CN108138196A - 欧亚种葡萄中的白粉菌抗性提供基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白粉菌抗性赋予基因，包含该抗性赋予基因的植物、植物部分和种子以及其在选择抗白粉菌植物上的用途。具体地，本发明涉及白粉菌抗性赋予基因，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是由SEQ ID No.1所代表的一级氨基酸序列，或与SEQ ID No.1具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列；且其中所述抗性赋予基因是受损的。

Description

欧亚种葡萄中的白粉菌抗性提供基因

本发明涉及白粉菌(Erysiphe necator)抗性赋予基因，包含该抗性赋予基因的植物、植物部分和种子以及其用于选择抗白粉菌植物的用途。

白粉菌，也被称为葡萄白粉菌(Uncinula necator)，是一种在葡萄中引起白粉病症状的真菌。真菌是葡萄属物种的常见病原菌，葡萄属物种最重要的物种是欧亚种葡萄(Vitis vinifera)或葡萄(grapevine)。

葡萄需要大量的农药，特别是杀真菌剂，来防止产量损失。在1992年至2003年期间，在法国、意大利、西班牙和德国销售的杀真菌剂，有73％用于葡萄保护，这种作物仅占经考虑的国家的农业用地的8％(EUROSTAT，2007年)。

在世界上，由真菌白粉菌引起的葡萄白粉病(PM)是葡萄经济最相关疾病之一。白粉菌是一种专性活体营养，能够感染葡萄的所有绿色组织，并在产量和浆果质量方面造成重大损失。白粉病症状是叶子的上下表面覆盖有白色或灰色粉末。果实感染导致浆果干皱或开裂。果实质量严重受损，酸度增加，花青素和糖含量下降。

频繁使用化学杀真菌剂控制了白粉病。但是，频繁使用化学杀真菌剂有几个缺点。首先，已有文件很好地记载了杀真菌剂对环境的影响。第二，在一些地区，化学品及其应用的成本可以达到葡萄生产总支出的20％。第三，Baudoin et al.(2008年)和Dufour et al.(2011年)已经记载了病原菌的抗性群的发展，其大大降低了化学处理的功效。因此，开发新的替代化学处理的方法引发越来越多的关注。

抗PM品种的产生是使可持续的葡萄种植成为现实可能同时维持种植者的收入的最佳选择之一。在加利福尼亚对“霞多丽”产量进行的研究表明，使用抗PM品种可以为种植者节省大约720美元/公顷，并且杀真菌剂的使用量大大减少(Fuller et al.,2014)。

大部分欧洲葡萄品种(欧亚种葡萄Vitis vinifera)，包括世界上最好，种植最广的酿酒葡萄和食用葡萄品种，都对PM很敏感(Gadoury et al.，2003)。相反，北美葡萄属物种与白粉菌共同进化并对病原菌具有不同程度的抗性(Fung et al.，2008)。这种抗性可以通过将欧亚种葡萄与其中一种美洲葡萄抗性品种杂交而渗入，但是在葡萄中育种是一个缓慢的过程，并且在以前，生产者和消费者对抗性杂种的接受有限(Fuller et al.，2014)。技术(如遗传转化或高通量标记辅助选择)的应用可用于获得对于生产者和消费者来说具有理想葡萄属性的葡萄抗性品种(Feechan et al.，2013a)。

开发抗性植物最常见的策略集中于抗性基因(R基因)的渗入。R基因编码识别病原菌效应子并触发防卫反应的蛋白质，由植物激素在其中起主要作用的信号传导网络介导(Pavan et al.，2010)。抗性表现为感染部位的局部过敏反应(Bari和Jones，2009)。由R基因赋予的抗性几乎不持久，因为病原菌效应子的突变允许其克服抗性(Parlevliet etal.，1993)。

另一种方法是以易感基因(S基因)的失活为基础，易感基因定义为其功能丧失导致隐性遗传抗性的基因(Pavan et al.，2010)。一些病原菌能够通过激活植物蛋白来抑制植物防御，这些功能是植物免疫系统的负调控。编码这些植物蛋白的基因被称为易感基因(S基因)且其敲除释放了对植物防御的抑制并导致抗性(Pavan et al.，2010)。S基因的缺点是有时与敲除有关的多效表型(Pavan et al.，2011)。霉菌基因座O(MLO)基因是PM S基因的典型例子。

由于敲除MLO基因而产生的抗性(mlo抗性)是1992年在大麦中发现的(1992)，长期以来被认为是一种独特的抗性形式。然而，进一步的研究表明，MLO基因在整个植物界中大部分是保守的，其功能缺失导致在几个物种如拟南芥(Consonni et al.，2006)、豌豆(Pavan et al.，2011)、番茄(Bai et al.，2008)和辣椒(Zheng et al.，2013)中的抗性。并非所有的MLO基因都是S基因，MLO家族成员分为七个进化枝(Acevedo-Garciaet al.，2014；Pessina et al.，2014)。只有两个进化枝含有S基因：进化枝IV含有所有单子叶植物S基因(Panstruga et al.，2005；et al.，2010)；进化枝V含有所有双子叶植物S基因(Consonni et al.，2006；Bai et al.，2008；Feechan et al.，2008；Winterhagen et al.，2008)。并非所有的进化枝IV和V成员都是S基因。

发明内容

考虑到白粉菌感染对葡萄生产的经济影响，本领域对白粉菌抗性提供基因一直有需求。

除其它目的之外，本发明的目的是满足本领域的这种需求。

根据本发明，，通过提供所附权利要求书中概述的受损的白粉菌抗性提供基因来满足除其它目的之外的上述目的。

具体而言，根据本发明的第一方面，通过提供白粉菌抗性赋予基因来满足除其它目的之外的上述目的，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的一级氨基酸序列，或在本发明抗性赋予基因受损的条件下与SEQ ID No.1具有超过70％同一性，优选超过80％同一性，更优选超过90％同一性，最优选超过95％同一性的一级氨基酸序列。

或者，根据本发明的第一方面，通过提供白粉菌抗性赋予基因来满足除其它目的之外的上述目的，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的一级氨基酸序列，或在本发明抗性赋予基因受损的条件下与SEQ ID No.2具有超过70％同一性，优选超过80％同一性，更优选超过90％同一性，最优选超过95％同一性的一级氨基酸序列。

又或者，根据本发明的第一方面通过提供白粉菌抗性赋予基因来满足除其它目的之外的上述目的，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的一级氨基酸序列，或在本发明抗性赋予基因受损的条件下与SEQ ID No.3具有超过70％同一性，优选超过80％同一性，更优选超过90％同一性，最优选超过95％同一性的一级氨基酸序列。

本文使用的序列同一性定义为，在本发明序列的全长上相同的连续一致的核苷酸或氨基酸的数目除以本发明序列全长的核苷酸或氨基酸的数目，并乘以100％。例如，与SEQID No.1具有80％同一性的序列，包含在SEQ ID No.1的539个氨基酸总长度上有431或432个相同的一致氨基酸，即430或431/539*100％＝80％。

根据本发明的受损的抗性赋予基因，意在表示对白粉菌提供降低的或甚至不存在的易感性的基因，如叶和茎上的粉状斑点所示。

根据本发明的受损的抗性赋予基因是突变的基因。目前的基因中的一个或多个突变可以通过不同的机制导致受损。例如，编码蛋白质的DNA序列中的一个或多个突变可导致突变的、截短的或非功能性蛋白质。非编码DNA序列中的一个或多个突变可导致选择性剪接、翻译或蛋白质运输。或者，导致基因转录活性改变的一个或多个突变决定了可用于翻译成蛋白质的mRNA的量，由于编码蛋白质水平低或完全不存在，可导致抗性。此外，本发明的基因的受损可能是在翻译后引起的，即在蛋白质水平上。

