解为在SEQID NO：4中101位上的SNP。SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：4实质的相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的11号染色体上找到。表2中可以找到SNP_04在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_04的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、进一步更优选与SEQ IDNO：4所示核苷酸序列具有至少95％的一致性，甚至更优选与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少98％同一性、特别优选地与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下SEQ ID NO：4中101位上的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：4具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：4具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：4的101位上具有“T”(胸腺嘧啶)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_04的特征在于回交植物在SEQ ID NO：4的101位上具有C、A或G。一方面，回交植物在SEQ ID NO：4的101位上具有C。在本发明的一个实施方案中，SNP_04的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ IDNO：4的101位上具有“T”，而回交植物在SEQ ID NO：4的101位上具有C、或者在SEQ ID NO：4的101位上具有A、或在SEQ ID NO：4的101位上具有G(或在与SEQ ID NO：4具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_05”(或者其可以命名为“mME72255”)理解为在SEQ ID NO：5中101位上的SNP。SEQ ID NO：5或与SEQ ID NO：5实质的相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的12号染色体上找到。表2中可以发现SNP_05在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_05的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、进一步更优选与SEQID NO：5所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少98％同一性、特别优选与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下在SEQ ID NO：5中101位上的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：5具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：5具有实质的序列同一性。

本发明中使用的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：5的101位具有“C”(胞嘧啶)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_05的特征在于回交植物在SEQ ID NO：5的101位具有G、A或T。一方面，回交植物在SEQ ID NO：5的101位具有T。在本发明的一个实施方案中，SNP_05的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ ID NO：5的101位上具有“C”，而回交植物在SEQ ID NO：5中的101位上具有T或在SEQ ID NO：5的101位上具有G或在SEQ ID NO：5的101位上具有A(或在与SEQ ID NO：5具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_06”(或者其可以命名为“mME72261”)理解为在SEQ ID NO：6中101位上的SNP。SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6实质上相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的12号染色体上找到。表2中可以找到SNP_06在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_06的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选地与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、进一步更优选与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少98％同一性、特别优选与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下，在SEQ ID NO：6中101位上的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO：6具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：6具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：6的101位上具有“G”(鸟嘌呤)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_06的特征在于回交植物在SEQ ID NO：6的101位上具有C、A或T。一方面，回交植物在SEQ ID NO：6的101位上具有A。在本发明的一个实施方案中，SNP_06的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ ID NO：6的101位上具有“G”，而回交植物在SEQ ID NO：6的101位上具有A，或在SEQ ID NO：6的101位上具有C或在SEQ ID NO：6的101位上具有T(或在与SEQ ID NO：6具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

在本发明的上下文中，应将“SNP_07”(或者其可以被命名为“mME72279”)理解为在SEQ ID NO：7中101位上的SNP。SEQ ID NO：7或与SEQ ID NO：7实质上相同的序列可以在例如ICuGI数据集或melonomics.net上的12号染色体上找到。表2中可以找到SNP_07在物理染色体上的相对位置。还显示了基因组版本CM3.6.1(New Melonomics v4.0)上的位置。优选地，包含SNP_07的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少85％序列同一性、更优选与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、更优选与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少95％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少97％同一性、甚至更优选与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少98％同一性、特别优选与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列，条件是在每种情况下SEQ ID NO：7中101位的核苷酸与回交植物相同位置上的相应核苷酸不同。与SEQID NO：7具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高序列同一性的此类序列被称为与SEQ ID NO：7具有实质的序列同一性。

用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO：7的101位上具有“T”(胸腺嘧啶)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_07的特征在于回交植物在SEQ ID NO：7的101位上具有C、A或G。一方面，回交植物在SEQ ID NO：7的101位上具有C。在本发明的一个实施方案中，SNP_07的特征在于ToLCNDV抗性供体植物或源自该供体植物的渗入片段在SEQ IDNO：7的101位上具有“T”，而回交植物在SEQ ID NO：7的101位上具有C，或在SEQ ID NO：7的101位上具有G或在SEQ ID NO：7的101位上具有A(或在与SEQ ID NO：7具有实质的序列同一性的序列的等同位置上)。

表2

*SNP核苷酸位置基于Diaz等人，2015，Mol Breeding 35：188，第1-7页中的位置。

可以看出，SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04位于物理11号染色体上的CMPSNP475(30.27Mb)和ECM192(29.0Mb)之间，即位于11号染色体的下半部分。在基因组CM3.6.1上，SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04位于11号染色体的起始于32.07Mb到中止于33.24Mb的区域。

SNP_05、SNP_06和SNP_07位于物理12号染色体的CMPSNP2002(12.5Mb)和CMPSNP310(5.1Mb)之间，即位于12号染色体的上半部分。在基因组CM3.6.1，SNP_05、SNP_06和SNP_07位于12号染色体的起始于5.89Mb到中止于9.37Mb的区域。

可以根据标准方法检测本文所述的分子标记物。例如，可以使用KASP测定法(参见\Vww.kpbioscience.co.uk)或其他测定法来检测SNP标记物。已经针对本文所述的SNP开发了KASP测定法。相应的细节在实施例部分中公开。序列表中给出了各KASP测定法中使用的序列。为了开发用于SNP的KASP测定法，根据一般常识设计了两个等位基因特异的正向引物和一个等位基因特异的反向引物(参见例如Allen等人2011,Plant Biotechnology J.9,1 0 86-1 099，特别是第097-098页关于KASP测定方法)。

可以通过使用整体或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定“序列同一性”和“序列相似性”。当序列通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)进行最佳比对时共有至少某一最小序列同一性百分比，如以下进一步定义，则可以将其称为“实质上相同”或“基本上相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch整体比对算法在两个序列的整个长度上进行比对，从而使匹配数最大化并使缺口数最小化。通常，使用默认参数，其中缺口创建罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.5(二者均用于核苷酸和蛋白质比对)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵为DNAFULL，对于蛋白质，默认评分矩阵为Blosum62(Henikoff&Henikoff,l 992,PNAS 89,1 09 1 5-1 09 1 9)。序列比对和百分比序列同一性的分数例如可以使用计算机程序确定，如EMBOSS，其可在万维网址ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)上获得。或者，可以通过针对数据库如FASTA、BLAST等进行搜索来确定序列相似性或同一性，但是优选检索命中并成对比对以比较序列同一性。如果百分比序列同一性为至少85％、90％、95％、98％或99％(使用默认参数由Emboss的“needles”确定，即缺口创建罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.5，对于核酸使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质使用Blosum62)，则两个蛋白质或两个蛋白结构域，或两个核酸序列具有“实质的序列同一性”。当提及与参考序列具有“实质的序列同一性”、或与参考序列具有至少80％、例如至少85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.9％的核酸序列同一性的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，在一个实施方案中，认为所述核苷酸序列与给定核苷酸序列实质上相同，并且可以使用严格杂交条件进行鉴定。在另一个实施方案中，与给定核苷酸序列相比，核酸序列包含一个或多个突变，但是仍可以使用严格杂交条件进行鉴定。

