CN101351116A

CN101351116A - 抗病黄瓜属植物

Info

Publication number: CN101351116A
Application number: CNA2006800502355A
Authority: CN
Inventors: 勒内·约翰内斯·马里亚·霍夫斯泰德; 沃特·彼得·约翰内斯·德·鲁伊特
Original assignee: Ruiter Seeds R & D De BV
Current assignee: Ruiter Seeds R. & D. B. V. De
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2026-11-06
Also published as: NO20082558L; CA2628423C; IL191146A; WO2007053015A2; RU2418405C2; CA2628423A1; JP2009514523A; CN101351116B; MA29982B1; KR20080077140A; WO2007053015A3; EP1956887A2; EP1782685A1; JP5694644B2; US8895812B2; IL191146A0; RU2008122333A; US20080307540A1; KR101388281B1

Abstract

本发明涉及一种抗黄瓜线形病毒和抗黄瓜白粉菌的植物，其中所述植物是黄瓜属物种的植物，所述植物在单染色体上包含至少一个赋予线形病毒抗性的染色体区以及至少一个赋予白粉菌抗性的染色体区，其中所述至少一个赋予线形病毒抗性的区连接于至少一个标记物，该标记物选自由标记物E16/M50－244、E16/M50－188、以及E11/M48－251组成的组，以及其中所述至少一个赋予白粉菌抗性的区连接于至少一个标记物，该标记物选自由在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T^G、在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G^A、在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C^T、在SEQ ID NO：4中的第221位置的插入突变 5′－AATTT－3′、以及标记物E16/M50－F－194、E11/M48－F－251、E23/M38－M001、E23/M40－M003、E24/M46－M002、E24/M46－M003、E12/M91－M003、E26/M43－M003、E14/M59－F－134以及E14/M59－F－200组成的组。

Description

抗病黄瓜属植物

技术领域

本发明属于抗病植物和植物育种领域，更具体地涉及抗白粉菌和线形病毒的黄瓜属(黄瓜)植物的培育。

背景技术

大批生产的黄瓜(黄瓜属，Cucumis satiυus))产品可能遭受各种各样的疾病。黄化病毒可引起一种这样的疾病并且可以引起黄瓜生产的显著经济损失。线形病毒的家族(长线形病毒科)，其形成影响黄瓜的黄化病毒的最高分类群，包括30种以上的之字形和线形的昆虫传播的植物病毒。该家族包括三个属，其中粉虱传播的Criniυirus属包括与黄瓜的密切相关的物种。该属尤其包括物种南瓜黄矮化失调病毒(CYSDV)、莴苣传染性枯黄病毒(LIYV)以及甜菜伪黄化病毒(BPYV)。CYSDV和BPYV形成对黄瓜培育者的最大威胁。

这些病毒通常存在于昆虫媒介中并通过昆虫在植物上的摄食活动加以传播。因此，借助于施加杀虫剂可以控制黄瓜线形病毒。然而，优选地，在农业和园艺学中线形病毒的控制是通过提供寄主植物的抗病毒培养变种来实现。目前，在抗黄瓜变种的基因组中的至少两个数量的性状基因座或QTL被识别为与黄瓜中的线形病毒抗性有关(参看WO 02/22836)。因此通过检测连接于这些QTL的特定标记物就可以监测与线形病毒抗性有关的遗传物质适当基因渗入后代植物系中。因此，QTL的知识可以有助于培育抗线形病毒的培养变种。

影响大批量黄瓜生产的另一种重要疾病是黄瓜白粉病(PM)。瓜菜中的PM可以由真菌瓜类白粉病菌(S.fuliginea)和烟草白粉病菌(E.cichoracearum)引起。该疾病是广为流传的并且可以整年发生。症状开始为在受感染叶表面上的细白真菌线的小斑点，这些斑点可以向外生长并最终用白色、粉状聚集的孢子和菌丝覆盖茎和叶。严重感染导致叶的变色和凋落，同时伴随果实数目和尺寸的减少。虽然许多杀真菌剂可有效抵抗白粉菌，但真菌对于化学制剂的抗性正在形成。

各种黄瓜变种对于白粉菌呈现一定水平的抗性。这样的品系包括例如印度野生黄瓜登记号(accession)PI 197088、登记号PI200815、PI 200818、以及培养变种Natsufushinari和Asomidori(Morishita等，2003)。此外，与相对于PM的抗性有关的各种基因是已知的(Fanourakis，1984；Fujieda和Akiya，1962；Kooistra，1968，1971；Shanmugasundarum等，1971，1972)，其包括在Natsufushinari中的pm-1和pm-2、在PI 200815和PI 200818中的pm-3以及栽培种(cultigen)Wis.SMR 18中的“pm-h(”(基因“pm-h”不使下文的pm-h指示的pm基因座受到损害)。虽然几种大批量黄瓜变种可获得对PM的部分耐受性，但大多数批量培育者仍然依靠使用叶的杀真菌剂。这部分地是由于以下事实：难以将PM抗性引入呈现其它类型抗性的品系。例如，培育者已想到以下缺点：获得PM抗性等位基因的品系变得对线形病毒敏感并且反过来也是一样，而先前它们不是如此。事实上，杂交实验迄今还没有产生对PM和线形病毒均呈现抗性的黄瓜品系。迄今还没有获得这种有益的双抗性重组体。这是意想不到的，因为一般说来通过相对直接的培育方法可以将不同的性状并入单基因组中。

本发明的一个目的是提供这样的黄瓜属植物，其对影响黄瓜的线形病毒家族的病毒(尤其是BPYV和CYSDV)呈现抗性，并且其另外对由真菌瓜类白粉病菌(S.fuliginea)和/或烟草白粉病菌(E.cichoracearum)引起的黄瓜白粉病呈现抗性。

发明内容

本发明的发明人现已发现许多对CYSDV和PM均呈现抗性的黄瓜属植物。此外，他们发现，这些双抗性黄瓜属植物包含与白粉菌抗性有关的两种数量性状基因座(QTL)(如本文描述的pm-l和pm-h)以及一种主要的与线形病毒抗性有关的QTL(如本文描述的QTL-1)。更重要地，他们发现，所有QTL都位于单基因连锁群中。因此，本发明的发明人基本上发现，在这些植物中，用于抗线形病毒和白粉菌的基因存在于单染色体上。这样的植物可非常有利地用于植物育种。此外，本发明的发明人发现，为何先前通过杂交实验不能获得双抗性黄瓜属植物的可能机制。不希望受到理论的限制，认为对一种疾病的抗性来说必不可少的遗传成份的基因渗入导致丧失对其它疾病的抗性来说必不可少的遗传成份。通过这个发现，本发明的发明人已开发了培育方案，借助于这些方案可以解决这种问题，从而获得所需要的双抗性植物。

在第一个方面，本发明提供了黄瓜属物种的植物，该植物呈现对黄瓜线形病毒的抗性以及对黄瓜白粉菌的抗性。

在本发明的这样的植物的一种优选实施方式中，负责线形病毒抗性(QTL-1)的基因组区以及负责白粉菌抗性的基因组区(pm-h和/或pm-l)存在于单染色体上。在这样的植物的一种甚至更优选的实施方式中，pm-h和pm-l均存在并且QTL-1位于pm-h和pm-l之间。

在本发明的植物的一种进一步的实施方式中，QTL-1的存在是通过至少一种旁侧标记物的存在来指示，其中旁侧标记物选自由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251组成的组，如在WO 02/22836中所详细描述的，在此上下文中特别提及它。

在本发明的植物的另一种实施方式中，称作pm-h的QTL的存在是通过核酸序列的存在来指示，其中核酸序列包含至少一个突变，该突变来自与所述植物的白粉菌抗性有关的单核苷酸多态性(SNP)，其中所述至少一种单核苷酸多态性(SNP)选自如下文表2所示的SNP1和SNP2。

在本发明的植物的另一种实施方式中，称作pm-l的QTL的存在是通过核酸序列的存在来指示，其中核酸序列包含至少一个突变，该突变来自与所述植物的白粉菌抗性有关的并在下文表3中表示为SNP 3的单核苷酸多态性(SNP)，或包含至少一个突变，该突变表示为下文表3中的5-bp插入5′-AATTT-3′并与所述植物的白粉菌抗性有关。

因此本发明优选地提供了抗黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌的植物，其中所述植物是黄瓜属物种的植物，所述植物在单染色体上包含至少一个赋予线形病毒抗性的染色体区和至少一个赋予白粉菌抗性的染色体区，其中所述至少一个赋予线形病毒抗性的区连接于至少一个标记物，该标记物选自由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251组成的组，以及其中所述至少一个赋予白粉菌抗性的区连接于至少一个标记物，该标记物选自：

-SEQ ID NO(序列识别号)1中的单核苷酸多态性标记物39T→G；

-在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A；

-在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T；

-在SEQ ID NO：4中第221位置的插入突变5′-AATTT-3′；和

-标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E 12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200组成的组。

本发明的植物可以可选地包含与线形病毒抗性有关的第二QTL(如在WO 02/22836中所描述的QTL-2，关于此QTL的定位和特性的详细情况，特别提及此文献的说明书)。该QTL显示为位于分开的染色体上。

在另一个方面，本发明提供了如上文所定义的本发明的部分黄瓜属植物。优选地，所述植物部分选自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、根状茎、种子、原生质体以及愈伤组织(calli)，并且最优选为种子。

在另一个方面，本发明提供了通过杂交如上所述的本发明的双(线形病毒加上PM抗性[包括PM-leaf(pm-l)和PM-hypo(pm-h)抗性表型])抗性黄瓜属植物和第二黄瓜属植物或其它植物变种、优选包含商业上所期望的特性的黄瓜品系的植物而获得的F1种子。优选地，所述第二黄瓜属植物至少包含作为隐性基因的pm-h。所述第二黄瓜属植物那么至少是杂合的，优选地对于隐性pm-h性状为纯合的。在另一种优选实施方式中，所述第二黄瓜属植物对线形病毒敏感并且更优选为近交植物。

在另一个方面，本发明提供了通过培育如上文所定义的本发明的F1种子而获得的杂交植物。

在另一个方面，本发明提供了如上文所定义的本发明的杂交植物的一部分。优选地所述植物部分选自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、根状茎、种子、原生质体以及愈伤组织，并且最优选为果实。

如上所述，通过各自仅抗一种病的植物的杂交，对于抗性PM或线形病毒必不可少的遗传成份的基因渗入被认为导致丧失对其它疾病的抗性必需的遗传成份。通过这个发现，本发明的发明人已开发了培育方案，借助于这些方案可以解决这种问题，从而获得所需要的双抗性植物。本发明的发明人发现，为了有效地从线形病毒抗性亲本黄瓜品系的植物(其中所述抗性产生自QTL-1)和PM抗性黄瓜品系的植物(其中所述抗性产生自pm-h和pm-l)之间的杂交来产生双抗性黄瓜属植物，培育方法必须包括允许形成重组体的步骤(即，允许在一个染色体中发生同源重组事件)，接着是选择在单染色体中具有QTL-1和pm-l或QTL-1和pm-h的植物的步骤。优选地，所述选择步骤包括选择在单染色体中具有QTL-1、pm-l以及pm-h的植物。更优选地，QTL-1被渐渗到在基因组区(含有(harbouring)pm-h和pm-l)之间的基因组区中，使得有效地，用于线形病毒抗性的QTL 1被夹在用于PM抗性的两个QTL之间。

如本文所定义的并与对PM或线形病毒的抗性有关的任何QTL存在的鉴定可以通过检测连接于植物染色体上相应QTL的一种或多种基因标志、与植物染色体上相应QTL处于连锁不平衡状态的基因标志、或其组合来进行。

一种适用于在所述植物中检测所述QTL的存在和/或位置的方法包括使用表征所述QTL的AFLP标记物。优选地，选择在单染色体中具有QTL-1、pm-l和/或pm-h的植物的所述步骤包括检测至少一种AFLP标记物，该标记表征数量性状基因座QTL-1，其与在相同染色体(其含有用于pm-l的数量性状基因座(QTL))上的线形病毒抗性有关，或可替换地，与在相同染色体(其含有用于与PM抗性有关的pm-h的数量性状基因座(QTL))上的线形病毒抗性有关，优选地与在相同染色体(其含有数量性状基因座pm-h和pm-l)上的线形病毒抗性有关，在这种情况下，所述QTL-1标记物位于QTLpm-h和QTLpm-l之间的染色体区。因此，该选择方法可以涉及检测一种或多种标记物，该标记物选自由表2、表3以及表4的标记物组成的标记物组。

