CN109475098B - ToLCNDV抗性甜瓜植物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及抗番茄曲叶新德里病毒(ToLCNDV)感染的甜瓜植物(甜瓜(Cucumis melo))。抗性甜瓜植物在5号染色体上具有基因组基因渗入片段，其以显性方式赋予对ToLCNDV的耐受性。还公开了用于鉴定那些片段的标记物、用于鉴定或产生抗性甜瓜植物的方法。

Description

ToLCNDV抗性甜瓜植物
本申请涉及抗番茄曲叶新德里病毒(ToLCNDV)感染的甜瓜植物 (甜瓜(Cucumismelo))。抗性甜瓜植物在5号染色体上具有基因组基因渗入片段，其以显性方式赋予对ToLCNDV的耐受性。还公开了用于鉴定那些片段的标记物、用于鉴定或产生抗性甜瓜植物的方法。
番茄曲叶新德里病毒(Tomato leaf curl New Dehli virus) (ToLCNDV)归类于属于双粒病毒科(Geminiviridae)家族的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)。ToLCNDV具有由称为DNA A和DNA B 的两个单链DNA分子组成的二分基因组(Saez et al.,2016,Annals of Applied Biology)。
在1995年在印度最初发现ToLCNDV感染番茄(Solanum lycopersicum)植物。后来发现ToLCNDV也感染其他茄科(Solanacea) 物种的植物，如茄子(Solanum melongena)(茄子)、红辣椒(辣椒属 (Capsicum spp.))和马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯)。在2012年，在西班牙发现ToLCNDV感染葫芦物种(小西葫芦(courgette)、西葫芦 (Cucurbitapepo)变种giromontiina)，并且在2015年在突尼斯，所述病毒被鉴定为甜瓜、黄瓜和小西葫芦中的病害源。同时，已证实感染许多葫芦科(Curcubitacea)物种，例如Benincasahispida(冬瓜)、Citrullus lanatus(西瓜)、甜瓜(甜瓜)、甜瓜变种flexuosus(蛇甜瓜)、Cucumis sativus(黄瓜)、Cucurbita moschata(南瓜(musky gourd))、Cucurbita pepo(西葫芦(pumpkin))、西葫芦变种giromontiina(小西葫芦 (courgette))、Lagenariasiceraria(瓠瓜葫芦(bottle gourd))、Luffa cylindrica(丝瓜(sponge gourd))、Momordica charantia(苦瓜(bitter gourd))。也报道过感染种子(例如鳢肠(Ecliptaprostrata)–菊科 (Asteraceae))和其他作物例如大麻槿(Hibiscus cannabinus)(洋麻(kenaf)–锦葵科(Malvaceae))和番木瓜(Carica papaya)(番木瓜(papaya) -番木瓜科(Caricaceae))。在地中海地区，这种病害确实发生在意大利 (西西里岛)、西班牙和突尼斯的各种作物物种中。在亚洲国家，在孟加拉国、印度、印度尼西亚、巴基斯坦、菲律宾、斯里兰卡和泰国的不同作物中都证实有感染。关于ToLCNDV地理分布的其他信息缺乏，但从今天的观察结果来看，病毒显然似乎在地理上和其他作物上进一步传播。病害症状通常包括叶子上的黄色花叶病、叶卷曲、叶脉肿大和植物发育迟缓的表型外观。用ToLCNDV感染幼苗后的瓜类显示出矮化生长和减少或抑制的果实产生。还报道了表现出表皮粗糙和纵向开裂的果实。因此，ToLCNDV导致各种重要作物物种的经济损失，并且是一个主要威胁。ToLCNDV对植物的感染通过吸吮韧皮部的粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))传播病毒而持续发生。(欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant ProtectionOrganization)，EPPO RS 2015/114、2016/024、2016/040，出版日期 2015-06)。
在丝瓜中，已显示出对ToLCNDV的抗性受单个显性基因的控制 (Islam et al.,2010,Euphytica 174(1):83-89)。
在番茄中，已通过沉默病毒基因产生了对ToLCNDV具有抗性的转基因植物(Varma&Praveen,2006,ISB News Report)。
已开发了通过将受感染的西葫芦植物的汁液机械转移到来自其他葫芦属(黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、西瓜属(Citrullus)、葫芦属(Lagenaria))的未感染植物来传播ToLCNDV的测试。鉴定了五种抗ToLCNDV的甜瓜种质(accessions)(亚种agrestis变种苦瓜属(momordica)：Mom-KhaInd/Kharbuja、Mom-PI124Ind/PI 124112、Mom-PI124Ind/PI 414723和亚种agrestis野生型： Ag-WM9Ind/WM9、Ag-WM7Ind/WM7)(Lopez et al.,2015,Euphytica 204(3),679-691)。没有使用天然粉虱感染系统确认这些种质的抗性。
Saez et al.2016,第214-216页(Proceedings of Cucurbitaeceae 2016,theXIth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae July 24-282016,Warsaw,Poland)记载了甜瓜亚种 Agrestis种质WM-7的ToLCNDV抗性以耐受﹕易感的3:1比例在F2 种群中分离，这暗示WM-7中存在单显性抗性基因。尤其是，如Lopez etal.2015中所述，使用机械接种，以及不使用经粉虱病媒(vector) 的自然感染。
通过机械汁液传输筛选试验筛选了抗ToLCNDV的不同的南瓜属 (Cucurbita)物种(西葫芦(C.pepo)、南瓜(C.moschata)、笋瓜(C.maxima)、 C.fraternal、黑籽南瓜(C.ficifolia))。发现四种南瓜种质(PI 604506、 PI 381814、Nigerian local、Kurokawa)对于ToLCNDV的机械感染显示出低症状。然而，该结果只能对所述种质中的两个(PI604506、PI 381814)在粉虱感染时重现，证明不仅应在人工条件下测试对 ToLCNDV的抗性，而且还应通过使用天然存在的粉虱感染系统测试对ToLCNDV的抗性(Saez et al.,2016,Annals of Applied Biology)。因此，当通过粉虱转移病毒时，尚不清楚被鉴定为对ToLCNDV感染具有抗性的种质在自然生长条件下是否具有抗性。
防治作物植物的ToLCNDV感染的尝试包括通过杀虫剂施用防治病媒(粉虱)和栽培技术的适用，包括使用无病毒作物材料(移植)、建立无作物期、杂草管理(消除病毒感染的杂草)和摧毁田间受感染的植物。然而，由于与病害相关的复杂流行病学因素，这些尝试并不总是有效的(Saez et al.,2016,Annals of Applied Biology)。
因此，需要建立其他测定以减少ToLCNDV感染、将病毒进一步传播到其他地理区域并扩散到其他作物物种。对ToLCNDV具有抗性的品种的育种对于管理该病害将是至关重要的。
本发明的一个目的是提供防治甜瓜植物中ToLCNDV感染的测定。
本发明公开了抗ToLCNDV感染的甜瓜植物细胞和甜瓜植物。
通常已知，ToLCNDV确实感染葫芦科物种的各种不同的植物物种，包括甜瓜物种。还熟知，ToLCNDV通过植物吸吮害虫烟粉虱(粉虱)从受感染的植物持续传播到未感染的植物。已证明ToLCNDV从一种作物物种转移到不同的作物物种，或者甚至从杂草物种转移到作物物种。粉虱可以从所防治区域外获取ToLCNDV，甚至可以从不同物种中获取ToLCNDV，并将其转移到在防治区域中种植的甜瓜植物。因此，粉虱病媒防治对预防ToLCNDV感染的效果有限。TolCNDV抗性甜瓜植物具有以下优点：即使在培育甜瓜植物的区域周围的植物感染ToLCNDV，它们也能抵抗TolCNDV的感染而没有大的产量损失。
发明人发现了甜瓜的ToLCNDV抗性供体种质，并且已经使用西班牙ToLCNDV毒株的粉虱感染绘制了分离群中的抗性，用于抗性表型分析。在5号染色体(QTL5)上鉴定了定量性状基因座(QTL)，并将其从野生供体种质渐渗到优良栽培的甜瓜株系中。包含纯合形式的QTL5基因渗入的优良株系的种子由Nunhems B.V.根据布达佩斯条约以登记号NCIMB 42585保藏。在这些种子中，存在本文提供的单核苷酸多态性(SNP)标记物(SNP_01至SNP_06)的供体基因型。供体本身不均一，具有白色果肉，白利糖度低。它不是具有农艺价值的种质。供体在美国种子库也不再可用。通过鉴定QTL5并将其从供体转移到栽培的甜瓜中，现在可制备具有高农艺价值的栽培甜瓜品种和栽培种(具有均一的特征和具有高白利糖度和良好保质期的可销售果实)，其具有针对ToLCNDV的抗性，因此可在ToLCNDV侵染的区域种植那些甜瓜品种而不会有产量损失。
在本发明的上下文中，本领域中也称为甜瓜(muskmelon)植物细胞或甜瓜植物的“甜瓜(Melon)植物细胞”或“甜瓜植物”应理解为来源于物种甜瓜的植物细胞或属于物种甜瓜的植物。
甜瓜可分为：罗马甜瓜(C.melo cantalupensis)、冬甜瓜(C.melo inodorous)和网纹甜瓜(C.melo reticulatus)。罗马甜瓜也被称为硬皮甜瓜(Cantaloupes)，基本上是圆形的，有突出的棱条，几乎没有网纹。大多数都有橙色、甜的果肉，它们通常很香。与欧洲硬皮甜瓜相比，北美'硬皮甜瓜'不属于这种类型，但属于真甜瓜。冬甜瓜(或冬甜瓜)可以细分为不同的类型，如蜜瓜(Honeydew melon)、Piel de Sapo、糖瓜、日本甜瓜等。网纹甜瓜是真甜瓜，具有网状皮(网状)并包括 Galia甜瓜、Sharlyn甜瓜和北美硬皮甜瓜。
甜瓜和甜瓜的野生近缘种是二倍体，并且具有12对同源染色体，编号为1至12。
在本发明的上下文中，“抗性(resistant)”或“对……具有抗性 (beingresistant to)”应理解为意指植物，其是特定病原体的宿主物种并因此可被给定的病原体感染，但其中所述植物包含遗传元件(例如基因渗入片段)，其与缺乏该遗传元件的易感植物相比导致降低感染后的植物中病原体的生长和/或扩散。在本发明的上下文中，“抗性”或“对……具有抗性”特别是指对ToLCNDV具有抗性的植物细胞或植物。抗性是相对术语，其可以覆盖由病原体感染引发的植物细胞或植物中的一系列(不同)反应。植物细胞或植物的那些反应的效果可以通过各种方法测量。通常，通过定义出现在植物细胞或植物中的症状水平来测量效果。通常将一个株系的几株植物(例如10株或更多株) 的平均症状与对照株系或品种(优选易感对照株系或品种)的几株植物的平均症状进行比较。因此，在一个时间点对一个株系或品种的至少10株或更多株单独的植物进行评分，并计算平均病害评分。
关于本发明，根据ToLCNDV感染后的表型观察，应用以下通常已知的症状水平：
1＝死的植物
2＝严重的花叶病和卷曲、萎黄病和生长减缓。没有恢复
3＝强的花叶病和卷曲、萎黄病和生长减缓。没有恢复
4＝卷曲和花叶病、萎黄病、没有或轻度的生长减缓。没有恢复
5＝卷曲和花叶病、萎黄病、没有生长减缓。上部植物带略有恢复
6＝轻度卷曲、花叶病和萎黄病，没有生长减缓。中上部植物恢复
7＝轻度卷曲、花叶病和萎黄病，没有生长减缓。症状仅出现在下部植物带
8＝微弱的花叶病
9＝没有症状
为了确定症状水平(或病害评分)，优选幼年植物被ToLCNDV 感染。幼年植物优选是第一片真叶正展开时的植物，优选在播种后约 12-15天的植物。感染优选通过饲喂携带病毒的病媒(粉虱属(Bemisia)) 进行。为此目的，植物在最佳或接近最佳条件下发芽并生长。优选至少测定一次症状水平，例如，感染后30天(或更晚，例如感染后31、 32、33、34、35天)。任选地，在感染后的不同时间点测定两次或甚至三次症状水平以确认结果，例如，感染后约15天、20天或25天的第一次评分和ToLCNDV感染后约30天(或更晚，例如感染后31、 32、33、34、35天)的第二次评分。也参见实施例。在一个方面，如果植物株系具有5.0或更高的平均病害评分，则该植物株系被认为对 TolCNDV感染具有抗性，而易感对照株系或品种，例如品种Gandalf (或Gandalf F1，Nunhems BV)或Vedantrais，当在相同条件下生长并以相同方式感染时，具有2.5或更低或者2.0或更低的平均病害评分。
已经观察到，位于野生甜瓜供体植物中的5号染色体上的特定片段向栽培甜瓜植物的基因渗入赋予栽培甜瓜植物或由源自其的细胞中对ToLCNDV感染的抗性。各个片段仅以杂合状态存在便足以赋予 ToLCNDV抗性，证明该片段以显性方式赋予对TolCNDV感染的抗性。鉴定了5号染色体上的单核苷酸多态性(SNP)，其与赋予ToLCNDV 抗性的5号染色体的片段紧密连锁。抗性供体的SNP核苷酸(即基因渗入片段的核苷酸)在保藏的种子中以纯合形式存在，即供体核苷酸以SNP_01至SNP_06(与QTL5连锁)的纯合形式存在。因此，SNP 可用于检测植物细胞、植物组织、植物部分和/或标记辅助选择(MAS) 中包含QTL5的基因渗入片段的存在，以将QTL转移到其他优良甜瓜株系或品种中。SNP还可用于选择包含比保藏种子中存在的片段更小的基因渗入片段的植物，由此较小的亚片段保留QTL。或者，SNP可用于鉴定包含QTL5的其他供体以及用于将这些QTL渐渗到栽培的甜瓜中。
因此，本发明涉及甜瓜植物细胞或甜瓜植物，其包含来自 ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含供体植物在SNP_01和SNP_06之间的序列，优选供体植物在SNP_01和SNP_05之间的序列，更优选供体植物在SNP_01和 SNP_04之间的序列。赋予ToLCNDV抗性的QTL存在于所述基因渗入片段上，如可通过本文所述的抗性测定法确定的。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_02和SNP_06 之间的序列，优选供体植物的SNP_02和SNP_05之间的序列，更优选供体甜瓜植物的SNP_02和SNP_04之间的序列。
本发明进一步涉及甜瓜植物细胞或甜瓜植物，其包含来自 ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性供体植物的SNP_03和SNP_06之间的序列，优选ToLCNDV抗性供体植物的SNP_03和SNP_05之间的序列。
最优选地，本发明涉及甜瓜植物细胞或甜瓜植物，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_03和SNP_04 之间的序列。