在本文中，受损也表示为编码非功能性基因或蛋白质。虽然本发明基因的功能尚未确定，但通过在植物中建立白粉菌抗性(非功能性)或白粉菌易感性(功能性)，可以容易地确定非功能性基因或蛋白质。抗白粉菌(非功能性)植物通过包含这样的基因来表示：相比SEQ ID Nos.1或2或3该基因在蛋白质水平上突变或观察到包含SEQ ID Nos.4或5或6的mRNA的水平降低。

功能性和非功能性基因或蛋白质也可以使用互补实验来确定。例如，在组成型启动子的控制下用本发明基因拷贝转化抗白粉菌的欧亚种葡萄植物将导致白粉菌易感性欧亚种葡萄植物。

根据本发明，该白粉菌抗性赋予基因在受损时提供白粉菌抗性。根据本发明，受损可以通过在本文中由SEQ ID Nos.1或2或3确定的蛋白质的缺失或减少来指示。在本领域中，已知许多机制导致基因在转录、翻译或蛋白质水平的受损。

例如，在转录水平的受损可以是转录调控序列(例如启动子、增强子、起始、终止或内含子剪接序列)中一个或多个突变的结果。这些序列通常位于SEQ ID Nos.4和5和6表示的编码序列的5'、3'或内部。受损也可以由本发明基因的缺失、重排或插入来提供。

翻译水平的受损可以通过提前终止密码子或其他RNA至蛋白质的控制机制或翻译后修饰影响(例如，蛋白质折叠或细胞运输)来提供。

蛋白质水平的受损可以通过截短的，错误折叠的或受干扰的蛋白质-蛋白质相互作用来提供。

根据本发明的受损通过减少或缺失根据SEQ ID Nos.1或2或3的功能性蛋白来指示，而不依赖于潜在机制。

鉴于此，根据本发明第一方面的一个实施例，根据本发明的受损包括在本发明基因中的一个或多个突变，其分别导致具有SEQ ID No.1所示的一级氨基酸序列的蛋白质表达产物或包含SEQ ID No.4的mRNA的缺失；或者，具有SEQ ID No.2或3所示的一级氨基酸序列的蛋白质表达产物或者包含SEQ ID No.5或6的mRNA的缺失。

根据本发明的第一方面的另一个实施例，本发明的受损包括在本发明基因中的一个或多个突变，其导致非功能性的蛋白质表达产物。

根据本发明该第一方面的另一个实施例，本发明的受损包括转录水平降低，其导致包含SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的mRNA水平降低。

根据本发明的第一方面的又一个实施例，本发明的受损包括含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6的mRNA的翻译水平降低。

根据本发明的一个特别优选实施例，本发明的白粉病抗性赋予基因来源于欧亚种葡萄。

根据第二方面，本发明涉及欧亚种葡萄植物，其在基因组中包含如上所述的受损的白粉菌抗性赋予基因，其中该受损提供白粉菌抗性。

根据本发明第二方面的一个优选实施例，与对白粉菌敏感的欧亚种葡萄植物相比，本发明的欧亚种葡萄植物显示，本发明的白粉菌抗性赋予基因的表达或转录降低了至少10％，优选地，其中与对白粉菌敏感的欧亚种葡萄植物相比，表达或转录降低了至少20％，优选至少30％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，最优选至少80％，例如25％、35％、40％、45％、55％、60％、65％或75％。

根据本发明第二方面的另一个优选实施例，本发明的欧亚种葡萄植物显示，本发明的白粉菌抗性赋予基因的缺失表达或转录。

根据本发明第二方面的一个特别优选的实施例，本发明的欧亚种葡萄植物在其基因组中包含，编码具有SEQ ID No.1的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因；和编码具有SEQ ID No.2的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.2具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因；和/或编码具有SEQ ID No.3的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.3具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因。根据一个特别优选的实施例，根据制备方法不同，本发明涉及以下欧亚种葡萄植物：其包含与受损的VvMLO6或VvMLO11基因组合的受损的VvMLO7基因，或包含与受损的VvMLO6和VvMLO11基因组合的受损的VvMLO7基因。

根据第三方面，本发明涉及本发明的抗白粉菌植物的种子、植物部分或繁殖材料，所述种子、植物部分或繁殖材料在其基因组中包含提供白粉菌抗性的本发明的一个或两个受损的白粉菌抗性赋予基因。

根据第四方面，本发明涉及由SEQ ID Nos.4或5或6表示的分离的核苷酸序列，或与其具有超过70％同一性，优选超过80％同一性，更优选超过90％同一性，并且最优选超过95％同一性的核苷酸序列。

根据第五方面，本发明涉及由SEQ ID Nos.1或2或3表示的分离的氨基酸序列，或与其具有超过70％同一性，优选超过80％同一性，更优选超过90％同一性，并且最优选超过95％同一性的氨基酸序列。

根据第六方面，本发明涉及本发明的白粉菌抗性赋予基因的用途，用于选择抗白粉菌欧亚种葡萄植物应用的本发明的分离的核苷酸序列或本发明的分离的氨基酸序列使用，例如本发明序列来开发分子标记。

附图说明

将在以下特别优选实施例中进一步详细描述本发明。在该实施例中，参考了附图，其中：

图1：显示对照(EVB)和转基因株系(TLB1、TLB2、TLB3、TLB4、TLB5、TLB6和TLB7)中接种了白粉菌的葡萄的病程曲线下面积(AUDPC)。报道了从两次实验的8-19个生物学重复样计算出的AUDPC值的平均分数。误差棒显示平均值的标准误差。根据Tukey或Games-Howell事后检验，星号表示相对于对照株系EVB有统计学显著差异(P＝0.05)。接种30天后收集每个株系的代表性叶片的图片。

图2：显示对照株系EVB(A)和抗性转基因株系TLB4(B)中的白粉菌分生孢子的萌发。在接种白粉菌后第3天、10天和21天(dpi)获得的感染叶片的显微图像。插入高倍突出显示的在3dpi和10dpi时白粉菌分生孢子的萌发。

图3：显示对照株系EVB(A，B)和抗性转基因株系TLB4(C，D)中乳突的形成。在接种后第3天(dpi)用明视场(A，C)和荧光(B，D)显微镜拍摄的显微图像。箭头表示乳突(P)。四个图像的比例尺是相同的。

图4：显示四个葡萄MLO基因在之后要接种白粉菌的6个mlo株系(TLB1、TLB2、TLB3、TLB4、TLB5和TLB6)中的基因表达。在接种前(0dpi；浅灰色)，接种后第1天(深灰色)和第10天(白色)分析VvMLO6(A)、VvMLO7(B)、VvMLO11(C)和VvMLO13(D)的表达。记录了从两个实验汇集的5至9个植物计算出的每个株系的平均分数。误差棒显示了平均值的标准误差。根据Tukey或Games-Howell事后检验，对于每个时间点，符号突出显示了相对于对照EVB有显著差异：*为0dpi，+为1dpi和#为10dpi。

图5：显示对照株系EVB和抗性株系TLB4中的13个葡萄基因在三个时间点处的相对表达。色标表示相对于0dpi处的对照EVB计算出的相对表达值，其用作数据标准化的参考。根据Fisher事后检验，星号突出表示统计学上的显著差异。一个和两个星号分别表示在P＝0.05和P＝0.01时的显著性。采用Multiexperiment Viewer软件以相对表达数据的Log2作图。

具体实施方式

实施例

材料和方法

用于葡萄转化的构建体

用特异性引物对(表1)扩增4个MLO靶基因VvMLO6、VvMLO7、VvMLO11和VvMLO13的300-600bp的片段，并将其克隆到载体pENTR/SD-TOPO(Invitrogen)中。

表1用于扩增RNAi构建体的MLO基因片段的引物。

基因#	正向引物	反向引物
			VvMLO6	CACCTGCTTACAGTATTACAAACTCCC	TTTCCCTTGCATACCTAAAC
VvMLO7	CACCGACAATTTTTAACGAGAGAGT	ATCTCATGTTGGGTTCGGATT
			VvMLO11	CACCTCACTTATGCTACTGGGGTT	ATCAACTTTGGGAACTGATCTGAC
VvMLO13	CACCGAGCTAATGTTGCTAGGGTT	AAATTTTGCATGGCTTTGAG