在另一个方面，本发明提供了一种用于选择黄瓜属物种的植物的方法，该物种呈现对黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌的抗性，所述方法包括在所述植物中检测在单染色体上QTL-1、以及至少QTLpm-l和pm-h之一的存在。

在上述方法的一种实施方式中，该方法包括以下步骤：

a)提供来自黄瓜属植物的基因组DNA样品，所述样品包含足够长度的基因组DNA片段；

b)进行纯化反应以从由QTL-1、pm-l和pm-h组成的组选择这样的片段，其包含至少第一QTL、或与其有关的分子标记物；

c)对所述选择的片段进行核酸扩增反应以从由QTL-1、pm-l和pm-h组成的组检测这样的片段，其包含至少第二QTL、或与其有关的分子标记物，以及

d)在步骤c)的反应产物中检测具有预测长度或预测核酸序列的扩增的DNA片段。

在一种优选实施方式中，所述步骤b)包括使用至少一组限定用于所述第一QTL的分子标记物的引物、或至少一种具有碱基序列的核酸探针，其中所述碱基序列基本上互补于限定所述标记物的核酸序列并且所述核酸探针在严格杂交条件下特异性地杂交限定所述标记物的核酸序列。

在另一种优选实施方式中，所述步骤c)包括使用至少一组限定用于所述第二QTL的分子标记物的引物，或至少一组引物，其在严格条件下特异性地杂交用于所述第二QTL的分子标记物的核酸序列。

在本发明的方法的另一种实施方式中，在所述植物中检测在单染色体上所述QTL存在的步骤是通过利用原位杂交技术或原位扩增技术来进行。此外，在这样的方法中适宜使用这样的探针和引物，其限定用于所述QTL的分子标记物或其在严格条件下特异性地杂交用于所述QTL的分子标记物的核酸序列。

在本发明的几个方面，分子标记物优选为SNP、插入突变标记物或AFLP标记物更优选这样的标记物，其选自由列在表2-4中的标记物以及那些来自本文中为此目的明确引用的参考文献的标记物组成的组。

在另一个方面，本发明提供了一种用于产生黄瓜属物种的植物的方法，其中所述植物呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性，所述方法包括以下步骤：

a)通过检测在所述植物的基因组中存在至少一种标记物来选择第一黄瓜属植物，该植物包含赋予对黄瓜线形病毒的抗性的染色体区，其中上述标记物连接于赋予黄瓜线形病毒抗性的QTL，其是由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251来指示；

b)通过检测在所述植物的基因组中存在至少一种标记物来选择第二黄瓜属植物，该植物包含赋予对黄瓜白粉菌的抗性的至少一个染色体区，其中上述标记物连接于赋予第一黄瓜白粉菌抗性的QTL，其是由以下标记物来指示：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，以及

标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001；

或

通过在所述植物的基因组中检测至少一种标记物的存在，该标记物连接于赋予第二黄瓜白粉菌抗性的QTL，其是由以下标记物来指示：

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中位置221处的插入突变5′-AATTT-3′，以及

标记物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134和E14/M59-F-200；

c)杂交来自步骤a)和步骤b)的所述植物以产生F1种子；

d)将一定量的F1种子培育到F1植物，通过杂交或自交从所述F1植物产生进一步的后代种群；以及

e)从所述进一步的后代植物中选择一种植物，该植物包含至少一种标记物，其连接于赋予黄瓜线形病毒抗性的-QTL(如在步骤a)中所定义的)以及至少一种标记物，其连接于赋予黄瓜白粉菌抗性的QTL(如在步骤b)中所定义的)。

技术人员应当明了，所述进一步的后代种群应具有足够的大小以可以在所述进一步的后代种群中检测这样的植物的存在，其已在单染色体中经历至少两个同源重组事件。通常，大约1,000株植物的种群将是足够的。目前建议的标记物选择技术的一个优点是，对于这样的种群大小可以容易地筛选感兴趣的基因型的存在，其在表型上可以是不可检测的。

在本方法的一种优选实施方式中，在步骤b)中的选择第二黄瓜属植物的步骤包括选择第二黄瓜属植物，该植物仅具有赋予所述第一或第二黄瓜白粉菌抗性的QTL之一，并且其中所述方法进一步包括以下步骤：

f)选择第三黄瓜属植物，其具有另一种赋予所述第一或第二黄瓜白粉菌抗性的QTL(即，在所述第二黄瓜属植物中并不存在的一种QTL)；

g)杂交在步骤e)获得的F1植物和所述第三黄瓜属植物以产生进一步的后代植物；以及

h)从后代植物中选择一种植物，其包含如在步骤a)中所定义的赋予黄瓜线形病毒抗性的QTL以及如在步骤b)中所定义的两种赋予黄瓜白粉菌抗性的QTL。

在一种优选实施方式中，选择这样的植物，其包含两种赋予白粉菌抗性的基因座pm-h和pm-l并且，其中由QTL-1表征的赋予线形病毒抗性的基因座位于两种赋予白粉菌抗性的基因座pm-h和pm-l之间。

因此，在用于产生黄瓜属物种的植物(其呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性)的方法的另一种优选实施方式中，选择黄瓜属植物(该植物包含染色体区，该染色体区赋予如在步骤b)、e)、f)或h)中所定义的对黄瓜白粉菌的抗性)的步骤包括：

-在所述植物的基因组中检测至少一种标记物的存在，该标记物连接于赋予第一黄瓜白粉菌抗性的QTL并由在SEQ ID NO：1中的SNP标记物39T→G、在SEQ ID NO：2中的SNP标记物29G→A、以及标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、和E23/M38-M001来指示；以及

-在所述植物的基因组中检测至少一种标记物的存在，该标记物连接于赋予第二黄瓜白粉菌抗性的QTL并由在SEQ ID NO：3中的SNP标记物193C→T、在SEQ ID NO：4中在位置221的插入突变5′-AATTT-3′、以及标记物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134和E14/M59-F-200来指示。

在用于产生黄瓜属物种的植物(其呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性)的方法的另一种优选实施方式中，至少步骤a)、b)、e)、f)或h)之一包括以下步骤：提供来自所述植物的基因组DNA样品并在所述基因组DNA样品中检测所述至少一种标记物。

在一种可替代的优选实施方式中，步骤e)包括在植物基因组中检测至少一种与QTL-1有关的标记物以及至少一种与pm-h或pm-l有关的标记物，优选在植物的基因组中和在单染色体上检测至少一种与QTL-1有关的标记物、至少一种与pm-h有关的标记物以及至少一种与pm-l有关的标记物，优选包括如选自列在表2、3以及4中的标记物组的标记物。

在另一种优选实施方式中，步骤e)的进行是通过本发明的用于选择如上所述的黄瓜属物种的双抗性植物的方法。

应当明了，如在步骤c)-e)中描述的方法，其中单染色体中的至少两个同源重组事件已在单交中发生，其产生双抗性F1，也可以经多代实现，使得建议的(至少两个)在单染色体中的同源重组事件，因此双抗性植物的形成，可以在F2、F3、F4、F5或任何后来的代中实现。这样的变异是在本发明的范围内，并且技术人员可以容易地获得。

在用于产生黄瓜属物种的植物(其呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性)的可替换方法中，所述方法可以包括以下步骤：

a)通过进行本发明的方法来选择黄瓜属物种的第一植物，其呈现对黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌的抗性；

b)近交所述植物以产生对于所述QTL为纯合的植物品系；

c)杂交来自步骤a)和步骤b)的所述植物以产生F1种子；

d)使所述F1种子生长成F1植物。

本发明的另一个方面涉及通过本发明的方法产生的植物、或其部分。

本发明现在便于非常快速地筛选后代植物以便选择可能呈现双抗性的植物。例如，可以在后代植物中检测那些植物，其具有至少pm-h标记物之一、至少pm-l标记物之一以及至少QTL-1标记物之一。这样的植物可能已获得所期望的基因渗入。筛选另外的标记物可以提高预测后代植物呈现双抗性的置信水平。在检测植物(对于三种QTL的每一种，其呈现至少一种标记物)以后，则可以选择该植物并用于培育方案、或用于另外的鉴定实验。

本发明的植物的一个优点，其中性状位于一个并且相同的染色体上，是它们提供改善的可能性，以当利用常规培育时，将控制两种形式的抗性的基因更容易地移动到其它(杂种)植物中，而如果性状位于分开的染色体上，通过利用常规培育技术将更难产生包含两种组合性状的杂种。

附图说明

图1-6示出若干可能的重组方案，其中来自两种分开的植物的白粉菌(pm)和线形病毒(QTL-1)抗性被结合到单种后代植物中。应当明了，表示为具有多重抗性基因座的各种亲代本身可以是杂交或自交的结果。因此，具有QTL pm-l和pm-h的植物可以通过杂交具有单QTL的植物而获得。

图7示出在单连锁群中来自黄瓜NPI的用于白粉菌抗性(pm)和来自Khira黄瓜的用于线形病毒抗性(QTL-1)的各种基因的位置。如在本文中所使用的，Pm-leaf相当于pm-1以及Pm-hypo相当于pm-h。

图8示出在SNP附近的DNA序列以及如由本文表2和3中的相应SEQ ID所指示的插入标记物。

具体实施方式

定义

如在本文中所使用的，术语“黄瓜”是指黄瓜属物种的一种植物、或其部分，包括但不限于这样的植物，其通常称为黄瓜、美洲腌食用小黄瓜、香蕉瓜、小黄瓜、腌食用小黄瓜、温室黄瓜、柠檬小黄瓜、Mandera(曼德拉黄瓜)、腌渍黄瓜、Serpent(蛇形黄瓜)、鲜食黄瓜、蛇王瓜、以及西印度腌食用小黄瓜。

如在本文中所使用的，术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织，如在植物中为完整的植物细胞，细胞凝块和组织培养物，从其可以再生植物。植物部分的实例包括但不限于：来自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、以及种子的单细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、根状茎、种子、原生质体、愈伤组织等。

如在本文中所使用的，术语“线形病毒”是指Closteriυiridae家族的病毒，包括但不限于这样的病毒，其通常被称为南瓜黄矮化失调病毒(CYSDV)、莴苣传染性枯黄病毒(LIYV)以及甜菜伪黄化病毒(BPYV；还称作黄瓜黄化斑点病毒(CCSV)、黄瓜黄化病毒、甜瓜黄化病毒或草莓灰白(pallidosis)病毒)，优选为BPYV和CYSDV，最优选为CYSDV。优选地，对于黄瓜属植物来说，术语“线形病毒”是指对黄瓜属植物特别重要的属，即Criniυiideae。

如在本文中所使用的，术语“白粉病”是指在黄瓜(黄瓜L.)中由真菌南瓜白粉病菌(还称作白粉病菌和单丝壳白粉菌)和/或由真菌二孢白粉菌(还称作Goloυinomyces cichoracearum)和/或由真菌Leυeillula taurica(还称作辣椒白粉病菌、Erysiphe taurica、Oυulariopsis cynarea、Leυeillula solanacearum)引起的真菌性疾病。

本文中所使用的术语“QTL”具有其技术领域认可的含义，是指染色体区，该染色体区包含与连续分布的(数量)表型性状的表达有关的等位基因(例如，具有基因或调节序列的形式)。术语“用于疾病抗性的QTL”是指位于特定染色体上的区域，其与至少一种为抗性编码的基因或至少一个调控区有关，即，染色体的区域，其控制与抗性有关的一种或多种基因的表达。为了称呼与抗性有关的QTL，本文中使用了更短的等效短语：“赋予抗性的基因座”。可以通过利用一种或多种分子基因组标记物来指示它们在特定黄瓜登记号的基因组中的基因位置，从而限定QTL。一种或多种标记物本身又指示特定的基因座。基因座之间的距离通常通过在相同染色体上的基因座之间的交换频率来度量。在分开较远的两个基因座之间更可能发生交换。相反地，如果两个基因座靠在一起，则(在它们之间)较少可能发生交换。通常，一厘摩(Kosambi图谱函数(cM))大约等于基因座(标记物)之间的1％重组(Lui，1997)。当可以通过多重标记物来指示QTL时，终点标记物之间的遗传距离表示QTL的大小。

本文中所使用的术语“染色体”具有其技术领域认可的含义，是指在细胞核中自复制遗传结构，其包含细胞DNA并在其核苷酸序列中含有基因的线性阵列。

如在本文中所使用的，术语“连锁群”是指位于相同染色体上的所有基因或遗传性状。在连锁群内，那些足够靠在一起的基因座将在遗传杂交中呈现连锁。因为交换的可能性随在染色体上的基因之间的物理距离的增加而增加，所以其在连锁群内的位置彼此远离的基因不可能在直接遗传试验中呈现任何可检测的连锁。术语“连锁群”最多地用来指在遗传系统中呈现连锁行为的遗传座，其中还未进行染色体定位。因此，在本文范围内，术语“连锁群”与染色体(物理实体)是同义的。

