BR112018000425A2

BR112018000425A2 - genes que fornecem resistência a erysiphe necator em vitis vinifera

Info

Publication number: BR112018000425A2
Application number: BR112018000425A
Authority: BR
Inventors: Lenzi Luisa; Perazzolli Michele; Malnoy Mickael; Velasco Riccardo; Pessina Stefano
Original assignee: Fondazione Edmund Mach
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2020-04-28
Also published as: EP3320098B1; US11441157B2; BR112018000431B1; US20200291421A1; EP3320096A1; BR112018000431A2; WO2017005323A1; AU2016289432A1; EP3320098A1; CN108138196B; CL2018000045A1; US10683516B2; ZA201800057B; US20180201950A1; US20180192606A1; CN108138196A; ES2964639T3; AU2016289432B2; WO2017005747A1; AU2015401501A1

Abstract

genes que fornecem resistência a erysiphe necator em vitis vinifera? a presente invenção de refere a genes que conferem resistência a erysiphe necator, a plantas, a partes de plantas e a sementes compreendendo os presentes genes que fornecem resistência, e à aplicação dos mesmos para seleção de plantas resistentes a erysiphe necator. de maneira específica, a presente invenção de refere a genes que conferem resistência a erysiphe necator, em que a sequência de aminoácidos codificada pelos genes que conferem resistência é a sequência de aminoácidos primária representada por seq id nº 1, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a seq id nº 1, e sendo que o gene que confere resistência está prejudicado.

Description

GENES QUE FORNECEM RESISTÊNCIA A ERYSIPHE NECATOR EM

VITIS VINIFERA

DESCRIÇÃO [0001] A presente invenção se refere a genes que conferem resistência a Erysiphe necator, a plantas, a partes de plantas e a sementes compreendendo os presentes genes que fornecem resistência, e à aplicação dos mesmos para seleção de plantas resistentes a Erysiphe necator.

[0002] Erysiphe necator, também designado como Uncinula necator, é um fungo causador dos sintomas do míldio pulverulento em uva. O fungo é um patógeno comum para o gênero Vitis, do qual a espécie mais importante é a Vitis vinifera ou parreira.

[0003] A parreira exige uma grande quantidade de pesticidas, particularmente fungicidas, para evitar perdas de rendimento. Entre 1992 e 2003, 73% dos fungicidas, vendidos na França, Itália, Espanha e Alemanha, foram usados para proteção de parreiras, uma cultura que cobre somente 8% das terras usadas para agricultura nos países considerados (EUROSTAT, 2007).

[0004] O míldio pulverulento (PM) da parreira, causado pelo fungo Erysiphe necator, é uma das doenças muitíssimo economicamente relevantes da parreira ao redor do mundo. E. necator é um biótrofo obrigatório, que pode infectar todos os tecidos verdes da parreira e que causa perdas significativas de rendimento e de qualidade de baga. Os sintomas de míldio pulverulento são um pó branco ou cinza que cobre as superfícies

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2/49 superior e inferior das folhas. As infecções em frutas resultam no murchamento ou rachadura das bagas. A qualidade da fruta é severamente prejudicada, com acidez aumentada e teores em antocianina e açúcar diminuídos.

[0005] O míldio pulverulento é controlado com aplicações frequentes de fungicidas químicos. No entanto, a aplicação intensa de fungicidas químicos tem várias desvantagens. Primeiro de tudo, os efeitos sobre o meio-ambiente de fungicidas são bem documentados. Em segundo lugar, os custos dos produtos químicos e suas aplicações podem atingir até 20% das despesas totais para produção de uvas em algumas áreas. Em terceiro lugar, o desenvolvimento de populações resistentes do patógeno já foi documentado por Baudoin et al. (2008) e Dufour et al. (2011), reduzindo fortemente a eficácia de tratamentos químicos. Portanto, existe um interesse crescente no desenvolvimento de novos métodos alternativos em relação aos tratamentos químicos.

[0006] A geração de variedades resistentes a míldio pulverulento é uma das melhores opções para tornar o cultivo de parreiras sustentável uma possibilidade realística, preservando, ao mesmo tempo, os rendimentos dos agricultores. Um estudo realizado em produção de Chardonnay na Califórnia mostrou que a aplicação de variedade resistente a míldio pulverulento podería economizar, para os agricultores, cerca de US$ 720/ha, com uma redução significativa da utilização de fungicidas (Fuller et al. , 2014) .

