CN103502268A - 黄瓜中的白粉病抗性提供基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及黄瓜属（Cucumis）科尤其是黄瓜（Cucumis sativus）的白粉病抗性提供基因，其中所述抗性由本发明的基因的受损提供。此外，本发明涉及包含本发明的受损的抗性赋予基因的植物及其种子、胚或其他繁殖材料。尤其是，本发明涉及白粉病抗性赋予基因，其中被所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列选自由SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20和SEQ ID No.22、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的氨基酸序列组成的组。
Description
描述
本发明涉及黄瓜（Cucumis sativus）的白粉病抗性提供基因，其中所述抗性由本发明的基因在表达或蛋白水平的受损提供。此外，本发明涉及包含本发明的抗性赋予基因的植物及其种子、胚或其他繁殖材料。
白粉病（PM）是属于田地和温室中的黄瓜属（Cucumis）科的植物诸如黄瓜（Cucumis sativus）（黄瓜，cucumber）中已知的主要真菌疾病之一。
白粉病一般由白粉菌目（Erysiphales）的许多不同的真菌种引起。该病以如下区别性症状为特征：诸如在叶和茎上的白粉样斑点。一般地说，较低的叶最易受侵袭，但霉可出现在植物暴露于地面上的任何部分。随着该病的发展，斑点因大量孢子形成而变大变密，且霉沿着植物长度如在茎甚至在果实上上下传播。
被严重侵袭的叶可变得干燥且易碎，或者可以枯萎和死亡。由于这种感染，果实在大小上可以更小，数目更少，不大能够成功储存，日烧伤，不完全成熟，且具有不好的口味。它还可能使植物倾向于更易受其他病原体伤害。最终，植物可以死亡。
除了其他之外，白粉病可以由真菌苍耳单丝壳（Sphaerothecafuliginea）（最近重新命名：苍耳单囊白粉菌（Podosphaera xanthii），还称为白粉粉孢霉（Oidium erysiphoides））和/或二孢白粉菌（Erysiphecichoracearum DC）（最近重新命名：菊科白粉菌（Golovinomycescichoracearum），还称为菊粉孢菌（Oidium chrysanthemi））引起。
考虑到黄瓜属植物物种诸如黄瓜的经济重要性，在本领域对提供白粉病抗性提供基因存在持续的需要。
鉴于本领域中的以上需要，除了其他目的之外，本发明的一个目的是满足这种需要。
根据本发明，除了其他目的之外，该目的由如所附权利要求1中限定的白粉病抗性赋予基因满足。
具体地说，除了其他目的之外，本发明的这个目的由白粉病抗性赋予基因满足，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列选自由SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.20和SEQ ID No.22、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性诸如多于96%、97%、98%、99%的氨基酸序列组成的组；且其中所述抗性赋予基因是受损的。
除了其他目的之外，本发明的目的另外由白粉病抗性赋予基因满足，其中从所述抗性赋予基因转录的cDNA序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性诸如多于96%、97%、98%、99%的cDNA序列组成的组；且其中所述抗性赋予基因是受损的。
根据本发明的受损的抗性赋予基因意指提供减少的或甚至不存在的对由真菌引起的表现为叶和茎上的粉样斑点的白粉病的易感性的基因，所述真菌诸如属于白粉菌目诸如苍耳单丝壳（最近重新命名：苍耳单囊白粉菌，还称为白粉粉孢霉）和/或二孢白粉菌的真菌。
根据本发明的受损的抗性赋予基因是突变的基因。本发明的基因的突变可通过不同的机制导致受损。例如，在蛋白质编码DNA序列中的突变可导致突变的、截短的或无功能的蛋白质。在非编码DNA序列中的突变可引起可变的剪接、翻译或蛋白质运输。可选地，导致改变的基因转录活性的突变可导致蛋白的低水平或不存在，基因转录活性决定可用于翻译成蛋白质的mRNA的量。另外，基因功能的受损可在翻译后即在蛋白质水平上引起。
根据本发明的受损还通过以下显示：与本文提供的SEQ ID Nos.相比在含有在蛋白质水平被突变的基因的黄瓜植物中观察到白粉病抗性，或未观察到本文提供的SEQ ID Nos.的表达。
受损还在本文显示为无功能的基因或蛋白质。尽管本发明的基因的功能仍没有被鉴定，无功能的基因或蛋白质可通过在植物中确立白粉病抗性（无功能的）或白粉病易感性（有功能的）而容易确定。白粉病抗性（无功能的）植物通过以下显示：与本文提供的SEQ ID Nos.相比含有在蛋白质水平被突变的基因，或未观察到本文提供的SEQ ID Nos.的表达。