如在本文中所使用的，术语“等位基因”是指基因的任何一种或多种可替换形式，所有这些等位基因与至少一种性状或特征有关。在双倍体细胞中，给定基因的两种等位基因占据在一对同源染色体上的相应的基因座。因为本发明涉及QTL，即，可以包含一种或多种基因或调节序列的基因组区，所以在某些情况下更准确地是指“单元型(”(即，染色体节段的等位基因)而不是“等位基因”，然而，在那些情况下，术语“等位基因”应理解为包括术语“单元型”。

在本文中“基因”定义为包括DNA序列的遗传单位，其占据染色体上的特定位置并且其包含用于生物中特定特性或性状的遗传指令。

在本文中“基因座”定义为给定基因或调节序列在给定物种的染色体上占据的位置。

“同源重组”是指在相同核苷酸序列的区域中两个DNA分子或成对染色体的染色单体之间DNA片段的交换。在本文中“重组事件”应理解为是指减数分裂交换。

如在本文中所使用的，术语“分子标记物”是指一种指示剂，其用于显示核酸序列的特性差异的方法中。这样的指示剂的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)标记物、插入突变标记物、微随体标记物(SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)标记物、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记物或同工酶标记物或本文所述标记物的组合，其限定了特定的遗传和染色体位置。如在本文中所定义的，“连接于QTL的分子标记物”因此可以指SNP、插入突变以及更通常的AFLP标记物或在本领域中使用的任何其它类型的标记物。在本文列举的AFLP标记物的范围内，标记物是指旁侧有两个AFLP引物的黄瓜特异性DNA序列，这些引物包括“核心引物”E和M，其对应于限制酶EcoRI和Msel的限制位点，(Vos et al.，1995；Bai et al.2003)接着是如所指出的2或3额外的选择性碱基，各自接着是鉴定选择性核苷酸的两数字代码，借此“核心引物”被延伸(关于代码，参见表1)。E16/M50-244表示通过利用扩增引物EcoRI+CC和Msel+CAT所获得的标记物，以产生总长度为244bp的片段。片段的长度可以取决于用来检测片段的方法，并且是它的真实长度的近似，加上或减去几个碱基。在定义如本文提供的标记物时，应参考在连锁图中在染色体上该标记物相对于其它标记物的位置。因此，标记物E16/M50-244是通过其引物的序列、以及通过其作为扩增产物的长度、以及通过其相对于E14/M59-F-200和/或E23/M38-M003的位置、或如本文提供的通过其相对于其它标记物的位置(如在顺序清单中所描述的，其中顺序清单在表4的矩阵具有相应的距离，单位为cM)加以限定。然而，应当考虑到，植物之间的杂交可以导致某些标记物被丧失，所以没有某些标记物并不排除存在遗传成份，其赋予对疾病的抗性并且标记物被认为连接于其上。

表1：如通常用于AFLP分析、以及如在本文中所使用的引物延伸代码(来源：关键基因(Keygene)，瓦格宁根(Wageningen)，荷兰)

术语“黄瓜特异性DNA序列”是指多核苷酸序列，其与黄瓜属物种的基因组的序列(其显示与它的最大相似性，优选在用于QTL-1的标记物的情况下，旁侧QTL-1标记物的黄瓜登记号PI250147的DNA序列的一部分)具有大于80％的核苷酸序列同源性、优选大于85％、更优选大于90％、甚至更优选大于95％、还要更优选大于97％、最优选大于99％。

如在本文中所使用的，术语“核苷酸序列同源性”是指在两种多核苷酸之间存在同源性。当为获得最大对应加以排列时，如果在两个序列中的核苷酸序列是相同的，则多核苷酸具有“同源”序列。通常通过经比较窗比较两个序列的部分来进行两个或更多多核苷酸之间的序列比较，以鉴定和比较序列相似性的局部区域。比较窗通常是大约20至200个邻接的核苷酸。多核苷酸的“序列同源性的百分率”，如百分之50、60、70、80、90、95、98、99或100的序列同源性，可以通过经比较窗比较两个最佳排列序列来确定，其中当和参比序列(其并不包含添加或缺失)进行比较以获得两个序列的最佳排列时在比较窗中的多核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(即，缺口)。百分率是通过下述加以计算：(a)确定相同核酸碱基出现在两个序列中的位置数目以产生配对位置的数目；(b)配对位置的数目除以在比较窗中的位置总数；以及(c)将结果乘以100以产生序列同源性的百分率。用于比较的序列的最佳排列可以通过已知算法的计算机化实施或通过直观检查来进行。容易获得的序列比较和多序列对比算法分别是基本的局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul et al.，1990；Altschul et al，1997)和ClustalW程序，两者均可从互联网获得。其它适宜的程序包括但不限于GAP、BestFit、PlotSimilarity、以及在Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI，USA)(Devereuxet al，1984)中的FASTA。

如在本文中所使用的，术语“pm-h”是指在下胚轴中表达的推定的白粉菌抗性基因，优选地如通过表2的特异性SNP的存在所限定。

表2.显示与白粉菌抗性表型(本文中表示为QTL pm-h)完全关联的SNP

SNP#	指示	抗性核苷酸	易感核苷酸	核苷酸位置(SEQID NO)
SNP#	指示	抗性核苷酸	易感核苷酸	核苷酸位置(SEQID NO)	SNP1	39T＞G	G	T	39(SEQ IDNO：1)
SNP2	29G＞A	A	G	29(SEQ IDNO：2)	SNP1	39T＞G	G	T	39(SEQ IDNO：1)

如在本文中所使用的，术语“pm-l”是指推定的白粉菌抗性基因pm-leaf，优选地如通过表3的特异性突变的存在所限定。

表3.显示与白粉菌抗性表型(本文中表示为QTL pm-l)完全关联的突变

突变	指示	抗性核苷酸	易感核苷酸	核苷酸位置(SEQID NO)
突变	指示	抗性核苷酸	易感核苷酸	核苷酸位置(SEQID NO)	SNP3	193C＞T	T	C	193(SEQ IDNO：3)
插入1	221→AATTT	AATTT	_	221-225(SEQ IDNO：4)	SNP3	193C＞T	T	C	193(SEQ IDNO：3)

术语“QTL-1”是指连接于线形病毒抗性的基因组区，如由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、和/或E11/M48-251所限定的，如详细描述在WO 02/22836中，对其本说明书特别提及。

术语“后代”植物是指任何植物，其作为后代形成自一种或多种亲本植物或其后代的无性或有性生殖。例如，可以通过克隆或自交亲本植物或通过杂交两种亲本植物来获得后代植物，并且后代植物和F1或F2或更远的代自交。F1是产生自亲代的第一代后代，至少其之一首次用作性状的供体，而第二代(F2)或后来的代(F3、F4等)的后代是产生自F1、F2等的自交的样品。F1因此可以是(并且通常是)两种纯育亲代(对于性状来说，纯育是纯合的)之间的杂交所产生的杂种，而F2可以是(并且通常是)由所述F1杂种的自花传粉所产生的后代。

如在本文中所使用的，术语“杂合的”是指当不同的等位基因存在于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传条件。

如在本文中所使用的，术语“纯合的”是指当相同的等位基因存在于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传条件。

在植物育种的范围内，术语“杂种”是指这样的植物，其是遗传上不相似的亲代的后代并通过杂交不同品系或品种或物种的植物而产生，其中杂交包括但不限于两个近交品系之间的杂交。

如在本文中所使用的，术语“近交的”是指基本上纯合的个体或品系。

如在本文中所使用的，术语“基因渗入”、“渐渗的”以及“渐渗”是指人工和天然过程，借此通过杂交那些物种，一个物种、变种或培养变种的基因组区被移动进入另一个物种、变种或培养变种的基因组。该过程可以可选地通过回交到回归亲本来完成。

“基因工程”、“转化”以及“遗传修饰”在本文中均用作异名，是指将分离的和克隆的基因转移到另一生物的DNA、通常为染色体DNA或基因组中。

如在本文中所使用的，术语“种群”是指遗传上异种的植物集合，其共享共同的遗传衍生物。

如在本文中所使用的，术语“变种”或“培养变种”是指一组类似的植物，其通过结构或遗传特点和/或性能可以与相同物种内的其它变种区别开来。

术语“抗性的”和“抗性”包括对感染的部分的和完全的抗性。易感植物可以是对感染无抗性的或具有低水平抗性。该术语用来包括这样的可分开鉴定的抗性形式为“完全抗性”、“免疫性”、“中等抗性”、“部分抗性”、“过敏性”以及“耐受性”。

“完全抗性”是指在感染以后疾病完全不能发展，并且可以是疾病不能进入细胞的结果(没有初期感染)或可以是因子(agent)不能在细胞中增殖以及感染其后细胞的结果(没有阈下感染、没有扩散)。

术语“易感的”在本文中用来指对疾病没有抗性的植物，其导致植物被该疾病所感染、导致疾病症状。术语“易感的”因此相当于“无抗性的”。

在核酸的范围内，术语“杂种”是指双链核酸分子、或双链体，其是通过互补核苷酸碱基之间的氢键结合所形成。术语“杂交”或“退火(anneal)”是指这样的过程，通过该过程并借助于互补碱基之间的氢键结合，核酸序列的单链形成双螺旋节段。

术语“探针”是指单链寡核苷酸序列，其将与靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列形成氢键结合的双链体。

如在本文中所使用的，术语“引物”是指一种寡核苷酸，当置于一些条件下时，其中诱导引物延伸产物的合成，即，在有核苷酸和用于聚合作用的试剂(如DNA聚合酶)存在的情况下以及在适宜温度和pH下，其能够使扩增靶退火以使DNA聚合酶可以附着，从而用作DNA合成的起始点。(扩增)引物优选为单链，以获得最大扩增效率。优选地，引物是一种寡脱氧核苷酸。该引物必须足够长以在有用于聚合作用的试剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素，其包括引物的温度和组成(A/T和/或G/C含量)。一对双向引物包括一种正向引物和一种反向引物，如在DNA扩增(如PCR扩增)领域中所通常使用的。应当明了，如在本文中所使用的，“引物”可以指一种以上的引物，尤其是在关于要扩增的靶区的末端序列信息存在某种歧义的情况下。因此，“引物”包括引物寡核苷酸的集合，其包含表示序列中可能变异的序列，或包括核苷酸，其允许典型的碱基配对。寡核苷酸引物可以通过任何适宜的方法加以制备。用于制备特定序列的寡核苷酸的方法在本领域是已知的，并且包括，例如，克隆和限制适当的序列、以及直接化学合成。化学合成方法可以包括，例如，磷酸二酯或磷酸三酯方法、二乙基氨基磷酸酯方法以及固体载体方法(披露在例如，美国专利第4,458,066号中)。如果需要的话，可以通过可检测的结合方式，例如通过光谱、荧光、光化学的、生化的、免疫化学的、或化学的方式，来标记引物。在有适量的四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dATP、dGTP、dCTP以及dTTP，即dNTP)或类似物存在的情况下，在由适当盐、金属阳离子、以及pH缓冲系统组成的反应介质中，用聚合剂来催化寡核苷酸引物的模板相关延伸。适宜的聚合剂是已知可以催化引物相关DNA合成和模板相关DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I或其克林诺片段、T4DNA聚合酶、以及Taq DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶来催化DNA合成的反应条件在本领域是已知的。合成产物是由模板链和引物延伸链构成的双链体分子，其包含靶序列。这些产物本身又作为用于另一次复制的模板。在第二次复制中，用其互补引物来使第一循环的引物延伸链退火；合成产生“短”产物，通过引物序列或它们的补体，其结合于5′-末端和3′-末端。变性、引物退火、以及延伸的重复循环导致由引物限定的靶区的指数累积。运行足够的循环以获得所期望量的包含核酸靶区的多核苷酸。所期望的量可以变化，并且由产物多核苷酸要发挥的功能来确定。PCR方法充分地描述在手册中并且对于技术人员来说是已知的。在通过PCR进行扩增以后，靶多核苷酸的检测可以通过与探针多核苷酸的杂交，其在严格至中等严格的杂交和洗涤条件下与靶序列的多核苷酸形成稳定的杂交体。如果期望探针将基本上完全互补(即，大约99％或更大)于靶序列，则将使用严格条件。如果期望某种失配，例如，期望不同的品系，从而探针将不是完全互补的，则可以降低杂交的严格性。然而，选择这样的条件，其排除非特异性/不定结合。影响杂交、并且相对于非特异性结合进行选择的条件在本领域是已知的，并且描述在，例如，Sambrook and Russell，2001中。通常，更低的盐浓度和更高的温度会增加杂交条件的严格性。