[0007] A maioria das cultivares da parreira européia (Vltls vinifera) , que inclui as cultivares mais finas e

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3/49 muitíssimo amplamente plantadas no mundo para vinho e de uvas de mesa, são altamente suscetíveis ao míldio pulverulento (Gadoury et al. 2003) . Ao contrário, espécies de Vitis norte-americanas evoluíram conjuntamente com E. necator e possuem vários níveis de resistência ao patógeno (Fung et al., 2008). Essa resistência podería ser introgredida por cruzamento de V. vinifera com uma das espécies de Vitis americanas resistentes, mas a procriação é um processo lento na parreira e a aceitação de híbridos resistentes pelos produtores e pelos consumidores tem sido limitada no passado (Fuller et al., 2014) . A aplicação de tecnologias, como transformação genética ou seleção auxiliada por marcador de elevada produtividade, pode ser usada para se obter cultivares de parreiras resistentes, com propriedades de uva desejáveis para produtores e consumidores (Feechan et al., 2013a).

[0008] A estratégia mais comum para desenvolver plantas resistentes é concentrada sobre a introgressão de genes resistentes (R-genes). R-genes codificam proteínas que reconhecem efetores de patógeno e desencadeiam resposta de defesa, mediados por uma rede de sinalização, na qual os hormônios de plantas desempenham um papel principal (Pavan et al., 2010) . A resistência é manifestada como resposta hipersensível localizada no sítio de infecção (Bari e Jones, 2009). A resistência conferida por R-genes é parcamente durável, já que mutações de efetores de patógeno permitem superar a resistência (Parlevliet et al., 1993) .

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4/49 [0009] Uma abordagem alternativa se baseia na inativação de genes de suscetibilidade (S-genes), definidos como genes, cuja perda de função resulta em resistência herdada de maneira recessiva (Pavan et al., 2010). Alguns patógenos são capazes de suprimir a defesa da planta por ativação de proteínas da planta, cuja função é a regulação negativa do sistema de imunidade da planta. Os genes que codificam essas proteínas da planta são conhecidos como genes de suscetibilidade (S-genes) e seu nocaute libera a supressão de defesa da planta e conduz à resistência (Pavan et al., 2010) . A desvantagem dos S-genes são os fenótipos pleiotrópicos, algumas vezes associados a seu nocaute (Pavan et al., 2011) .

Genes de locus O de míldio (MLO) são um exemplo típico de S-genes de míldio pulverulento.

[0010] A resistência devida ao nocaute de um gene de MLO (resistência mio) foi descoberta em cevada em 1992 (Jorgensen, 1992) e durante um longo tempo foi considerada como uma forma única de resistência. No entanto, estudos ulteriores revelaram que genes de MLO são grandemente conservados através do Reino Vegetal e sua perda de função resultou em resistência em várias espécies, tais como Arabidopsis (Consonni et al., 2006), ervilha (Pavan et al., 2011), tomate (Bai et al., 2008) e pimenta (Zheng et al., 2013) . Nem todos os genes de MLO são S-genes e os membros da família de MLO estão divididos em sete classes (Acevedo-Garcia et al., 2014; Pessina et al., 2014) . Somente duas classes contêm Sgenes: a classe IV contém todos os S-genes monocotiledôneos (Panstruga et al., 2005; Reinstãdler et

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5/49 al., 2010); e a classe V contém todos os S-genes dicotiledôneos (Consonni et al., 2006; Bai et al., 2008; Feechan et al., 2008; Winterhagen et al., 2008) . Nem todos os membros das classes IV e V são S-genes.

[0011] Considerando o impacto econômico de uma infecção por Eryslphe necator na produção de uvas, existe uma demanda continua na técnica para genes que forneçam resistência a Eryslphe necator.

[0012] É um objeto da presente invenção, dentro outros objetos, atender a essa demanda na técnica.

[0013] De acordo com a presente invenção, o objeto acima, dentre outros objetos, é atendido pelo fornecimento de genes prejudicados que fornecem resistência a Eryslphe necator, conforme destacado nas reivindicações apensas.

[0014] De maneira especifica, o objeto acima, entre outros objetos, é atendido de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, pelo fornecimento de genes que conferem resistência a Eryslphe necator, em que a sequência de aminoácidos codificada pelos genes que conferem resistência é a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 1, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 1, sob a condição de que os presentes genes que conferem resistência estejam prejudicados .