序列验证后，使用Urso等(2013年)描述的步骤将四个基因片段克隆到RNAiGateway载体pK7GWIWG2D(II)(Karimi et al.2002；http://www.psb.ugent.be/)中。如Zottini等(2008年)所述，通过在两条链上测序验证最终的构建体，并将其克隆到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101中。通过PCR(GoTaq Green Master Mix-Promega，Fitchburg，USA)测试根癌农杆菌转化的细胞，以使用设计用于在35S启动子和MLO片段(5’-CGCACAATCCCACTATCCTT–3’)上退火的特异性引物来确认该构建体的存在(表1)。

植物材料和转化

葡萄转化使用欧亚种葡萄品种Long-Cluster Brachetto的体细胞胚。将植物材料在20-24℃和70±5％的相对湿度(RH)下在暗生长室中体外培养。转基因植物的植物转化、再生和选择如Dalla Costa等(2014)所述进行。共进行了五个转化：四个旨在使四个MLO靶基因沉默，一个用空载体(pK2WG7)作为对照。

筛选再生剂和体外材料的繁殖

使用Illustra Nucleon Phytopure试剂盒(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)从体外叶片组织中提取基因组DNA。用与用于确认在根癌农杆菌中存在构建体的相同的引物来评估转基因整合。将确定具有转基因插入的体外株系移至木本植物(WP)培养基(McCown和Lloyd，1981)中，放于生长室(20-24℃，70±5％RH)中，并每月一次转移到新培养基中。

温室驯化

在生长室(25℃，白天16小时/晚上8小时，湿度70±5％)中进行渐进过程使植物适应温室条件。将根器发达(至少两根主根，3cm长)的一个月月龄的植物转移到含有湿的经高压灭菌的草皮(Terriccio Vegetal Radic-Tercomposti Spa，意大利Brescia，TerrescioSpa)的250ml塑料杯中并用石蜡膜密封，以保存湿度。每隔7天在石蜡膜层上做一个或两个孔，逐步降低环境湿度，促进叶表皮的形成。三周后，完全去除石蜡膜密封件，一周后，将植物转移到1L的盆中并在温室条件(25℃，白天16小时/晚上8小时，湿度70±5％)下生长。

白粉菌接种和病害严重度评估

从意大利北部未经处理的葡萄园(特伦蒂诺地区)中的感染叶片获得PM接种物，并通过随后在温室条件下在葡萄“Pinot Noir”植物上接种来维持。通过从携带新孢子白粉菌的感染的幼嫩叶片轻轻地刷到目标叶片上(Blaich et al.，1989)，用PM对该植物进行干燥接种。将接种的植物在25℃、相对湿度(RH)为100％的温室中培养6小时，以促进真菌穿入叶片中，然后保持在25℃、相对湿度为70±10％，直到最后症状的评估。根据欧洲和地中海植物保护组织(EPPO，1998)的标准指南，在接种后14天、22天和30天(dpi)，用肉眼评估所有叶片的病害严重度。

病害严重度表示为被PM菌丝体覆盖的近轴叶片面积相对于总叶片面积的比例(0至100％的百分比，每隔5％)，并且计算每株植物的平均值。进行了两个接种实验。对于每个实验，以随机完全区组设计分析每个株系的3至9个生物学重复样(植物)。根据下式计算病害严重度的降低：[(对照植物中的病害严重度-经处理植物中的病害严重度)/对照植物中的病害严重度]×100。为了同时分析所有的时间点，我们使用病程曲线下面积(AUDPC)，这是随时间推移的病害强度的定量总和(Campbell和Madden，1990；Madden et al.，2007)。

为了评估病害严重度，根据Angeli等(2012)的描述并稍作修改，评估感染叶片产生的白粉菌分生孢子的数量。在30dpi从每个重复样中收集三片叶子，每个叶片切割四个直径为0.8cm的圆盘，总共12个圆盘用于重复样。将叶片圆盘转移至含有5mL蒸馏水以及0.01％吐温80(Sigma-Aldrich，Sant Louis，USA)的50mL管中。将管涡旋1分钟，并在光学显微镜下用血球计数器测定每毫升分生孢子浓度。最终按照每平方厘米(cm²)葡萄叶片的分生孢子转化分生孢子量。

组织学分析

从3,10和21dpi的每个转基因和对照株系的3个生物学重复样中收集两个接种的叶片，并进行组织学分析。为了观察真菌菌丝，清洁叶子并染色，如Vanacker等(2000)所述并作如下变化：将叶子切成小块，将近轴表面朝上放在用乙醇：冰醋酸混合物(3:1，v/v)润湿的滤纸上，直到叶绿素被除去。将叶块转移到浸有水的滤纸中2小时，然后转移到显微镜载玻片上，并将一滴苯胺蓝(占乳糖甘油中的0.1％[w/v])吸移到叶片表面上。使用LeicaLMD6500显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)的明场照明使菌丝显现。

为了检测乳突，在乙醇：冰醋酸混合物(3:1，v/v)中清洁叶片直到叶绿素被除去，并在含有乳酸、甘油和水(1:1:1)的溶液中平衡过夜。使用Leica LMD6500显微镜(LeicaMicrosystem，Wetzlar，德国)的LMD滤波器(BP滤波器380-420nm激发，415分色镜和BP445-485nm发射)使乳突显现。

样品收集，RNA提取和基因表达分析

首先对体外转基因植物进行基因表达分析，以鉴定沉默的株系，收集三个生物学重复样。对于在驯化的转基因植物上进行的第二次分析，在接种前、接种后24小时和10天后立即收集叶片样品。选择这些时间点是因为与白粉菌感染期间MLO基因的上调有关(Feechan et al.，2008；Winterhagen et al.，2008)。对于每个时间点的每个株系，从五个不同的植物收集叶片样品。每个样品包含来自同一植物的两片半叶；只收集从枝条顶端起第三和第五节的叶子。立即将样品冷冻在液氮中，并保存于80℃。

用Spectrumtm植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)提取总RNA，用DNAse I(Sigma-Aldrich)处理并使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen，Life Technologies，Waltham，USA)进行逆转录。

使用Advanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad，Hercules，USA)以15μL反应体积用特异性引物(表2)进行qPCR分析。，使用由CFX Manager软件运行CFX96 TouchReal-Time PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，USA)。

表2用于扩增MLO基因片段以进行qPCR分析的引物。

该软件以自适应基线应用比较性量化。样品在两个技术重复样中运行，热循环参数如下：95℃3分钟，然后以95℃10秒和55℃30秒进行40个循环，最后一步为95℃10秒。用于VvMLO6、VvMLO11和VvMLO13的基因表达分析的引物从Winterhagen等(2008)中获得，而对于VvMLO7，我们设计了特定引物对(表2)。还分析了调节植物与PM之间的相互作用的标记基因的表达。从Guo et al.(2014)中获得用于VvWRKY19、VvWRKY27，VvWRKY48和VvWRKY52的引物，从Gao et al.(2014)获得用于VvEDS1的引物，从Dufour et al.(2013)获得用于VvPR1，VvPR6和VvLOX9的引物。用NCBI引物设计工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)来设计新的引物对(表2)。使用cDNA的四个连续稀释(1/10-1/100-1/1000-1/10000)来计算引物对的效率，通过琼脂糖凝胶电泳来确认产物的大小。在每次qPCR运行(温度从65℃到95℃递增(每步0.5℃，5秒))后，确定特定最终解离曲线的存在。