包含赋予ToLCNDV抗性的在11和/或12号染色体上供体渗入片段的栽培甜瓜植物，在感染ToLCNDV时，表现出减轻的症状，而易感对照(缺少11和12号染色体上的渗入片段)在相同条件下表现出预期的严重症状。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的植物或根据本发明的植物细胞的特征在于，它们在被ToLCNDV感染后显示出平均症状水平(或平均疾病评分)为至少7.0、更优选为至少8.0或9.0。如前所述，当QTL为纯合形式时，QTL11赋予高水平的抗性。通过例如反交将包含QTL11的渗入片段导入ToLCNDV易感植物，并且将其自交以产生纯合渗入片段(包含纯合形式的SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部的供体基因型)，由此产生对ToLCNDV感染具有高度抗性的植物，其平均疾病评分为至少7.0、优选至少8.0、或者优选至少9.0。QTL12赋予的抗性水平比QTL11低，但其以部分显性方式赋予抗性。通过例如反交将包含QTL12的渗入片段导入TolCNDV易感植物，并且任选地将其自交以产生纯合渗入片段(包含杂合或纯合形式的SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的供体基因型)，由此产生具有较高抗性水平的植物，其平均疾病评分为至少5.0、优选至少6.0。

ToLCNDV感染后的症状水平以1至9的尺度进行评估，其中1定义为具有最严重症状的水平，9定义为最高抗性水平，已在上文对其进行了描述，因此可在此处应用。用于确定症状水平的优选测试在下面的“一般方法”中给出。

由11号染色体上的渗入片段赋予的ToLCNDV抗性以隐性方式表达，因此，只有当两条11号染色体都包含含有QTL11和一个或多个或全部本文提供的SNP标记物(SNP_01，SNP_02，SNP_03和SNP_04)的供体SNP基因型的渗入片段时、和/或两条11号染色体都包含含有介于本文公开的11号染色体的SNP标记物之间的供体植物序列的渗入片段时，才能观察到该ToLCNDV抗性。

由12号染色体上的渗入片段赋予的ToLCNDV抗性以显性方式表达，因此，当12号染色体之一包含含有QTL12和一个或多个或全部本文提供的SNP标记物(SNP_05，SNP_06和SNP_07)的供体SNP基因型的渗入片段时、和/或12号染色体之一包含含有介于本文公开的12号染色体的SNP标记物之间的供体植物序列的渗入片段时，就能观察到该ToLCNDV抗性。

包含纯合形式的QTL11和杂合或纯合形式的QTL12的植物将具有至少8.0、优选至少9.0的平均ToLCNDV疾病评分，即是高抗性的。这种植物的优势在于，抗性基于两个不同的QTL，这意味着不太可能发生抗性破坏。

因此，本发明的其他具体实施方案涉及根据本发明的栽培的甜瓜植物、植物部分和植物细胞，其中来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段包括介于SNP_01与SNP_04之间、或介于SNP_01与SNP_03之间、或介于SNP_01与SNP_02之间、或介于SNP_02与SNP_04之间、或介于SNP_02与SNP_03之间、或介于SNP_03与SNP_04之间的供体植物的序列，所述渗入片段以纯合状态存在。渗入片段包含QTL11，因此赋予植物高的ToLCNDV抗性。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的栽培的甜瓜植物、植物部分和植物细胞，其中来自ToLCNDV抗性供体植物的12号染色体的渗入片段包括介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_07之间的供体植物的序列，所述渗入片段以杂合或纯合状态存在。渗入片段包含QTL12，因此赋予植物ToLCNDV抗性。

在另一方面，提供了栽培的甜瓜植物、植物部分或植物细胞，在其基因组中其包含QTL11(纯合形式)和QTL12(杂合或纯合形式)，即其包含两个如上和本文其他地方所述的渗入片段。这样的甜瓜植物可以例如通过使包含QTL11的植物与包含QTL12的植物杂交并选择包含两个渗入片段和两个QTL的后代来产生。另外，本文提供的保藏种子包含纯合形式的两个QTL(SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05、SNP_06和SNP_07的抗性供体基因型以纯合形式存在)，通过使植物与其他甜瓜植物杂交，以及任选地通过选择包含至少一个选自SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04的SNP标记物和至少一个选自SNP_05、SNP_06和SNP_07的SNP标记物(优选至少一个选自SNP_05和SNP_06的SNP标记物)的抗性供体基因型的后代植物，其可用于将两个QTL传递至任何其他栽培的甜瓜品系或品种。如所描述的，任选地可以测试后代的ToLCNDV抗性。优选但非必须地，QTL11和QTL12均来自同一供体植物。

表3说明了以纯合形式或杂合形式包含供体SNP的甜瓜植物或甜瓜植物细胞的SNP基因型，以及缺少渗入片段的回交亲本SNP基因型。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体上的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段位于SNP_01和SNP_04之间，并且由此该渗入片段包含SEQ ID NO：3的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：3具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶(T)。在另一方面，渗入片段还包含SEQ ID NO：4的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：4具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶(T)，和/或渗入片段还包含SEQ ID NO：2的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：2具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的鸟嘌呤(G)。任选地，渗入片段还包含SNP_01的抗性供体核苷酸。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段位于SNP_01和SNP_04之间，并且其中该渗入片段包含SEQ ID NO：3的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：3具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶(T)，渗入片段任选地进一步包含SNP_02和/或SNP_01的抗性供体核苷酸。任选地，渗入片段进一步包含SNP_04的供体SNP基因型。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_02和SNP_03之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个的供体SNP核苷酸。因此任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3，并且介于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，渗入片段包含从SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：3的整个区域。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_04和SNP_03之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中一个或两个的供体SNP核苷酸。因此任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3，并且介于SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：3之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，渗入片段包含从SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：3的整个染色体区域。

在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_04和SNP_02之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个的供体SNP核苷酸。因此，任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2，并且介于SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，在这个方面，从SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4的整个染色体区域来自供体，并且包含SEQ ID NO：2、3和4。

在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_01和SNP_03之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个供体SNP核苷酸。因此任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3，并且介于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，在这个方面，从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3的整个染色体区域来自供体，并且包含SEQ ID NO：1、2和3。

在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体11号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_01和SNP_04之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个供体SNP核苷酸。因此，任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4，并且介于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，在这个方面，从SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4的整个染色体区域来自供体，并且包含SEQ ID NO：1、2、3和4。存在于保藏种子中的渗入片段包含SEQID NO：1、2、3和4。但是，由于SNP_03与抗性表型最紧密连锁，因此在保持QTL的同时，可以减少渗入片段的大小。因此，例如，可通过重组除去渗入片段内的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1和2，并由栽培甜瓜序列代替。或者可以通过重组除去渗入片段内的SEQ ID NO：4，并由栽培甜瓜序列代替。或者例如可以通过重组除去渗入片段两端的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4。同样地，例如可以通过重组除去片段一侧上的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和另一侧上的SEQ ID NO：4。

在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体12号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含SEQ ID NO：6的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：6具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的鸟嘌呤(G)。在另一方面，该渗入片段还包含SEQ ID NO：5的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：5具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胞嘧啶(C)，和/或该渗入片段还包含SEQ ID NO：7的核苷酸101上、或与SEQ ID NO：7具有实质的序列同一性的序列的等同核苷酸上的胸腺嘧啶(T)。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体12号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_06和SNP_05之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个的供体SNP核苷酸。因此，任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5，并且介于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：5之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，渗入片段包含从SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：5的整个染色体区域。

一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体12号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_06和SNP_07之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个的供体SNP核苷酸。因此，任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，并且介于SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，渗入片段包含从SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：7的整个染色体区域。