术语“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下，多核苷酸将杂交至它的靶亚序列，通常在核酸的复杂混合物中，但基本上不杂交至其它序列。严格条件是与序列相关的并且在不同情况下将是不同的。尤其是在更高温度下，更长的序列进行杂交。对于核酸杂交的详尽的指导可参见Tijssen，1993。通常，选择的严格条件是在规定的离子强度pH下低于特定序列的热熔点(T_m)大约5-10℃。T_m是这样的温度(在规定的离子强度、pH、以及核酸浓度下)，在该温度下，在平衡时，50％的与靶互补的探针杂交于靶序列(当靶序列过量存在时，在T_m下并在平衡时，50％的探针被占据)。严格条件将是那些条件，其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度为小于大约1.0M钠离子、通常大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少大约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度则为至少大约60℃。还可以借助于加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，正信号是至少两倍背景，优选10倍背景杂交。典型的严格杂交条件经常是：50％甲酰胺、5xSSC、以及1％SDS，在42℃下温育，或5xSSC、1％SDS，在65℃下温育，以及在65℃下在0.2xSSC、以及0.1％SDS中洗涤。对于PCR，大约36℃的温度常用于低严格性扩增，虽然退火温度可以在大约32℃和48℃之间，其取决于引物长度。用于确定杂交参数的另外的指导提供在许多参考文献(例如，Ausubel，et al.1999)中。

优选实施方式的描述

产生双抗性植物

在农业和园艺学中培育方案的目的是通过改善它们的遗传组成来增强植物的性能。本质上，这种改善是通过对影响感兴趣的性能特性的基因增加最有利等位基因的频率来实现。野生植物品系提供了遗传性和表型变异的丰富资源。传统上，农业或园艺实践利用了这种变异：选择具有所期望的基因型或潜在的表型特性的野生植物品系或其后代，使它和具有另外的所期望的基因型或潜在的表型特性的品系进行杂交，以及从后代植物中选择那些植物，其呈现(增加频率的)所期望的基因型或潜在的表型特性。增长的知识和应用孟德尔式遗传定律连同分子遗传工具已在过去的百年中促进了这种选择方法。例如，基于试验所述植物是否存在数量性状基因座(QTL)，即，是否存在包含与连续分布(数量)表型性状的表达有关的等位基因的染色体区，已可以获得用于选择具有所期望的基因型或潜在的表型特性的植物的方法。通常，QTL的特点在于一种或多种标记物，其统计上与表型性状中的数量变异有关并且基本上与基因是同义的。QTL编图便于鉴定影响感兴趣的性状表达的候选基因座。在植物育种中，它便于标记物辅助选择(MAS)，即，通过在那些植物中检测QTL伴随标记物来选择具有有利等位基因的植物。

在栽培植物的培育方案中的主要问题之一是在分离的性状之间存在负遗传相关。例如，在各种疾病抗性植物品系中，在生殖能力和生产之间就存在负遗传相关性。人们理解到，DNA从一种植物品系的基因组基因渗入另一种植物品系的基因组可以干扰或影响基本的生殖性状的表达。同样，试图将赋予抗性的基因序列从一种植物渐渗进入另一种植物可以除去在受体品系中已经存在的抗性性状。

各种性状的遗传知识便于，例如，选择对与疾病抗性有关的QTL来说为纯合的品系。同常规培育方案相比，在培育计划中应用所期望性状的遗传性起点和位置的知识将增加所预测的培育结果的准确性并加快选择。例如，以下事实，即所期望性状的遗传基础遗传上连接于另一种性状，有助于在后代之间增加所述两种性状的均匀性，因为对于所期望的等位基因为纯合的亲代会将它们传到大多数后代，其将在后代中呈现为降低的分离。

如上所述，本发明的发明人发现了对线形病毒和白粉菌均具有抗性的植物。这样的植物至今还未发现。试图将DNA从线形病毒抗性品系渐渗进入已经具有白粉菌抗性的植物品系、或反过来也一样，先前已表明是不成功的。

本发明的发明人另外发现，在双抗性植物中，对于线形病毒和白粉菌具有抗性的基因是如此紧密连接，以致实际上它们好像单个单位那样被共遗传。在如此紧密连接的基因之间的这样的遗传结构(genetic configuration)有时也称作等位基因(基因)，其处于结合相(处于顺式)。在这样的情况下，一般认为，这些基因存在于单染色体上。事实上，当提及在单染色体上存在基因或QTL时，它是指它们处于结合相。

本发明的发明人发现，在双抗性植物中，对线形病毒和白粉菌具有抗性的基因是存在于连锁群4中。按照Horejsi等(2000)，黄瓜L的连锁群4还包含对霜霉病(dm)抗性具有抗性的基因。LG4可以通过下述RFLP标记物的(任何)一种或组合(如通过软件包INTMAP，Keygene，Wageningen，荷兰；图位以cM为单位并在括号中)来进一步表征：CsC032a/E1(25.9)；CsP357/H3(31.7)；CsC588/H3(34.2)；CsC477H3(35.3)；CsC694/E5(38.5)；CsP347/H3(38.5)；CsC365/E1(41)；CsC386/E1(41)；CsC230/E1(41.7)；CsP064/E1(45.5)。

明确的染色体数还未赋予黄瓜染色体，在其上定位有用于线形病毒抗性的QTL1以及用于白粉菌抗性的pm-l和pm-h。然而，染色体可以通过参照连锁群(LG 4)加以指明，其中在连锁群上定位有这些和其它基因组区。术语连锁群在本文中用来指物理遗传单位，在其上定位有赋予抗性的等位基因，并且其具有和染色体相同的等级水平。

用于线形病毒和pm抗性的基因是在单染色体上，这一发现的意义具有两个方面。

首先，对于培育目的来说非常有利的是，具有定位在单染色体上的基因，更优选甚至在较小的邻接染色体节段上，因为它们将被共同地传到后代植物。由于在负责白粉菌抗性的基因和负责线形病毒抗性的那些基因之间的物理连锁的结果，杂交的后代植物，其中本发明的双抗性植物用作亲本植物，可在后代植物中保证分离的低频率。

第二，这种知识可以有助于植物育种，因为它对两种性状为何如此难以结合到单个植物品系中提供了可能的解释。不希望受到任何理论的限制，认为，负责线形病毒抗性的QTL的特定位置和对该QTL的选择妨碍了所期望的基因渗入的形成或至少便于发生非常少的所期望的基因渗入。与白粉菌抗性有关的QTL和用于线形病毒抗性的QTL是如此靠近，以致用于第二抗性性状(例如，线形病毒)的QTL基因渗入已经具有第一抗性(例如，白粉菌)的植物品系中可导致(部分)丧失第一抗性性状。在植物品系具有用于白粉菌抗性的两种QTL(pm-l和pm-h)的情况下，用于线形病毒抗性的QTL的基因渗入仅可发生在基因组的非常小的部分，而没有“损伤”作为白粉菌抗性的基础的遗传信息。

因此，除了发现各种抗性基因位于单染色体中之外，还发现，当两种白粉菌抗性等位基因均存在于双抗性植物中时，与线形病毒抗性(QTL-1)有关的QTL是位于与PM抗性有关的两种QTL(pm-h和pm-l)之间。此发现可以至少部分地进一步解释观测到的重组进入所期望的基因型的低频率。此外，它推测这样的植物如何可以形成的至少三种可能的方案，从而为用于它们生产的若干种可重复的方法创造条件：

第一种方法包括将赋予线形病毒抗性的基因座(QTL-1，如在本文中所定义的)从感兴趣的第一品系的植物渐渗到感兴趣的第二品系的白粉菌抗性植物中，从而具有赋予两种PM抗性的基因座pm-h和pm-l。如果这导致感兴趣的第二品系的遗传背景，则该方法将涉及将QTL-1基因渗入在赋予两种PM抗性的基因座pm-h和pm-l之间的基因组区，以在具有感兴趣的第二品系的遗传背景的后代植物中形成具有构型(configuration)pm-l-QTL-1-pm-h的基因组DNA序列装配(参见图1)。基于此，可以预测，在单染色体的特定区域仅双同源重组事件(即，对于每个交换的一个事件)能够在感兴趣的第二品系的遗传背景中形成具有线形病毒和PM抗性的双抗性表型。在后代植物中适当基因渗入的建立可以通过利用QTL-1、pm-l和pm-h特异性标记物加以监测。

在第二种方法中，可以希望将抗性性状结合在不同的遗传背景中，例如，结合在感兴趣的第一品系中。这样的方法可以包括将赋予两种PM抗性的基因座pm-h和pm-l从感兴趣的第二品系的植物渐渗到感兴趣的第一品系的线形病毒抗性植物(其具有QTL-1基因座)中。在这种情况下，该方法将涉及pm-h和pm-l基因座独立地基因渗入QTL-1基因座的任何一侧，以便在具有感兴趣的第一品系的遗传背景的后代植物中形成具有构型pm-l QTL-1-pm-h的基因组DNA序列装配(参见图2)。基于此构型，可以预测，需要在单染色体的特定区域中的至少两个双同源重组事件(即，四个交换事件)以形成线形病毒和PM抗性的双抗性表型。再一次，在后代植物中适当基因渗入的建立可以通过利用QTL-1、pm-l和pm-h特异性标记物加以监测。

上述可以解释，为何从例如野生物添加(accession)到例如PM抗性的CYSDV抗性的基因渗入的商用黄瓜品系是非常稀少的事件。它还可以解释，为何从例如野生物添加到例如线形病毒抗性的两种PM抗性基因座基因渗入的商用黄瓜品系是更稀少的事件。

重组是在减数分裂期间在两个同源染色体之间的信息交换。在一种重组植物中，最初存在于染色体内特定位置上的DNA与另一种植物(即，对于父本为母性的，或反过来也是一样)交换DNA。在双重组体中，这种交换发生两次，例如，在基因/基因座的两侧。为了仅交换所需要的物质，以及在染色体中保留尽可能多的有价值的最初信息，这将通常需要发生四个交换事件(参见上述)。发现这样的双重组体的正常方式是筛选F2植物的种群。此种群必须具有足够的大小以检测稀少(低频率)双重组体。双重组的频率是单重组体的频率的积。例如，可以发现在10cM面积中的重组体具有10％的频率，并且可以发现双重组体具有10％x10％＝1％的频率(1厘摩被定义为在测交中1％的重组后代)。

回避这种低频率问题的一种方式是进行“平行重组”。基本上这是指，使两个重组事件可以分别在两种不同的植物中发生，其后通过简单杂交所述重组事件被结合到一种植物中并在获得的F2中进行选择。这导致减少要筛选的植物数目。

因此，用于产生双抗性植物的第三种方法包括将赋予两种PM抗性的基因座pm-h或pm-l之一从感兴趣的第一品系渐渗到感兴趣的第二品系的线形病毒抗性植物(其具有QTL-1基因座)中，以形成具有构型pm-l QTL-1或QTL-1-pm-h的基因组DNA序列装配，以及将赋予两种PM抗性的基因座pm-h或pm-l的另一种从感兴趣的第三品系渐渗到感兴趣的第二品系的另一种线形病毒抗性植物(其具有QTL-1基因座)中，以形成具有构型QTL-1-pm-h或pm-l QTL-1的基因组DNA序列装配(参见图3)。其后，包含来自每个独立重组的基因渗入的后代植物被杂交以形成具有构型pm-l QTL-1-pm-h的基因组DNA序列装配(参见图3)。再一次，在各种后代植物中适当基因渗入的建立可以通过利用QTL-1、pm-l和pm-h特异性标记物加以监测，基于此选择用于进一步杂交的植物。本领域技术人员可以从图4-6衍生其它方法。

用于限制要筛选的植物数目的方法可以例如进行如下：杂交两个个体，一个包含两种PM抗性等位基因(pm-l和pm-h)而另一个包含QTL抗性等位基因。选择在pm等位基因之一和QTL-1之间具有1次交叉的植物，如下：如果两个pm等位基因的两个终点之间的遗传距离是10cM并且QTL1位于中间(所以在QTL1和pm-l或pm-h的任何一个之间为5cM)，那么在QTL1和任何一种pm基因座之间的重组以5％的频率发生。因此，在杂交的200株后代植物的首次筛选中，10株将为A型重组体以及10株将为B型重组体。自交如此鉴定的重组体并通过运行旁侧QTL-1和pm基因座的标记物来筛选为纯合体后代的10株植物。在纯合体AxB之间进行10次杂交(10A与10B杂交)并在获得的F2中筛选10株植物以发现1个双重组体。最后，这将给予10种独立的双重组体。于是筛选的植物总数为500，而在常规方法中这将需要筛选4000株植物以形成10种独立的双重组体(在QTL-1和任何一种pm基因座之间距离为5cM，并且双重组体的频率为0.05x0.05＝0.2％)。