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6/49 [0015] Em alternativa, o objeto acima, dentre outros objetos, é atendido de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, pelo fornecimento de genes que conferem resistência a Erysiphe necator, em que a sequência de aminoácidos codificada pelos genes que conferem resistência é a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 2, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 2, sob a condição de que os presentes genes que conferem resistência estejam prejudicados.

[0016] Como ainda outra alternativa, o objeto acima, dentre outros objetos, é atendido de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, pelo fornecimento de genes que conferem resistência a Erysiphe necator, em que a sequência de aminoácidos codificada pelos genes que conferem resistência é a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 3, sob a condição de que os presentes genes que conferem resistência estejam prejudicados.

[0017] A identidade de sequências, conforme usada aqui, é definida como o número de nucleotídeos, ou de

Petição 870180001750, de 08/01/2018, pág. 14/152 / 49 aminoácidos, alinhados consecutivos idênticos, sobre o comprimento completo das presentes sequências, dividido pelo número de nucleotideos, ou de aminoácidos, do comprimento completo das presentes sequências, e multiplicado por 100%. Por exemplo, uma sequência com 80% de identidade em relação a SEQ ID N° 1 compreende, sobre o comprimento total de 539 aminoácidos da SEQ ID N° 1, 432 aminoácidos alinhados idênticos, isto é, 430 ou 431/539 x 100% = 80%.

[0018] Um gene prejudicado que confere resistência, de acordo com a presente invenção, é entendido a indicar um gene que forneça uma suscetibilidade reduzida, ou mesmo ausente, a Erysiphe necator, conforme indicado por pontos como pó sobre as folhas e os caules.

[0019] Genes prejudicados que conferem resistência, de acordo com a presente invenção, são genes mutados. A mutação, ou as mutações, nos presentes genes pode resultar/resulta em prejuízo por diferentes mecanismos. Por exemplo, uma ou mais mutações na proteína que

codifique	sequências	de	ADN	podem resultar em	proteínas
mutadas,	truncadas	ou	não	funcionais. Uma	ou	mais
mutações	em sequências	de	ADN não codificantes	podem

causar junção alternativa, tradução ou tráfico de proteína. Alternativamente, uma ou mais mutações resultando em uma atividade transcricional alterada de um gene, que determine a quantidade de mARN disponível para tradução para formar proteína, podem resultar em uma resistência devido a um baixo nível, ou completa ausência, de proteínas codificadas. Adicionalmente, o

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8/49 prejuízo dos presentes genes pode ser causado depois da tradução, isto é, em nível de proteína.

[0020] Prejudicado(a) é também indicado(a) aqui como codificando um gene ou proteína não funcionais. Embora a função dos presentes genes não esteja ainda identificada, um gene ou proteína não funcionais podem ser prontamente identificados pelo estabelecimento de resistência a Erysiphe necator (não funcional) ou suscetibilidade a Erysiphe necator (funcional) em uma planta. Uma planta com resistência a Erysiphe necator (não funcional) é indicada por compreender um gene, que está mutado no nível de proteína, quando comparado a SEQ ID N°s 1 ou 2 ou 3, ou são observados níveis reduzidos de mARN compreendendo a SEQ ID N°s 4 ou 5 ou 6.

[0021] Genes, ou proteínas, funcionais e não funcionais, também podem ser determinados usando-se experimentos de complementação. Por exemplo, a transformação de uma planta de Vitis vinifera resistente a Erysiphe necator, com uma cópia dos presentes genes, sob o controle de um promotor constitutivo, resultará em uma planta de Vitis vinifera suscetível a Erysiphe necator.

[0022] De acordo com a presente invenção, os presentes genes que conferem resistência a Erysiphe necator fornecem resistência a Erysiphe necator quando prejudicados. Prejudicado(a) de acordo com a presente invenção pode ser indicado pela ausência ou diminuição de uma proteína identificada aqui por SEQ ID N°s 1 ou 2 ou 3. Na técnica, muitos mecanismos são conhecidos

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9/49 resultando no prejuízo de um gene na transcrição, na tradução ou em nível de proteína.

[0023] Por exemplo, o prejuízo no nível de transcrição pode ser o resultado de uma ou mais mutações em sequências de regulação de transcrição, tais como promotores, intensificadores, sequências de iniciação, de terminação ou de junção de íntron. Geralmente, essas sequências estão localizadas 5' das, 3' das ou dentro das sequências codificantes representadas por SEQ ID N°s 4 e 5 e 6. O prejuízo também pode ser fornecido por uma eliminação dos, rearranjo dos ou inserção nos presentes genes.