在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞包含来自供体12号染色体的渗入片段，该渗入片段赋予ToLCNDV抗性，由此该渗入片段包含至少介于SNP_05和SNP_07之间的供体基因组序列，任选地包含这些SNP标记物中的一个或两个的供体SNP核苷酸。因此，任选地，渗入片段包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7，并且介于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7之间的核苷酸序列也来自抗性供体。因此，渗入片段包含从SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7的整个染色体区域。存在于保藏种子中的渗入片段包含SEQ ID NO：5、6和7。但是，由于SNP_06与抗性表型最密切连锁，因此在保持QTL不变的情况下，可以减少渗入片段的大小。因此，例如可以通过重组除去渗入片段内的SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7，并由栽培甜瓜序列代替。

如前所述，本文包括植物、植物部分和植物细胞，所述植物、植物部分和植物细胞包含11号染色体上的渗入片段和12号染色体上的渗入片段。

包含根据本发明的植物细胞的植物是本发明的另一个实施方案。

根据本发明的甜瓜植物可以是近交系，开放授粉品种(OP)或F1杂合品种。

在一方面，F1杂合子以杂合形式包含11号染色体和/或12号染色体上的渗入片段，即通过以下产生：使两个近交亲本系杂交，其中一个具有11号染色体和/或12号染色体上的渗入片段(优选以纯合形式，虽然不是必须的)，和从所述杂交中收集F1杂合种子。F1杂合子还可以纯合形式包含11号染色体和/或12号染色体上的渗入片段，即通过以下产生：使两个近交亲本系杂交，每个亲本系包含纯合或杂合形式的11号染色体和/或12号染色体上的渗入片段。

在一个优选的方面，甜瓜植物是F1杂合子，并包含纯合形式的11号染色体上的渗入片段。任选地，F1杂合子进一步包含杂合或优选地纯合形式的12号染色体上的渗入片段。这种F1杂合子优选地是通过以下产生：使两个近交系杂交，每个近交系包含11号染色体上的渗入片段和12号染色体上的渗入片段，优选两者均为纯合形式。这样的近交系也包括在本文中。

根据本发明的甜瓜植物可以是任何类型。优选地，其具有良好的农艺特性和良好的果实质量特性，例如大的平均果实大小(至少500g、600g、700g、800g、900g、1000g或更大)，高的果实平均白利糖度(例如，可溶性固体总量的平均折射％为至少10％、12％、14％、16％、18％或更高)，每棵植物产生许多果实、果肉坚实等。

一方面栽培的甜瓜植物和植物细胞属于以下物种之一：罗马甜瓜、无臭甜瓜和网纹甜瓜。

一方面，本发明的栽培甜瓜包含赋予ToLCNDV抗性的一个或两个渗入片段，并且所述栽培甜瓜包含以下特征中的一个或多个或全部：成熟时的平均TSS为至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％；果实成熟时花梗的附着不是“非常弱”(TG/104/5Rev.,UPOV Code:CUCUM_MEL中的UPOV特征39，可在网站UPOV.int上找到)；果实的保质期不是“非常短”(TG/104/5 Rev.,UPOV Code:CUCUM_MEL中的UPOV特征68，可在网站UPOV.int上找到)；纵切面的果实形状没有拉长(TG/104/5 Rev.,UPOV Code:CUCUM_MEL中的UPOV特征28，可在网站UPOV.int上找到)。

如本领域已知地(例如，使用数字手持折射计)测量平均％TSS(或白利糖度)，测量一个系或品种的几种成熟果实的TSS。参见例如Burger等人2003,J American Soc HortScience 128(4):537-540，第538页，TSS的测量。

还可以将其他抗性引入本发明的甜瓜植物中，如对以下一种或多种疾病的抗性：细菌性青枯病、根腐烂、冠枯病、甜瓜锈病、白粉病、黄萎病、硫磺烧伤、痂、西瓜花叶病、霜霉病、甜瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum fsp.melonis(Fom))族0、甜瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum fsp.melonis(Fom))族1、甜瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumfsp.melonis(Fom))族2、甜瓜尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum fsp.melonis(Fom))族1.2、枯萎病。

R2、根结(线虫)、炭疽病、黄瓜花叶病和南瓜花叶病、和/或对以下一种或多种害虫的抗性：蚜虫抗性(Aphid resistance)、泡菜蠕虫(Pickle Worm)、黑地甲虫(DarklingGround Beetle)、带状黄瓜甲虫(Banded Cucumber Beetle)、螨虫(Mite)、西部点状黄瓜甲虫(Western Spotted Cucumber Beetle)、甜瓜叶蝉(Melon Leafhopper)、甜瓜蠕虫(MelonWorm)、西部条纹黄瓜甲虫(Western Striped Cucumber Beetle)或甜瓜叶虫(MelonLeafminer)。还可以引入针对病原性病毒、真菌、细菌或害虫的其他抗性基因。

本发明的一个特定方面涉及包含根据本发明的渗入片段的植物或植物细胞，该渗入片段可以获自(衍生自或存在于)保藏号为NCIMB 42625的保藏种子或其后代。保藏的种子是包含纯合形式的两个渗入片段的栽培甜瓜植物，其中SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05、SNP_06和SNP_07是以纯合形式存在的供体核苷酸。对于赋予ToLCNDV抗性的QTL11，发现标记物SNP_03是最显著的，而对于QTL12，发现SNP_06是最显著的。这意味着通过选择具有保藏种子中存在的较小QTL11和/或QTL12渗入片段大小(即片段的子片段)的重组体，可以减少QTL11和QTL12的供体渗入的大小。例如，可以以本领域技术人员已知的方式生产植物，所述植物包含这些渗入片段的子片段(其中所述子片段仍包含赋予ToLCNDV抗性的QTL11或12)、包含SNP_03的供体SNP基因型(对于QTL11)或包含供体SNP基因型SNP_06(对于QTL12)，但是对于一个或多个或全部其他SNP，具有回交亲本的SNP基因型。因此，技术人员可以生产甜瓜植物，其包含仅包含一个供体SNP的子片段(即对于QTL11，SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个，对于QTL12，SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个)，但仍保留赋予抗性的QTL。技术人员甚至可能除去所有供体SNP并仍保留QTL。可以对11号和/或12号染色体区域进行测序，以鉴定或确定植物是否具有存在于(或可获自)保藏号NCIMB42625保藏的种子中的渗入片段或子片段。同样，通过进行如本文所述的ToLCNDV抗性测定法可以容易地检测出QTL11和/或12是否仍存在于不包含全部供体SNP、或者甚至不再包含任何供体SNP的子片段中。

可以通过多种方法鉴定渗入片段，如本文提供的多态性标记物(供体和回交亲本之间的SNP标记物、多态性)，对甜瓜基因组进行染色体绘图或测序，以及鉴定来自特定供体渗入的11号和/或12号染色体上的染色体部分。渗入片段的核苷酸序列对于已经用于渗入性状的供体品系是特异性和独特的。例如，为了鉴定来自本发明特定供体的渗入片段，例如，可以对保藏的种子的基因组进行全基因组测序。例如，这也已经在番茄中完成，其中番茄近交繁殖系和杂合子的基因组序列鉴定了特定野生品系的6号染色体和9号染色体上的渗入片段。参见Lin等人,Nature Genetics published October 12,2014,doi:10.1038/ng.3117，第5页，图4。