当在本文中提及包含两个SNP(单核苷酸多态性)“之间”的序列的基因渗入片段时，这在一个方面包括两个SNP中的一个或两个本身也来自抗性供体，即在SNP位置处具有供体核苷酸。在另一个方面，两个SNP来自受体，例如易感甜瓜植物，而只有两个SNP之间的区域来自抗性供体并赋予TolCNDV抗性，即赋予供体片段的抗性位于两个 SNP标记物之间。因此，例如，植物可以包含含有ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_03和SNP_04之间的序列的基因渗入片段，在一方面，该植物包含SEQ ID NO:3的核苷酸68处的胸腺嘧啶(T)和/或 SEQID NO:4的核苷酸227处的腺嘌呤(A)，即供体核苷酸。在另一方面，这两个SNP之间的仅一个区域(整个区域或其一部分)来自供体，而SNP_03和SNP_04来自受体，具有例如SEQ ID NO:3的核苷酸68处的胞嘧啶(C)和例如SEQ ID NO:4的核苷酸227处的鸟嘌呤(G)。
因此，关于5号染色体上的QTL，SNP_01、SNP_02、SNP_03、 SNP_04、SNP_05和SNP_06可都具有抗性供体基因型。或者仅SNP_01 和SNP_02可具有抗性供体基因型；或者仅SNP_02和SNP_03可具有抗性供体基因型；或者仅SNP_03和SNP_04可具有抗性供体基因型等。或者仅单个SNP，即仅SNP_01或仅SNP_02或仅SNP_03或仅SNP_04 或仅SNP_05或仅SNP_06具有抗性供体基因型。因此，不具有抗性供体基因型的SNP具有另一种基因型——受体基因型。SNP的受体基因型可为其他3个核苷酸中的任何一个，即对于SNP_01，受体基因型可为腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。因此，例如当说明基因渗入片段在关于5号染色体上的QTL的SNP_03和SNP_04之间时，SNP_03和 SNP_04都可具有抗性供体基因型。或者仅一个SNP，即仅SNP_03或仅SNP_04可具有抗性供体基因型；或者甚至SNP_03和SNP_04都不具有抗性供体基因型，而其间的序列仍含有QTL5。
并非本文提供的所有SNP都需要具有抗性供体基因型的原因是，包含来自供体的QTL的基因渗入片段可能小于例如在保藏的种子中渐渗的染色体片段，但所述片段仍包含QTL5。仍然可通过表型，和/ 或通过将片段转移到易感植物并由此转移ToLCNDV抗性表型，或通过测序SNP标记物之间的区域来鉴定供体片段，或本领域技术人员已知的其他方法，例如用更多SNP标记物饱和该区域、等位性测试、鉴定因果基因等，来鉴定植物含有基因渗入片段(包含QTL5)。
因此，可以使用方法的组合来显示QTL5存在于植物细胞或植物中，即使并非所有连锁的SNP都存在供体SNP基因型。当转移到易感株系或品种中时，QTL5赋予至少5.0的平均ToLCNDV抗性并且是显性的。
在本发明的一个优选实施方案中，来自供体植物的5号染色体的基因渗入片段赋予本发明的栽培的甜瓜植物细胞或本发明的栽培的甜瓜植物对ToLCNDV的抗性，所述基因渗入片段包含供体植物的 SNP_01和SNP_06之间、SNP_01和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和 SNP_04之间、SNP_03和SNP_06之间、SNP_03和SNP_05之间，优选SNP_03和SNP_04之间的序列。
优选地，本发明的甜瓜植物细胞源自栽培的甜瓜植物或本发明的甜瓜植物为栽培的甜瓜植物。
一方面，本发明涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物(或植物部分)，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段赋予ToLCNDV抗性并且所述基因渗入片段可通过一个或多个(或所有)以下SNP的供体植物的SNP基因型来检测(包含一个或多个(或所有)以下SNP的供体植物的SNP基因型)：SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05和/或SNP_06 以及任选地SNP_01和SNP_06之间的任何SNP。
在一个方面，植物、植物部分或植物细胞包含QTL5并且包含至少SNP_03的SNP供体基因型，因为该SNP与ToLCNDV抗性QTL5 最显著相关。在另一方面，植物、植物部分或植物细胞包含至少SNP_03 和SNP_04或至少SNP_03和SNP_02的SNP供体基因型。任选地，植物、植物部分或植物细胞包含QTL5并且包含SNP_01、SNP_02和 SNP_03的SNP供体基因型；或者包含SNP_02、SNP_03和SNP_04 的SNP供体基因型。
因此，基因渗入片段可以包含与QTL5连锁的所有SNP标记物的供体SNP基因型(如在本文中保藏的种子中)，或较小的片段，由此不存在一个或多个SNP标记物。如下文进一步描述的，甚至可以不存在全部供体SNP标记物或除一种供体SNP标记物之外的全部供体SNP标记物，而QTL5仍然存在于基因渗入片段上。
包含本文提供的SNP的核苷酸序列(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 6)是抗性供体的核苷酸序列，即它们含有供体SNP核苷酸。因此，一方面，本发明涉及栽培的甜瓜植物细胞或甜瓜植物(或植物部分)，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段赋予ToLCNDV抗性，并且所述基因渗入片段可通过以下检测(包含以下)：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的核苷酸101处的胞嘧啶或与SEQ ID NO:1具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的胞嘧啶，和/或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的核苷酸945处的胸腺嘧啶或与SEQ ID NO:2具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的胸腺嘧啶，和/或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3的核苷酸68处的胸腺嘧啶或与SEQ ID NO:3具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的胸腺嘧啶，和/或SEQ ID NO:4或在SEQ ID NO:4 的核苷酸227处的腺嘌呤或与SEQ ID NO:4具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的腺嘌呤，和/或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的核苷酸839处的胞嘧啶或与SEQ ID NO:5具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的胞嘧啶，和/或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的腺嘌呤或与SEQ ID NO:6具有基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的腺嘌呤。赋予ToLCNDV抗性的QTL存在于所述基因渗入片段上。
与本发明相关的“供体植物细胞”或“供体植物”应当意指对 ToLCNDV具有抗性的甜瓜植物细胞或甜瓜植物。同样地，来自供体植物或细胞的术语DNA片段或基因渗入片段应指对ToLCNDV具有抗性的甜瓜植物的5号染色体的片段，由此当转移到TolCNDV易感甜瓜植物中时，该片段赋予ToLCNDV抗性。在本发明的一个优选实施方案中，供体植物是甜瓜的野生物种或野生种质。在本发明的一个特别优选的实施方案中，来自供体植物细胞或植物的DNA片段或基因渗入片段是从在NCIMB 42585下保藏的种子生长的植物获得的供体片段或从在NCIMB 42585下保藏的种子生长的植物获得的后代获得的供体片段或从通过与在NCIMB 42585下保藏的种子生长的植物杂交获得的植物获得的供体片段。
供体甜瓜植物可以从各种来源获得。本领域技术人员熟知如何检测ToLCNDV抗性供体植物的其他来源。为了检测ToLCNDV抗性供体植物的这些来源，基本上可以通过机械方法，如Lopez等人(2015, Euphytica 204(3),679-691)所述或通过粉虱传播病毒来用ToLCNDV 感染甜瓜植物。优选地，在本发明的上下文中通过粉虱感染发生感染。然后可以选择与易感对照组相比表现出降低的症状水平的植物，并将其用作赋予ToLCNDV抗性的基因组片段或序列的来源。本文在“一般方法”下给出了如何用ToLCNDV感染甜瓜植物的优选方法以及测定受感染植物的症状水平的方法。
在本发明的上下文中，优选供体植物的平均症状水平等于或大于 5.0，更优选等于或大于6.0，进一步优选等于或大于7.0，甚至更优选等于或大于8.0，以及最优选等于或大于9.0。一方面，供体植物包含 SNP_01、SNP_2、SNP_3、SNP_04、SNP_05或SNP_06中的一个或多个或者全部的供体SNP基因型，如表2所示。优选地，SNP供体基因型为纯合的。本文中所述供体为例如不具有农业价值的野生甜瓜，例如其产生白色果肉的果实，具有低白利糖度等。
与本发明相关的“轮回(recurrent)植物细胞”或“轮回植物”或“受体植物”应理解为对ToLCNDV感染敏感(本文中与易感同义使用)或无抗性的甜瓜植物细胞或甜瓜植物。可通过观察ToLCNDV 感染后的症状水平来确定植物对ToLCNDV是否敏感或无抗性。轮回植物的平均症状水平优选低于3.0，更优选等于或低于2.5或等于或低于2.0。本文其他地方描述了症状水平和如何用ToLCNDV感染甜瓜植物的方法，因此在此是适用的。在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的轮回甜瓜植物细胞来源于栽培的甜瓜植物或根据本发明的轮回甜瓜植物是栽培的甜瓜植物。优选地，它是优良株系、育种株系或品种。
“基因渗入片段”是指已经通过杂交或传统育种技术引入相同或相关物种的另一植物中的染色体片段、染色体部分或区域。从供体植物到轮回植物的片段的基因渗入向供体和轮回植物之间杂交的后代引入表型，其在轮回植物中不存在。关于本发明，从供体植物转移到轮回植物的表型是对ToLCNDV的抗性，例如，平均病害评分为5.0。为了将片段基因渗入到特定的育种株系或品种中，第一杂交步骤之后可为例如与预期的育种株系或品种进行一次或多次回交。如本文所理解的，基因渗入可意指ToLCNDV抗性供体植物与ToLCNDV非抗性轮回植物的第一次杂交，并且进一步回交从第一次杂交获得的ToLCNDV 抗性植物与ToLCNDV抗性应当渐渗其中的受体植物一次或多次。在这种情况下，基因渗入的片段是由动词“渐渗”(例如回交)至受体品种或育种株系所指的育种方法的结果。因此，ToLCNDV抗性对轮回植物的基因渗入是由人指导的技术方法。特别地，本文中的基因渗入是指人工育种过程或方法。本文提供的一种或多种或所有分子标记物(SNP标记物)可用于该方法。所得到的植物，即包含来自供体的一个基因渗入片段(在5号染色体上)(即包含重组5号染色体)的栽培株系或品种，也是人工的并且在自然界中不存在。
基因渗入片段可以很大，例如，甚至是染色体的一半，但优选较小，例如约15Mb或更小，例如约10Mb或更小、约9Mb或更小、约 8Mb或更小、约7Mb或更小、约6Mb或更小、约5Mb或更小、约 4Mb或更小、约3Mb或更小、约2Mb或更小、约1Mb(等于1,000,000 个碱基或更小)或约0.8Mb(等于800,000个碱基对)或更小。
基因渗入片段可以源自野生甜瓜植物或野生甜瓜种质或甜瓜的野生近缘种或地方品种(landraces)(供体)。可以使用野生甜瓜植物或野生甜瓜种质或甜瓜植物的野生近缘种或地方品种将供体基因组的片段渐渗到栽培甜瓜Cucumis melo的基因组中，以产生具有良好农业特征的育种株系或品种。因此，此类栽培甜瓜植物具有“栽培甜瓜的基因组”，但在其基因组中包含供体的片段，例如近缘野生甜瓜属基因组的基因渗入片段，所述近缘野生甜瓜属例如为Cucumis melo ssp. agrestis、甜瓜(C.melo ssp.melo)、C.melo ssp.acidulous、C.callosus、 C.trigonus、C.picrocarpus，或其他野生甜瓜或甜瓜的野生近缘种。据了解，术语“基因渗入片段”从未包含整条染色体，而是仅包含染色体的一部分。因此携带基因渗入的染色体也包含轮回(受体)甜瓜植物的一部分或多个部分以及供体甜瓜植物的多个部分。
当栽培甜瓜的5号染色体包含基因渗入片段时，因此这意味着栽培的甜瓜植物包含重组5号染色体，由此所述基因渗入的片段包含赋予ToLCNDV抗性的QTL。如其他地方所述，来自供体的基因渗入片段可包含一个或多个或所有供体SNP核苷酸(对于SNP_01、SNP_02、 SNP_03、SNP_04、SNP_05和/或SNP_06)或包含供体SNP核苷酸的一个或多个或所有序列(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6)。
所以，例如基因渗入片段(以纯合或杂合形式)可以包含以下SNP 基因型中的一种或多种或全部并且可通过以下SNP基因型中的一种或多种或全部进行检测：SEQ ID NO:1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:2中SNP_02的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO: 3中SNP_03的TT或TC基因型和/或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA 或AG基因型，和/或SEQ ID NO:5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6中SNP_06的AA或AG基因型。
在本发明中，在一个方面，栽培甜瓜的5号染色体的下部，在Diaz 等2015(Mol.Breeding 35:188)的第3页的5号染色体上的标记物 CMGAAN144下方，或在标记物CMGAAN144和标记物AI_13-H12 之间，均包含来自供体的QTL5。
一方面，本发明的供体植物不是由Lopez et al.,2015,Euphytica 204(3),679-691鉴定的对ToLCNDV具有抗性的五种甜瓜亚种agrestis 种质(亚种agrestis变种苦瓜属：Mom-KhaInd/Kharbuja、 Mom-PI124Ind/PI 124112、Mom-PI124Ind/PI 414723和亚种agrestis 野生型：Ag-WM9Ind/WM9、Ag-WM7Ind/WM7)之一。
术语“育种”包括如育种者已知的杂交、回交、自交、选择、双单倍体产生、胚胎拯救、原生质体融合、标记物辅助选择、突变育种等(即除基因修饰/转化/转基因方法之外的方法)，例如，通过所述方法可以获得、鉴定、产生和/或转移重组5号染色体。
在本发明的一个优选的实施方案中，基因渗入片段来源于野生甜瓜属植物或野生甜瓜属种质，最优选地，基因渗入片段来源于野生甜瓜(Cucumis melo ssp.melo)，有小果实(不超过6cm长)，有白色的酸味果肉。该供体用于本发明，但本领域技术人员可鉴定其他供体，其包含例如与该供体的SNP_01至SNP_06相同的SNP基因型，并且在6号染色体的相同区域中包含QTL。