本发明现在可以提供用于标志辅助选择(MAS)的更好模型。因此本发明涉及植物育种的方法以及涉及选择植物的方法，尤其是黄瓜属植物，特别是作为培育植物用于培育计划的栽培的黄瓜属植物或具有所期望的基因型或潜在的表型特性的栽培的黄瓜属植物，尤其涉及产生有价值的黄瓜果实，在本文中也称作商业上有价值的植物。在本文中，栽培植物被定义为这样的植物，其是特意选择的植物或衍生自在为获得所期望的基因型或潜在的表型特性的农业或园艺实践中已特意选择的植物，尤其是通过近交获得的植物。

本发明的双抗性植物可以例如具有基因型AABBcc、AABbcc、AaBBcc或AaBbcc，其中“A”是基于显性pm-l基因座的抗性基因型，而“a”是其相应的无抗性等位基因；“B”是基于显性QTL-1基因座的抗性基因型，而“b”是其相应的易感等位基因；以及“c”是基于隐性pm-h基因座的抗性基因型。因此，本发明的双抗性植物包括纯合植物以及杂交植物。通过进行以下杂交(亲代配子的基因型)可以获得这些基因型：ABc x ABc、ABc x Abc、ABc x aBc、ABc x abc、以及Abc x aBc。因此可以看到，产生配子abc的植物(该植物不是抗性的，除了pm-h)仍然可以用来产生本发明的双抗性(杂种)植物。在一种特别优选的实施方式中，本发明的双抗性植物是近交植物，对于抗性等位基因是纯合的。

因为pm-h基因座是隐性基因座，所以在F1或BC1中不能通过利用生物测定对其进行监测，即，如果易感亲代用来产生F1/BC1(如在培育中常见的)。因此，特别有利的是，在后代植物中适当基因渗入的建立可以通过利用如本文提供的QTL-特异性标记物来加以监测。通过利用MAS或MAB方法，因此本领域技术人员被提供了选择植物的方法。

因此本发明还提供了用于选择黄瓜属物种的植物的方法，上述植物呈现对黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌的抗性，所述方法包括在所述植物中检测在单染色体上如本文定义的QTL-1的存在，以及如本文定义的QTLpm-l和pm-h的至少一种。在本发明的用于选择这样的植物的优选方法中包括：

a)提供来自黄瓜属植物的基因组DNA样品；

b)在所述基因组DNA样品中检测至少一种连接于QTL的分子标记物，其中QTL选自由QTL-1、pm-l和pm-h组成的组，更优选地从所述组检测至少两种分子标记物，其中一种标记物检测线形病毒抗性而另一种标记物检测白粉菌抗性。

提供来自黄瓜属植物的基因组DNA样品的步骤可以通过本领域众所周知的标准DNA分离方法来完成。

在一种优选实施方式中，检测分子标记物的步骤(步骤b)可以包括使用一组双向引物，其用于AFLP方法以产生扩增产物，该扩增产物后来证明是适用于QTL的标记物。在本文中这样的一组引物称作限定AFLP标记物的引物或标记物特异性引物。双向意味着，引物的取向是如此，以致在核酸的扩增反应中一种作为正向引物而另一种作为反向引物。

可替换地，在另一种优选实施方式中，检测分子标记物的步骤(步骤b)可以包括使用具有基本上互补于限定所述分子标记物的核酸序列的碱基序列的核酸探针并且该核酸探针在严格条件下特异性地杂交限定所述分子标记物的核酸序列。适宜的核酸探针可以例如是对应于标记物的单链扩增产物。

检测分子标记物的步骤(步骤b)还可以包括对所述基因组DNA进行核酸扩增反应以检测一种或多种QTL。这可以适宜地通过进行PCR反应并利用一组标记物特异性引物来完成。在一种优选实施方式中，所述步骤b)包括使用至少一组为所述QTL限定AFLP标记物的引物、或一组这样的引物，其在严格条件下特异性地杂交用于所述QTL的AFLP标记物的核酸序列。

优选这样进行检测具有预测长度或预测核酸序列的扩增DNA片段的步骤d)，使得扩增的DNA片段具有一定长度，其对应于(多少几个碱基，例如，或多或少一个、两个或三个碱基的长度)预期长度(如基于相同引物与来自植物的DNA的类似反应，其中首先检测到标记物)，或核酸序列，其对应于(具有大于80％的同源性，优选大于90％，更优选大于95％，甚至更优选大于97％，还要更优选大于99％)预期的序列(如基于与植物中的QTL有关的标记物序列，其中所述标记物被首先检测到)。本领域的技术人员明了，在抗性植物中缺少的标记物，虽然它们存在于易感亲代中(所谓的反式标记物)，也可以在测定中用于检测后代植物中的抗性，虽然通过试验标记物的缺少来检测特定性状的存在不是最佳的。

检测具有预测长度或预测核酸序列的扩增DNA片段的步骤可以通过标准凝胶电泳技术或通过利用自动DNA测序仪来进行。这里不必描述这些方法，因为对于技术人员来说它们是众所周知的。

为了在植物中检测在单染色体上两种QTL的存在，还可以使用染色体着色方法。在这样的方法中，通过原位杂交或原位PCR技术可以在相同的染色体中检测至少第一QTL和至少第二QTL。这样的技术还可以用来估计在所述染色体中QTL-1相对于pm-l和pm-h的位置并且在本技术领域是已知的(例如，参看Jiang等，1995)。更方便地，两种QTL存在于单染色体上的事实可以通过确定它们处于结合相来证实，即，当与存在于分开的染色体上的基因比较时，性状显示出减少的分离。

分子标记物和QTL

分子标记物用于显示核酸序列的差异。这种显示可能起因于在用限制酶(RFLP)消化后的DNA-DNA杂交技术和/或起因于利用聚合酶链反应的技术(例如，STS、微随体、AFLP)。基于这些亲代基因型的杂交，在两种亲代基因型之间的所有差异将在编图种群中分离(例如，BC₁、F₂；参见图2)。可以比较不同标记物的分离并可以计算重组频率。在不同染色体上分子标记物的重组频率通常为50％。在位于相同染色体上的分子标记物之间，重组频率取决于标记物之间的距离。低重组频率对应于染色体上标记物之间的低的遗传距离。比较所有重组频率将导致在染色体上分子标记物的最合乎逻辑的次序。这种最合乎逻辑的次序可以描绘在连锁图中(Paterson，1996)。在连锁图上的一组相邻或邻接标记物可以准确定位与对疾病的抗性有关的QTL的位置，其中连锁图与对疾病的增加水平的抗性(例如，在感染接触疾病因子以后降低的患病发生率)和/或在建立感染以后降低的病变生长速率有关。

如将要现在说明的，这里鉴定的标记物可以用于本发明的各个方面。本发明的方面并不限于应用这里鉴定的标记物。应当强调的是，这些方面还可以利用在本文中未明确披露的或甚至还未鉴定的标记物。不同于遗传单位“基因”，在其上表型表达取决于大量不能预测的因素，遗传单位“QTL”是指在基因组上的区域，其直接与表型可量化性状有关。因此，虽然基因本身与植物育种具有很少的关系或没有关系，但QTL可直接应用于植物育种。本发明的发明人现在已经发现，如本文定义的用于黄瓜中线形病毒抗性和白粉菌抗性的QTL在后代植物的基因组中应具有相对于彼此的特殊构造。本发明的发明人基于以下观测结果获得该发现：在黄瓜基因组中在单染色体上属于不同QTL的一串邻接基因组标记物的存在与两种表型抗性性状的存在有关，并且它们表明，这种染色体组的组织可以按照一般孟德尔遗传定律进行遗传。

如本文定义的QTL是位于单染色体或连锁群上，并且它们的位置最好通过若干在不同的情况下任意的标记物加以表征。在本研究中，使用了扩增的片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNPs)、以及插入突变标记物，虽然也可以使用限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、微随体标记物(例如，SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)标记物、酶切扩增多态性序列(GAPS)标记物或同工酶标记物或这些标记物的组合。通常，QTL可以跨越几百万碱基的区域。因此，提供QTL的全序列信息实际上是不能实行的而且也无必要，因为首先检测QTL的方式(通过在一串邻接基因组标记物的存在和特定表型性状的存在之间的观测到的相关性)使得可以在后代植物的种群中追踪那些植物，其具有用于呈现特定表型性状的遗传潜力。通过提供非限制性的标记物清单，本发明因此便于在培育计划中有效使用QTL。

标记物对于品种的特定品系是特异的。因此，特定性状与特定标记物有关。如在本申请中指出的标记物不仅指示QTL的位置，它们还与植物中特定表型性状的存在有关。重要的是注意到，指示在基因组上QTL位置的邻接基因组标记物基本上是任意的或非限制性的。通常，QTL的位置由邻接的一串标记物来指示，其中标记物呈现与表型性状的统计相关性。在发现标记物在上述串之外后(即，具有LOD得分低于一定阈值的标记物，这表明该标记物是如此远离以致在该标记物和QTL之间区域中的重组如此频繁地发生，从而标记物的存在并不以统计显著的方式与表型的存在有关)，QTL的边界被设定。因此，还可以通过位于所述规定区域内的其它标记物来指示QTL的位置。

进一步重要的是要注意到，邻接基因组标记物也可以用来指示个体植物中QTL的存在(并且由此指示表型的存在)，即，它们可以用于标志辅助选择(MAS)方案。原则上，潜在有用标记物的数目是有限的但可以是非常大，并且技术人员可以容易地鉴定在本申请提及的那些标记物之外的标记物。在MAS方案中可以使用：任何连接于QTL的标记物，例如，属于由标记物跨越基因组区的物理边界，其中标记物具有建立的LOD得分高于一定阈值，从而表明杂交中在标记物和QTL之间不发生或发生非常少的重组；以及在与QTL处于连锁不平衡状态的任何标记物；以及表示在QTL内实际因果突变的标记物。这意味着，在本申请中鉴定为与QTL有关的标记物，如用于QTL-1的AFLP标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251，仅是适用于MAS方案的标记物实例。此外，当QTL、或其赋予特定性状的部分被渐渗到另一个遗传背景中时(即，进入另一植物物种的基因组)，那么在后代中可能不再会发现某些标记物，虽然性状存在于其中，这表明这样的标记物是在基因组区(其仅表示在最初亲代品系中QTL的赋予特定性状的部分)之外，以及新的遗传背景具有不同的基因组组织。这样的标记物(其缺少表明在后代中成功引入了遗传成份)被称作“反式标记物”并且根据本发明可以同样适用于MAS方案。

在鉴定QTL以后，QTL效应(抗性)可以例如通过评估BC₂S₁后代(分离用于在研究中的QTL)中的抗性加以证实。可以适当地通过利用如本领域已知的用于黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌的抗性生物测定来评价抗性。例如，可以使用CYSDV分离物(isolate)，登记号为PV-0592/EWSN 6，在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)(Braunschweig，德国)的收集中，并且可以通过例如烟粉虱(B生物型)的传播来产生实验感染此外，可以进行在天然感染条件下的(现场)试验以评估对CYSDV或其它线形病毒的抗性。可以通过植物材料的人工接种来评估白粉菌抗性。本发明提供的标记物可以非常适用于在可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物中检测本发明的一种或多种QTL的存在，并且因此可以用于这样的方法，其涉及标记物辅助培育以及选择白粉菌和线形病毒抗性黄瓜属植物。优选地，借助于至少一种如本文定义的用于QTL的标记物来检测本发明的QTL的存在。因此本发明在另一个方面涉及检测用于白粉菌和/或线形病毒抗性的QTL存在的方法，该方法包括在可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物中检测所述QTL的核酸序列的存在，该存在可以通过利用所述标记物加以检测。

本发明的QTL的核苷酸序列的分辨可以例如通过确定与所述QTL有关的一种或多种标记物的核苷酸序列并设计用于所述标记物序列的内部引物，其然后可以用来进一步确定在所述标记物序列之外的QTL的序列。例如，来自表2、3以及4的AFLP标记物的核苷酸序列可以通过下述步骤来获得：从电泳凝胶(其用于在主体植物的基因组中确定所述标记物的存在)分离所述标记物，以及通过例如本领域众所周知的双脱氧链终止法确定所述标记物的核苷酸序列。