对照基因是延伸因子1α(GenBank登录号EC959059)，GAPDH(GenBank登录号CB973647)和肌动蛋白(GenBank登录号AY6807019)，其被认为是葡萄的对照(Reid et al.，2006)。在这项工作中，使用GeNorm软件(medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/)确认了这些基因的稳定性。所有三个对照基因的M值均低于0.5，而当M值低于1.5时通常认为足够稳定(Ling and Salvaterra,2011；Van Hiel et al.，2009；Strube et al.，2008)。

用Hellemans et al.(2007)提出的系统将阈值周期(Ct)转换为相对表达，使用两个技术重复样的平均Ct作为输入。Hellemans方法考虑了每个引物对的效率值。对于MLO基因的表达，我们使用所有样品的平均Ct作为对照Ct，而对于涉及植物防卫或mlo抗性的其他基因的分析，我们使用在T＝0时的对照EVB。由于图形原因选择了两种不同的方法。

统计分析

病害严重度

使用Statistica 9软件(StatSoft，Tulsa，USA)和统计软件包SPSS(IBM，Armonk，USA)分析严重度数据。最小的统计单位是整株植物。我们对植物所有叶片的严重度值取平均值，并将所得的平均严重度用于进一步分析。将正态分布的数据(Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验，P>0.05)进行了方差齐次性检验(Levene的检验，P>0.05)，随后用Tukey的事后检验进行单因素方差分析(ANOVA)以检测在每个时间点的显著差异(P<0.05)。为了满足方差分析的先决条件，用以下等式y＝arcsin(x)将数据进行变换。在非齐次方差的情况下，使用Games-Howell的事后检验。

合并两个实验的数据，对于三个时间点(14,22和30dpi)，独立地进行分析。如上所述分析了AUDPC数据用于严重度数据。用Kruskall-Wallis检验分析了分生孢子数数据(P<0.05)。

qPCR数据分析

对于基因表达分析，根据等式Y＝ln(x)(Pessina et al.，2014)将相对表达值按对数尺度转换，以获得残余方差的正态分布和齐次性，并用Shapiro-Wilk(P≤0.05)和Levene(P≤0.05)检验评估。用Tukey's检验(P<0.05)对同方差数据进行成对比较，而采用统计软件包SPSS(IBM)用Games-Howell检验(P<0.05)对非方差数据进行分析。

对两个实验中MLO基因的相对表达进行独立分析并随后进行汇总。为了评估表达差异，采用Tukey事后检验(P<0.05)用单因素方差分析来检测每个时间点的显著差异。此外，所有数据均使用Tukey事后检验(P<0.05)进行双因素方差分析，以同时考虑转基因株系和时间点的影响。只有当时间点和转基因株系因素之间没有显著的相互作用(P>0.05)时，我们才从这个测试中得出结论。对于TLB4的基因表达表征，我们使用Fisher作为事后检验。

相关性

我们使用Pearson双尾相关性检验来调查两种可能的相关性：30dpi的病害严重度和分生孢子量之间以及14dpi的病害严重度和10dpi的MLO基因的相对表达之间。在这两种情况下，所有数据、严重度和相对表达已用以下等式y＝arcsin(x)进行变换，以实现正态分布。

结果

MLO转基因株系的转化、选择和驯化

共进行了5个基因转移。4个旨在敲低(KD)特异性MLO基因(i＝KD-VvMLO6，ii＝KD-VvMLO7，iii＝KD-VvMLO11，iv＝KD-VvMLO13)，第5个旨在插入空载体。获得了34个再生株系，其中26个确认含有插入物(表S3)。图S1显示了6个株系的PCR分析结果。在体外繁殖26个转基因株系，并用qPCR测试MLO基因的沉默。这证明8个中的3个株系来自基因转移(iii)(KD-VvMLO11)，且9个中的3个株系来自基因转移(iv)(KD-VvMLO13)。基因转移(i)(KD-VvMLO6)和(ii)(KD-VvMLO7)导致少量表现出不降低表达的再生株系(表S3)。对再生株系也进行了脱靶沉默测试，显示RNAi片段靶向其他进化枝V MLO基因。选择具有各种沉默基因组合的6个株系，并用首字母缩略词TLB1(Brachetto转基因株系)至TLB6表示(表S3)。TLB1至3的株系来自基因转移(iii)(KD-VvMLO11)，TLB4至TLB6的株系来自基因转移(iv)(KD-VvMLO13)(表S3)。对照是EVB株系(空载体Brachetto)。此外，还考虑了不降低表达的再生株系TLB7在文中。将包括对照在内的所有株系称为“转基因株系”。来自TLB1到7的株系进一步表示为“RNAi株系”，来自TLB1到6的株系表示为“mlo株系”。

进入驯化过程的植物的存活率为85％左右。在温室条件下，转基因植物表现出正常生长，无有多效表型。

转基因株系的白粉病抗性

在两个独立的实验中对7个RNAi株系(TLB1、TLB2、TLB3、TLB4、TLB5、TLB6、TLB7)和转基因对照株系EVB进行PM接种。3个mlo株系，TLB4、TLB5和TLB6显示出白粉菌感染显著降低(图1)，其大于在30dpi时的60％(表3)。

表3：7个RNAi株系的病害减少。

*EVB株系用作对照(12个重复样)，病害减少按(EVB的病害严重度-转基因株系的病害严重度)/EVB的病害严重度×100计算。

^#TLB7的负值意味着与EVB相比，该株系表现出更高的感染水平。

TLB6的病害减少随着感染的进展而下降(表3)，可能是由于来自附近感染植物的二次感染。TLB2、TLB3和TLB7显示出与EVB对照相当的PM易感性水平(图1和表2)。图1中的叶片显示了抗性和易感株系之间的差异。所有的mlo株系在30dpi时表现出叶片表面分生孢子的减少，并且仅TLB4、TLB5和TLB6的降低具有统计学显著性。与EVB植物相比，TLB4分生孢子减少93％，TLB5减少95％，TLB6减少72％。分生孢子数与病害严重度呈正相关(P＝0.01)，Pearson相关系数为0.578。这意味着叶片症状的减少反映了抗性株系中分生孢子数量的减少。

通过组织学分析进一步表征了株系TLB4，在3dpi时与EVB植物相比，PM感染的进展减慢(图2)。在EVB中，第一个分生孢子在10dpi时出现，并且在21dpi时它们遍布叶片表面(图2A)。另一方面，在TLB4叶片上，分生孢子仅在21dpi时可见，且仅有少量(图2B)。在3dpi时在TLB4和EVB中观察到了乳突的形成(图3)。EVB的乳突已经有明显的边缘，并且它只与白粉菌的感染部位相应出现(图3B)。相反，与EVB相比，在TLB4中检测到的乳突更弥散、更大，并且在多于一个真菌感染部位形成(图3D)。

MLO基因在MLO转基因株系中的表达及其与严重度的相关性

通过基因表达分析检测6个mlo株系(TLB1、TLB2、TLB3、TLB4、TLB5、TLB6)和对照EVB。转基因株系中4个进化枝V MLO基因的基因表达分析证实了体外观察到的脱靶沉默，并在时间点显示了一些变异性(图4)。株系TLB1、TLB2和TLB3全部用旨在使VvMLO11沉默的构建体来转化，其确实使靶基因VvMLO11沉默。TLB1也显示了VvMLO13的沉默，且TLB3显示了VvMLO6的沉默(表4)。

表4：4个MLO基因的相对表达^#

	VvMLO6	VvMLO7	VvMLO11	VvMLO13
					TLB1	67％	72％	25％**	49％**
TLB2	79％	94％	40％**	156％
					TLB3	71％*	93％	27％**	69％
TLB4	38％**	49％**	34％**	33％**
					TLB5	35％**	55％**	50％**	88％
TLB6	42％**	53％**	55％**	45％**