除了甜瓜植物以外，本文还提供了可以从中生长此类植物的种子。

因此，本发明的另一方面涉及甜瓜种子，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中对于11号染色体，该渗入片段包含介于SNP_01和SNP_04之间、或者介于SNP_01和SNP_03之间、或者介于SNP_01和SNP_02之间、或者介于SNP_02和SNP_04之间、或者介于SNP_02和SNP_03之间、或者介于SNP_03和SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列；和/或其中对于12号染色体，渗入片段包含介于SNP_05和SNP_07之间、或者介于或SNP_05和SNP_06之间、或者介于SNP_06和SNP_07之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。应当理解，渗入片段包含赋予抗性的QTL。因此，如果将渗入片段递送到ToLCNDV易感甜瓜品系或品种中，特别是以纯合形式，那么ToLCNDV易感品系或品种将对ToLCNDV产生抗性或高度抗性，如所述。一方面，包含渗入片段(其包含QTL11和/或QTL12)的栽培甜瓜植物的平均疾病评分为9.0(无症状)，而易感对照显示出预期的症状。

在另一方面，在接种的ToLCNDV抗性植物的上部未检测到ToLCNDV病毒，或者仅在极低水平上检测到ToLCNDV病毒，参见实施例。因此，包含QTL11和/或QTL12的植物(例如供体植物或包含一个或两个渗入片段的植物)在上部的叶中包含显著较低的平均ToLCNDV病毒水平(或病毒滴度)，比易感对照品系或品种低例如15dpi(感染后的天数)、20dpi、25dpi、30dpi和/或35dpi(或更晚)。“显著较低”在本文中是指平均病毒水平，其可通过例如qPCR检测，其比易感对照组织低至少1000倍、更优选至少5000倍、或至少10000倍、或至少50000倍、或至少100000倍、或至少1000000倍。ToLCNDV水平的定量描述于例如Simon等人(PlantDisease 2018年1月,第102卷,第1号,第165-171页)。一方面，抗性植物系的平均Ct(周期阈值)值是易感品系或品种的值的至少2倍，或是该值的至少2.5倍或3.0倍。一方面，抗性植物系的平均Ct值为至少30、31、32、33、34、35、36、37或38，而易感品系或品种的平均Ct值为15或更低、14或更低、例如13或更低、12或更低、11或更低、10或更低。参见例如万维网bitesizebio.com/24581/what-is-a-ct-value/或其中引用的参考文献。Ct值与样品中靶核酸(在这种情况下为ToLCNDV病毒DNA)的量成反比，并且与样品中的拷贝数相关。较低的Ct值表示大量的靶核酸，而较高的Ct值表示较低的靶核酸的量。

在本发明的一个实施方案中，种子包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段，其中渗入片段包含介于SNP_02和SNP_04之间、或介于SNP02和SNP_03之间、或介于SNP_03和SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。

本发明的另一个实施方案涉及可从本发明的植物获得或从本发明的植物获得的甜瓜种子，或包含根据本发明的植物细胞的种子。

本发明的另一方面涉及甜瓜植物果实，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中对于11号染色体，该渗入片段包含介于SNP_01和SNP_04之间、或者介于SNP_01和SNP_03之间、或者介于SNP_01和SNP_02之间、或者介于SNP_02和SNP_04之间、或者介于SNP_02和SNP_03之间、或者介于SNP_03和SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列；和/或其中对于12号染色体，渗入片段包含介于SNP_05和SNP_07之间、或者介于SNP_05和SNP_06之间、或者介于SNP_06和SNP_07之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。

本发明的另一个实施方案涉及可从本发明的植物获得或从本发明的植物获得的甜瓜果实，或包含根据本发明的植物细胞的果实。

因此，本文描述的用于根据本发明的甜瓜植物细胞或甜瓜植物的优选和另外的实施方案也适用于代表根据本发明的甜瓜植物的甜瓜果实的优选和另外的实施方案。

本发明的另一方面涉及甜瓜植物繁殖材料，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和/或12号染色体的渗入片段，其中对于11号染色体，该渗入片段包含介于SNP_01和SNP_04之间、或者介于SNP_01和SNP_03之间、或者介于SNP_01和SNP_02之间、或者介于SNP_02和SNP_04之间、或者介于SNP_02和SNP_03之间、或者介于SNP_03和SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列；和/或其中对于12号染色体，渗入片段包含介于SNP_05和SNP_07之间、或者介于SNP_05和SNP_06之间、或者介于SNP_06和SNP_07之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。

本发明的另一个实施方案涉及可从本发明的植物获得或从从本发明的植物获得的甜瓜植物繁殖材料，或包含根据本发明的植物细胞的甜瓜植物繁殖材料。

因此，本文描述的用于根据本发明的植物细胞或植物的优选和另外的实施方案适用于也代表根据本发明的甜瓜植物的繁殖材料的优选和另外的实施方案。

术语“繁殖材料”包括植物的适于通过营养(无性生殖)或生殖(有性生殖，性生殖)途径产生后代的那些成分。适用于营养繁殖的是例如插条、体外组织、细胞、原生质体、胚胎或愈伤组织培养物、微繁殖方法或生根。其他繁殖材料包括，例如果实、种子、幼苗，其包含所描述的赋予ToLCNDV抗性等的一个或两个渗入片段。一方面，繁殖材料采取插条的形式，其通过嫁接到另一种根茎或体外组织培养材料，特别是胚胎培养物中而繁殖。特别优选的是体外组织培养物，特别是体外胚胎培养物形式的繁殖材料。

本发明的另一个实施方案涉及生产ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法，其包括以下步骤：

a)选择ToLCNDV抗性供体植物；

b)使步骤a)中选择的供体植物与对ToLCNDV敏感的回交植物杂交；

c)从步骤b)中杂交的植物获得种子，和任选地；

d)自交从种子生长的植物一次或多次，或使从种子生长的植物与对TolCNDV敏感的回交植物反交一次或多次，以获得自交或反交后代，和任选地；

e)测试从步骤c)中获得的种子生长的植物或步骤d)的自交或反交的植物是否对ToLCNDV具有抗性(或测试哪一种对ToLCNDV具有抗性)，和/或植物是否包含一个或多个选自SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04；和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07的供体植物的SNP。

该方法任选地进一步包括选择包含(优选纯合形式的)QTL11和/或QTL12的ToLCNDV抗性植物的步骤。任选地，将包含一个或多个SNP标记物的植物自交以产生纯合植物。

如本文其他地方所述，可以通过用ToLCNDV感染甜瓜植物并确定ToLCNDV感染的甜瓜植物的症状水平，来选择根据本发明的生产ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法中步骤a)中的ToLCNDV抗性供体植物。一方面，供体植物的平均疾病评分为9.0。任选地，供体植物包含选自SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04的SNP的一个或多个或全部SNP；和/或选自SNP_05、SNP_06和SNP_07的一个或多个或全部SNP的一个或多个抗性SNP基因型。一方面，供体的平均疾病评分为9.0，并且至少包括表3的SNP_03和/或SNP_06的抗性基因型。在另一方面，供体的平均ToLCNDV疾病评分为9.0，并且包括SNP_02、SNP_03和SNP_04的抗性基因型，任选地还包括SNP_01的抗性基因型。在另一方面，供体的平均ToLCNDV疾病评分为9.0，并且包括SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05和SNP_06以及任选地SNP_07的抗性SNP基因型。优选地，供体的SNP基因型是纯合的。任选地，供体可以自交以选择纯合的供体植物。在另一方面，供体植物包含介于SNP_01和SNP_04之间和/或介于SNP_05和SNP_06之间(任选地介于SNP_05和SNP_07之间)的与保藏号NCIMB 42625下报藏的种子中渗入的片段相同的序列。供体可以是野生甜瓜或甜瓜的野生近缘物。供体可以与在NCIMB 42625的种子中渗入QTL11和QTL12所使用的供体相同。一方面，感染后ToLCNDV病毒颗粒在供体植物的上部叶子中非常低(例如，至少30或更大的平均Ct值)，或者不能检测到，例如使用如实施例中所描述的qPCR或斑点印迹。