用于在可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物中检测QTL存在的上述方法的实施方式中，该方法还可以包括以下步骤：提供寡核苷酸或多核苷酸，其能够在严格杂交条件下杂交到连接于所述QTL的标记物的核酸序列，优选选自表2、3以及4的标记物；用可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物的消化的基因组核酸接触所述寡核苷酸或多核苷酸；以及确定存在所述寡核苷酸或多核苷酸与所述消化的基因组核酸的特定杂交。

优选地，虽然还可以采用原位杂交方法，用获自所述可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物的核酸样品进行所述方法。可替换地，以及在一种更优选的实施方式中，在已确定QTL的核苷酸序列以后，技术人员可以设计特定的杂交探针或寡核苷酸，其能够在严格杂交条件下杂交于所述QTL的核酸序列，并且可以在用于在可疑的白粉菌和/或线形病毒抗性黄瓜属植物中检测本发明的QTL的存在的方法中使用这样的杂交探针。

通过选择性扩增来自抗性的个体和从亲代变种传下来的敏感个体的黄瓜DNA的片段，可以获得用于主要线形病毒抗性基因的基因座的标记物。：

-其中所述片段已经受到了紧跟连接作用的使用限制酶(例如，EcoRI和MseI)的消化阶段，以在片段的末端附着用于引物的互补衔接子，其在它们的末端具有一个或多个特定的核苷酸，其中引物对的引物之一为了检测目的被标记物；

-通过在变性条件下的凝胶电泳，分离扩增产物，以及

-用衍生自抗性后代的片段混合物和来自敏感后代的混合物获得的凝胶电泳分布图同来自亲代变种的片段进行比较，以鉴定在遗传上连接于抗性基因座多态带。所述鉴定以后是证实步骤，其中对所有个体进行证实并计算标记物和抗性基因座之间的遗传重组率。

原则上，如本文使用的个体AFLP标记物具有指定的标记物代码。此代码限定两种引物，可选地连同附图，指出在限定的添加物中引物的扩增产物的长度(还参见上文关于表1的描述)。因此，AFLP标记物限定了单或双链DNA片段，如通过对黄瓜基因组DNA进行扩增反应所获得的，其在指定的添加物的情况下导致指定长度的片段。此外，标记物在5′-3′方向包含由第一引物序列、黄瓜特异性DNA序列和第二引物序列构成的序列，以及其补体。因此黄瓜特异性DNA序列旁侧有两个引物。术语“黄瓜特异性DNA序列”是指旁侧有相应引物的区域的核苷酸序列并且表示扩增自黄瓜登记号Khira PI250147的序列，如在专利申请WO 02/22836中所描述的，其中通过使用规定的引物，或与其的序列同源性至少为90％的序列，优选至少95％，最优选至少98％。

通过转基因方法生产白粉菌和线形病毒抗性黄瓜属植物

根据本发明的另一个方面，包含至少QTL-1和一种、优选两种pm-l和pm-h或其赋予抗性的部分的核酸(优选DNA)序列可以用于生产本发明的双抗性黄瓜属植物。在此方面，本发明便于使用如本文定义的QTL或其赋予抗性的部分用于生产双抗性黄瓜属植物，该应用涉及在适宜的受体植物中引入包含所述QTL的核酸序列。如上所述，所述核酸序列可以衍生自适宜的线形病毒和/或白粉菌抗性供体植物。本文中鉴定为QTL-1的线形病毒抗性基因座的适宜来源是来自巴基斯坦的黄瓜当地品种Khira，PI250147。许多PM抗性黄瓜培养变种连同它们的商业来源例如列在http://cuke.hort.ncsu.edu/cucurbit/cuke/cukemain.html。PM抗性植物可以例如通过T.C.Wehner(Cucurbit Genetics Cooperative(CGC)，Department of Horticultural Science，North Carolina State University，Raleigh，NC 27695-7609U.S.A.的黄瓜基因管理者)获得。如本文描述的两种pm基因座的来源均是NPI，其是通过杂交Natsufushinari(PI 279465)和PI 200815而获得。登记号可以例如获自基因资源中心(Centre for Genetic Resources)，荷兰(CGN)，瓦格宁根，荷兰。若干植物数据库可用来帮助选择适宜的储存库集合，如由西班牙瓦伦西亚的农业生物多样性的保护和繁殖中心(Center for theConservation and Breeding of Agrodiversity)(COMAV)主持收集的ECP/GR瓜菜数据库、或由美国农业部的国家种质资源实验室，贝尔茨维尔，马里兰(USDA′s National Germplasm Resources Laboratory，Beltsville，Maryland)主持收集的种质资源信息网(GermplasmResources Information Network)(GRIN)。对线形病毒或白粉菌呈现抗性的其它黄瓜属植物也可以用作抗性供体植物，因为本发明描述了如何可以鉴定这种物质。

在适宜的供体植物中鉴定以后，包含用于线形病毒或白粉菌抗性的QTL或其赋予抗性部分的核酸序列可以通过任何可获得的方法被转移到适宜的受体植物。例如，所述核酸序列可以通过杂交线形病毒或白粉菌抗性供体植物和易感受体植物(即，通过基因渗入)、通过转化、通过原生质体融合、通过双单倍体技术或通过胚芽抢救或通过任何其它核酸转移系统加以转移，可选地继之以选择包含QTL和呈现抗性的后代植物。对于转移的转基因方法，包含用于线形病毒或白粉菌抗性的QTL或其赋予抗性部分的核酸序列可以通过利用本领域已知的方法分离自所述供体植物并且如此分离的核酸序列可以通过转基因方法被转移到受体植物，例如借助于载体、在配子中、或在任何其它适宜的传递元素中，如涂布有所述核酸序列的轰击颗粒(ballistic particle)。

植物转化通常涉及构建将在植物细胞中起作用的表达性载体。在本发明中，这样的载体包括核酸序列，其包含用于线形病毒或白粉菌抗性的QTL或其赋予抗性部分，该载体可以包含赋予线形病毒或白粉菌抗性的基因，其是在调节元素(element)的控制下或操作上连接于调节元素，如启动子。表达性载体可以含有一种或多种这样的操作中连接的基因/调节元素组合，只要包含在组合中的至少一种基因为线形病毒或白粉菌抗性编码。载体可以具有质粒的形式，并且可以单独或连同其它质粒一起使用，以提供对线形病毒和白粉菌具有抗性的转基因植物，其中使用本领域已知的转化方法，如土壤杆菌转化系统。

表达性载体可以包括至少一种标记物基因，操作上连接于调节元素(如启动子)，其使转化细胞可以包含通过负选择(通过抑制并不包含选择性标记物基因的细胞的生长)或通过正选择(通过筛选由标记物基因编码的产物)恢复的标记物。许多通常使用的用于植物转化的选择性标记物基因在本领域是已知的，并且包括，例如，为代谢上对选择性化学试剂(其可以是抗生素或除草剂)进行脱毒的酶编码的基因、或为对抑制剂不敏感的自身修饰靶(altered target)编码的基因。若干正选择方法在本领域是已知的，如甘露糖选择。可替换地，无标记物转化可以用来获得没有所提及的标记物基因的植物，与其有关的技术在本领域是已知的。

将表达性载体引入植物中的一种方法是基于土壤杆菌属的天然转化系统(参见例如，Horsch等，1985)。根瘤土壤杆菌和发根土壤杆菌是植物病原土壤细菌，其遗传上转化植物细胞。根瘤土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物的遗传转化的基因(参见例如，Kado，1991)。将表达性载体引入植物组织的方法包括用根瘤土壤杆菌直接感染或共培养植物细胞(Horsch等，1985)。土壤杆菌属载体系统的描述和用于土壤杆菌属介导的基因转移的方法由Gruber和Crosby，1993以及Moloney等，1989提供，还参见美国专利第5,591,616号。植物表达性载体、报道基因以及转化方案的概况描述和土壤杆菌属载体系统以及土壤杆菌属介导的基因转移的方法的描述可以参见Gruber和Crosby，1993。例如由Miki等，1993和由Phillips等，1988提供了培养植物组织的一般方法。用于分子克隆技术和适当的表达性载体的合适的参考手册是Sambrook和Russell，2001。

用于将表达性载体引入植物的另一种方法是基于微轰击粒子介导的转化，其中DNA被携带在微轰击粒子表面上。借助于基因枪(biolistic)装置将表达性载体引入植物组织，其中基因枪装置将微轰击粒子加速到300至600m/s的速度，其足以穿过植物细胞壁和细胞膜(参见，Sanford等，1987，1993；Sanford，1988，1990；Klein等，1988，1992)。将DNA引入植物的另一种方法是通过对靶细胞进行超声处理(参见Zhang等，1991)。可替换地，脂质体或原生质球融合已用来将表达性载体引入植物(参见例如，Deshayes等，1985和Christou等，1987)。还有报道，利用CaCl₂沉淀作用、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进入原生质体(参见例如，Hain等，1985和Draper等，1982)。也已经描述了原生质体以及全细胞和组织的电穿孔(D′Halluin等，1992和Laursen等，1994)。

其它众所周知的技术如使用BAC，其中部分黄瓜基因组被引入细菌人工染色体(BAC)，即用来基于在细菌大肠杆菌中发现的天然存在的P因子质粒(Zhao和Stodolsky，2004)在大肠杆菌细胞中克隆DNA片段(100至300kb插入片段大小；平均150kb)的载体，可以例如连同BIBAC系统(Hamilton，1997)一起使用，以产生转基因植物。

在转化黄瓜靶组织以后，利用现为本技术领域众所周知的再生和选择方法，上述选择性标记物基因的表达便于优先选择转化的细胞、组织和/或植物。

通过非转基因方法生产线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物

在用于产生线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物的一种可替换的实施方式中，原生质体融合可以用来将核酸从供体植物转移到受体植物。原生质体融合是一种在两种或更多种原生质体(细胞，其细胞壁通过酶促处理被除去)之间的诱导或自发联合，如体细胞杂交，以产生单、双或多核细胞。融合细胞，其甚至可以是借助于在自然界不能杂种繁殖的植物物种所获得，被组织培养成杂交植物，其呈现所期望的性状组合。更具体地说，第一原生质体可以获自黄瓜属植物或其它植物品系，其对由线形病毒或白粉菌引起的感染呈现抗性。第二原生质体可以获自第二黄瓜或其它植物变种，优选包含商业上有价值特性的黄瓜品系，如，但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。然后利用本技术领域已知的传统原生质体融合方法来融合原生质体。

可替换地，在将包含如本文所述的一种或多种QTL的核酸从供体植物转移到受体植物时可以采用胚芽抢救。胚芽抢救可以作为一种方法用来从杂交中分离胚芽的核酸，其中植物不能产生能发芽的种子。在这种方法中，植物的受精子房或未成熟的种子被组织培养以产生新植物(Pierik，1999)。

本发明还涉及用于产生线形病毒或白粉菌抗性黄瓜属植物的方法，该方法包括以下步骤：根据如上所述的本发明，在供体黄瓜属植物中检测与对线形病毒或白粉菌的抗性有关的数量抗性基因座(QTL)的存在，以及将包含至少一种如此检测的QTL、或其赋予线形病毒或白粉菌抗性部分的核酸序列从所述供体植物转移到线形病毒或白粉菌易感受体黄瓜属植物。可以通过本文先前描述的任何方法来转移所述核酸序列。

这样的方法的一种优选实施方式包括借助于杂交所述植物并通过基因渗入将所述核酸序列从线形病毒或白粉菌-抗性供体黄瓜属植物转移到线形病毒或白粉菌易感受体黄瓜属植物。这种转移可以因此适当地通过利用传统的培育技术来完成。优选通过利用标记物辅助选择(MAS)或标记物辅助培育(MAB)将QTL渐渗到商业性黄瓜变种中。MAS和MAB涉及使用一种或多种分子标记物，用于鉴定和选择那些后代植物，其包含为所期望的性状编码的一种或多种基因。在本情况下，这样的鉴定和选择是基于选择本发明的QTL或与其有关的标记物。MAS也可以用来开发藏有(harboring)感兴趣的QTL的近等基因系(NIL)，从而可以更详细研究每种QTL效应，并且也是用于开发回交近交系(BIL)种群的一种有效方法(参见例如，Nesbitt等，2001；van Berloo等，2001)。按照这种实施方式开发的黄瓜属植物可以有利地从受体植物衍生大多数它们的性状，以及从供体植物衍生线形病毒和白粉菌抗性。