[0024] O prejuízo no nível de tradução pode ser fornecido por um códon stop prematuro ou outro ARN para mecanismos de controle de proteína ou modificações póstraducionais que influenciem, por exemplo, o dobramento da proteína ou tráfico celular.

[0025] O prejuízo no nível de proteína pode ser fornecido por interações truncadas, mal dobradas ou proteína-proteína perturbadas.

[0026] Independentemente do mecanismo subjacente, o prejuízo de acordo com a presente invenção é indicado por uma diminuição, ou ausência, de uma proteína funcional de acordo com SEQ ID N°s 1 ou 2 ou 3.

[0027] Considerando o acima exposto, de acordo com uma modalidade do primeiro aspecto da presente invenção, o prejuízo de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais mutações nos presentes genes, resultando na ausência de um produto de expressão de proteína com uma sequência de aminoácidos primária representada por SEQ

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ID N° 1, ou um mARN compreendendo SEQ ID N° 4; ou, na alternativa, a ausência de um produto de expressão de proteina com uma sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 2 ou 3 ou mARN compreendendo SEQ ID N° 5 ou 6, respectivamente.

[0028] De acordo com outra modalidade desse primeiro aspecto da presente invenção, o presente prejuízo compreende uma ou mais mutações nos presentes genes, resultando em um produto de expressão de proteína não funcional.

[0029] De acordo com ainda outra modalidade desse primeiro aspecto da presente invenção, o presente prejuízo compreende um nível de transcrição reduzido, resultando em um nível reduzido de um mARN compreendendo SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6.

[0030] De acordo com ainda outra modalidade desse primeiro aspecto da presente invenção, o presente prejuízo compreende um nível de tradução reduzido de um mARN compreendendo SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6 .

[0031] De acordo com uma modalidade especialmente preferida da presente invenção, o presente gene que confere resistência a Erysiphe necator é derivado de Vitis vinifera.

[0032] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção se refere a plantas de Vitis vinifera compreendendo, em seu genoma, um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, conforme descrito acima, sendo que o prejuízo fornece resistência a Erysiphe necator.

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11/49 [0033] De acordo com uma modalidade preferida desse segundo aspecto da presente invenção, as presentes plantas de Vitis vinifera exibem uma expressão, ou transcrição, dos presentes genes, que conferem resistência a Erysiphe necator, sendo reduzida em pelo menos 10%, quando comparada a uma planta de Vitis vinifera suscetível a Erysiphe necator, de preferência, em que a expressão, ou a transcrição é reduzida em pelo menos 20%, quando comparada a uma planta de Vitis vinifera suscetível a Erysiphe necator, de preferência, pelo menos 30%, mais preferivelmente, pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 70%, e, muitíssimo preferivelmente, pelo menos 80%, tais como 25%, 35%, 40%, 45%, 55%, 60%, 65% ou 75%.

[0034] De acordo com outra modalidade preferida desse segundo aspecto da presente invenção, as presentes plantas de Vitis vinifera exibem uma expressão, ou transcrição, ausente dos presentes genes que conferem resistência a Erysiphe necator.

[0035] De acordo com uma modalidade especialmente preferida desse segundo aspecto da presente invenção, as presentes plantas de Vitis vinifera compreendem, em seu genoma, um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 1, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com SEQ ID N° 1; e, em adição, um gene

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12/49 prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 2, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com SEQ ID N° 2; e/ou um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com SEQ ID N° 3 . Formulado de maneira diferente, a presente invenção se refere, de acordo com uma modalidade especialmente preferida, a plantas de Vitis vinifera compreendendo um gene VvML07 prejudicado em combinação com um gene VvMLOô ou VvMLOll prejudicado ou compreendendo um gene VvML07 prejudicado em combinação com genes VvMLOô e VvMLOll prejudicados.

[0036] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a sementes, a partes de plantas ou a material de propagação das presentes plantas resistentes a Erysiphe necator compreendendo, em seu genoma, os presentes um ou dois genes prejudicados que conferem resistência a Erysiphe necator, fornecendo resistência a Erysiphe necator.