本发明的另一个实施方案涉及一种生产ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法，其包括以下步骤：

a)选择在11号染色体和/或12号染色体上包含渗入片段的ToLCNDV抗性栽培的甜瓜植物，所述渗入赋予了本文所述的ToLCNDV抗性，

b)使步骤a)中选择的甜瓜植物与另一甜瓜植物杂交，例如对ToLCNDV敏感的甜瓜植物或对ToLCNDV不具有抗性的植物，例如具有4.0或更低、优选小于4.0或小于3.0的平均TolCNDV疾病评分的植物，

c)从步骤b)中杂交的植物中获得种子，和任选地，

d)自交从种子生长的植物一次或多次，或使从种子生长的植物与对ToLCNDV敏感的植物反交一次或多次，以获得自交或反交后代，和任选地

e)测试从步骤c)中获得的种子生长的植物或步骤d)的自交或反交植物是否对ToLCNDV具有抗性(或测试哪一种对ToLCNDV具有抗性)，和/或植物是否包含选自SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04；和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07的来自供体植物的一个或多个SNP。

该方法任选地进一步包括选择包含(优选纯合形式的)QTL11和/或QTL12的ToLCNDV抗性植物的步骤。

如本文其他地方所述，可以通过用ToLCNDV感染甜瓜植物并确定ToLCNDV感染的甜瓜植物的症状水平，来选择根据本发明的生产ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法中步骤a)中的ToLCNDV抗性栽培的植物。一方面，栽培植物的平均疾病评分为至少5.0、6.0、7.0、8.0或9.0。任选地，栽培植物包含选自SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部SNP；和/或选自SNP_05、SNP_06和任选的SNP_07中的一个或多个或全部SNP的一个或多个抗性供体SNP基因型。一方面，栽培植物是在整个说明书中描述的在11号染色体和/或12号染色体上包含渗入片段的栽培甜瓜植物。一方面，步骤a)中的植物可以是从以保藏号NCIMB42625保藏的种子生长的植物或其后代植物，该后代植物保留QTL11和/或QTL12。因此，其可以是这样的植物，在11号染色体和/或12号染色体上包含与保藏种子中存在的渗入片段相同的渗入片段，或在11号染色体和/或12号染色体上包含比保藏种子中存在的渗入片段小的渗入片段。

在根据本发明的生产ToLCNDV抗性甜瓜植物方法的一方面，在步骤a)中，ToLCNDV抗性供体植物或栽培的甜瓜植物在11号和/或12号染色体上包含片段，其中对于11号染色体，该片段在介于SNP_01和SNP_04之间、或介于SNP_01和SNP_03之间、或介于SNP_01和SNP_02之间、或介于SNP_02和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间、或介于SNP_03和SNP_04之间包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列；和/或其中对于12号染色体，所述片段在介于SNP_05和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。

在本发明的一个实施方案中，用于生产根据本发明的ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法被用于生产根据本发明的植物。如本文所述的用于根据本发明的植物的优选和另外的实施方案相应地适用于生产根据本发明的ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法。

通过根据本发明的生产ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法可获得的或获得的植物也是本发明的实施方案。

本发明的另一个实施方案涉及生产甜瓜果实和任选甜瓜种子的方法，其包括以下步骤：

a)生长包含两条11号染色体的ToLCNDV抗性甜瓜植物，每条11号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物11号染色体的渗入片段，该渗入片段包含SNP_03的供体植物序列，或介于SNP_03和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间的供体植物序列；或该渗入片段包含SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部抗性供体基因型；

b)收获在步骤a)中生长的甜瓜植物的果实，和任选地

c)从步骤b)中获得的果实中收集种子。

步骤a)的甜瓜植物是如说明书中所述的植物，其包含如前所述的QTL11，特别是纯合形式的QTL11，从而使表型表达。任选地，甜瓜植物可进一步在12号染色体上包含渗入片段，也如上所述。因此，步骤a)的植物可以进一步包含一条或两条12号染色体，其具有ToLCNDV抗性供体植物12号染色体上的渗入片段，所述渗入片段包含供体植物的SNP_05和/或SNP_06和/或SNP_07的序列，或介于SNP_05和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间的供体植物序列。

一方面，步骤a)的栽培甜瓜植物是F1杂合植物，并且产生了商业用途的甜瓜果实。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的生产甜瓜果实或种子的方法中步骤a)的甜瓜植物具有描述为根据本发明的植物的不同实施方案的特定特征。因此，本文所述的根据本发明的植物的不同实施方案可适用于生产根据本发明的杂合甜瓜种子的方法。

根据本发明的生产甜瓜种子的方法可获得的种子也是本发明的实施方案。

本发明的另一个实施方案涉及生产杂合甜瓜种子的方法，特别是生产F1杂合种子的方法，其包括以下步骤：

a)提供第一ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包含两条11号染色体，每条染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段，该渗入片段包含QTL11和供体植物的SNP_03序列，或介于SNP_03和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间的序列；或该渗入片段包含QTL11和SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部的抗性供体基因型；

b)提供第二ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包含两条11号染色体，每条11号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段，该渗入片段包含QTL11和供体植物的SNP_03序列，或介于SNP_03和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间的序列；或该渗入片段包含QTL11和SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部的抗性供体基因型；

c)使步骤a)中提供的近交甜瓜植物与步骤b)中提供的近交甜瓜植物杂交；

d)收集从步骤c)的杂交获得的种子。

一方面，步骤a)或步骤b)的近交植物是雄性不育的，因此仅在步骤c)中发生异体授粉，在步骤d)中产生F1杂合种子。

任选地步骤a)或步骤b)中的近交植物还包含两条12号染色体，每条12号染色体包含如所述的具有QTL12的渗入片段。因此，一方面，步骤a)或步骤b)中的植物包含纯合形式的QTL11，并且还包含纯合形式的QTL12。因此，F1杂合种子包含纯合形式的QTL11和杂合形式的QTL12。

在另一方面，步骤a)中的植物和步骤b)中的植物均包含纯合形式的QTL11和纯合形式的QTL12。因此，步骤c)的F1杂合种子包含纯合形式的两个QTL。

收集的杂合种子，尤其是F1杂合种子也是本发明的实施方案。这些是出售的用于生产商业甜瓜果实的种子。从这些种子中生长的植物在果实生产领域中对ToLCNDV具有抗性或高度抗性。