^#每个相对表达(RE％)值是两个实验的三个时间点(0dpi，1dpi，10dpi)的值的平均值。

RE％按如下计算：RE％＝(对照EVB的RE/mlo株系的RE)*100。

*根据Tukey事后检验，统计学显著差异P＝0.05。

**根据Tukey事后检验，统计学显著差异P＝0.01。

来自旨在使VvMLO13沉默的转化的株系TLB4、TLB5和TLB6显示更多的脱靶沉默。在TLB4和TLB6中，所有4个进化枝V MLO基因都被沉默，而在TLB5中，VvMLO6、VvMLO7和VvMLO11被沉默(表4)。

已发现VvMLO7的相对表达与PM症状的严重度之间具有统计学显著(P＝0.05)的Pearson正相关性，但是对于其他三个MLO基因则没有。VvMLO7的Pearson相关系数为0.272，这意味着相关性虽然显著，但较弱。

mlo株系TLB4的基因表达分析

在三个时间点，对抗性株系TLB4的在PM感染后调节的13个基因进行表达谱分析(图5)。选择株系TLB4是因为它使全部4个MLO进化枝V基因沉默。在EVB中，特别是在10dpi时，我们观察到基因的普遍上调。相反，在转基因株系TLB4中，较少的基因被上调，上调的强度(以倍数变化而言)有限。此外，在接种后，TLB4中的三个基因被下调，即在1dpi时为VvPR6(PATHOGENESIS RELATED)和在10dpi时为VdNPF3.2(NITRATE TRANSPORTER/PEPTIDETRANSPORTERFAMILY)和VvALS1(ACETOLACTATE SYNTHASE)。值得注意的是，在接种之前，TLB4与对照EVB之间的表达没有差异。

讨论

MLO基因的功能缺失突变降低了大麦(Büschges et al.，1997)、拟南芥(Consonniet al.，2006)、豌豆(Pavan et al.，2011)、番茄(Bai et al.，2008)，小麦(Wang et al.，2014)和辣椒(Zheng et al.，2013)中对PM的易感性。因为在双子叶植物中所有进化枝VMLOS基因都与PM易感性有关(Consonni et al.，2006；Bai et al.，2008；Feechan et al.，2008；Winterhagen et al.，2008)，这项工作的目的在于确定葡萄的哪个进化枝V MLO基因在PM易感性中起作用，并因此可以使其失活以开发抗性基因型。在26个转基因株系中，来自基因转移(iii)(KD-VvMLO11)和(iv)(KD-VvMLO13)的6个转基因株系支持显著的基因敲低。在从基因转移(i)(KD-VvMLO6)和(ii)(KD-VvMLO7)获得的再生株系中，表达的降低并不明显。不能排除这是由于构建体中存在短RNAi片段(Preuss和Pikaard，2003)。由于进化枝VMLO基因具有高水平的序列同一性，在上述6个株系中的5个中检测到脱靶沉默是意料之中的(36-60％，平均为46％；Feechan et al.，2008；Winterhagen et al.，2008)。在具有高度序列相似性的基因家族中寻找特异性(短RNAi片段)和有效性(长RNAi片段)之间的平衡特别困难(Zhao et al.，2005)。由于目的在于研究4种彼此非常相似的MLO基因的敲低效果，我们选择了长RNAi片段，所以脱靶沉默不仅是意料之中的，也是所期望的。MLO基因的敲除和敲低可诱导多效表型，如叶片上的坏死斑点和大麦的减产(1992)、拟南芥的缓慢生长(Consonni et al.，2006)、辣椒的植株减小(Zheng et al.，2013)。在所采用的实验条件下，在葡萄中没有观察到多效表型。TLB4、TLB 5和TLB 6对PM显示出明显抗性，从而允许研究抗性与特异性MLO基因表达之间的联系。在易感和抗性mlo株系中，VvMLO11表达显着降低：结论是其敲低与葡萄对PM的易感性没有直接联系。VvMLO6在抗性株系TLB4、TLB5和TLB6以及易感株系TLB3中显著沉默。与VvMLO11一样，在易感和抗性株系中VvMLO6的敲低表明这不应该是S基因。与VvMLO6相似，VvMLO13在抗性株系TLB4和TLB6中被敲低，但在易感株系TLB1中也被敲低。VvMLO7仅在3个抗性株系TLB4、TLB5和TLB6中被敲低；结论是VvMLO7代表造成欧亚种葡萄的PM易感性的主要候选物。在MLO转基因株系中，VvMLO7的相对表达与病害严重度之间的显著正相关激发了这样的结论：定点突变或寻找天然非功能性等位基因可用于育种计划以获得PM抗性基因型。然而，应该注意，VvMLO7总是与其他两个或三个MLO基因一起被敲低。同样在拟南芥中，同时敲除三个MLO基因对获得完全抗性是必要的：敲除AtMLO2产生中等水平的抗性，而单独或组合敲除AtMLO6和AtMLO12不会降低感染强度。当AtMLO2与AtMLO6或AtMLO12一起被敲除时，抗性水平上升，当三个基因一起被敲除时变成完全抗性(Consonni et al.，2006)。在葡萄中，VvMLO7似乎像拟南芥的AtMLO2一样起作用。在葡萄的PM易感性中起加性和协同作用的两个候选物是VvMLO6和VvMLO11，因为其表达在所有三个抗性株系中显著降低。在拟南芥中，三个MLO基因的敲除诱导完全抗性(Consonni etal.，2006)，这种情况在葡萄中没有观察到，这与通过RNAi方法获得的MLO基因的不完全沉默一致。在拟南芥mlo三突变体中进行的互补测试表明，VvMLO11和VvMLO13诱导对PM的易感性，而VvMLO7只有部分作用，而VvMLO6根本没有作用(Feechan et al.，2013b)。然而，通过RNAi获得的欧亚种葡萄的单和双VvMLO11和VvMLO13敲低突变体没有显示PM渗入的显著降低(Qiu et al.，2015)。因此，我们的数据表明VvMLO7是葡萄的主要S基因，具有由VvMLO11和VvMLO6提供的推定的加性效应。VvMLO6的作用特别令人惊讶，由于其在PM感染期间没有上调(Feechan et al.，2008；Winterhagen et al.，2008)。相反，预计VvMLO13会对PM易感性产生显著影响，但结果是不起作用。但是，应该考虑到Feechan et al.(2013b)是在异源体系(拟南芥)中操作，没有精确复制葡萄植物的PM感染。