有功能和无功能的基因或蛋白质还可以使用互补实验确定。例如，用本发明的基因或蛋白中的任何一种转化抗白粉病的黄瓜植物，在该基因或蛋白有功能时将产生白粉病易感的黄瓜植物，而在该基因或蛋白无功能时该黄瓜植物将仍有抗性。
根据本发明，本发明的白粉病抗性赋予基因在本发明的基因受损时提供了白粉病抗性。根据本发明的受损可通过以下显示：在本文被鉴定为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20或SEQ ID No.22的有功能或非突变的蛋白质的不存在或减少。在本领域中，许多机制已知导致基因在转录、翻译或蛋白质水平的受损。
例如，在转录水平的受损可以是在转录调控序列诸如启动子、增强子和起始序列、终止序列或内含子剪接序列中的一个或更多个突变的结果。这些序列一般位于由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19或SEQ ID No.21所表示的编码序列的5’、3’或这些编码序列之内。受损还可以由在本发明的基因中的缺失、重排或插入提供。
在翻译水平的受损可以由提前终止密码子或其他的RNA->蛋白质控制机制（诸如剪接）或影响例如蛋白质折叠或细胞运输的翻译后修饰提供。
在蛋白质水平的受损可以由截短的、错误折叠的或受干扰的蛋白质-蛋白质相互作用提供。
不依赖于背后的机制，根据本发明的受损通过以下显示：根据SEQID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.20或SEQ ID No.22的有功能的蛋白质的减少或不存在。
根据优选的实施方案，根据本发明的受损由在本发明的基因中导致蛋白质表达产物不存在的一个或更多个突变提供。如所示的，这些突变可引起在转录或翻译水平的缺陷表达。
根据另一优选的实施方案，根据本发明的受损由在本发明的基因中导致无功能的蛋白质表达产物的一个或更多个突变引起。无功能的蛋白质表达产物可以例如由提前终止密码子、不正确的翻译或翻译后加工或由插入、缺失或氨基酸变化引起。
利用分子生物学方法，本发明的基因的受损还可以通过基因沉默例如利用本发明的基因的siRNA或敲除完成。在本发明的背景下还考虑了基于EMS或其他能够随机改变核酸成为其他核苷酸的致突变的化合物的方法。此类突变的检测通常涉及高灵敏度解链曲线分析或基于核苷酸测序的TILLING程序。
本发明涉及在核苷酸水平或氨基酸水平具有多于70%、优选多于80%、更优选多于90%以及最优选多于95%序列同一性的核苷酸和氨基酸序列。
将本文使用的序列同一性定义为在本发明序列的全长上的相同的连续的比对的核苷酸或氨基酸的数目除以本发明序列的全长的核苷酸或氨基酸的数目，再乘以100%。
例如，与SEQ ID No.1具有80%同一性的序列在SEQ ID No.15的1782个核苷酸的总长度上包括1426个相同的比对的连续核苷酸，即1426/1782×100%=80%。
根据本发明，本发明的基因衍生自黄瓜。
根据另一方面，本发明涉及在其基因组中包含本发明的受损的白粉病抗性赋予基因的黄瓜植物，即不表达选自由以下组成的组的有功能的蛋白质的植物：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQID No.18、SEQ ID No.20和SEQ ID No.22、及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的氨基酸序列。
一般地且优选地，本发明的植物对于本发明的受损基因来说将是纯合的，即包含两个受损的白粉病抗性赋予基因，其中从所述抗性赋予基因转录的cDNA序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的cDNA序列组成的组。
考虑到本发明的植物的益处，即，提供在黄瓜植物中的白粉病抗性，本发明还涉及能够提供本发明的抗白粉病的黄瓜植物的种子、植物部分或繁殖材料，所述种子、植物部分或繁殖材料包含一个或更多个本发明的白粉病抗性赋予基因，即，受损的白粉病抗性赋予基因，其中从所述抗性赋予基因转录的cDNA序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的cDNA序列组成的组。
根据又另一方面，本发明涉及选自由以下组成的组的分离的核苷酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的核苷酸序列。
根据仍另一方面，本发明涉及选自由以下组成的组的分离的氨基酸序列：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20和SEQ ID No.22、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的氨基酸序列。