在本发明的不同实施方案中，涉及用于生产杂合甜瓜种子，特别是F1杂合种子的方法，其包括以下步骤：

a)提供第一ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包括两条12号染色体，每条染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的12号染色体的渗入片段，该渗入片段包含QTL12和供体植物的SNP_06序列，或介于SNP_05和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间的序列；或该渗入片段包含QTL12和SNP_05和SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的抗性供体基因型；

b)提供第二近交甜瓜植物；

d)收集从步骤c)的杂交获得的种子。

任选地，步骤b)中的第二近交甜瓜植物也是ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包含具有来自ToLCNDV抗性供体植物的12号染色体的渗入片段的两条12号染色体，该渗入片段包含QTL12和供体植物的SNP_06序列，或介于SNP_05和SNP_07之间、或介于SNP_05和SNP_06之间、或介于SNP_06和SNP_07之间的序列；或该渗入片段包含QTL12和SNP_05和SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的抗性供体基因型。

一方面，步骤a)或步骤b)的近交植物是雄性不育的，因此仅在步骤c)中发生异体授粉，产生步骤d)中的F1杂合种子。

在步骤d)中收集的F1杂合种子包含杂合形式或纯合形式的QTL12。由于QTL12是部分显性的，纯合子植物中的ToLCNDV抗性评分将比QTL12杂合植物中的更高。

收集的杂合种子，尤其是F1杂合种子也是本发明的实施方案。这些是出售的用于商业甜瓜果实生产的种子。从这些种子中生长的植物将在果实生产领域中具有ToLCNDV抗性。

就本发明而言，“近交植物”或“近交系”是指已经经历了几代自交并且在其遗传结构和表型外观上是高度均匀的植物。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的生产杂合甜瓜种子的方法的步骤a)和b)的近交系具有描述为根据本发明植物的优选和其他实施方案的特定特征。本文所述的根据本发明植物的优选和其他实施方案相应地适用于生产根据本发明的杂合甜瓜种子的方法。

通过根据本发明的用于生产杂合甜瓜种子的方法可获得的或获得的杂合种子也是本发明的实施方案。

本发明的另一个实施方案是产生甜瓜果实的方法，其包括以下步骤：

a)生长上述F1杂合植物，即在其基因组中包含纯合形式的QTL11和/或杂合或纯合形式的QTL12，和任选地，

b)收获由步骤a)中生长的植物产生的果实。

术语“果实”在其植物学意义上通常被理解为是从被子植物花的子房发育的携带种子的结构。

通过本发明的生产甜瓜果实的方法可获得的或获得的甜瓜果实也是本发明的实施方案。

可以借助SNP标记物，特别是本文公开的SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个，鉴定由于其基因组中存在QTL11和/或QTL12而产生ToLCNDV抗性的甜瓜供体植物。因此，本发明首次使本领域技术人员能够鉴定供体植物，从所述供体植物可以将赋予甜瓜植物ToLCNDV抗性的渗入片段递送到回交甜瓜植物中。

同样，本发明首次提供了栽培的甜瓜植物、植物部分和细胞，其基因组中包含在11号染色体和/或12号染色体上的渗入片段，所述渗入片段赋予原本易感的甜瓜植物对ToLCNDV的抗性。

因此，本发明的另一实施方案涉及SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部用于鉴定ToLCNDV抗性甜瓜植物或其部分(例如细胞、果实、叶)的用途。

优选地，该用途涉及鉴定ToLCNDV抗性供体甜瓜植物或植物部分和/或栽培的甜瓜植物或植物部分。

另一实施方案是SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部用于将ToLCNDV抗性渗入ToLCNDV易感甜瓜植物，特别是栽培的甜瓜系或品种的用途。

本发明的另一个实施方案是SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部用于繁殖ToLCNDV抗性甜瓜植物中的用途。

还提供了一种筛选(或选择)在11号染色体和/或12号染色体上存在赋予ToLCNDV抗性的片段的植物或植物部分(如植物组织、细胞等)或由其衍生的DNA的方法。该方法包括以下步骤：

i)针对SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的SNP基因型，筛选基因组DNA；

ii)和任选地选择包含SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的抗性供体基因型的植物或植物部分。

可以使用各种方法进行此类筛选，如SNP基因分型测定法(例如KASP测定法、TaqMan测定法、高分辨率熔解(HRM)测定法、SNP基因分型阵列测定法如Fluidigm、Illumina等，或同样可以使用DNA测序。

在整个说明书中清楚地表明，植物、植物部分或其基因组DNA的筛选可以用于多种目的，例如鉴定ToLCNDV抗性供体，或者作为育种程序的一部分，例如鉴定和/或选择包含QTL11和/或QTL12的植物或植物部分，或用于检查竞争者是否利用本发明并产生包含QTL11和/或QTL12的近交系或杂合子。

还提供了用于(例如在发生ToLCNDV病毒感染的地区)生长本发明植物的方法，所述方法包括在生长区域(例如，田间或受保护的环境，如温室或隧道)内播种种子或播种幼苗，和任选地收获果实。

如本文所述，在11号染色体和/或12号染色体上包含渗入片段的细胞或组织可以由以下组成或包含以下：非繁殖的细胞或组织、或不可再生的细胞或组织、或者繁殖的或可再生的细胞或组织。它们可以包含或由光合或非光合细胞组成。营养性植物部位、细胞和组织，如收获的果实或果肉部位，是非光合部位和组织。细胞和组织可以在细胞或组织培养物中。

收获的果实或加工的果实也包括在本文中，例如，甜瓜果肉的切片、块或立方体，例如在一个容器中。

一方面，根据本发明的植物、植物部分和植物细胞并非仅通过EPC(欧洲专利公约)28(2)所定义的基本生物方法获得。

一方面，植物是非GMO的(非遗传修饰的)。

本文的QTL11是与WO2017/114848中描述的QTL不同的QTL，因为11号染色体上的位置是不同的位置。当针对甜瓜CM3.6.1基因组BLAST搜索SNP1至SNP16标记物序列时，这是很明显的。最紧密相关的标记物是Melon_sbg_33761_74(SEQ ID NO:7)、Melon_sbg_2720_78(SEQ ID NO:8)和Melon_sbg_14207_58(SEQ ID NO:9)，其位于染色体的33.18Mb、33.34Mb和33.35Mb。相反，本发明QTL11的最紧密相关的标记物SNP_03位于32.49Mb。该位置在11号染色体上的更上游，在位于32.3Mb的其标记物Melon_sbg_55680_17(SEQ ID NO:5)和位于32.6Mb的其标记物Melon_sbg_60684_74(SEQ ID O:6)的区域中。然而，在RIL-30中，在对应于Melon_sbg_617_42(SEQ ID NO：1)至Melon_sbg_33761_74(SEQ ID NO：7)的区域中不存在渗入片段，而该品系仍然对ToLCNDV具有抗性并且仍然包含其QTL11。由于其供体是甜瓜亚种田间酸味品系，而本发明的供体是甜瓜亚种甜味品系(Cucumis melo subsp.meloaccession)，其渗入的核苷酸序列也将与本发明的核苷酸序列完全不同。甜瓜田间亚种在系统发育上与甜瓜甜味亚种在不同的簇中，参见例如Gur等人的增补图S3，“Genome-WideLinkage-Disequilibrium Mapping to the Candidate Gene Level in Melon(Cucumismelo)”,Scientific Reports,第7卷,Article number:9770(2017),doi:10.1038/s41598-017-09987-4。