在一个方面，合适的供体是野生甜瓜植物或种质，其平均 ToLCNDV病害评分为至少7.0，或至少7.1、7.2、7.3或7.4或7.5或 7.6，等级为1＝死亡植物至9＝无症状；且包含一种或多种或所有以下 SNP基因型：
SEQ ID NO:1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 2中SNP_02的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO:3中SNP_03的 TT或TC基因型和/或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO:5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 6中SNP_06的AA或AG基因型。
“植物品种”为已知最低等级的同一植物学分类群中的植物群，其(不论是否满足植物育种者权利的识别条件)可以根据由某种基因型或基因型组合产生的特征的表达来定义，可以通过表达这些特征中的至少一种来区别于任何其他植物群，并且可以被视为实体，因为它可以在没有任何变化的情况下繁殖。因此，术语“植物品种”不能用于表示植物群，即使它们属于同一类，如果它们的特征全部在于存在一个或两个基因座或基因(或由于这些特定基因座或基因产生的表型特征)，但就其他基因座或基因而言，它们之间可存在巨大的差异。
“F1、F2、F3等”是指两个亲本植物或亲本株系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子长出的植物称为F1代。F1 植物自交产生F2代等。
“F1杂种”植物(或F1杂种种子)是由两个近交的亲本株系杂交得到的世代。因此，F1杂种种子是由其长出F1杂种植物的种子。由于杂种优势，F1杂种更有活力(vigorous)且具有更高的产量。近交株系(inbred line)在基因组中大多数基因座处上基本上是纯合的。
“植物株系”或“育种株系”是指植物及其后代。本文使用的术语“近交株系”是指已经被反复自交且几乎为纯合的植物株系。因此“近交株系”或“亲本株系”是指已经历过几代(例如至少5、6、7或更多代)近交的植物，产生具有高度均一性(uniformity)的植物株系。
“均一性(uniformity)”或“均一(uniform)”涉及植物株系或品种的遗传和表型特征。由于近交株系是通过几代近交而产生，因此其在遗传上是高度均一的。同样地，由这种近交株系产生的F1杂种在其基因型和表型的特征和性能上是高度均一的。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物的特征在于赋予ToLCNDV抗性的基因渗入片段源自在 NCIMB 42585下保藏的种子或其后代。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的甜瓜植物细胞源于栽培的甜瓜植物或本发明的甜瓜植物是栽培的甜瓜植物，并且所述基因渗入片段源于野生的甜瓜属植物或野生甜瓜属种质或者本文所述的为优选供体植物的供体植物或由在NCIMB 42585下保藏的种子或其后代获得。
“甜瓜植物的5号染色体”在本发明的上下文中应理解为由ICuGI (国际葫芦基因组学倡议)指定的属于甜瓜基因组的5号染色体的支架、片段、区域、标记物和核酸序列。
“直系同源的5号染色体”是指甜瓜野生近缘种的5号染色体，其部分可渐渗到栽培甜瓜5号染色体中。
“重组染色体”是指具有通过在同源染色体之间杂交而产生的新基因组成的染色体，例如“重组5号染色体”，即5号染色体，其不存在于任一亲本植物中并且通过5号染色体对的同源染色体之间的罕见交换事件而产生。在本文中，例如，提供了包含赋予ToLCNDV抗性的QTL的重组甜瓜5号染色体。因此，重组5号染色体是栽培甜瓜的染色体，具有来自野生供体的基因渗入片段，由此基因渗入片段包含赋予ToLCNDV抗性的QTL。
“ICuGI”在本文中是指由国际葫芦基因组学倡议公布的甜瓜数据，其公开了例如甜瓜的基因图谱(http:// www.icugi.org/cgi-bin/cmap/map set_info？species acc＝CM)。甜瓜基因组图谱的当前版本CM_3.5.1是2012年3月4日，并且5号染色体的图谱被称为ICuGI_V(或LG_V，或连锁群(Linkage Group)V)。除了ICuCI数据之外，还可以从Diaz等人(2015,Mol Breeding 35,188) 以及相应文章的在线版本中包含的附加数据中获得包括额外标记物和定位(mapping)信息的其他信息。
“栽培的甜瓜植物”指的是甜瓜植物，即由人类栽培并具有良好农业特性的甜瓜的品种、育种株系或栽培种，特别是产生具有良好尺寸、质量和均匀性的可食用和可销售的果实；这些植物不是“野生甜瓜植物”，即通常比栽培植物具有更差的产量和更差的农业学特征，以及例如在野生种群中自然生长的植物。“野生植物”包括例如物种的生态型、PI(植物引入)株系、地方品种或野生种质或野生近缘种。
在本发明的上下文中，“SNP(＝单核苷酸多态性)”应理解为发生在基因组中特定位置的单核苷酸的变异。SNP是两株植物之间基因组中给定位置的单核苷酸的变异。如果具有ToLCNDV抗性的野生甜瓜植物(供体植物)在其特定单一位置的相应序列中显示与栽培甜瓜植物的相同位置处的相应核苷酸不同的核苷酸，则该位置定义野生甜瓜和栽培甜瓜之间的SNP。如果供体植物在特定位置具有四种可能的核苷酸(A、C、T或G)之一，则当栽培的植物在相同的相应序列位置具有剩余的三种可能的核苷酸中的任一种时，发生SNP。因此，在包含来自供体的基因渗入片段的栽培甜瓜植物中，可容易地确定SNP 的单核苷酸是来自供体还是来自栽培的甜瓜(受体)。
“SNP核苷酸”是指单核苷酸，而“SNP基因型”是指二倍体植物细胞中的核苷酸对。因此，对于SNP_01，ToLCNDV抗性供体的 SNP核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸101的胞嘧啶(C)，而包含SEQ ID NO:1的植物或细胞的SNP基因型可以为CC(两条染色体上的胞嘧啶)或CT(一条染色体上的胞嘧啶和另一条染色体上的胸腺嘧啶)，其中ToLCNDV抗性供体SNP核苷酸(胞嘧啶)以及由此所得的SEQ ID NO:1(或与SEQ ID NO:1基本相同的序列)是纯合的或杂合的。术语“SNP供体基因型”是指供体SNP核苷酸以纯合形式或杂合形式存在，即对于SNP_01，SNP供体基因型是CC或CT。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME11320_k”的“SNP_01”应理解为SEQ ID NO1中101位的SNP。可以在ICuGI数据集的5 号染色体上发现SEQ ID NO 1或与SEQ ID NO 1基本相同的序列。根据ICuGI公布的标记物的SNP_01的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_01的核苷酸序列与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQ ID NO 1中101位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％、97％、98％、 99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ ID NO:1的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 1或在包含与SEQ ID NO:1的基本序列同一性的序列中的101位具有'C'(胞嘧啶)。在本发明的一个优选实施方案中，SNP_01的特征在于轮回植物在SEQ ID NO 1中的101位具有A、G或T。在一个方面，轮回植物在SEQID NO 1中的101位具有T。
在本发明的一个实施方案中，SNP_01的特征在于供体植物在SEQ ID NO 1的101位(或在与SEQ ID NO:1基本上具有序列同一性的序列的等同位置)具有C，并且轮回植物在SEQ ID NO 1中的101位具有T。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME43070_k”的“SNP_02”应理解为SEQ ID NO2中945位的SNP。在ICuGI数据集的5号染色体上可以发现SEQ ID NO 2或与SEQ ID NO 2基本相同的序列。根据 ICuGI公布的标记物的SNP_02的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_02的核苷酸序列与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQ ID NO 2中945位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ IDNO 2具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ ID NO:2的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 2或在包含与SEQ ID NO:2的基本序列同一性的序列中的945位具有'T'(胸腺嘧啶)。
在本发明的一个优选实施方案中，SNP_02的特征在于轮回植物在 SEQ ID NO 2中或在包含与SEQ ID NO:2的基本序列同一性的序列中的945位具有A、C或G。
在一个方面，轮回植物在SEQ ID NO 2中或在包含与SEQ ID NO: 2的基本序列同一性的序列中的945位具有‘G’(鸟嘌呤)。
在本发明的一个特别的实施方案中，SNP_02的特征在于供体植物在SEQ ID NO 2(或在包含与SEQ ID NO:2的基本序列同一性的序列) 的945位具有T，并且轮回植物在SEQID NO 2(或在包含与SEQ ID NO:2的基本序列同一性的序列)中的945位具有G。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME10621_k”的“SNP_03”应理解为SEQ ID NO3中68位的SNP。在ICuGI数据集的5号染色体上可以发现SEQ ID NO 3或与SEQ ID NO 3基本相同的序列。根据 ICuGI公布的标记物的SNP_03的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_03的核苷酸序列与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQID NO 3中68位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ ID NO 3具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ IDNO:3的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 3(或在包含与SEQ ID NO:3的基本序列同一性的序列)中的68位具有'T'(胸腺嘧啶)。在本发明的一个实施方案中，SNP_03的特征在于轮回植物在SEQ ID NO 3(或在包含与SEQ ID NO:3的基本序列同一性的序列) 中的68位具有A、C或G。在一个方面，轮回植物在SEQ ID NO 3(或在包含与SEQ ID NO:3的基本序列同一性的序列)中的68位具有C。
在本发明的一个实施方案中，SNP_03的特征在于供体植物在SEQ ID NO 3(或在包含与SEQ ID NO:3的基本序列同一性的序列)的68 位具有“T”，并且轮回植物在SEQ ID NO3(或在包含与SEQ ID NO: 3的基本序列同一性的序列)中的68位具有“C”。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME50729_k”的“SNP_04”应理解为SEQ ID NO4中227位的SNP。在ICuGI数据集的5号染色体上可以发现SEQ ID NO 4或与SEQ ID NO 4基本相同的序列。根据 ICuGI公布的标记物的SNP_04的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_04的核苷酸序列与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQ ID NO 4中227位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ IDNO 4具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ ID NO:4的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 4(或在包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列)中的227位具有'A'(腺嘌呤)。在本发明的一个实施方案中，SNP_04的特征在于轮回植物在 SEQ ID NO 4(或在包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列)中的227位具有C、T或G。在一个方面，轮回植物在SEQ ID NO 4 (或在包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列)中的227位具有G。
在本发明的一个实施方案中，SNP_04的特征在于ToLCNDV抗性供体植物在SEQ IDNO 4(或在包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列)的227位具有A，并且轮回植物在SEQ ID NO 4(或在包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列)中的227位具有G。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME32395_k”的“SNP_05”应理解为SEQ ID NO5中839位的SNP。在ICuGI数据集的5号染色体上可以发现SEQ ID NO 5或与SEQ ID NO 5基本相同的序列。根据 ICuGI公布的标记物的SNP_05的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_05的核苷酸序列与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQ ID NO 5中839位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ IDNO 5具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ ID NO:5的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 5(或在包含与SEQ ID NO:5的基本序列同一性的序列)中的839位具有'C'(胞嘧啶)。在本发明的一个实施方案中，SNP_05的特征在于轮回植物在SEQ ID NO 5(或在包含与SEQ ID NO:5的基本序列同一性的序列)中的839位具有A、T或G。在一个方面，轮回植物在SEQ ID NO 5 (或在包含与SEQ ID NO:5的基本序列同一性的序列)中的839位具有T。