本发明还涉及一个或多个本发明的白粉病抗性赋予基因、一个或多个本发明的分离的核苷酸序列、或一个或多个本发明的分离的氨基酸序列用于提供抗白粉病的黄瓜植物（黄瓜）的用途。如所示的，本发明的用途是基于本文描述的基因在表达或蛋白质水平的受损，且可以通过本发明提供的cDNA和氨基酸序列任选地联合白粉病抗性的存在或不存在的确定和/或联合互补测定而容易地确定。
在本发明的优选实施方案的以下实施例中将进一步描述本发明。在该实施例中，参考附图，其中：
图1：示出了CsKIP2在黄瓜种质的选择中的相对表达水平。加入在不存在（-）或存在（+）转座子的情况下每组的表达平均值，包括标准误差棒。棒的颜色指示用来进行计算的参考基因。
图2：示出了用引物ID3和ID4扩增并且通过凝胶电泳（2%琼脂糖，10v/cm，40分钟）显现的CsKIP2的DNA片段。
图3：示出了在CsKIP2基因组DNA中不存在（上部链）和存在（下部链）转座子样元件的情况下系的cDNA序列比对。此处，在从存在转座子样元件的系取得的cDNA中可见72bp缺失。引物结合位置以粗体斜体字符显示。
图4：示出了易感白粉病的CsKIP9等位基因与抗白粉病的CsKIP9等位基因的氨基酸比对。
实施例
实施例1：黄瓜种质筛选CsKIP2表达水平和等位基因变体对抗性/易感性的贡献
引言
基因的功能受损可由不同的机制引起。在蛋白质编码DNA序列中的突变可以是等位基因功能丧失或基因特性改变的原因。可选地，改变的基因转录活性可导致可用蛋白的低水平，基因转录活性决定可用于翻译成蛋白质的mRNA的量。另外，基因功能的受损可在翻译后即在蛋白质水平上引起。
本实施例显示，在CsKIP2的编码序列中的突变（缺失）提供了白粉病抗性。
材料和方法
选择在白粉病抗性水平上不同的总计十二种黄瓜种质系用于分析。使种子在标准温室条件下萌发。在播种后7天用本地的白粉病分离株感染下胚轴，接着在播种后14天感染第一真叶。在播种后28天（在感染下胚轴后21天和14天）进行反应表型的评估并以1-9的尺度对表型评分，其中1是完全易感且9是完全抵抗。
采集被感染的植物的材料用于随后的根据标准程序的RNA分离（Machery-Nagel RNA Plant）。RNA分离之后是利用标准Oligo-dT引物联合反转录酶（Finnzymes）与1μg总RNA输入的cDNA合成。
用CsKIP2特异性的PCR引物对（表1，ID1ID2）确定CsKIP2的表达水平，从外显子5到外显子7扩增了具有对cDNA特定的大小的DNA片段，与从基因组DNA取得的产物大小十分不同。此外，从三个不同的管家基因扩增作为内参起作用的对照片段，所述管家基因即延长因子1-α（EF-1，拟南芥（A.thaliana）直向同源物At1g07920.1）、蛋白质磷酸酶2a亚基a2（PDF2，拟南芥直向同源物At3g25800.1）和包含解旋酶结构域的蛋白1（HEL1，拟南芥直向同源物At1g58050.1）。
对于在PCR扩增过程中的dsDNA的特异性实时检测，将LCGreen（Idaho Technologies）以0.5×浓度加入到PCR反应混合物中。使用ΔΔCt方法进行计算。
对于以CsKIP2检测等位基因变体，在cDNA中靶向特定的区域。这个区域被怀疑容纳转座子样元件（外显子11转座子）。被设计用来特异性扩增CsKIP2的外显子9（局部）、10和11（局部）的引物（表1，ID3ID4）用于检测该片段。
表1：CsKIP2特异性PCR引物
| ID1: | 5’CGACACTTGAGCTTCTGGAG3’ |
| ID2: | 5’GCAAGATGTGCAACAATGAATC3’ |
| ID3: | 5’CCCGCAATGTGGCTATTTGCTGT3’ |
| ID4: | 5’CCCGAGGCTGAACGACCGGA3’ |
结果
从白粉病疾病测试中选择12个种质系用于后续的CsKIP2的表达研究和等位基因变异的检测。被怀疑作为白粉病抗性的诱发因子（causativefactor）的转座子样元件在基因组DNA中的存在或不存在在开始表达研究之前进行以调查其对表达的影响。
基于对照基因确定CsKIP2在从所选植物取得的叶材料中的表达。基于所获得的数据，结果显示没有表达的总体影响。平均来说，所观察到的表达水平是相似的（图1）。
在确定表达水平后，调查了在转座子样元件中的等位基因变异。用引物ID3和ID4扩增的片段产生了大小为199bp或127bp的可变片段（图2）。较小片段严格见于抗性植物且与基因组DNA中转座子的存在相关。
发现这些片段的序列除了在外显子11中的72bp缺失以外是高度相似的，该缺失聚集在基因组DNA中转座子的最初位置（图3）。
结论
进行了CsKIP2在来自受感染的黄瓜植物的叶材料中的表达分析以评价基因表达与抗性的相关性。平均来说，表达水平在抗性植物和易感植物中是相似的。
还发现见于基因组DNA的CsKIP2基因的外显子11中的转座子样元件的存在与CsKIP2的表达水平不相关。
发现基因组DNA中转座子样元件的存在与植物对白粉病的抗性有关。在基因组DNA中具有转座子样元件的抗性植物与易感植物相比在cDNA的外显子11中显示72bp的缺失。