种子保藏信息

栽培甜瓜种子的代表性例子命名为甜瓜TOLCHR11-12，根据布达佩斯条约专家解决方案(EPC 2000，规则32(1))，由Nunhems B.V.在2016年8月10日保藏在NCIMB Ltd.(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn Aberdeen,Scotland AB21 9YA,UK)，该种子包含两个渗入片段(纯合形式)，一个渗入片段在11号染色体上包含渗入的ToLCNDV抗性，一个渗入片段在12号染色体上包含渗入的ToLCNDV抗性。种子的保藏号为NCIMB 42625。

申请人要求仅根据EPC规则32(1)或具有类似规则和规定的国家或条约的相关立法，将生物材料及其衍生的任何材料的样品分配给指定的专家，直到专利被授权，或者自申请日起20年(如果该申请被驳回、撤回或视为撤回)。

在本申请未结案期间，美国专利局长官确定有权利的人员可以要求获得保藏材料。根据37C.F.R.§1.808(b)的规定，在专利被授权后，保藏人对公众可获得保藏材料的所有限制将不可撤回地取消。保藏将保持30年，或者在最近一次请求后保留5年，或者保留专利的可执行期，以较长者为准，如果在此期间不再存活，则将被替换。申请人不放弃根据本申请的专利或根据植物品种保护法(7USC 2321等)赋予的任何权利。

序列说明

在序列表中所示的SEQ ID NO中，除G(鸟嘌呤)、A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶)以外的其他字符具有以下含义：

R：G或A

Y：T或C

M：A或C

K：G或T

S：G或C

W：A或T

H：A或C或T

B：G或T或C

V：G或C或A

D：G或A或T

N：G或A或T或C

SEQ ID NO 1：包含SNP_01的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 2：包含SNP_02的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 3：包含SNP_03的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 4：包含SNP_04的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 5：包含SNP_05的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 6：包含SNP_06的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 7：包含SNP_07的ToLCNDV抗性供体植物的序列。

SEQ ID NO 8-10：SNP_01 FAM等位基因引物、SNP_01 VIC等位基因引物、SNP_01通用引物。

SEQ ID NO 11-13：SNP_02 FAM等位基因引物、SNP_02 VIC等位基因引物、SNP_02通用引物。

SEQ ID NO 14-16：SNP_03 FAM等位基因引物、SNP_03 VIC等位基因引物、SNP_03通用引物。

SEQ ID NO 17-19：SNP_04 FAM等位基因引物、SNP_04 VIC等位基因引物、SNP_04通用引物。

SEQ ID NO 20-22：SNP_05F AM等位基因引物、SNP_05 VIC等位基因引物、SNP_05通用引物。

SEQ ID NO 23-25：SNP_06 FAM等位基因引物、SNP_06 VIC等位基因引物、SNP_06通用引物。

SEQ ID NO 26-28：SNP_07 FAM等位基因引物、SNP_07 VIC等位基因引物、SNP_07通用引物。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7

附图说明

图1：显示了通过粉虱传播ToLCNDV感染35天后(dpi)的ToLCNDV抗性供体植物系(野生供体)、回交植物系(回交)和植物系NCIMB 42625平均症状水平(三个重复)。如本文“一般方法”中所述测定平均症状水平。

一般方法

1.测定ToLCNDV感染植物的症状水平

1.1植物和病原体(病毒)

ToLCNDV的甜瓜植物(Cucumis melo)感染株用于甜瓜植物的感染。在本发明中，使用在西班牙穆尔西亚分离的ToLCNDV株作为接种物。

1.2 ToLCNDV接种物

ToLCNDV接种物来源维持在感染的活甜瓜植物上。必须确保使用纯净的病毒分离株，并且病毒来源和粉虱均没有污染其他疾病，特别是其他病毒(例如CGMMV、CYSDV、CYVY、SqMV)。为了预增殖ToLCNDV接种物，将粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))饲养在ToLCNDV敏感(易感)、感染的甜瓜植物上，并放入防虫笼中。在感染测试植物之前，将ToLCNDV感染的植物放入防虫笼中，将粉虱释放到同一笼中，并在ToLCNDV感染的植物上饲养约3天。

1.3接种待测植物

对于待分析的每种基因型甜瓜植物，生长14株植物，直到第一片真叶伸展为止(通常在播种后12-15天)，其中12株被感染，并且其中2株被模拟感染。还包括12株易感品种的植物，在该实验中品种Gandalf F1(Hild Samen)和品种Vedantrais。将待测试ToLCNDV抗性的每个基因型的12株植物放入防虫笼中，将感染的粉虱(如上文1.2所述获得)释放到笼中以感染植物。必须确保笼中的每株测试植物至少有5-10只粉虱。粉虱和测试植物在笼中放置约48小时，然后用适当的杀虫剂清除粉虱。每个基因型还有两株植物是模拟感染，即，除了用于感染的粉虱不含ToLCNDV以外，以与测试植物相同的方式对其进行处理。

1.4生长被感染的测试植物

将根据1.3所述获得的被感染的测试植物移植到更大的盆中，并转移至带有冷却设备的温室中。使植物在约18℃的夜间温度和约25℃的日温下，在14至16小时日照的时间表生长。每个感染基因型的感染植物一式两份在两个不同的地点生长，每个地点包含6株ToLCNDV感染的植物和1株模拟感染的植物。根据种植面积对地点进行随机化。

1.5.对ToLCNDV感染的症状水平进行评分

在ToLCNDV感染后大约15天(dpi)已经可以进行症状水平的评分，但最好在ToLCNDV感染后大约30天(dpi)或更晚(例如35dpi)进行症状水平的评分。如果存在从病毒感染中恢复过来的植物，则任选地可以在ToLCNDV感染后大约45天(dpi)对症状进行进一步评分。

根据以下指示的表型使用以下的症状水平：

1.6任选的附加测试

在每个实验设置中，建议使用至少一个对ToLCNDV高抗性的基因型(例如平均症状水平8-9)和/或一个对ToLCNDV高敏感的基因型(例如平均症状水平1或2)作为对照。进一步建议在每个测试设置中还包括对ToLCNDV感染具有中等抗性的基因型。当这些对照基因型显示出预期的症状水平时，这清楚地表明实验条件可正确评估测试植物。特别重要的是包括易感对照系或品种，其在例如30dpi或更晚(例如35dpi)评分时显示预期的症状。

此外，建议检查ToLCNDV在感染植物和对照植物中的感染和传播。这可以通过检查植物上部中病毒DNA的存在和/或量来完成。检查上部植物部分中ToLCNDV DNA的存在和/或量的合适方法是将植物材料与探针杂交，所述探针与所用ToLCNDV株的DNA杂交。各种杂交技术是本领域众所周知的。一个简单的所谓的斑点印迹分析就足以获得有价值的结果。另外地或可替代地，可以使用qPCR。

1.选择ToLCNDV抗性供体植物

根据“一般方法”中描述的测试，测试甜瓜植物野生品系对ToLCNDV抗性的症状水平。鉴定对ToLCNDV感染具有高抗性的野生供体植物，其在15dpi、25dpi和35dpi的平均疾病评分为9(无症状)，而易感对照品系在15dpi的平均疾病评分为2.8，在25dpi的平均疾病评分为2.0，在35dpi的平均疾病评分为2.0。