如以上简要说明的，传统的培育技术可以用来将为线形病毒或白粉菌抗性编码的核酸序列渐渗到线形病毒和白粉菌易感受体黄瓜属植物中。在一种方法中，其称作谱系培育，对线形病毒或白粉菌呈现抗性并且包含为线形病毒或白粉菌抗性编码的核酸序列的供体黄瓜属植物与线形病毒或白粉菌易感受体黄瓜属植物杂交，其中上述易感受体黄瓜属植物优选呈现商业上所期望的特性，如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。形成的植物种群(表示F₁杂种)然后自花传粉并结种子(F₂种子)。然后筛选生长自F₂种子的F₂植物的对线形病毒和白粉菌的抗性。可以用许多不同的方式来筛选上述种群。

首先，可以利用传统疾病筛选来筛选该种群。这样的疾病筛选在本技术领域是已知的。优选地，使用定量生物测定。第二，可以利用一种或多种上文描述的分子标记物来进行标记物辅助选择以鉴定那些后代，其包含为线形病毒或白粉菌抗性编码的核酸序列。可以使用在上文中描述检测QTL的存在的方法时所提及的其它方法。此外，标记物辅助选择可以用来证实从定量生物测定所获得的结果，并且因此，若干种方法也可以联合使用。

可以利用轮回选择和回交、自交和/或双单倍体的技术或用来形成亲代品系的任何其它技术来开发近交的线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物品系。在轮回选择和回交的方法中，通过杂交回归亲本和第一供体植物(其不同于回归亲本并在本文中称作“非回归亲本”)，可以将线形病毒和白粉菌抗性渐渗到靶受体植物(回归亲本)。回归亲本是这样一种植物，其是无抗性的或对线形病毒和白粉菌具有低水平抗性并且具有商业上所期望的特性，如但不限于(另外的)疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性等。非回归亲本呈现线形病毒和白粉菌抗性并且包含为线形病毒和白粉菌抗性编码的核酸序列。非回归亲本可以任何植物变种或近交系，其与回归亲本是杂交结实的。来自回归亲本和非回归亲本之间的杂交的后代回交于回归亲本。然后对获得的植物种群筛选所期望的特性，可以以许多不同方式进行上述筛选。例如，可以利用本领域已知的表型病理学筛选或定量生物测定来筛选上述种群。可替换地，代替利用生物测定，可以利用一种或多种上文描述的分子标记物、杂交探针或多核苷酸来进行标记物辅助选择(MAS)，以鉴定那些后代，其包含为线形病毒和白粉菌抗性编码的核酸序列。此外，MAS可以用来证实从定量生物测定获得的结果。再一次，pm-h的隐性特性意味着，通过利用表型筛选如抗性生物测定不能在F₁或BC₁种群中筛选这种基因。本文定义的标记物因此最终适用于通过基因型筛选来选择适当的后代植物。

在筛选以后，选择这样的F₁杂交植物，其呈现线形病毒和白粉菌抗性表型或更优选地基因型并且因此包含为线形病毒和白粉菌抗性编码所必要的核酸序列，然后回交于回归亲本若干代以便于黄瓜属植物变成愈加近交的。此过程可以进行二至五或更多代。原则上，来自回归亲本与线形病毒和白粉菌抗性非回归亲本的杂交过程的后代对于编码线形病毒和白粉菌抗性的一种或多种基因来说是杂合的。

应当明了，例如，当将pm-l和pm-h基因座均渐渗到植物品系中时，pm-h基因座是隐性的并且仅在可以形成纯合的pm-h植物的条件下才在后代植物中出现抗性表型。

通常，将所期望的性状引入杂种黄瓜变种的方法包括以下步骤：

(a)杂交近交的黄瓜亲代与另一种黄瓜属植物，其包含一种或多种所期望的性状，以产生F1后代植物，其中所期望的性状选自由线形病毒抗性和白粉菌抗性组成的组；

(b)优选利用如本文描述的分子标记物，选择具有所期望的性状的所述F1后代植物，以产生所选择的F1后代植物；

(c)回交所选择的后代植物和所述近交的黄瓜亲代植物以产生回交后代植物；

(d)选择这样的回交后代植物，其具有所述近交的黄瓜亲本植物的所期望的性状以及形态和生理特性，其中所述选择包括分离基因组DNA和试验所述DNA是否存在至少一种用于QTL-1、pm-l和/或pm-h的分子标记物，优选如本文描述的；

(e)连续地重复步骤(c)和(d)两次或更多次以产生所选择的第三或更高的回交后代植物；

(f)可选地自交所选择的回交后代以鉴定纯合的植物；以及

(g)杂交至少所述回交后代之一或与另一种近交的黄瓜亲本植物(优选为pm-hypo抗性的，即是纯合的pm-h)自交，以当生长在相同环境条件下时，产生具有杂种黄瓜变种的所期望的性状和所有形态和生理特性的杂种黄瓜变种。

如前所述，最后回交代可以被自交以为纯合的纯育(近交的)后代提供线形病毒和白粉菌抗性。因此，轮回选择、回交以及自交的结果是产生这样的品系，其在遗传上同源于与线形病毒和白粉菌抗性有关的基因以及与商业上感兴趣的性状有关的其它基因。

线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物和种子

植物育种的目标是在单个变种或杂种中结合各种所期望的性状。对于商业性农作物来说，这些性状可以包括对疾病和昆虫的抗性、耐热性以及耐旱性、减少的农作物成熟期、更高的产量、以及更好的农学质量。植物特性(如萌发和群落地段、生长速率、成熟期、以及植物高度)的均匀性可能也具有重要意义。

通过一些技术来培育商业性农作物，其中所述技术利用了植物的传粉方法。如果花粉从一个花被转移到相同植物的相同花或另一个花，则植物被自花传粉。当相同家族或品系中的个体用于传粉时，则植物被近缘授粉。如果花粉来自不同植物(来自不同家族或品系)上的花，则植物被异花传粉。

已自花传粉并选择类型许多代的植物在几乎所有基因座变成纯合的并产生纯育后代的均匀种群。两种不同纯合品系之间的杂交可产生杂交植物的均匀种群，其对于许多基因座可以是杂合的。在若干基因座各自杂合的两种植物的杂交将产生异种植物的种群，其在遗传上是不同的并且将不是均匀的。

在黄瓜属植物育种计划中杂种黄瓜变种的开发涉及三个步骤：(1)从各种种质库选择植物，用于最初的培育杂交；(2)自交从培育杂交选择的植物若干代，以产生一系列近交品系，其明显地是纯育的并且是高度均匀的；以及(3)杂交所选择的近交系和不相关的近交系以产生杂种后代(F1)。在足够量的培育以后，连续子代将仅用来增加开发的近交的种子。优选地，近交系应在大约95％或更多的其基因座处包含纯合的等位基因。

近交品系的纯合性和同质性的一个重要结果是，通过杂交规定的一对近交所产生的杂种将总是相同的。在已鉴定了产生优越杂种的近交以后，则可以利用这些近交亲代连续供给杂种种子并且从这种杂种种子供给可以产生杂种黄瓜属植物。

本发明的一个方面是通过本发明的方法获得的线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物、或其部分。

本发明的另一个方面涉及线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物、或其部分，包括如上文详细描述的具有任何构型的QTL，其中至少所述QTL之一不是处于其天然遗传背景。本发明的线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物可以具有任何遗传类型如近交、杂种、单倍体、双单倍体或转基因的。另外，本发明的植物对于抗性性状来说可以是杂合的或纯合的，优选纯合的。虽然本发明的QTL、以及其赋予抗性部分可以被转移到任何植物以提供线形病毒和白粉菌抗性植物，但本发明的方法和植物优选地涉及黄瓜属物种的植物。

本文描述的线形病毒和白粉菌抗性近交的黄瓜品系可以用于另外的杂交以产生线形病毒和白粉菌抗性杂交植物。例如，本发明的第一线形病毒和白粉菌抗性近交的黄瓜属植物可以杂交于第二近交的黄瓜属植物，其具有商业上所期望的性状如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、所期望的果实特性等。该第二近交的黄瓜品系可以或可以不具有线形病毒或白粉菌抗性。优选地，该品系对于pm-h而言是纯合的，以便这种隐性性状表达在杂种后代植物中。

本发明的另一个方面涉及用于生产种子的方法，其中种子可以生长成线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物。在一种实施方式中，该方法包括以下步骤：提供本发明的线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物，杂交所述线形病毒和白粉菌抗性植物与另一种黄瓜属植物，以及收集从所述杂交获得的种子，当种植时其产生线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物。

在另一种实施方式中，该方法包括以下步骤：提供本发明的线形病毒和白粉菌抗性黄瓜属植物，杂交所述线形病毒和白粉菌抗性植物与黄瓜属植物，收集从所述杂交获得的种子，再生所述种子成植物，通过本文描述的任何方法选择线形病毒和白粉菌抗性植物，自花传粉所选择的植物足够数目的代以获得具有固定等位基因的植物，其中等位基因赋予植物中的线形病毒和白粉菌抗性，回交如此产生的植物和具有所期望的表型性状的黄瓜属植物足够数目的代以获得具有线形病毒和白粉菌抗性以及具有所期望的表型性状的黄瓜属植物，以及收集从植物(来自最后一次回交)产生的种子，当种植时其产生具有线形病毒和白粉菌抗性的黄瓜属植物。

表4以阵列格式示出在双抗性植物中标记物的存在或缺少，其中标记物已知具有pm抗性或线形病毒抗性亲代起源(指示为在抗性亲代中的存在)。该阵列进一步指出与双(PM和线形病毒)抗性植物品系有关的AFLP标记物的起源和相对位置。由术语pm-l和pm-h指示的“标记物”指出在本文中提及的两个相应的白粉菌抗性基因座的中心位置。对QTL-1基因座没有确立位置，虽然通过利用线形病毒伴随标记物的位置可以确定该基因座位于两个pm基因座之间。从该表可以明了，同遗传库号(pool nrs.)10-15相比，遗传库号1-6已从线形病毒抗性亲代获得更短的基因渗入。阵列的解释如下：标记物E23/M40-M003(56.9cM)，例如，存在于pm抗性亲代中并且也存在于双抗性后代中，而标记物E11/M80-M003(79.1cM)存在于线形病毒抗性亲代中但不存在于双抗性后代中。因此，标记物E23/M40-M003是PM伴随标记物，其存在表明在所试验的植物品系中存在pm-l伴随遗传区，而另一方面标记物E11/M80-M003表示在与线形病毒抗性有关的QTL-1基因座附近的遗传区，但其对于pm-hypo(pm-h)抗性的表达不是必要的。

表4.在本发明的双抗性植物中，AFLP标记物得分

+＝纯合存在(高强度带)

-＝不存在(没有带)

+/-＝杂合存在(低强度带)

D＝中等存在(中等强度带)

＝标记物值(存在[+]和不存在[-]均为指示性的)，如在PM抗性亲代中

＝标记物值，如在线形病毒抗性亲代中

□＝未确立在亲代品系中存在标记物

参考文献

Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struhl K(eds.)(1998)Current Protocols in Molecular Biology Wiley，New York.

Bai YL，Huang CC，van der Hulst R，Meijer Dekens F，Bonnema G，Lindhout P(2003)QTLs for tomato powdery mildew resistance(Oidiumlycopersici)in Lycopersicon parviflorum G1.1601co-localize with two qualitativepowdery mildew resistance genes.Mol.plant microbe interactions 16：169-176.

Christou P，Murphy JE，and Swain WF(1987)Stable transformationof soybean by electroporation and root formation from transformed callus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962-3966.

Deshayes A，Herrera-Estrella L，Caboche M(1985)Liposome-mediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by anEscherichia coli plasmid.EMBO J.4：2731-2737.

D′Halluin K，Bonne E，Bossut M，De Beuckeleer M，Leemans J(1992)Plant.Cell 4：1495-1505.

Draper J，Davey MR，Freeman JP，Cocking EC and Cox BJ(1982)Ti plasmid homologous sequences present in tissues from Agrobacterium plasmid-transformed Petunia protoplasts.Plant and Cell Physiol.23，451-458.

Fanourakis NE(1984)Inheritance and linkage studies of the fruitepidermis structure and investigation of linkage relations of several traits andof meiosis in cucumber.Ph.D.Diss.，Univ.of Wisconsin，Madison.

Fuj ieda K，and Akiya R(1962)Genetic study of powdery mildewresistance and spine color on fruit in cucumber.J.Jpn.Soc.Hort.Sci.31：30-32.

Ganal MW(1996)Isolation and analysis of high-molecular-weight DNAfrom plants，In：Nonmammalian Genomic Analysis：A Practical Guide.Academic Press Inc.，San Diego，61-73.

Gruber MY，Crosby WL(1993)Vectors for plant transformation.InBR Glick，JE Thompson，eds，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology.CRC Press，Baton Rouge，LA，pp 89-119.