显然，负责RNA的正确剪接（即，使外显子与内含子分离）的机制将转座子样元件连同编码序列的一部分（即72bp）从RNA剪接。在mRNA翻译成蛋白质后，72bp缺失的mRNA产生了具有24个氨基酸残基缺失的蛋白质。认为该24个氨基酸残基缺失的蛋白质产物（即来自抗性植物的CsKIP2）已失去其作为寄主因子（host-factor）的功能。
实施例2：黄瓜种质筛选CsKIP9等位基因变体对抗性/易感性的贡献
确定了5株黄瓜植物的CsKIP9的cDNA序列。表2在以下概括了所测试的植物及其白粉病抗性。
表2：用于CsKIP9的cDNA测序的黄瓜植物
| 黄瓜植物 | 白粉病抗性 |
| OK561 | - |
| OK537 | + |
| OK619 | + |
| OK123 | + |
| OK563 | - |
对由cDNA编码的氨基酸序列进行比对，如图4所示。发现在CsKIP9（SEQ ID No.2）的第284位天冬氨酸（D）对天冬酰胺（N）的氨基酸取代（LEEN到LEED）与观察到的白粉病抗性相关。
实施例3：具有无功能的CsKIP9的抗白粉病的黄瓜植物。
确定抗白粉病的黄瓜植物的CsKIP9的cDNA序列并界定了外显子3中的氨基酸取代。具体地说，有功能的CsKIP9的外显子3（SEQ ID No.2第61位至63位）的前几个氨基酸的编码序列是谷氨酸（E）-亮氨酸（L）-甲硫氨酸（M）[ELM]。然而，在鉴定的抗白粉病的黄瓜植物中，该序列被突变成丙氨酸（A）-苏氨酸（T）-异亮氨酸（I）[ATI]，表明在CsKIP9中的这一取代与观察到的白粉病抗性相关。
本文鉴定的白粉病抗性提供基因被概括在以下表3中。所提供的cDNA和氨基酸序列是处于其有功能的形式的白粉病抗性基因，所述有功能的形式即，当在蛋白质水平受损时诸如通过突变或在表达水平受损时提供白粉病抗性。
表3：本发明的基因的cDNA和氨基酸序列
Claims (11)
1.白粉病抗性赋予基因，其中被所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列选自由SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.20和SEQ ID No.22、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的氨基酸序列组成的组；且其中所述抗性赋予基因是受损的。
2.白粉病抗性赋予基因，其中从所述抗性赋予基因转录的cDNA序列选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的cDNA序列组成的组；且其中所述抗性赋予基因是受损的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的白粉病抗性赋予基因，其中所述受损是导致蛋白质表达产物不存在的在所述基因中的一个或更多个突变。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的白粉病抗性赋予基因，其中所述受损是导致无功能的蛋白质表达产物的在所述基因中的一个或更多个突变。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的白粉病抗性赋予基因，其中所述受损是基因沉默。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的白粉病抗性赋予基因，其中所述基因衍生自黄瓜（Cucumis sativus）。
7.在其基因组中包含权利要求1至6中任一项限定的受损的白粉病抗性赋予基因的黄瓜植物，其中所述受损提供白粉病抗性。
8.根据权利要求7所述的在其基因组中包含权利要求1至6中任一项限定的受损的白粉病抗性赋予基因的植物的种子、植物部分或繁殖材料，其中所述受损提供在所述植物中的白粉病抗性。
9.分离的核苷酸序列，选自由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19和SEQ ID No.21、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的核苷酸序列组成的组。
10.分离的氨基酸序列，选自由SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20和SEQ ID No.22、以及具有多于70%同一性、优选多于80%同一性、更优选多于90%同一性以及最优选多于95%同一性的氨基酸序列组成的组。
11.如权利要求1至6中任一项限定的白粉病抗性赋予基因、根据权利要求9的分离的核苷酸序列、或根据权利要求10的分离的氨基酸序列用于提供抗白粉病的黄瓜植物的用途。
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