在本发明的一个实施方案中，SNP_05的特征在于ToLCNDV抗性供体植物在SEQ IDNO 5(或在包含与SEQ ID NO:5的基本序列同一性的序列)的839位具有C，并且轮回植物在SEQ ID NO 5(或在包含与SEQ ID NO:5的基本序列同一性的序列)中的839位具有T。
在本发明的上下文中，或者命名为“mME49184_k”的“SNP_06”应理解为SEQ ID NO6中445位的SNP。在ICuGI数据集的5号染色体上可以发现SEQ ID NO 6或与SEQ ID NO 6基本相同的序列。根据 ICuGI公布的标记物的SNP_06的相对位置可从表1中推导出。优选地，包含SNP_06的核苷酸序列与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，更优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性，进一步更优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少97％的同一性，甚至进一步更优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少98％的同一性，特别优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少99％的同一性或更特别优选与SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列具有至少99.5％的同一性，条件是，在每种情况下，SEQ ID NO 6中445位的核苷酸与轮回植物的相同位置处的相应核苷酸不同。与SEQ IDNO 6具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多序列同一性的此类序列被称为具有与SEQ ID NO:6的基本序列同一性。
用于本发明的ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 6(或在包含与SEQ ID NO:6的基本序列同一性的序列)中的445位具有'A'(腺嘌呤)。在本发明的一个实施方案中，SNP_06的特征在于轮回植物在 SEQ ID NO 6(或在包含与SEQ ID NO:6的基本序列同一性的序列)中的445位具有C、T或G。在一个方面，轮回植物在SEQ ID NO 6 (或在包含与SEQ ID NO:6的基本序列同一性的序列)中的445位具有G。
在本发明的一个特别的实施方案中，SNP_06的特征在于 ToLCNDV抗性供体植物在SEQ ID NO 6(或在包含与SEQ ID NO:6 的基本序列同一性的序列)的445位具有A，并且轮回植物在SEQ ID NO 6(或在包含与SEQ ID NO:6的基本序列同一性的序列)中的445 位具有G。
Figure GDA0003553617240000221
Figure GDA0003553617240000231
Figure GDA0003553617240000241
Figure GDA0003553617240000251
可根据标准方法检测本文描述的分子标记物。例如，可以使用 KASP测定法(参见www.kpbioscience.co.uk)或其他测定法检测SNP 标记物。已为本文描述的SNP开发了KASP测定法。各种细节在实施例部分中公开。序列表中给出了在相应的KASP测定法中使用的序列。为了开发针对SNP的KASP测定法，根据公知常识设计两个等位基因特异性正向引物和一个等位基因特异性反向引物(对于KASP测定法，参见例如Allen et al.2011,PlantBiotechnology J.9,1086-1099，尤其是第097-098页)。
可通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定“序列同一性(Sequence identity)”和“序列相似性(sequence similarity)”。然后，当序列通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss 程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)最佳比对，这些序列共享至少某一最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义的)时，所述序列可以被称作“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman 和Wunsch全局比对算法来在全长上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gapcreation) 罚分＝10，空位延伸(gap extension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对均如此)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992, PNAS 89,10915-10919)。例如可以使用计算机程序(例如可在万维网 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上获得的EMBOSS)来确定用于百分比序列同一性的序列比对和评分。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中并进行成对比对以比较序列同一性。如果序列同一性百分比为至少85％、90％、95％、98％、99％或更多(例如至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或更多(如通过使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)，对于核酸，使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用评分矩阵Blosum62的 Emboss“Needle”所确定的))，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。
当提到这样的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)，即所述核酸序列与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.9％核酸序列同一性的序列同一性时，在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为是与给定的核苷酸序列基本上相同的，并且可以使用严格杂交条件进行鉴定。在另一个实施方案中，与给定的核苷酸序列相比，所述核酸系列包含一个或多个突变体，但是仍然可以使用严格杂交条件进行鉴定。
当用ToLCNDV感染时，在5号染色体上包含渗入的赋予 ToLCNDV抗性的片段的栽培的甜瓜植物表现出减轻的症状，而易感对照(缺乏基因渗入片段)在相同条件下显示出预期的严重症状。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物的特征在于它们感染ToLCNDV后显示出平均症状水平为至少4.0，更优选至少5.0。如前所述，当QTL为纯合或杂合形式时，QTL5赋予抗性。通过例如回交引入包含QTL5的基因渗入片段并且任选地自交以产生纯合的基因渗入片段(包含纯合形式的SNP_01、SNP_02、 SNP_03、SNP_04、SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部的供体基因型)的ToLCNDV易感植物将产生对ToLCNDV感染具有抗性的植物，其平均病害评分为至少4.0，优选至少5.0，优选至少6.0或优选至少7.0。在ToLCNDV感染之后出现的在1至9之间的症状水平已在上文中描述并且因此在此适用，其中1被定义为具有最严重症状的水平，9被定义为最高抗性水平。用于确定症状水平的优选测试在下文的“一般方法”下给出。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物的特征在于，它们感染ToLCNDV后显示出4至6的症状水平，更优选5至6的症状水平，而易感对照组示出症状水平为2或更低。
由基因渗入片段赋予的对ToLCNDV的抗性以显性方式表达，因此当仅一条5号染色体包含在本文公开的5号染色体的标记物之间包含供体植物序列的基因渗入片段时可以观察到。
因此，本发明的其他具体实施方案涉及本发明的甜瓜植物细胞或本发明的甜瓜植物，其中，来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段以杂合状态存在，所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_01和SNP_06之间、SNP_01和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和 SNP_04之间、SNP_03和SNP_06之间、SNP_03和SNP_05之间或优选地SNP_03和SNP_04之间的序列。因此，本发明的植物细胞或本发明的植物中的至少一条5号染色体包含刚刚描述的基因渗入片段就足够了。然而，应当理解，对于刚刚描述的基因渗入片段，该5号染色体也可以纯合状态存在而不减少抗性的程度，因为由刚刚描述的基因渗入片段赋予的ToLCNDV抗性是显性的。因此，本发明包括本发明的植物细胞或本发明的植物，其包含杂合或纯合状态的刚刚描述的基因渗入片段。
表2说明了包含纯合形式或杂合形式的ToLCNDV抗性供体SNP 的植物或细胞的SNP基因型以及缺乏基因渗入片段的轮回亲本SNP 基因型。
表2
Figure GDA0003553617240000281
在一个实施方案中，提供了(物种甜瓜的)栽培的甜瓜植物，其包含重组5号染色体，其中重组5号染色体包含基因渗入片段，所述基因渗入片段当以纯合或杂合形式存在时赋予甜瓜植物ToLCNDV抗性，并且其中所述基因渗入片段来自物种甜瓜的野生供体。在一个方面，所述基因渗入片段包含SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05和/或SNP_06中的一种或多种或全部的SNP供体基因型。在一个实施方案中，所述基因渗入片段包含至少SNP_03和/或SNP_04 的供体SNP基因型。供体的SNP基因型可以纯合形式(如果基因渗入片段是纯合形式)或以杂合形式(如果基因渗入片段是杂合形式)存在。因此，例如，植物或植物细胞或植物部分可包含SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03的TT或TC基因型。因此，植物、植物细胞或植物部分可以纯合形式或杂合形式包含SEQ ID NO:3或包含与 SEQ ID NO:3具有至少95％、97％或98％序列同一性的序列。
在一个实施方案中，提供了栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞，其在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予ToLCNDV抗性，其中所述基因渗入片段位于SNP_01和 SNP_06之间(或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6之间，或包含与SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO 6具有至少90％或至少95％或至少97％或 98％序列同一性的序列)；或者，其中基因渗入片段位于SNP_01和 SNP_05之间(或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5之间，或包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO 5具有至少90％或至少95％或至少97％或 98％的序列同一性的序列)。
在一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予ToLCNDV抗性，其中所述基因渗入片段位于SNP_01和SNP_06之间(或在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6之间或包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO 6具有至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，或该片段位于SNP_01和SNP_05之间(或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 5之间，或包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO 5具有至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，其中所述基因渗入片段包含SEQ ID NO 3的核苷酸68处或包含与SEQ ID NO:3的基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的胸腺嘧啶(T)。
在另一方面，所述基因渗入片段任选地还包含SEQ ID NO 4的核苷酸227处或包含与SEQ ID NO:4的基本序列同一性的序列的等同核苷酸处的腺嘌呤(A)。
在另一方面，所述基因渗入片段任选地还包含SNP_02和/或 SNP_05的供体核苷酸。因此，所述基因渗入片段可包含SNP_03、 SNP_04和SNP_05的供体基因型；或SNP_03和SNP_02的供体基因型；或SNP_03和SNP_02和SNP_04的供体基因型；或SNP_03、SNP_02、 SNP_04和SNP_05的供体基因型。
在另一方面，所述基因渗入片段任选地还包含SNP_02和/或 SNP_01的供体核苷酸。因此，基因渗入片段可包含SNP_03和SNP_02 的供体基因型；或SNP_03、SNP_02和SNP_01的供体基因型；并且任选地还包含SNP_04的供体基因型，并且还任选地包含SNP_05的供体基因型，并且进一步任选地包含SNP_06的供体基因型。
在另一方面，所述基因渗入片段任选地还包含SNP_05和/或 SNP_06的供体核苷酸。
因此，在一个方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予 ToLCNDV抗性，其中基因渗入片段位于SNP_01和SNP_06之间(或 SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6之间，或包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO6至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，并且其中，所述基因渗入片段包含SNP_01、SNP_02、SNP_03、 SNP_04、SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部的ToLCNDV抗性SNP基因型。在一个方面，所述片段包含SNP_03和/或SNP_04的供体SNP基因型。