[0037] De acordo com um quarto aspecto, a presente invenção se refere a sequências de nucleotídeos isoladas

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13/49 representadas por SEQ ID N°s 4 ou 5 ou 6, ou a sequências de nucleotídeos com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com elas.

[0038] De acordo com um quinto aspecto, a presente invenção se refere a sequências de aminoácidos isoladas representadas por SEQ ID N°s 1 ou 2 ou 3, ou a sequências de aminoácidos com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com elas.

[0039] De acordo com um sexto aspecto, a presente invenção se refere à aplicação dos presentes genes que conferem resistência de Erysiphe necator, às presentes sequências de nucleotídeos isoladas ou às presentes sequências de aminoácidos isoladas, para seleção de plantas de Vitis vinifera resistente a Erysiphe necator usando-se, por exemplo, as presentes sequências para o desenvolvimento de marcadores moleculares.

ABREVIATURAS [0040] AUDPC: área sob a curva de progresso da doença;

[0041] ddi: dias depois da inoculação;

[0042] EVB: vetor vazio de Brachetto;

[0043] PM: míldio pulverulento;

[0044] ER: expressão relativa;

[0045] AS: ácido salicílico; e [0046] TLB1-7: Linhagem Transgênica de Brachetto 1-7.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0047] A presente invenção será adicionalmente detalhada no seguinte exemplo de uma modalidade

especialmente preferida	da	presente invenção.	No
exemplo,	é feita referência	às	figuras aqui.
[0048]	Figura 1: mostra	a	área sob a curva	de
progresso	da doença (AUDPC)	de	parreiras inoculadas	com

Erysiphe necator no controle (EVB) e em linhagens transgênicas (TLB1, TLB2, TLB3, TLB4, TLB5, TLB6 e TLB7) . As classificações médias de valores de AUDPC calculados em 8-19 replicados biológicos a partir de dois experimentos são relatadas. As barras de erro mostram o erro padrão da média. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas com respeito à linha de controle EVB, de acordo com os testes posthoc de Tukey ou Games-Howell (P = 0,05). As fotografias de folhas representativas para cada linhagem foram coletadas 30 dias depois da inoculação.

[0049] Figura 2: mostra a germinação de conidias de Erysiphe necator na linha de controle de EVB (A) e na linhagem transgênica resistente TLB4 (B) . Imagens de microscópio de folhas infectadas foram tiradas em 3, 10 e 21 dias depois da inoculação (ddi) com míldio pulverulento. O inserto em elevado aumento destacou a germinação de uma conidia de Erysiphe necator em 3 ddi e 10 ddi.

[0050] Figura 3: mostra a formação de papilas na linha de controle de EVB (A, B) e na linhagem transgênica resistente TLBC4 (B, C) . Imagens de microscópio tiradas com um microscópio de campo brilhante (A, C) e de

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15/49 fluorescência (B, D) em três dias depois da inoculação (ddi) . As setas indicam as papilas (P) . A barra de escala é a mesma para as quatro imagens.

[0051] Figura 4: mostra a expressão de quatro genes de MLO de parreira nas seis linhagens de mio (TLB1, TLB2, TLB3, TLB4, TLB5 e TLB6) seguindo a inoculação com Erysiphe necator. A expressão de VvMLOô (A) , VvML07 (B) , VvMLOll (C) e VvML013 (D) foi analisada antes (0 ddi; cinza claro), um (cinza escuro) e dez (branco) dias depois da inoculação. As classificações médias, calculadas a partir de cinco a nove plantas reunidas a partir de dois experimentos, são relatadas para cada linha. As barras de erro mostram o erro padrão da média. Para cada ponto de tempo, os símbolos destacam diferenças significativas com respeito ao controle de EVB, de acordo com o teste post-hoc de Tukey ou GamesHowell (P = 0,05): * para 0 ddi, + para 1 ddi e # para 10 ddi.

[0052] Figura 5: mostra a expressão relativa de 13 genes de parreira em três pontos de tempo na linha de controle de EVB e na linhagem resistente TLB4. A escala de cores indica os valores de expressão relativa calculados com respeito ao controle de EVB em 0 ddi, usado como referência para a normalização dos dados. Os asteriscos destacam diferenças estatisticamente significativas de acordo com o teste post-hoc de Fisher. Um e dois asteriscos indicam significância em P = 0,05 e P = 0,01, respectivamente. A imagem foi preparada com o programa de computador Multiexperiment Viewer com Log2 de dados de expressão relativa.