MLO基因表达的降低最终导致对PM病原菌的抗性的确切机制尚不完全清楚。抗性似乎与分泌囊泡的运输(Miklis et al.，2007；Feechan et al.，2011)以及称为乳突的细胞壁附着物的形成有关(Consonni et al.，2006)。这些结构由富含蛋白质和自发荧光的酚类化合物的胼胝质基质组成(Vanacker et al.，2000)，其形成取决于内膜运输(Hückelhoven，2014)。本文结果表明，虽然乳突的形状和大小在抗性和易感株系中不同，但是所有的转基因株系积累了过度强加至乳突结构的自发荧光材料。众所周知，基于乳突的防卫反应在抗性和易感基因型之间在形成时间，组成和大小方面是不同的(Chowdhury etal.,2014；Hückelhoven,2014；et al.，2000)。mlo抗性大麦中乳突的快速形成(et al.，2000)和大小增加(Stolzenburg et al.，1984)与mlo抗性相关。在葡萄中，乳突形成局限于对照植物的感染部位，而在抗性株系TLB4中扩散。Chowdhury et al.(2014)表示，有效和无效乳突之间的差异是由于有效乳突具有较高浓度的胼胝质、纤维素和阿拉伯木聚糖。这表明，在葡萄的情况下，不同类型的荧光可以反映乳突组成的差异。已经提出MLO蛋白是在尝试PM渗透部位的囊泡相关和肌动蛋白依赖的防卫途径的负调节蛋白(Panstruga，2005)。此外，Miklis et al.(2007)提出，一旦MLO蛋白处于真菌的控制之下，肌动蛋白丝状体通过囊泡运输起到为生长的菌丝提供营养的作用。就好像如果病原菌能够控制物质向细胞壁的运输，则其改变乳突的组成，并将其从有效转变为无效。乳突的形成并不是MLO基因活性所激发的唯一过程。为了了解MLO敲低对参与植物-病原菌相互作用的其他基因的影响，分析了PM接种后已知差异表达的13个基因的表达。在抗性株系TLB4中，在不存在PM感染的情况下，MLO基因的敲低并不影响这13个基因的表达水平。在白粉菌感染下(Guo et al.，2014)，转录因子VvWRKY19，VvWRKY48和VvWRKY52上调：在我们的实验中相同基因在EVB中出现上调，但是它们在TLB4中水平低得多。VvNPF3.2是一种在感染了白粉菌的葡萄中上调的亚硝酸盐/硝酸盐转运蛋白(Pike et al.，2014)，其在TLB4中在10dpi时下调，表明在该株系中只有严重感染会诱发VvNPF3.2上调。VvEDS1(增强的疾病易感性)和VvPAD4(植物抗毒素不足)是参与水杨酸(SA)途径的葡萄防卫基因(Gao F.et al.，2014)。SA激活致病相关基因并诱导抗病性(Ward et al.，1991)。两种基因在对照株系EVB中在10dpi时上调(VvPAD4在1dpi时也是这样)。这可能表明，只有重度白粉菌感染触发依赖于SA的植物防卫。VvEDS1在TLB4中不上调，而VvPAD4仅在10dpi时上调，就像如果PM感染水平不足以激活植物的反应。也观察到VvPR1和VvPR6都在对照中上调而在TLB4中没有上调，VvPR1和VvPR6是致病相关基因，其参与植物防卫，并且已知在用SA类似物预处理的感染PM的葡萄叶片中上调(Dufour et al.，2013)。VvLOX1编码脂氧合酶，与拟南芥AtLOX2同源，拟南芥AtLOX2在感染了PM孢子的植物中上调(Lorek，2012)。令人惊讶的是，该基因在TLB4中在10dpi时上调，但在EVB中不上调。第二种脂氧合酶VvLOX9在所考虑的葡萄株系中未显示出来表达上有任何改变，尽管已知其参与了植物防卫(Dufour et al.，2013)。VvPEN1(渗入)编码与拟南芥AtPEN1和大麦ROR2同源的SNARE蛋白，其在PM渗入抗性中具有重要作用(Collins et al.，2003)。当在异源系统(拟南芥)中表达时，已知VvPEN1与VvMLO11在尝试PM渗入的部位共定位(Feechan et al.，20013b)。然而，感染白粉菌不会引起其表达的任何改变。VvALS1是番茄乙酰乳酸合酶的同源物，是氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的关键酶，并参与mlo介导的抗性(Gao D.et al.，2014)。mlo番茄中SlALS1的沉默降低了其抗性，表明氨基酸内稳态是与mlo抗性相关的重要过程(Gao D.et al.，2014)。完全缺乏转录变化表明该基因在葡萄中的功能不依赖于转录水平。MLO基因的敲除增加了大麦(Jarosch et al.，1999；Kumar et al.，2001)和拟南芥(Consonni et al.，2006)对其他病原菌的易感性。葡萄霜霉菌(P.viticola)是一种类似白粉菌的专性活体营养型真菌，其感染揭示了MLO基因的敲低并没有改变葡萄对霜霉病的易感性，从而支持了MLOs S基因对白粉菌具有特异性且不参与植物与葡萄霜霉菌的相互作用的结论。

结论

MLO基因的敲低显著降低了欧亚种葡萄的PM易感性。VvMLO7表达的降低是参与抗性的主要因素，但VvMLO6和VvMLO11敲低的加性效应进一步有助于降低PM的严重度。没有观察到绝对抗性，正如基于通过RNAi的MLO基因的不完全沉默所预期的一样。在mlo株系中，在温室条件下没有检测到多效表型。这项工作提供了一个重要的信息，可用于繁育抗白粉菌的葡萄品种。通过本文鉴定的MLO基因(特别是VvMLO7)的基因组编辑的标签，应该导致敲除突变体对PM的高抗性。或者，在欧亚种葡萄和非功能性MLO等位基因尤其是VvMLO7的野生物种中的搜索，应该有助于产生持久的抗性。

缩写：

AUDPC：病程曲线下面积

dpi：接种后天数

EVB：空载体Brachetto

PM：白粉病

Re:相对表达SA：水杨酸

TLB1-7＝转基因株系Brachetto 1-7

参考文献

Acevedo-Garcia J,Kusch S,Panstruga R:Magical mystery tour:MLOproteins in plant immunity and beyond.New Phytol 2014,204(2):273-81

Aist JR,Bushnell WR:Invasion of plants by powdery mildew fungi,andcellular mechanisms of resistance.The Fungal Spore and Disease Initiation inPlants and Animals.Edited by Cole GT,Hoch HC.New YorK:plenum press；1991:321–345.

Angeli D,Puopolo G,Maurhofer M,Gessler C,Pertot I:Is themycoparasitic activity of Ampelomyces quisqualis biocontrol strains relatedto phylogeny and hydrolytic enzyme production？Biological Control 2012,63；348–358

Bai Y,Pavan S,Zheng Z,Zappel N,A,Lotti C,De Giovanni C,Ricciardi L,Lindhout P,Visser RGF,Theres K,Panstruga R:Naturally occurringbroad-spectrum powdery mildew resistance in a Central American tomatoaccession is caused by loss of MLO function.MPMI 2008,21:30-39

Bari R,Jones JDG:Role of plant hormones in plant defenseresponses.Plant Mol Biol,2009,69:473–488.

Baudoin A,Olaya G,Delmotte F,Colcol JF,Sierotzki H:QoI resistance ofPlasmopara viticola and Erysiphe necator in the mid-Atlantic UnitedStates.Plant Health Prog 2008,doi:10.1094/PHP-2008-0211-02-RS.

Blaich R,Heintz C,Wind R:Studies on conidial germination and initialgrowth of the grapevine powdery mildew Uncinula necator on artificialsubstrates.Appl Microbiology Biotechnology 1989,30,(4),415-421

Bruce TJA,Pickett JA:Plant defense signaling induced by bioticattacks.Curr Opin Plant Biol 2007,10:387–392.

Büschges R,Hollricher K,Panstruga R,Simons G,Wolter M,Frijters A,vanDaelen R,van der Lee T,Diergaarde P,Groenendijk J,S,Vos P,Salamini F,Schulze-Lefert P:The barley Mlo gene:a novel control element of plantpathogen resistance.Cell 1997,88(5):695-705

Calonnec A,Cartolaro P,Poupot C,Dubourdieu D,Darriet P:Effects ofUncinula necatoron the yield and quality of grapes(Vitis vinifera)andwine.Plant Pathol 2004,53(4):434-445.

Campbell CL,Madden LV:Introduction to Plant DiseaseEpiderniology.John Wiley and Sons 1990,New York.532pp.

Chen Z,Noir S,Kwaaitaal M,Hartmann A,Wu MJ,Mudgil Y,Sukumar P,MudayG,Panstruga R,Jones AM:Two seven-transmembrane domain MILDEW RESISTANCE LOCUSO proteins cofunction in Arabidopsis root thigmomorphogenesis.Plant Cell2009,21:1972–1991.

Chowdhury J,Henderson M,Schweizer P,Burton RA,Fincher GB,Little A:Differential accumulation of callose,arabinoxylan and cellulose innonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected withBlumeria graminis f.sp.Hordei.New Phytol 2014,204:650-660

Collins NC,Thordal-Christensen H,Lipka V,Bau S,Kombrink E,Qiu JL,Huckelhoven R,Stein M,Freialdenhoven A,Somerville SC,Schulze-Lefert P:SNARE-protein-mediated disease resistance at the plant cell wall.Nature 2003,425,973–977.