因此，在一个方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予 ToLCNDV抗性，其中所述基因渗入片段位于SNP_01和SNP_05之间 (或SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5之间，或包含与SEQ ID NO：1 或SEQID NO 5至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，并且所述基因渗入片段包含SNP_01、SNP_02、SNP_03、 SNP_04和SNP_05中的一种或多种或全部的ToLCNDV抗性SNP基因型。在一个方面，所述片段包含SNP_03和/或SNP_04的供体SNP 基因型。任选地，对于SNP_06，也存在抗性SNP基因型。
因此另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予ToLCNDV 抗性，其中所述基因渗入片段位于SNP_03和SNP_04之间(或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO:4之间，或包含与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO 4至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，并且其中，所述基因渗入片段任选地包含SNP_03和/或SNP_04的 ToLCNDV抗性SNP基因型。任选地，对于选自SNP_01、SNP_02、 SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部的SNP标记物而言，还存在供体基因型。
在另一方面，栽培的甜瓜植物或这些植物的细胞在5号染色体上包含来自野生供体的基因渗入片段，该基因渗入片段赋予ToLCNDV 抗性，其中基因渗入片段位于SNP_02和SNP_04之间(或SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO:4之间，或包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO 4至少90％或至少95％或至少97％或98％的序列同一性的序列)，并且其中，所述基因渗入片段任选地包含SNP_02和/或SNP_03和/或 SNP_04的ToLCNDV抗性SNP基因型。任选地，对于选自SNP_01、 SNP_05和SNP_06的一种或多种或全部的SNP标记物而言，还存在供体基因型。
包含本发明的植物细胞的植物是本发明的另一个实施方案。
本发明的甜瓜植物可为近交株系，开放授粉品种(OP)或F1杂种。在一个方面，F1杂种包含杂合形式的基因渗入片段，即通过杂交两种近交亲本株系产生的基因渗入片段，所述两种近交亲本株系中一种具有基因渗入片段(优选纯合形式，但不是必须的)，并从所述杂交中收集F1杂种种子。F1杂种还可包含纯合形式的基因渗入片段，即通过杂交两种近交亲本株系产生的基因渗入片段，所述两种近交亲本株系中的每一种亲本株系包含纯合或杂合形式的基因渗入片段。
本发明的甜瓜植物可为任何类型。优选地，它具有良好的农业特征和良好的果实品质特征，例如大的平均果实尺寸(至少500g、600g、 700g、800g、900g、1000g或更多)、果实的高平均白利糖度(例如至少10％、12％、14％、16％、18％或更多的平均折射计％总可溶性固体)、每种植物产生许多果实、坚实的果实果肉等。
还可在本发明的甜瓜植物中引入其他抗性，例如对一种或多种以下疾病的抗性：细菌枯萎病、根腐病、冠萎病、甜瓜锈病、白粉病、黄萎病、Sulphur Bum、疮痂病(Scab)、西瓜花叶病(Watermelon Mosaic)、霜霉病(Downy Mildew)、Fusarium oxysporum fsp.melonis(Fom)种族0、Fusarium oxysporum fsp.melonis(Fom)种族1、Fusarium oxysporumfsp.melonis(Fom)种族2、Fusarium oxysporum fsp. melonis(Fom)种族1.2、镰刀霉枯萎病(Fusarium Wilt)R2、根结(线虫)、炭疽病、黄瓜花叶兵(Cucumber Mosiac)和南瓜花叶病(Squash Mosaic)；和/或对一种或多种以下害虫的抗性：蚜虫抗性、泡菜蠕虫 (PickleWorm)、黑暗地面甲虫(Darkling Ground Beetle)、黄瓜条叶甲(Banded CucumberBeetle)、螨、十一星瓜叶甲(Western Spotted Cucumber Beetle)、甜瓜叶蝉、甜瓜蠕虫、西部黄瓜条叶甲 (Western Striped Cucumber Beetle)或甜瓜叶蝉。还可引入抵抗致病病毒、真菌、细菌或害虫的其他抗性基因。
本发明的一个具体方面涉及包含本发明的基因渗入片段的植物或植物细胞，所述基因渗入片段可从保藏于NCIMB 42585下的种子或其后代获得。保藏的种子为栽培的BC4S4世代的甜瓜植物，其包含纯合形式的基因渗入片段，其中供体核苷酸以纯合形式的SNP_01、SNP_02、 SNP_03、SNP_04、SNP_05和SNP_06存在。TolCNDV抗性最可能位于SNP_03和SNP_04之间，这意味着通过选择具有较小基因渗入片段尺寸的重组体可减小供体基因渗入的尺寸。因此，可以技术人员已知的方式产生这样的植物，其包含基因渗入片段的亚片段(其中所述亚片段仍赋予TolCNDV抗性)，该亚片段包含SNP_03和/或SNP_04 的供体SNP，但具有其他SNP中的一种或多种或全部的轮回亲本的 SNP基因型。
植物是否包含来自保藏种子的ToLCNDV抗性(相同尺寸的基因渗入片段或其亚片段)可以通过各种方法确定，例如测序和比较基因渗入片段和重组位点的序列。
包含本发明的甜瓜植物细胞的甜瓜植物和植物部分(例如叶、茎、根、果实、花粉、花等)也是本发明的一个实施方案。同样，本文包括可生长出这些植物的种子以及这些种子的部分(例如种子的细胞或组织，例如种皮、胚芽等)。
本发明的另一方面涉及甜瓜种子，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含 ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、SNP_01和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、 SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04之间、SNP_03和SNP_06 之间、SNP_03和SNP_05之间或SNP_03和SNP_04之间的序列。在本发明的一个优选实施方案中，种子包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含 ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、更优选 SNP_01和SNP_05之间、甚至更优选SNP_02和SNP_05之间、进一步优选SNP_02和SNP_04之间以及最优选SNP_03和SNP_04之间的序列。
本发明的另一个实施方案涉及从本发明的植物可获得或获得的甜瓜种子，或包含本发明的植物细胞的种子。
本发明的另一方面涉及甜瓜植物果实，其包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、SNP_01 和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、 SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04之间、SNP_03和SNP_06 之间、SNP_03和SNP_05之间或SNP_03和SNP_04之间的序列。在本发明的一个优选实施方案中，种子包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含 ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、更优选 SNP_01和SNP_05之间、甚至更优选SNP_02和SNP_05之间、进一步优选SNP_02和SNP_04之间以及最优选SNP_03和SNP_04之间的序列。
本发明的另一个实施方案涉及从本发明的植物可获得或获得的甜瓜果实，或包含本发明的植物细胞的果实。
优选地，本发明的甜瓜果实的特征在于，它们包含来自ToLCNDV 抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含杂合或纯合状态的供体植物的SNP_01和SNP_06之间、SNP_01和 SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、 SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04之间、SNP_03和SNP_06 之间、SNP_03和SNP_05之间或优选SNP_03和SNP_04之间的序列。
因此，本文描述的本发明的甜瓜植物细胞或甜瓜植物的优选和其他的实施方案也适用于代表本发明的甜瓜植物的甜瓜果实的优选和其他的实施方案。
本发明的另一方面涉及甜瓜植物繁殖材料，其包含来自ToLCNDV 抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、SNP_01 和SNP_05、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04、SNP_03和SNP_06之间、SNP_03 和SNP_05之间或SNP_03和SNP_04之间的序列。在本发明的一个优选实施方案中，繁殖材料包含来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性供体甜瓜植物的SNP_01和SNP_06之间、更优选SNP_01和SNP_05之间、甚至更优选地SNP_02和SNP_05之间、进一步优选地SNP_02和 SNP_04之间以及最优选地SNP_03和SNP_04之间的序列。
本发明的另一个实施方案涉及从本发明的植物可获得或获得的甜瓜植物繁殖材料，或包含本发明的植物细胞的甜瓜植物繁殖材料。
本文所述的本发明的植物细胞或植物的优选和其他的实施方案也适用于代表本发明的甜瓜植物繁殖材料的优选和其他的实施方案。
术语“繁殖材料”包括适于通过营养(无性的)或生殖(受精的，有性的)途径产生后代的那些植物部件。适于营养繁殖的是例如插条、体外组织、细胞、原生质体、胚芽或愈伤组织培养物、微体繁殖方法、根茎或块茎。其他繁殖材料包括例如果实、种子、幼苗等，其对于赋予ToLCNDV抗性的5号染色体基因渗入片段是纯合的或杂合的。在一个方面，繁殖材料采取通过嫁接到另一个根茎而繁殖的插条的形式或体外组织培养材料，特别是胚芽培养物。特别优选的是体外组织培养材料，特别是体外胚培养物形式的繁殖材料。
在一个方面，提供了包含本文所述重组5号染色体的非繁殖植物细胞。然而，在一个方面，这种非繁殖植物细胞可为甜瓜植物或甜瓜植物部分的一部分。
本发明的另一个实施方案涉及一种产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法，其包括以下步骤：
a)选择ToLCNDV抗性供体植物，
b)将步骤a)中选择的供体植物与对ToLCNDV敏感的轮回植物杂交
c)从步骤b)中杂交的植物获得种子并任选地
d)检验从步骤c)中获得的种子生长出的植物是否对ToLCNDV具有抗性和/或包含来自供体植物的选自SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05和SNP_06中的一种或多种SNP。
在本发明的产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法的步骤a)中的 ToLCNDV抗性供体植物可以通过用ToLCNDV感染甜瓜植物并如本文其他地方所述测定ToLCNDV感染的甜瓜植物的症状水平来选择。如果植物分别是ToLCNDV易感的或具有抗性的，则同样适用于本发明的产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法的步骤b)和c)中的检验。
在本发明的产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法的一个优选的实施方案中，步骤a)中ToLCNDV抗性供体植物包含赋予ToLCNDV抗性的5号染色体上的片段，所述片段包含供体植物的SNP_01和 SNP_06之间、SNP_01和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、 SNP_02和SNP_06之间、SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04 之间、SNP_03和SNP_06之间、SNP_03和SNP_05之间或SNP_03 和SNP_04之间的序列。最优选地，赋予ToLCNDV抗性的5号染色体上的片段包含SNP_03和SNP_04之间的序列。在本发明的一个具体优选的实施方案中，在本发明的产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法中，在步骤a)中ToLCNDV抗性供体植物包含赋予ToLCNDV抗性的 5号染色体的片段，所述片段包含SNP_01和SNP_06之间、SNP_01 和SNP_05之间、SNP_01和SNP_04之间、SNP_02和SNP_06之间、 SNP_02和SNP_05之间、SNP_02和SNP_04之间、SNP_03和SNP_06 之间、SNP_03和SNP_05之间或优选SNP_03和SNP_04之间的序列，如在NCIMB42585下保藏的种子中所发现。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法用于产生本发明的植物。本文所述的本发明的植物的优选和其他的实施方案相应地适用于产生本发明的ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法。
通过本发明产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法可获得或获得的植物也是本发明的一个实施方案。
本发明的另一个实施方案涉及产生甜瓜种子的方法，其包括以下步骤:
a)种植包含至少一条5号染色体的甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_03和SNP_04之间的序列，
b)采收步骤a)中种植的甜瓜植物的果实，