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EXEMPLO

MATERIAIS E MÉTODOS

Construtos para transformação de parreira [0053] Fragmentos de 300-600 pb para os quatro genes alvo de MLO VvMLOô, VvMLOl, VvMLOll e VvML013 foram amplificados com pares de iniciadores específicos (Tabela 1) e clonados no vetor pENTR/SD-TOPO (Invitrogen).

Tabela 1: Iniciadores usados para amplificar fragmentos de genes de MLO para os construtos ARNi.

Gene^#	Iniciador para Frente	Iniciador Reverso
VvMLOG	CACCTGCTTACAGTATTACAAACTCCC	TTTCCCTTGCATACCTAAAC
VvMLOl	CACCGACAAI I I I IAACGAGAGAGT	ATCTCATGTTGGGTTCGGATT
VvMLOl 1	CACCTCACTTATGCTACTGGGGTT	ATCAACTTTGGGAACTGATCTGAC
VvMLO13	CACCGAGCTAATGTTGCTAGGGTT	AAAI I I IGCATGGCTTTGAG

[0054] Depois da validação da sequência, os quatro fragmentos de gene foram clonados no vetor Gateway de ARNi pK7GWIWG2D (II) (Karimi et al. 2002;

http://www.psb.ugent.be/) usando-se o procedimento descrito por Urso et al. (2013) . Os construtos finais foram verificados por sequenciamento em ambas as fitas e foram clonados na cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101, conforme descrito por Zottini et al. (2008) . As células transformadas com A. tumefaciens foram testadas por PCR (GoTaq Green Master Mix - Promega, Fitchburg, EUA) para confirmar a presença dos construtos, usando-se iniciadores específicos projetados para se anelarem no promotor 35S (5'- CGCACAATCCCACTATCCTT - 3') e o fragmento de MLO (Tabela 1).

Material de planta e transformação

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17/49 [0055] Para a transformação de parreira, foram usados embriões somáticos de cultivar de V. vinifera LongCluster Brachetto. O material de planta foi cultivado in vitro no escuro em uma câmara de crescimento à 20-24°C e 70 ± 5% de umidade relativa (UR) . A transformação, a regeneração e a seleção de vegetal das plantas transgênicas foram realizadas conforme descrito por Dalla Costa et al. (2014) . Um total de cinco transformações foi realizado: quatro objetivando silenciar os quatro genes alvo de MLO, um com um vetor vazio (pK2WG7), como controle.

Seleção de regenerantes e propagação de materiais in vitro [0056] O ADN genômico foi extraído de tecido de folha in vitro usando-se o kit Illustra Nucleon Phytopure (GE Healthcare, Buckinghamshire, RU) . A integração de transgene foi avaliada com os mesmos iniciadores usados para confirmar a presença do construto em A. tumefaciens. As linhagens in vitro, que foram confirmadas como tendo a inserção do transgene, foram movidas para um meio de planta lenhoso (PL) (McCown e Lloyd, 1981), mantidas em câmara de crescimento (20— 24°C, 70 ± 5% de UR) e transferidas para meios frescos uma vez ao mês.

Aclimatação à estufa [0057] As plantas foram aclimatadas às condições de estufa com um processo progressivo realizado em uma câmara de crescimento (25°C, 16 horas dia / 8 horas noite, umidade de 70 ± 5%) . Plantas de um mês de idade, com um aparelho de raízes bem desenvolvido (pelo menos

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18/49 duas raízes principais, 3 cm de comprimento) foram transferidas para um copo plástico de 250 mL contendo turfa autoclavada úmida (Terriccio Vegetal RadicTercomposti Spa, Bréscia, Itália) e selados com parafilm, para preservar a umidade. A cada sete dias, um ou dois orifícios foram feitos na camada de parafilm, para reduzir de maneira progressiva a umidade do ambiente e promover a formação da cutícula foliar. Depois de três semanas, o selo de parafilm foi

completamente	removido e,	depois	de uma	semana,	as
plantas foram	transferidas para	potes	de 1 L	e
cultivadas sob	condições de	estufa	(25°C, 16	horas dia	/
8 horas noite,	umidade de 70	± 5%) .