在30dpi后，还对感染的供体植物和易感对照品系进行了印迹杂交和qPCR(定量PCR)。在30dpi的供体组织中未检测到ToLCNDV病毒，而在易感对照中检测到ToLCNDV病毒(注意，低Ct值表示高的病毒滴度，而高Ct值表示低的病毒量)。

qPCR阴性对照Ct＝34

使用Simon等人2018(同上)中描述的方案进行了另一实时qPCR(定量PCR)实验。简而言之，将Simon等人2018(同上)表1中的引物和探针ToLA-up(正向引物)、ToLA-Low(反向引物)和ToLA-Probe(TaqMan探针)用于如本文所述的qPCR分析，其中热循环条件为95℃下孵育2分钟、然后进行40个循环的在95℃下持续15秒、然后在60℃下持续1分钟。

如本文中以上所述，播种供体和易感品种Vedantrais的植物并用ToLCNDV接种。每个基因型六株植物，三个重复，每个重复包括三个模拟接种的Vedantrais植物。在15dpi、30dpi和45dpi下对每个植物进行表型评分。在60dpi从每株植物中取qPCR样品。

STDV＝标准偏差

结果证实无症状供体系在60dpi的叶中具有极低的ToLCNDV病毒水平。

2.鉴定ToLCNDV抗性的基因组位置

使用实施例1中获得的供体植物开发了三个作图群，以绘制赋予ToLCNDV抗性的基因座(QTL)的位置。如上所述，使用1至9的TolCNDV量表对作图群进行表型分型。最初使用192个SNP标记物进行基因分型，然后运行其他SNP标记物使QTL区域饱和。

在这些作图群中的分析揭示了两个主要的抗性相关的QTL，位于11号染色体和12号染色体。

本发明人从抗性材料开发出反交系以精细绘图，并进一步研究了供体的抗性。

在精细绘图期间鉴定的标记物以及根据Diaz等人(2015,Mol Breeding 35,188)公开的已知数据的其相应位置，显示在表2中(说明书中)。

3.KASP测定法的开发

开发了一种KASP测定法，用于鉴定与QTL11连锁的SNP(SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04)和与QTL12连锁的SNP(SNP_05、SNP_06和SNP_07)。可以通过在KASP测定法中使用以下引物来确定与QTL11和QTL12相关的SNP：

4.ToLCNDV渗入栽培的甜瓜植物

与Piel de Sapo型的回交亲本优良育种系进行反交，以开发包含纯合形式的QTL11和QTL12的品系。

将包含纯合形式的QTL11和QTL12的渗入系的种子以NCIMB 42625保藏。如使用KASP测定法所证实的，存在SNP_01至SNP_04和SNP_05至SNP_07的供体基因型。

图1和下表显示，供体和保藏的渗入系在35dpi评分时的平均疾病评分为9.0，而易感的回交亲本系在35dpi时的平均疾病评分为2.4。

AVG：测试基因型的平均值，STDV：标准偏差

与供体进行了另外的反交，将一个或两个QTL渗入原种Galia、Cantaloup和Charentais背景。

PCT/RO/134表

关于微生物保藏的说明

关于微生物保藏的说明

(专利合作条约实施细则13之2)

Claims

1.一种栽培的甜瓜植物或植物细胞，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和12号染色体的渗入片段，其中11号染色体上的渗入片段包含介于SEQ ID NO：1的核苷酸101上的SNP_01和SEQ ID NO：4的核苷酸101上的SNP_04之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列，和其中12号染色体上的渗入片段包含介于SEQ ID NO：5的核苷酸101上的SNP_05和SEQ ID NO：7的核苷酸101上的SNP_07之间的ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的序列。

2.根据权利要求1所述的栽培的甜瓜植物或植物细胞，其中11号染色体上的渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜的SNP_03序列，和其中12号染色体上的渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_06序列。

3.一种栽培的甜瓜植物或植物细胞，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体和12号染色体的渗入片段，其中11号染色体上的渗入片段包含SEQ ID NO：1或与SEQ IDNO：1具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的腺嘌呤，和/或SEQ ID NO：2或与SEQID NO：2具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的鸟嘌呤，和/或SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的胸腺嘧啶，和/或SEQ IDNO：4或与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的胸腺嘧啶，以及其中12号染色体上的渗入片段包含SEQ ID NO：5或与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的胞嘧啶，和/或SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的鸟嘌呤，和/或SEQ ID NO：7或与SEQ ID NO：7具有至少90％序列同一性的序列的核苷酸101上的胸腺嘧啶。

4.根据前述权利要求中任一项所述的栽培的甜瓜植物或植物细胞，其中11号染色体上的渗入片段为纯合形式，并且其中12号染色体上的渗入片段为纯合形式或杂合形式。

5.根据前述权利要求中任一项所述的栽培的甜瓜植物或植物细胞，其中11号染色体和12号染色体上的渗入片段来自野生甜瓜或甜瓜的野生近缘物，任选地来自相同的野生甜瓜或甜瓜供体品系的野生近缘物。

6.根据前述权利要求中任一项所述的栽培的甜瓜植物或植物细胞，其中11号染色体上的渗入片段包含隐性QTL，当QTL是纯合形式时所述隐性QTL赋予在1(死亡植物)至9(无症状)的尺度上至少7的平均TolCNDV抗性评分，并且其中12号染色体上的渗入片段包含部分显性QTL，当QTL是纯合形式或杂合形式时，其赋予至少5的平均TolCNDV抗性评分。

7.根据前述权利要求中任一项所述的栽培的甜瓜植物或植物细胞，其中植物或植物细胞是近交植物或植物细胞或F1杂合植物或植物细胞。

8.一种种子，其生长成根据权利要求1至7中任一项所述的植物。

9.一种栽培的甜瓜果实或果实部分，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的植物细胞。

10.一种栽培的甜瓜植物繁殖材料，其包含权利要求1至7中任一项所述的栽培的甜瓜植物细胞。

11.根据权利要求7所述的近交系在F1杂合种子生产中作为亲本的用途。

12.一种生产杂合栽培甜瓜种子的方法，其包括以下步骤：

a)提供第一ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包括两条11号染色体，每条11号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段，所述渗入片段包含QTL11和供体植物的SNP_03序列，或介于SNP_03和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间；或该渗入片段包含QTL11和SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部的抗性供体基因型；

b)提供第二ToLCNDV抗性近交甜瓜植物，其包含两条11号染色体，每条11号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的11号染色体的渗入片段，该渗入片段包含QTL11和供体植物的SNP_03序列，或介于SNP_03和SNP_04之间、或介于SNP_02和SNP_03之间；或该渗入片段包含QTL11和SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部的抗性供体基因型；

d)收集从步骤c)的杂交获得的种子。

13.标记物SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个和/或标记物SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个用于鉴定ToLCNDV抗性甜瓜植物或植物部分或植物细胞的用途。

14.标记物SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个和/或标记物SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个用于将ToLCNDV抗性渗入ToLCNDV易感的栽培甜瓜植物中的用途。

15.一种筛选在11号染色体和/或12号染色体上存在赋予ToLCNDV抗性的片段的植物或植物部分或由其衍生的DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

i)针对SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个的SNP基因型筛选基因组DNA；

ii)和任选地选择包含SNP_01、SNP_02、SNP_03和SNP_04中的一个或多个或全部和/或SNP_05、SNP_06和SNP_07中的一个或多个或全部的抗性供体基因型的植物或植物部分。