Consonni C,Humphry ME,Hartmann HA,Livaja M,Durner J,Westphal L,VogelJ,Lipka V,Kemmerling B,Schulze-Lefert P,Somerville SC,Panstruga R:Conservedrequirement for a plant host cell protein in powdery mildewpathogenesis.Nature Genetics 2006,38(6):716-720.

Dalla Costa L,Pinto-Sintra AL,Campa M,Poletti V,Martinelli L,MalnoyM:Development of analytical tools for evaluating the effect of T-DNA chimericintegration on transgene expression in vegetatively propagated plants.PlantCell Tiss Organ Cult 2014 118:471–484

Devoto A,Piffanelli P,Nilsson I,Wallin E,Panstruga R,Von Heijne G,Schulze-Lefert P:Topology,subcellular localization,and sequence diversity ofthe Mlo family in plants.J Biol Chem 1999,274:34993–35004

Dufour MC,Fontaine S,Montarry J,Corio-Costet MF:Assessment offungicide resistance and pathogen diversity in Erysiphe necator usingquantitative real-time PCR assays.Pest Manag.Sci.2011,67,60–69.

Dufour MC,Lambert C,Bouscaut J,Mérillon JM,Corio-Costet MF:Benzothiadiazole-primed defence responses and enhanced differentialexpression of defence genes in Vitis vinifera infected with biotrophicpathogens Erysiphe necator and Plasmopara viticola.Plant Pathol 2013,62(2):370-382

EPPO:Guideline for the biological evaluation of fungicides:Uncinulanecator.EPPO Bulletin 1998,18:605-612.

Feechan A,Jermakow AM,Torregrosa L,Panstruga R,Dry IB:Identificationof grapevine MLO gene candidates involved in susceptibility to powderymildew.Funct Plant Biol 2008,35:1255–1266

Feechan A,Kabbara s,Dry IB:Mechanisms of powdery mildew resistance inthe Vitaceae family.Mol Plant Pathology 2011,12(3):263-274

Feechan A,Anderson C,Torregrosa L,Jermakow A,Mestre P,Wiedemann-Merdinoglu S,Merdinoglu D,Walker AR,Cadle-Davidson L,Reisch B,Aubourg S,Bentahar N,Shrestha B,Bouquet A,Adam-BlondonAF,Thomas MR,Dry IB:Geneticdissection of a TIR-NB-LRR locus from the wild North American grapevinespecies Muscadinia rotundifolia identifies paralogous genes conferringresistance to major fungal and oomycete pathogens in cultivatedgrapevine.Plant J 2013a,76,661–674

Feechan A,Jermakow AM,Ivancevic A,Godfrey D,Pak H,Panstruga R,Dry IB:Host cell entry of powdery mildew is correlated with endosomal transport ofantagonistically acting VvPEN1 and VvMLO to the papilla.Mol Plant MicrobeInteract.2013b,26(10):1138-50.

Fuller KB,Alston JM,Sambucci O:The Value of Powdery Mildew Resistancein Grapes:Evidence from California.Wine economics and policy 2014

Fung RWM,Gonzalo M,Fekete C,Kovacs LG,He Y,Marsh E,McIntyre L M,Schachtman DP,Qiu W:Powdery mildew induces defense-oriented reprogramming ofthe transcriptome in a susceptible but not in a resistant grapevine.PlantPhysiology 2008,146:236-249.

Gadoury DM,Seem RC,Ficke A,Wilcox WF:Ontogenic Resistance to PowderyMildew in Grape Berries.Phytopathology 2003,93:5,547-555

Gao D,Huibers RP,Loonen AE,Visser RGF,Wolters AM,Bai Y:Down-regulation of acetolactate synthase compromises Ol-1-mediated resistance topowdery mildew in tomato.BMC Plant Biol 2014,14:32

Gao F,Dai R,Pike SM,Qiu W,Gassmann W:Functions of EDS1-like and PAD4genes in grapevine defenses against powdery mildew.Plant Mol Biol 2014,86(4-5):381-93

Guo C,Guo R,Xu X,Gao M,Li X,Song J,Zheng Y and Wang X:Evolution andexpression analysis of the grape(V.vinifera)WRKY gene family.J Exp Bot 2014,65(6):1513-28

Hellemans J,Mortier G,De Paepe A,Speleman F and Vandesompele J:qBaserelative quantification framework and software for management and automatedanalysis of real-time quantitative PCR data.Genome Biol.2007,8:R19

Hückelhoven R:The effective papilla hypothesis.New Phytol 2014,204:438-440JH:Discovery,characterization and exploitation of Mlo powderymildew resistance in barley.Euphytica 1992,63:141–152.

Karimi M,Inze D,Depicker A:GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.Trends Plant Sci 2002,7:193–195

Kessler SA,Shimosato-Asano H,Keinath NF,Wuest SE,Ingram G,PanstrugaR,Grossniklaus U:Conserved molecular components for pollen tube reception andfungal invasion.Science 2010,330:968.

Ling D,Salvaterra PM:Robust RT-qPCR Data Normalization:Validation andSelection of Internal Reference Genes during Post-Experimental DataAnalysis.PLOS One 2011,6:3

M F,Newton AC,Atzema JL,Baker SJ:The Barley mlo-gene:animportant powdery mildew source.Agronomie 2000,20 745-756.

Lorek JA:Molecular characterization of mlo-based powdery mildewresistance and the role of heterotrimeric G-protein signaling in Arabidopsisdefense.PhD dissertation,zu2012.

Madden LV,Hughes G,Van Den Bosch F:The Study of Plant DiseaseEpidemics.APS Press,St.Paul,2007.

McCown BH,Lloyd G:Woody plant medium(WPM)-a mineral nutrientformulation for microculture of woody plant species.Hortic Sci 1981,16:453

Miklis M,Consonni C,Bhat RA,Lipka V,Schulze-Lefert P,Panstruga R:Barley MLO modulates actin-dependent and actin-independent antifungal defensepathways at the cell periphery.Plant Physiol 2007,144:1132–1143

Muthman R:The use of plant protection products in the EuropeanUnion.Eurostat 2007,ISBN 92-79-03890-7

Panstruga R:Serpentine plant MLO proteins as entry portals forpowdery mildew fungi.Biochem Soc Transact 2005,33(Pt 2):389–392

Parlevliet JE:What is durable resistance,a general outline.InDurability of Disease Resistance.Edited by Jacobs TH,Parlevliet JE.Dordrecht:Kluwer；1993:23–29.

Pavan S,Jacobsen E,Visser RGF,Bai Y:Loss of susceptibility as a novelbreeding strategy for durable and broad-spectrum resistance.Mol Breed 2010,25:1–12.

Pavan S,Schiavulli A,Appiano M,Marcotrigiano AR,Cillo F,Visser RGF,Bai Y,Lotti C,Ricciardi L:Pea powdery mildew er1 resistance is associated toloss-of-function mutations at a MLO homologous locus.Theor Appl Gen 2011,123:1425-1431

Pessina S,Pavan S,Catalano D,Gallotta A,Visser RGF,Bai Y,Malnoy M,Schouten HJ:Characterization of the MLO gene family in Rosaceae and geneexpression analysis in Malus domestica.BMC genomics 2014,15:618

Piffanelli P,Zhou FS,Casais C,Orme J,Jarosch B,Schaffrath U,CollinsNC,Panstruga R,Schulze-Lefert P:The barley MLO modulator of defense and celldeath is responsive to biotic and abiotic stress stimuli.Plant Physiol 2002,129:1076–1085

Pike S,Gao F,Kim MJ,Kim SH,Schachtman DP,Gassmann W:Members of theNPF3 Transporter Subfamily Encode Pathogen-Inducible Nitrate/NitriteTransporters in Grapevine and Arabidopsis.Plant Cell Physiol 2014,55(1):162-70

Preuss S,Pikaard CS:Targeted gene silencing in plants using RNAinterference.RNA Interference(RNAi):Nuts&Bolts of siRNA Technology,2003,pp.23-36.