Hain R，Stabel P，Czernilofsky AP，Steinbliss HH，tterrera-EstrellaL，Schell J(1985)Uptake，integration，expression and genetic transmission of aselectable chimaeric gene to plant protoplasts.Mol.Gen.Genet.199：161-168.

Hamilton CM.(1997)A binary-BAC system for plant transformation withhigh-molecular-weight DNA.Gene 200：107-116.

Horejsi T，Staub JE and Thomas C.(2000)Linkage of randomamplified polymorphic DNA markers to downy mildew resistance in cucumber(Cucumis sativus L.)Euphytica 115(2)：105-113，

Horsch RB，Fraley RT，Rogers SG，Sanders PR，Lloyd A(1985)Asimple and general method for transferring genes into plants.Science 227：1229-1231.

Jiang J，Gill BS，Wang GL，Ronald PC and Ward DC(1995)Metaphaseand interphase fluorescence in situ hybridization mapping of the rice genome withbacterial artificial chromosomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4487-4491.

Kado CI(1991)：Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis.Crit.Rev.Plant Sci.10，1-32.

Klein TM，Gradziel T，Fromm ME，Sanford JC(1988).Factorsinfluencing gene delivery into zea mays cells by high velocity microprojectiles.Biotechnology 6：559-563.

Klein TM，Arentzen R，Lewis PA，and Fitzpatrick-McElligott S(1992)Transformation of microbes，plants and animals by particle bombardment.Bio/Technology 10：286-291.

Kleine M，Cai D，Hermann RG，and Jung C(1995)Physical mappingand cloning of a translocation in sugar beet(Beta vulgaris L.)carrying a gene forhematode(Heterodera schachtii)resistance from B.procumbens.Theor ApplGenet 90：399-406.

Kooistra E(1968)Powdery mildew resistance in cucumber.Euphytica17：236-244.

Kooistra E(1971)Inheritance of flesh and skin colors in powdery mildewresistant cucumbers(Cucumis sativus L.).Euphytica 20：521-523.

Lui BH(1997)Statistical Genomics：Linkage Mapping and QTL Analysis.CRC Press.pg 18-19.

Miki BL，Fobert PF，Charest PJ，Iyer VN.1993.Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants.In：Glick BR and Thompson JE(Eds.)Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology，CRC Press，pp.67-88.

Moloney MM，Walker JM，Sharma KK(1989)High efficiencytransformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors.Plant Cell Rep 8：238-242.

Morishita M，Sugiyama K，Saito T，and Sakata Y(2003)Review：Powdery Mildew Resistance in Cucumber.JARQ 37(1)，7-14.

Nesbitt TC，Tanksley SD(2001)fw2.2directly affects the size ofdeveloping tomato fruit，with secondary effects on fruit number andphotosynthate distzdbution.Plant Physiol.127：575-583.

Paterson AH(1996)Mapping genes responsible for differences inphenotype.p.41-54.In A.H.Paterson(ed.)Genome mapping in plants.R.G.LandesCompany.

Phillips RL，Somers DA，Hibberd KA.1988.Cell/tissue culture and invitro manipulation.In：G.F.Sprague & J.W.Dudley，eds.Corn and cornimprovement，3rd ed.，p.345-387.Madison，WI，USA，American Society ofAgronomy.

Pierik，R.L.M.(1999)In vitro Culture of Higher Plants，4th edition.Martinus Nijhoff Publishers，Dordrecht.

Sambrook J，and Russell DW(2001).Molecular Cloning：ALaboratory Manual.New York，NY，USA.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.

Sanford JC，Klein TM，Wolf ED，Allen N(1987).Delivery of substancesinto cells and tissues using a particle bombardment process.J.Particulate Sci.Technol.5：27-37.

Sanford JC(1988)The biolistic process.Trends in Biotechnology6：299-302.

Sanford JC(1990)Biolistic plant transformation.Physiologica Plantarum，79，206-209.

Sanford JC，Smith FD，and Russell JA(1993)Optimizing the biolisticprocess for different biological applications.Methods in Enzymology 217：483-509.

Shanmugasundarum S，Williams PH，and Peterson CE(1971)Inheritance of resistance to powdery mildew in cucumber.Phytopathology61：1218-1221.

Shanmugasundarum S，Williams PH，and Peterson CE(1972)Arecessive cotyledon marker gene in cucumber with pleiotropic effects.HortScience7：555-556.

Tijssen P(1993)Hybridization with Nucleic Acid Probes.Part I.Theoryand Nucleic Acid Preparation.In：Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology.Elsevier.

Van Berloo R，Aalbers H，Werkman A，Niks RE(2001)ResistanceQTL confirmed through development of QTL-NILs for barley leaf rust resistance.Mol.Breeding 8：187-195.

Vos P，Hogers R，Bleeker M，Reijans M，van de Lee T，Hornes M，Frijters A，Pot J，Peleman J，Kuiper M(1995)AFLP：a new technique forDNA fingerprinting.Nucl.Acids Res.23：4407-4414.

Zhang L，Cheng L，Xu N，Zhao M，Li C，Yuan J，and Jia S(1991)Efficient transformation of tobacco by ultrasonication.Biotechnology.9：996-997.

Zhao S，and Stodolsky M(2004)Bacterial Artificial Chromosomes.Methods in Molecular Biology Vol 255.Humana Press Inc.Totowa，NJ，USA.

Claims

1.一种对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌具有抗性的植物，其中，所述植物是黄瓜属物种的植物，所述植物在单染色体上包括至少一个赋予线形病毒抗性的染色体区和至少一个赋予白粉菌抗性的染色体区，

其中所述至少一个赋予线形病毒抗性的区连接于至少一种标记物，所述标记物选自由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251组成的组，以及

其中所述至少一个赋予白粉菌抗性的区连接于至少一种标记物，所述标记物选自由下述组成的组：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′，以及

标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200。

2.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物包含至少两个赋予白粉菌抗性的染色体区，其中所述至少两个区的第一个区连接于至少一种标记物，所述标记物选自由下述组成的组：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，以及

标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001，

以及其中所述至少两个区的第二区连接于至少一种标记物，所述标记物选自由下述组成的组：

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′，以及

标记物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200。

3.根据权利要求2所述的植物，其中，所述至少一个赋予线形病毒抗性的区位于所述至少两个权利要求2中所述的赋予白粉菌抗性的区之间。

4.权利要求1-3中任一项所述的黄瓜属植物的部分。

5.根据权利要求4所述的植物部分，其中，所述植物部分选自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、根状茎、种子、原生质体以及愈伤组织。

6.通过杂交权利要求1-3中的任一项所述的黄瓜属植物和第二种黄瓜属植物或其它植物变种、优选包含商业上所期望特性的黄瓜品系所获得的F1种子，其中，所述种子包括：

至少一种用于线形病毒抗性的标记物，所述标记物选自由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251组成的组，以及

至少一种用于白粉菌抗性的标记物，所述标记物选自由下述组成的组：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′，以及

7.根据权利要求6所述的种子，其中，所述第二种黄瓜属植物对线形病毒敏感并且其中所述至少一种用于白粉菌抗性的标记物是纯合子地存在。

8.根据权利要求6或7所述的种子，其中，所述第二种黄瓜属植物是近交植物。

9.通过栽培权利要求4-8中任一项所述的种子所获得的杂交植物。

10.权利要求9所述的杂交植物部分。

11.根据权利要求10所述的杂交植物部分，其中，所述杂交植物部分选自花粉、胚珠、叶、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、枝条、接穗、根状茎、种子、原生质体以及愈伤组织。

12.一种用于选择对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌具有抗性的植物的方法，其中，所述植物是黄瓜属物种的植物，所述方法包括进行标记物检测试验，其中所述试验包括以下步骤：

a)检测在所述植物的基因组中存在至少一种连接于线形病毒抗性的标记物，所述标记物选自由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251组成的组，以及

b)检测在所述植物的基因组中存在至少一种连接于白粉菌抗性的标记物，所述标记物选自由下述组成的组：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′，以及

13.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤包括：

检测在所述植物的基因组中存在至少一种连接于赋予第一黄瓜白粉菌抗性的QTL的标记物，其中所述QTL是由SEQID NO：1中的SNP标记物39T→G、SEQ ID NO：2中的SNP标记物29G→A、和标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001指示；以及

检测在所述植物的基因组中存在至少一种连接于赋予第二黄瓜白粉菌抗性的QTL的标记物，其中所述QTL是由SEQID NO：3中的SNP标记物193C→T、在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′、和标记物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200指示。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述方法包括：

a)提供来自所述植物的基因组DNA样品；

b)在所述植物的所述基因组DNA样品中检测所述至少一种连接于线形病毒抗性的标记物以及所述至少一种连接于白粉菌抗性的标记物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述步骤b)包括使用至少一组限定所述标记物的引物、或至少一种具有碱基序列的核酸探针，所述碱基序列基本上互补于限定所述标记物的核酸序列并且所述核酸探针在严格条件下与限定所述标记物的核酸序列特异性地杂交。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中，另外，通过表明所述标记物是存在的并处于结合相，例如，当与非结合标记物比较时，通过表明在杂交实验中所述标记物之间减少的分离，确定所述标记物存在于相同的染色体上。

17.通过根据权利要求12-16中任一项所述的方法选择的植物。

18.一种产生黄瓜属物种的植物的方法，所述植物呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性，所述方法包括以下步骤：

a)通过在所述植物的基因组中检测存在至少一种连接于赋予黄瓜线形病毒抗性的QTL的标记物，来选择包括赋予对黄瓜线形病毒抗性的染色体区的第一黄瓜属植物，其中所述QTL由标记物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251指示；

b)通过在所述植物的基因组中检测存在至少一种连接于赋予第一黄瓜白粉菌抗性的QTL的标记物，其中所述QTL由以下标记物指示：

在SEQ ID NO：1中的单核苷酸多态性标记物39T→G，

在SEQ ID NO：2中的单核苷酸多态性标记物29G→A，以及

标记物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001；

或

通过在所述植物的基因组中检测存在至少一种连接于赋予第二黄瓜白粉菌抗性的QTL的标记物，其中所述QTL由以下标记物指示：

在SEQ ID NO：3中的单核苷酸多态性标记物193C→T，

在SEQ ID NO：4中在第221位置的插入突变5′-AATTT-3′，以及

标记物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200；

来选择包括至少一个赋予对黄瓜白粉菌抗性的染色体区的第二黄瓜属植物；

c)杂交来自步骤a)和步骤b)的所述植物以产生F1种子；

d)将一定量的F1种子栽培成F1植物，通过杂交或自交从所述F1植物产生进一步的后代种群；以及

e)从所述进一步的后代植物中选择一种植物，所述植物包括：至少一种连接于如在步骤a)中所限定的赋予黄瓜线形病毒抗性的QTL的标记物；以及至少一种连接于如在步骤b)中所限定的赋予黄瓜白粉菌抗性的QTL的标记物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，在步骤b)中选择第二黄瓜属植物的步骤包括选择具有赋予所述第一或第二黄瓜白粉菌抗性的QTL之一的第二黄瓜属植物，以及其中所述方法进一步包括以下步骤：

f)选择第三黄瓜属植物，所述第三黄瓜属植物具有另一种赋予所述第一或第二黄瓜白粉菌抗性的QTL(即一种在所述第二黄瓜属植物中不存在的QTL)；

g)杂交在步骤e)中获得的F1植物和所述第三黄瓜属植物以产生进一步的后代植物，以及

h)从后代植物中选择一种植物，所述植物包括步骤a)中所述的赋予黄瓜线形病毒抗性的QTL以及步骤b)中所述的赋予黄瓜白粉菌抗性的两种QTL。

20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，选择黄瓜属植物的步骤包含步骤b)、e)、f)或h)中所述的赋予对黄瓜白粉菌抗性的染色体区，包括：

21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中，步骤a)、b)、e)、f)或h)的至少之一包括以下步骤：提供来自所述植物的基因组DNA样品并在所述基因组DNA样品中检测所述至少一种标记物。

22.一种用于产生黄瓜属物种的植物的方法，所述植物呈现对黄瓜线形病毒和对黄瓜白粉菌的抗性，所述方法包括以下步骤：

a)通过运用权利要求12-16中任一项所述的方法，选择黄瓜属物种的植物，所述植物包括赋予对黄瓜线形病毒和黄瓜白粉菌抗性的染色体区；

b)近交所述植物以产生对于所述QTL为纯合的植物品系；

c)杂交来自步骤a)和步骤b)的所述植物以产生F1种子；以及

d)将所述F1种子栽培成F1后代植物。

23.通过根据权利要求18-22中任一项所述的方法可获得的植物或其部分。