c)从步骤b)中获得的果实中收集种子。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的产生甜瓜种子的方法的步骤a)的甜瓜植物具有作为本发明的植物的优选和其他的实施方案所述的特定特征。本文所述的本发明的植物的优选和其他的实施方案相应地适用于本发明的产生杂种甜瓜种子的方法。
根据本发明的产生甜瓜种子的方法可获得的种子也是本发明的实施方案。
本发明的另一个实施方案涉及产生杂种甜瓜种子的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含至少一条5号染色体的第一近交甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_03和SNP_04之间的序列，
b)提供具有或不具有5号染色体的第二近交甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_03和SNP_04之间的序列，
c)将步骤a)中提供的植物与步骤b)中提供的植物杂交，
d)选择从步骤c)的杂交获得的种子。
“近交植物”或“近交株系”应指与本发明相关的植物，其经历了几代自交并且在其基因构成(genetic setup)和表型外观方面高度均一。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的产生杂种甜瓜种子的方法的步骤a)和b)的近交株系具有本发明的植物的优选和其他的实施方案所述的特定特征。本文所述的本发明的植物的优选和其他的实施方案相应地适用于本发明的产生杂种甜瓜种子的方法。
通过本发明的产生杂种甜瓜种子的方法可获得或获得的杂种种子也是本发明的实施方案。
本发明的另一个实施方案是产生甜瓜果实的方法，其包括以下步骤：
a)种植包含至少一条5号染色体的植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SNP_03和SNP_04之间的序列，
b)采收步骤a)中种植的植物产生的果实。
植物学意义上的术语“果实”通常被理解为由被子植物花的子房发育的具有种子的结构。
通过根据本发明的用于产生甜瓜果实的方法可获得或获得的甜瓜果实也是本发明的实施方案。
可以借助于SNP标记物鉴定对ToLCNDV具有抗性的甜瓜供体植物，特别是借助本文公开的SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、 SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部。因此，本发明首次使本领域技术人员能够鉴定供体植物，从中可以将赋予甜瓜植物ToLCNDV 抗性的基因渗入片段转移至轮回甜瓜植物中。
因此，本发明的另一个实施方案涉及SNP_01、SNP_02、SNP_03、 SNP_04、SNP_05或SNP_06中的一种或多种或全部用于鉴定 ToLCNDV抗性甜瓜植物或其部分(例如细胞、果实、叶)的用途。优选地，该用途涉及ToLCNDV抗性供体甜瓜植物和/或轮回甜瓜植物的鉴定，而且也涉及含有重组5号染色体的育种株系、栽培种或品种的鉴定，所述重组5号染色体例如为源自本文保藏的种子的重组5号染色体，其任选地包含保藏种子中存在的基因渗入片段的亚片段。
另一个实施方案为SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、SNP_05 或SNP_06中的一种或多种或全部用于将ToLCNDV抗性基因渗入至 ToLCNDV易感甜瓜植物、尤其是栽培甜瓜株系或品种中的用途。
而且，本发明的一个实施方案为SNP_01、SNP_02、SNP_03、 SNP_04、SNP_05或SNP_06中的一种或多种或全部在育种ToLCNDV 抗性甜瓜植物中的用途。
还提供了筛选植物或植物材料或源自其的DNA中存在的赋予 TolCNDV抗性的5号染色体上的片段的方法。该方法包括以下步骤：
-筛选基因组DNA中SNP_01、SNP_02、SNP_03、SNP_04、 SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部的SNP基因型；
-并任选地选择植物或植物材料，其包含SNP_01、SNP_02、 SNP_03、SNP_04、SNP_05和SNP_06中的一种或多种或全部的抗性供体基因型。
还提供了产生栽培的甜瓜植物的方法，所述栽培的甜瓜植物在5 号染色体上包含基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV QTL；所述方法包括：
-使对ToLCNDV易感的第一栽培甜瓜植物与对ToLCNDV具有抗性的第二野生甜瓜植物杂交，其中所述第二甜瓜植物包含SEQ ID NO:1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ IDNO:2中的SNP_02 的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO:3中的SNP_03的TT或TC 基因型和/或SEQ ID NO:4中的SNP_04的AA或AG基因型，和/或 SEQ ID NO:5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6 中SNP_06的AA或AG基因型；
-收集来自所述杂交的F1种子，并将F1植物回交至第一甜瓜植物以产生回交(BC1)种群，或自交所述F1植物一次或多次以产生 F2或F3种群，并且任选地自交回交种群以产生BC1S1种群，
-其中所述F2、F3、BC1或BC1S1植物包含SEQ ID NO:1中 SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:2中SNP_02的TT 或TG基因型，和/或SEQ ID NO:3中SNP_03的TT或TC基因型和 /或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6中SNP_06的 AA或AG基因型。
还提供了鉴定或检测在5号染色体上包含基因渗入片段的栽培的甜瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性等位基因，所述方法包括：
-使用分子标记测定法筛选甜瓜植物，所述分子标记测定法检测选自以下的SNP标记物中的至少一种：SEQ ID NO:1中的SNP_01、SEQ ID NO:2中的SNP_02、SEQ ID NO:3中的SNP_03、SEQ ID NO: 4中的SNP_04、SEQ ID NO:5中的SNP_05和/或SEQ ID NO:6中的 SNP_06；和
-鉴定和/或选择包含以下基因型的植物：SEQ ID NO:1中 SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:2中SNP_02的TT 或TG基因型，和/或SEQ ID NO:3中的SNP_03的TT或TC基因型，和/或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6中的SNP_06 的AA或AG基因型。
提供了产生包含ToLCNDV抗性表型的甜瓜F1杂种植物的方法，其包括：
-使包含至少一条重组5号染色体的第一近交甜瓜植物与具有或没有所述至少一条重组5号染色体的第二近交甜瓜植物杂交，所述重组5号染色体包含当以纯合或杂合形式存在时赋予第一近交甜瓜植物 ToLCNDV抗性的基因渗入片段，并且其中所述基因渗入片段来自甜瓜物种的野生植物，和
-收集来自所述杂交的F1杂种种子。
进一步涵盖产生5号染色体上包含ToLCNDV抗性的甜瓜植物的方法，所述方法包括：
a)使用分子标记测定法筛选野生甜瓜种质或几种野生甜瓜种质，所述分子标记测定法检测选自以下的SNP标记物中的至少一种：SEQ ID NO:1中的SNP_01、SEQ ID NO:2中的SNP_02、SEQ ID NO:3 中的SNP_03、SEQ ID NO:4中的SNP_04、SEQ ID NO:5中的SNP_05 和/或SEQ ID NO:6中的SNP_06；
b)鉴定和/或选择包含以下基因型的野生甜瓜植物：SEQ ID NO:1 中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:2中SNP_02的 TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO:3中SNP_03的TT或TC基因型和/或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO:5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6中SNP_06 的AA或AG基因型；
c)任选地在抗性测定中确认ToLCNDV抗性；
d)并任选地将所述ToLCNDV抗性从所述野生种质渐渗到栽培的甜瓜植物中。
提供包含重组5号染色体的甜瓜植物或其部分，所述重组5号染色体包含基因渗入片段，所述基因渗入片段当以纯合或杂合形式存在时赋予甜瓜植物ToLCNDV抗性，并且其中所述基因渗入片段包含以下单核苷酸多态性(SNP)标记物中的一种或多种或全部：
SEQ ID NO:1中SNP_01的CC或CT基因型，SEQ ID NO:2中SNP_02的TT或TG基因型，SEQ ID NO:3中SNP_03的TT或TC 基因型，SEQ ID NO:4中的SNP_04的AA或AG基因型，SEQ IDNO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO:6中SNP_06的 AA或AG基因型；
其中所述基因渗入片段来自甜瓜物种的野生植物，所述野生植物的平均ToLCNDV病害评分为至少7.0，以1＝死亡植物至9＝无症状的等级。
在一个方面，栽培的甜瓜植物至少包含SEQ ID NO:3中SNP_03 的TT或TC基因型和/或SEQ ID NO:4中SNP_04的AA或AG基因型。
在一个方面，ToLCNDV抗性QTL或包含QTL的基因渗入片段可获自/获自/存在于种子或其后代中，所述种子的代表性样品已以保藏号NCIMB42585保藏(其中后代保留了ToLCNDV抗性)。
种子保藏信息
包含基因渗入片段的栽培甜瓜的种子的代表性样品(命名为甜瓜 TOLCHR5)，所述基因渗入片段包含在5号染色体上基因渗入的TolCNDV抗性(回交4代、自交4代、BC4S4)，由Nunhems BV于 2016年6月6日根据布达佩斯条约在NCIMB Ltd.(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn Aberdeen,Scotland AB21 9YA,UK)，在 Expert Solution(EPC 2000，规则32(1))下保藏。给予种子以下保藏号NCIMB 42585。
如果申请被驳回、被撤回或被视为撤回，则申请人要求生物材料样品和由此衍生的任何材料仅根据EPC规则32(1)或具有类似规则和条例的国家或条约的相关立法发布给指定专家，直至提及专利授权或自申请之日起20年。
在本申请未决期间，可以根据请求向美国专利局局长确定的人员有权获得保藏。受制于37C.F.R.§1.808(b)，保藏人对于向公众提供保藏材料的所有限制将在专利授权后不可撤销地予以删除。保藏将持续 30年或最近一次请求后的5年或者专利的可执行期间，以较长者为准，并且如果在此期间变得不可存活，则其将被替换。申请人不会放弃根据该专利申请或植物品种保护法(7USC 2321及以下)授予的任何权利。
序列描述
除了G(鸟嘌呤)、A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶) 以外的字符在序列表中所示的SEQ ID NO中具有以下含义：
R: G或A
Y: T或C
M: A或C
K: G或T
S: G或C
W: A或T
H: A或C或T
B: G或T或C
V: G或C或A
D: G或A或T
N: G或A或T或C
在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中，抗性供体的SNP核苷酸以粗体和下划线来显示。
SEQ ID NO 1:包含SNP_01的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO:1:
Figure GDA0003553617240000421
SEQ ID NO 2:包含SNP_02的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO:2
Figure GDA0003553617240000422
SEQ ID NO 3:包含SNP_03的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO 3
Figure GDA0003553617240000423
Figure GDA0003553617240000431
SEQ ID NO 4:包含SNP_04的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO 4
Figure GDA0003553617240000432
SEQ ID NO 5:包含SNP_05的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO:5
Figure GDA0003553617240000433
Figure GDA0003553617240000441
SEQ ID NO 6:包含SNP_06的ToLCNDV抗性供体植物的序列。
SEQ ID NO:6
Figure GDA0003553617240000442
SEQ ID NO 7:用于SNP_01的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 8:用于SNP_01的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 9:用于SNP_01的KASP-测试通用引物。
SEQ ID NO 10:用于SNP_02的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 11:用于SNP_02的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 12:用于SNP_02的KASP-测试通用引物。
SEQ ID NO 13:用于SNP_03的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 14:用于SNP_03的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 15:用于SNP_03的KASP-测试通用引物。
SEQ ID NO 16:用于SNP_04的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 17:用于SNP_04的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 18:用于SNP_04的KASP-测试通用引物。