Inoculação de Erysiphe necator e avaliação da severidade da doença [0058] O inóculo de míldio pulverulento foi obtido a partir de folhas infectadas de um vinhedo não tratado no norte da Itália (região de Trentino) e mantido por inoculações subsequentes em plantas de Pinot Noir de V. vinifera, sob condições de estufa. As plantas foram inoculadas a seco com míldio pulverulento por escovamento cuidadoso de folhas jovens infectadas portando E. necator com recém-esporulação, por sobre as folhas alvo (Blaich et al., 1989) . As plantas inoculadas foram incubadas na estufa, à 25°C, com uma umidade relativa (UR) de 100%, durante 6 horas, para promover a penetração fúngica nas folhas, e, então, mantidas à 25°C, com uma umidade relativa de 70 ± 10%, até a avaliação do último sintoma. A severidade da doença foi avaliada visualmente sobre todas as folhas em 14, 22 e

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19/49 dias depois da inoculação (ddi), de acordo com as diretrizes padrão da European and Mediterranean Plant Protection Organisation (EPPO, 1998).

[0059] A severidade da doença foi expressa como a proporção (percentagem de 0 a 100%, com intervalos de 5%) de área de folha adaxial coberta por micélios de míldio pulverulento em relação à área de folha total, e um valor médio foi calculado para cada planta. Dois experimentos de inoculação foram realizados. Para cada experimento, três a nove replicados biológicos (plantas) por linhagem foram analisados em um projeto de bloco completo aleatorizado. A redução de severidade da doença foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: [(severidade da doença nas plantas de controle severidade da doença nas plantas tratadas)/severidade da doença nas plantas de controle x 100. Para analisar todos os pontos de tempo em conjunto, os inventores usaram a área sob a curva de progresso da doença (AUDPC), um resumo quantitativo de intensidade da doença ao longo do tempo (Campbell e Madden, 1990; Madden et al., 2007) .

[0060] Para avaliar a severidade da doença, o número de conídias de E. necator, produzidas a partir das folhas infectadas, foi avaliado conforme descrito por Angeli et al. (2012), com ligeiras modificações. Três folhas foram coletadas a partir de cada replicado em 30 ddi e quatro discos, de 0,8 cm de diâmetro para cada folha, foram cortados para um total de 12 discos por replicado. Os discos de folhas foram transferidos para tubos de 50 mL contendo 5 mL de água destilada com Tween

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20/49 à 0,01% (Sigma-Aldrich, Sant Louis, EUA) . Os tubos foram submetidos a vórtice durante um minuto e a concentração de conidias foi determinada por contagem com um hemocitômetro sob um microscópio de luz. A quantidade de conidias foi finalmente convertida em conidias por centímetro quadrado (cm²) de folha de parreira.

Análise histológica [0061] Duas folhas inoculadas foram coletadas, a partir de três replicados biológicos de cada uma de linhagem de controle e transgênica, em 3, 10 e 21 ddi, e submetidas à análise histológica. Para visualizar as hifas de fungo, as folhas foram limpadas e tingidas conforme descrito por Vanacker et al. (2000), conforme modificado como se segue: as folhas foram cortadas em pequenos pedaços e pousadas, com a superfície adaxial para cima, sobre papel de filtro umedecido com uma mistura de etanol : ácido acético glacial (3:1, v/v) até que a clorofila tivesse sido removida. Os pedaços de folha foram transferidos para papel de filtro embebido em água durante 2 horas, então, transferidos para uma lâmina de microscópio e foi pipetada uma gota de Azul de Anilina (0,1% [p/v] em lacto-glicerol) por sobre a superfície da folha. As hifas foram visualizadas usandose a iluminação de campo brilhante de um microscópio Leica LMD6500 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) .

[0062] Para a detecção das papilas, as folhas foram limpadas em uma mistura de etanol : ácido acético glacial (3:1, v/v) até que a clorofila tivesse sido removida, e equilibradas, durante uma noite, em uma

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21/49 solução contendo ácido lático, glicerol e água (1:1:1). As papilas foram visualizadas usando-se o filtro LMD (excitação em 380-420 nm de filtro BP, espelho dicróico 415 e emissão em 445-485 nm de BP) de um microscópio Leica LMD6500 (Leica Microsystem, Wetzlar, Alemanha).