Reid KE,Olsson N,Schlosser J,Peng F,Lund ST:An optimized grapevineRNA isolation procedure and statistical determination of reference genes forreal-time RT-PCR during berry development.BMC Plant Biol 2006,6:27

A,Müller J,Czembor JH,Piffanelli P,Panstruga R:Novel inducedmlo mutant alleles in combination with site-directed mutagenesis revealfunctionally important domains in the heptahelical barley Mlo protein.BMCPlant Biol 2010,10:31.

Robert-Seilaniantz A,Navarro L,Bari R,Jones JDG:Pathological hormoneimbalances.Curr Opin Plant Biol 2007,10:372–379.

Stolzenburg M,Aist JR,Israel HW:The role of papillae in resistance topowdery mildew conditioned by the ml-o gene in barley.I Correlative evidencePhysiological Plant Pathology 1984,25,337-346

Strube C,Buschbaum S,Wolken S,Schnieder T:Evaluation of referencegenes for quantitative real-time PCR to investigate protein disulfideisomerase transcription pattern in the bovine lungworm Dictyocaulusviviparus.Gene 2008,425:36–43

Urso S,Zottini M,Ruberti C,Lo Schiavo F,Stanca AM,Cattivelli L,ValèG:An Agrobacterium tumefaciens-mediated gene silencing system for functionalanalysis in grapevine.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,114(1):49-60.

Vanacker H,Carver TLW,Foyer CH:Early H₂O₂ accumulation in mesophyllcells leads to induction of glutathione during hypersensitive response in thebarley-powdery mildew interaction.Plant Physiology 2000,123:1289-1300

Van Hiel MB,Van Wielendaele P,Temmerman L,Van Soest S,Vuerinckx K,etal.:Identification and validation of housekeeping genes in brains of thedesert locust Schistocerca gregaria under different developmentalconditions.BMC Mol Biol 2009,10:56

Ward ER,Uknes SJ,Williams SC,Dincher SS,Wiederhold DL,Alexander DC,etal.Coordinate gene activity in response to agents that induce systemicacquired resistance.Plant Cell 1991,3:1085–1094.

Wightwick A,Walters R,Allinson G,Reichman S,Menzies N:EnvironmentalRisks of Fungicides Used in Horticultural Production Systems.Fungicides 2010,Odile Carisse(Ed.),ISBN:978-953-307-266-1

Wilcox WF:Grapevine Powdery Mildew.Publication number 102GFSG-D2.NewYork State Integrated Pest Management Program,2013

Winterhagen P,Howard SF,Qiu W,Kovács LG:Transcriptional Up-Regulationof Grapevine MLO Genesin Response to Powdery Mildew Infection.Am J Enol Vitic2008,59:2

Zhao W,Fanning ML,Lane T:Efficient RNAi-based gene family knockdownvia set cover optimization.Artificial Intelligence in Medicine 2005,35,61-73

Zheng Z,Nonomura T,Appiano M,Pavan S,Matsuda Y,Toyoda H,Wolters AA,Visser RGF1,Bai Y:Loss of Function in Mlo Orthologs Reduces Susceptibility ofPepper and Tomato to Powdery Mildew Disease Caused by Leveillula taurica.PLOSOne 2013,8(7):e70723

Zottini M,Barizza E,Costa A,Formentin E,Ruberti C,Carimi F,Lo SchiavoF:Agroinfiltration of grapevine leaves for fast transient assays of geneexpression and for long-term production of stable transformed cells.PlantCell Rep 2008,27:845–853

Claims (21)

1.白粉菌抗性赋予基因，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是由SEQ IDNo.1所代表的一级氨基酸序列，或与SEQ ID No.1具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列；且其中所述抗性赋予基因是受损的。

2.白粉菌抗性赋予基因，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是由SEQ IDNo.2所代表的的一级氨基酸序列，或与SEQ ID No.2具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列；且其中所述抗性赋予基因是受损的。

3.白粉菌抗性赋予基因，其中由所述抗性赋予基因编码的氨基酸序列是由SEQ IDNo.3所代表的的一级氨基酸序列，或与SEQ ID No.3具有超过70％的同一性，优选超过80％的同一性，更优选超过90％的同一性，并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列；且其中所述抗性赋予基因是受损的。

4.根据权利要求1所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是所述基因中的一个或多个突变，其导致具有SEQ ID No.1的一级氨基酸序列的蛋白质表达产物的缺失或包含SEQ ID No.4的mRNA的缺失。

5.根据权利要求2所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是所述基因中的一个或多个突变，导致具有SEQ ID No.2的一级氨基酸序列的蛋白质表达产物或包含SEQID No.5的mRNA的缺失。

6.根据权利要求3所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是所述基因中的一个或多个突变，导致具有SEQ ID No.3的一级氨基酸序列的蛋白质表达产物的缺失或包含SEQ ID No.6的mRNA的缺失。

7.根据权利要求1-3任一项所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是所述基因中的一个或多个突变，导致非功能性蛋白质表达产物。

8.根据权利要求1所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是转录水平降低，其导致包含SEQ ID No.4的mRNA的水平降低。

9.根据权利要求2所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是转录水平降低，其导致包含SEQ ID No.5的mRNA的水平降低。

10.根据权利要求3所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是转录水平降低，其导致包含SEQ ID No.6的mRNA的水平降低。

11.根据权利要求1-3任一项所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述受损是转录水平降低。

12.根据权利要求1-11任一项所述的白粉菌抗性赋予基因，其特征在于，所述基因来源于欧亚种葡萄。

13.欧亚种葡萄植物，其基因组中包含权利要求1-12任一项所定义的受损的白粉菌抗性赋予基因，其中所述受损提供白粉菌抗性。

14.根据权利要求13所述的欧亚种葡萄植物，其特征在于，与易感白粉菌的欧亚种葡萄植物相比，所述白粉菌抗性赋予基因的表达或转录降低至少10％。

15.根据权利要求14所述的欧亚种葡萄植物，其特征在于，与易感白粉菌的欧亚种葡萄植物相比，所述白粉菌抗性赋予基因的表达或转录降低至少20％，优选至少30％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，且最优选至少80％。

16.根据权利要求13-15任一项所述的欧亚种葡萄植物，其特征在于，所述白粉菌抗性赋予基因的表达或转录缺失。

17.根据权利要求13-16任一项所述的欧亚种葡萄植物，其特征在于，在其基因组中包含：

编码具有SEQ ID No.1的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有超过70％的同一性、优选超过80％的同一性、更优选超过90％的同一性、并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因；和

编码具有SEQ ID No.2的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.2具有超过70％的同一性、优选超过80％的同一性、更优选超过90％的同一性、并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因；和/或

编码具有SEQ ID No.3的一级氨基酸序列或与SEQ ID No.3具有超过70％的同一性、优选超过80％的同一性、更优选超过90％的同一性、并且最优选超过95％的同一性的一级氨基酸序列的蛋白质的受损的白粉菌抗性赋予基因。

18.根据权利要求13-17任一项所述的植物的种子、植物部分或繁殖材料，其特征在于，在其基因组中包含1个或2个或3个如权利要求1-12任一项所定义的受损的白粉菌抗性赋予基因，其中所述受损提供白粉菌抗性。

19.由SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所代表的分离的核苷酸序列，或与其具有超过70％同一性、优选超过80％同一性、更优选超过90％同一性、最优选超过95％同一性的核苷酸序列。

20.由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所代表的分离的氨基酸序列，或与其具有超过70％同一性、优选超过80％同一性、更优选超过90％同一性、最优选超过95％同一性的氨基酸序列。

21.至少一个如权利要求1-12任一项所述的白粉菌抗性赋予基因，根据权利要求19所述的分离的核苷酸序列，或根据权利要求20所述的分离的氨基酸序列，用于选择或识别抗白粉菌欧亚种葡萄植物的用途。