SEQ ID NO 19:用于SNP_05的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 20:用于SNP_05的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 21:用于SNP_05的KASP-测试通用引物。
SEQ ID NO 22:用于SNP_06的等位基因FAM的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 23:用于SNP_06的等位基因VIC的KASP-测试引物。
SEQ ID NO 24:用于SNP_06的KASP-测试通用引物。
附图说明
图1：示出ToLCNDV敏感型轮回植物(上图)和通过基因渗入包含供体的SNP_01和SNP_06之间的序列的片段整合了ToLCNDV 抗性的轮回植物(下图)。通过粉虱传播ToLCNDV感染后25天(dpi)，拍摄照片。
图2：示出ToLCNDV抗性的供体植物(野生供体)、轮回植物 (轮回)以及将ToLCNDV抗性从供体植物基因渗入至轮回植物之后获得的植物(基因渗入)通过粉虱传播ToLCNDV感染后35天(dpi) 的症状水平。如本文在“一般方法”中所述，测定症状水平。
一般方法
1.ToLCNDV感染的植物上症状水平的测定
1.1植物和病原体(病毒)
使用感染ToLCNDV菌株的甜瓜植物来感染甜瓜植物。在本发明中，将在Murcia,Spain中分离的ToLCNDV用作接种物。
1.2 ToLCNDV繁殖
ToLCNDV接种物源维持在活的受感染的甜瓜植物上。必须确保使用纯病毒分离物，并且病毒来源和粉虱都不会被其他疾病污染，特别是其他病毒(例如CGMMV、CYSDV、CYVYSqMV)。对于ToLCNDV接种物的预增殖，在昆虫检验笼中烟粉虱(Bemisia tabaci) 以ToLCNDV敏感型(易感)、受感染的甜瓜植物为食。在感染试验植物之前，将ToLCNDV感染的植物放入昆虫检验笼中，将粉虱释放到同一笼中，并使粉虱以ToLCNDV感染的植物为食约3天。
1.3接种待测植物
对于待分析的甜瓜植物的每种基因型，培育14株植物直至第一片真叶伸展开(通常在播种后12-15天)，其中12株被感染，2株被假感染。在该实验中还包括12株易感品种的植物，品种Gandalf F1(Hild Samen)和品种Vedantrais。将待测ToLCNDV抗性的每种基因型的 12株植物放入防虫笼中，将如上1.2所述获得的感染粉虱释放到笼中以感染植物。必须确保笼中的每株试验植物可获得至少5-10只粉虱。将粉虱和试验植物保持在笼中约48小时，然后用合适的杀虫剂消灭粉虱。每种基因型的两株植物也被假感染，即将它们以与试验植物相同的方式进行处理，除了用于感染的粉虱不含ToLCNDV。
1.4种植受感染的试验植物
将如1.3所述获得的感染的试验植物移植到较大的盆中，转移到具有冷却设备的温室中。植物在约18℃的夜间温度和约25℃的日间温度下在14至16小时日光的时间范围内生长。每种感染基因型的受感染植物在两个不同的样地中种植两次，每个样地包含6株ToLCNDV感染的植物和1株假感染的植物。这些样地关于种植区域是随机化的。
1.5.评分ToLCNDV感染的症状水平
症状水平的评分可在ToLCNDV感染后约15天(dpi)已经进行，但优选在ToLCNDV感染后约30天(dpi)或更晚进行。如果存在从病毒感染中恢复的植物，则在ToLCNDV感染后约45天(dpi)进行症状的进一步评分。
根据以下所示的表型使用以下症状水平：
Figure GDA0003553617240000461
Figure GDA0003553617240000471
1.6任选的额外测试
建议在每个实验配置中使用至少一种对ToLCNDV具有高度抗性的基因型(症状水平8-9)和一种对ToLCNDV高度敏感的基因型(症状水平1)。进一步建议在每个测试配置中还包括对ToLCNDV感染具有中等抗性的基因型。当包括刚刚提到的基因型并且相对于高抗性、高度敏感和中等抗性基因型获得的结果对每种基因型的症状水平进行评分时，获得最佳结果。这些基因型也清楚地表明通过粉虱用 ToLCNDV对甜瓜植物的感染量。
此外，建议检查受感染植物和对照植物中ToLCNDV的感染和传播。这可以通过检查植物上部的病毒DNA的存在和量来完成。检查上部植物部分中ToLCNDV DNA的存在和量的合适方法是将植物材料与用ToLCNDV菌株的DNA杂交的探针杂交。各种杂交技术在本领域中是公知的。简单的所谓Dot Blot分析足以获得有价值的结果。同样可以使用PCR或定量PCR技术。
实施例
1.ToLCNDV抗性供体植物的选择
对于ToLCNDV抗性，根据“一般方法”中描述的测试，测定甜瓜植物的野生种质的症状水平。鉴定出对ToLCNDV感染具有高抗性的野生供体植物，其具有约7的抗性水平(进一步参见下文中，平均病害评分为7.4，而易感植物的平均评分为2.0)。
2.ToLCNDV抗性的基因组位置的鉴定
研发了三种定位(mapping)种群，包括使用实施例1中获得的供体植物，来定位供体甜瓜植物基因组中赋予ToLCNDV抗性的片段(QTL) 的位置。
在这些定位种群中的分析揭示了与抗性相关的一个主要QTL，其位于5号染色体上并显示出显性遗传模式。
检测到的片段QTL的大小和观察到的遗传模式表明单基因座显性基因。从抗性材料，发明人研发了BC(回交)株系以精细定位并进一步研究来自供体的抗性。通过表型选择开发的10种晚期(advanced) BC家族的基因型结果显示与个体表型具有>93％一致性。
根据Diaz等人(2015,Mol Breeding 35,188)的公知数据，在精细定位期间鉴定的标记物及其各自的位置如下表所示：
Figure GDA0003553617240000481
3.研发KASP测试法
研发了KASP测试法用于鉴定QTL侧翼的SNP。与QTL相关的 SNP可通过在KASP测试法中使用以下引物来确定：
Figure GDA0003553617240000482
4.将ToLCNDV基因渗入栽培的甜瓜植物中
已用栽培的甜瓜植物进行了回交，并且已获得对ToLCNDV具有增加的抗性的轮回甜瓜植物。通过使用实施例3中所示的KASP测试序列建立这些株系中QTL的存在。在下表和图2中给出了在这些植物中实现的ToLCNDV症状水平的代表性结果。根据本文在“一般方法”下描述的方法测定感染后35天(dpi)的症状水平。
AVG STDV
野生供体 7.40 2.07
轮回 2.00 0.00
基因渗入 5.11 1.45
AVG：所测基因型的平均值，STDV：标准偏差
进行额外的回交以将抗性渐渗到优良的Piel de Sapo、Galia、 Cantaloup和Charentais背景中。通过表型选择研发的10种晚期BC 家族中的基因型结果显示与个体表型具有>93％的一致性。
序列表
<110> 纽海姆有限公司
<120> ToLCNDV抗性甜瓜植物
<130> BCS 16-8025 PCT
<150> EP16179134.8
<151> 2016-07-12
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 1
agctggtgca aagctggcat tcaaatcgaa tgaagaaata gcagtacaag tgaagtcaat 60
tccactagat gaagtaatcc cggattcaga acgagtgctt ctaataaaaa tcgatgttca 120
aggctgggaa tatcatgtgc taaaaggggc aaagagaatt ttgtcaagga agggcactga 180
agctccatat ctcatctatg 200
<210> 2
<211> 1145
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 2
ttgtaatcat ggccattgcc tgatytgcag aatgtggcgt cttgattggg cacggtctgg 60
atgaagttac tccaaagctt gtggaagtta atgggttctt ctcttcaccr tctgrtctcc 120
ttcccatcga caatgtggtt tcttcttcaa acacaaaaga aacccctgtt gaagctgtag 180
aagaaagctg tgagttcttt tctccactca gttctaggtt tagtttttta tttgtttttt 240
ttttcttttt tcctttttac ttgctttgag ctgtaggaca caacacaaaa tgataagaac 300
aaaaatcaat ctatgttatt gttgtcattg tctcgcctgc ctcttcaagg taactaggct 360
ataacactga tccaaaatgt ataatcttta ttgctaagta acttatattg caaagattgg 420
gatggaatag gagcataggt tgcatctaat agttttgtcc aactttggtt atagtttcag 480
ccagtttgtt cagatgaaat tcttagtgat tatcactaat ggaattgttt ttataaatgt 540
tgtaggtgtt gaaagaagtg aagaatatga aaaggaaagc aggggaaccg agaaggctga 600
aatcttaccg acaaaagcaa catctgaagc aggttctgaa gtccaacctg tttccagtga 660
ttctgctcag atggtaccca atatgttgga gctcggtgat gcttataagc tagctgtagg 720
tgctagagga ggaagacaat tgtctggcaa gcttttggaa caatggatyg ggaaggaatc 780
ttcaaaagtt agtgaagatc tgaagcttct cttgacacaa ctctcattta atcgtttgaa 840
tgaccaatca cgggagatga gtccaaggct gtccgtaaat ggagacgagg tgaggaactt 900
tgattacttg agygctgttg ggatgcaaat gctacaaaaa aggwtttcgc ttgaaagaaa 960
tgagtccggt gtagaatctt tagatggaag cataattagt gaaatcgatg gggaaaacat 1020
ggctgatagg ttgaaacgac agattgagta tgataagaag gttmtgartt ctttatacaa 1080
ggaattggag gaagaaagaa atgcatccgc aattgctgca aatcaggcaa tggccatgat 1140
tacaa 1145
<210> 3
<211> 168
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 3
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<212> DNA
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<400> 4
ggagkcttca tccgtcttta ccttcctcac ttttttacct aaccaagtta cgtcttgtag 60
gttgcaagat aacaaatttg gatttcttag aaacaattgt ttatgttgcc ccttcrttga 120
aagagttgga cttgtccgaa aacaactttt gtagamtacc ctcrtgtatt attaatttta 180
aatccctgaa atatctttat acaatggatt gtgagttgct ygaagaaatt tcaaaggttc 240
cagaaggtgt aatttgtacg agtgccgcag gatgcaaatc attggctaga tttcccgaca 300
acttagctga tttcatatct tgtggtaatt ctgcggtgcg taccatatct ctttctcatg 360
acttcaccat tatctctagc tcatgtatat ttaatttcat tcatataata tatattactt 420
ataactattt actgatctca tggtgcagga atgttgtaaa ggtggatg 468
<210> 5
<211> 1047
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 5
tgcaggtagt caaaccaatt gataatattt gctcaccatc aaaattggta accatagaca 60
tagaytgacc aagcccaggc aaaacggcat catctttttg ttttctatca ttactattct 120
gattacccaa aagaaatctt ctttttgtac ttggagagaa ataatccccg tctgcacatt 180
gcatggaagg tgtgctgtca tgagcatcag cattacacac accagaatta gatttcttgc 240
tagccaagat ttcacaacca ccaagagaag caggacctac gcctggggtc tctgcctyag 300
aaagccaags atcaaagcac acttgtgaag gacctgaaac tgtctcagat ccagggattt 360
ctcctacatt gggtaagcta gcctgttcaa agccatcaca cacatctaca agcggcagtc 420
taccatacat ggaactatta gaataagcag gcttattttc ataaaacaca ttaacgcttg 480
catttggatt agttaaacat ggcatcaaat gggaagaatc ccgaaatctc aagctgttct 540
cattggaccg cagcactcca gaattcaagt ctcttgacca tacttttttt tgcctgctat 600
caacagtaaa attttgagct ttaccatatc cacagtcaag tggctcattt cgagagttac 660
gcttcctcct cattaaatca cktacagaac ggccttccct ggagttatgt gtgcctgtac 720
ctgcatttcg taatgtaaca tccacctgcc ctccatcttc acttgaaaag caactaatga 780
actcagaatc tttggtcgaa cttgtccata tgtcaggcct gcaagaattg acacacgtcg 840
aatctgtatt cactttctca gcctcatgaa aaggtaaaga tccccaaaat gatttctctt 900
tcttgtgact gcaagaacct gaatcaatgc catgcaataa tattgcaagt ttggaagatc 960
tttcattctc aacattaaga tctctatcag gtgagttttc agtcgaccct ccagaagaag 1020
agaacatatc atctgcakgt acgcagt 1047
<210> 6
<211> 1118
<212> DNA
<213> 甜瓜(Cucumis melo)
<400> 6
gcgtacmtgc aggcaaagaa tggcacagta cagtaatggt agctcatctg ttcatcaagg 60
agaatcaagc tgcctcagcc attcagtatc ggttccaccc ctgatcatct cctacaatga 120
tcgcattcgt cctctccttg atgctgttga caagcttcgt cacctcatga tcatgagaga 180
aggcatccaa ctgcctacca tagttgttgt tggtgatcag tcawccggta agtcaagtgt 240
cctcgagtcg ttggctggga tcagcctacc tcgaggtcag ggcatctgca ccagggtccc 300
tctgataatg aggctccaaa accatcctga tcccgaaccc gagcttgttt tggagtacaa 360
tgggaaaaag atccacaccg acgaatcctt cattgctgaa gacatctgta cagctacaga 420
ggagattgct ggcagtggca aaggaatatc gaaagcgcca ttgactttga ttgtgaagaa 480
aaatggtgtt cctgatctta caatggttga tctccctgga attacragag tgcctgttaa 540
agatcagcct gaagacattt atgaccaaat aaaagatata atcatggaac atatcaagcc 600
agaagagagc atcatcttga atgtcttgtc tgcgacggtt gattttccaa cttgtgaatc 660
gatacggatg tctcaaagtg tcgacaagac gggaatgaga acgttggcag ttgtgactaa 720
gtctgacaag gcaccagaag gcctacacga gaaggtcacc rcggatgatg tcagtatcgg 780
ccttggttat gtttgcgtta ggaaccgaat tggcaatgag acatatgagg aagctcgggt 840
tgcagaagcc aaattgtttt caactcatcc tcttctctcc aaaattgaca aatctgttgt 900
gggcattcca gtcttggctc agaagttggt gcaaattcaa gcaggtaccc aaactaattc 960
ctgactcaaa agctaggttc cgttagataa ccattttgtt ttagaaaatc aagtttattt 1020
tctctaaatm gtgtaccatg attttcatct ttcttaaata aaaaagttgm attcttwact 1080
aaattttaaa agcaaaaaca agttttaata cttttttt 1118
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tccggattca gaacgagtgc ttc 43
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tcccggattc agaacgagtg cttt 44
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgatattcc cagccttgaa catcgattt 29
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tcggactcat ttctttcaag cgaac 45
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tccggactca tttctttcaa gcgaaa 46
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ygctgttggg atgcaaatgc tacaaaa 27
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tgatctggaa cctctggacc atg 43
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tatgatctgg aacctctgga ccata 45
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccagcgatga aacaactcct ttgcat 26
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtgacc aagttcatgc taaattacac cttctggaac ctttgaaatt 50
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtcgga gtcaacggat tacaccttct ggaacctttg aaatc 45
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctttatacaa tggattgtga gttgctygaa 30
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tggctgagaa agtgaataca gattcg 46
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat taggctgaga aagtgaatac agattca 47
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtccatatgt caggcctgca agaat 25
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggtgacc aagttcatgc tatcaaagtc aatggcgctt tcgatatt 48
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaaggtcgga gtcaacggat tcaaagtcaa tggcgctttc gatatc 46
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaggagattg ctggcagtgg caa 23

Claims (10)

1.一种用于产生ToLCNDV抗性甜瓜植物的方法，其包括以下步骤：
a)选择ToLCNDV抗性供体植物，
b)将步骤a)中选择的供体植物与对ToLCNDV敏感的植物杂交，
c)从步骤b)中杂交的植物中获得种子，并
d)鉴定从步骤c)中获得的种子生长的植物是否对ToLCNDV具有抗性和包含来自供体植物的一种或多种选自SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06的SNP核苷酸；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤。
2.一种产生甜瓜种子的方法，其包括以下步骤：
a)种植包含至少一条5号染色体的甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03与SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04之间的序列，其中SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，
b)采收步骤a)中培育的甜瓜植物的果实，并任选地
c)从步骤b)中获得的果实中收集种子。
3.一种产生杂种甜瓜种子的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含至少一条5号染色体的第一近交甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03和SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04之间的序列，其中SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，
b)提供含或不含5号染色体的第二近交甜瓜植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03和SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04之间的序列，其中SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，
c)将步骤a)中提供的植物与步骤b)中提供的植物杂交，并任选地
d)选择从步骤c)的杂交获得的种子。
4.一种产生甜瓜果实的方法，其包括以下步骤：
a)种植包含至少一条5号染色体的植物，所述5号染色体具有来自ToLCNDV抗性供体植物的5号染色体的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含供体植物的SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03和SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04之间的序列，其中SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，
b)采收步骤a)中种植的植物产生的果实。
5. SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQ ID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06用于鉴定ToLCNDV抗性甜瓜植物的用途；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤。
6.SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQ ID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06用于将ToLCNDV抗性基因渗入到ToLCNDV易感甜瓜植物中的用途；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤。
7.SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQ ID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06用于育种ToLCNDV抗性甜瓜植物的用途；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤。
8.用于鉴定或检测5号染色体上包含基因渗入片段的栽培甜瓜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含ToLCNDV抗性等位基因，所述方法包括：
-使用分子标记测定法来筛选甜瓜植物，所述分子标记测定法检测选自以下的SNP标记物中的至少一种：SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤；和
-鉴定和/或选择包含以下基因型的植物：SEQ ID NO: 1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 2中SNP_02的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO: 3中的SNP_03的TT或TC基因型，和/或SEQ ID NO: 4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 6中的SNP_06的AA或AG基因型。
9.用于产生5号染色体上包含ToLCNDV抗性的甜瓜植物的方法，所述方法包括：
a)使用分子标记测定法筛选野生甜瓜种质或几种野生甜瓜种质，所述分子标记测定法检测选自以下的SNP标记物中的至少一种：SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ IDNO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQ ID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06，其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤；
b)鉴定和/或选择包含以下基因型的野生甜瓜植物：SEQ ID NO: 1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 2中SNP_02的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO: 3中的SNP_03的TT或TC基因型，和/或SEQ ID NO: 4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 6中的SNP_06的AA或AG基因型，
c)任选地在抗性测定中确认ToLCNDV抗性。
10.筛选甜瓜植物或植物材料或源自其的DNA中存在的赋予TolCNDV抗性的5号染色体上的片段的方法，所述方法包括以下步骤：
-筛选基因组DNA中SEQ ID NO:1的核苷酸101处的SNP_01、SEQ ID NO:2的核苷酸945处的SNP_02、SEQ ID NO:3的核苷酸68处的SNP_03、SEQ ID NO:4的核苷酸227处的SNP_04、SEQID NO:5的核苷酸839处的SNP_05和/或SEQ ID NO:6的核苷酸445处的SNP_06中的一种或多种或全部的SNP基因型；其中SNP_01为胞嘧啶，SNP_02为胸腺嘧啶，SNP_03为胸腺嘧啶，SNP_04为腺嘌呤，SNP_05为胞嘧啶，SNP_06为腺嘌呤；
-任选地，选择包含以下基因型的甜瓜植物或植物材料：SEQ ID NO: 1中SNP_01的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 2中SNP_02的TT或TG基因型，和/或SEQ ID NO: 3中的SNP_03的TT或TC基因型，和/或SEQ ID NO: 4中SNP_04的AA或AG基因型，和/或SEQ ID NO: 5中SNP_05的CC或CT基因型，和/或SEQ ID NO: 6中的SNP_06的AA或AG基因型。
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