Coleta de amostra, extração de ARN e análise de expressão de gene [0063] A primeira análise de expressão de gene foi realizada em plantas transgênicas in vitro, para identificar linhagens silenciadas, com três replicados biológicos coletados. Para a segunda análise, realizada em plantas transgênicas aclimatadas, foram coletadas amostras de folhas imediatamente antes da inoculação, 24

horas	e	10	dias depois	de	inoculação	com míldio
pulverulento.	Esses pontos	de	tempo foram	escolhidos
porque	estão	associados com	a	regulação à	montante de
genes	de	MLO	durante a infecção	com E. necator (Feechan
et al	• /	2008	; Winterhagen	et	al., 2008) .	Para cada

linhagem em cada ponto de tempo, foram coletadas amostras de folhas a partir de cinco plantas diferentes. Cada amostra compreendia duas meia-folhas tiradas da mesma planta; somente folhas do terceiro e do quinto nós a partir do topo do broto foram coletadas. As amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio liquido e armazenadas à -80°C.

[0064] O ADN total foi extraído com o kit Spectrum^tmPlant Total RNA (Sigma-Aldrich), tratado com a DNAse L (Sigma-Aldrich) e transcrito de maneira reversa usandose a transcriptase reversa Superscript ILL (invitrogen, Life Technologies, Waltham, EUA) .

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22/49 [0065] A análise de qPCR foi realizada com Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, EUA) em urn volume de reação de 15 pL com iniciadores específicos (Tabela 2), usando-se um sistema de detecção CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, EUA), sob controle do programa de computador CFX Manager.

Tabela 2: Iniciadores usados para amplificar fragmentos de genes de MLO para a análise de qPCR.

Nome	Para frente (‘5 - ‘3)	Reverso (‘5 - ‘3)
EF1a	GAACTGGGTGCTTGATAGGC	AACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA
GAPDH	TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA	CCACAGACTTCATCGGTGACA
Actin	TCCTTGCCTTGCGTCATCTAT	CACCAATCACTCTCCTGCTACAA
VvMLOG	GTGCAGTTATGTGACACTCCC	ACACACCATCCGAGTGC
VvMLO7	CTTTCTTCGCATGGAGCACG	GAGCCCATCTGTGTCACCAA
VvMLO11	GCACCCCCTTACATGGC	TCTGGACCAGGATTTCTATGATG
VvMLO13	CTGGTGACACAGATGGGTTC	CTACTTGACATGGGTGTGGC
VvWRKY19	GGGGAGGCTGTGGTTAGGTT	GTTTGGCATTTGGCTTGTCT
VvWRKY27	CTTGGATCAGAATCACCCCTAA	GCCGTGGTATGTGGTTTTGTA
VvWRKY48	CAAGATTTCAAGGACCAAGCAG	AGTATGCCTTCCTCGGTATGT
VvWRKY52	CCTCTTGATGATGGGTTTAGTT	GTCTTCCACGGTAGGTGATTT
VvALSI	CCGTGCATACCGAGCATTTG	AGGCCGGTTCTGTATGTTGG
VvEDSI	AGGGTTTTATATTGTTATCTCAAGGC	GGAAGAAAATATCTTATTACTACATAATGTTTC
VvLOX9	GACAAGAAGGACGAGCCTTG	CATAAGGGTACTGCCCGAAA
VvLOXI	ATCAATGCTCTTGCTCGGGA	CCAGAGCTGGTCATAGGCAG
VvPAD4	ACGATTGCACTGGTAAGCCA	CGACTCCGTCATCGCCTAAA
VvPENI	CTTCGCAAGAAGCTCAGGGA	TGCTCTTGGATCGCCTTCTG
VvPR1	CCCAGAACTCTCCACAGGAC	GCAGCTACAGTGTCGTTCCA
VvPR6	ACGAAAACGGCATCGTAATC	TCTTACTGGGGCACCATTTC
VvNPF3.2	TCGTCACATCAGCACAGCTT	ATCTGCGAGCCAATGGAACA

[0066] O programa de computador emprega quantificação comparativa com uma linha de base adaptativa. As amostras foram processadas em dois replicados técnicos com os seguintes parâmetros de ciclo térmico: 95°C 3 min, seguido por 40 ciclos de 95°C 10 seg e 55°C 30 seg, com uma etapa final à 95°C 10 seg. Os iniciadores para a análise de expressão de gene de VvMLOô, VvMLOll e VvML013 foram tirados de Winterhagen et al. (2008), enquanto que, para VvML07, os inventores projetaram seu par de iniciadores específicos (Tabela 2) . A expressão

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23/49 de genes marcadores modulada na interação entre plantas e o míldio pulverulento também foi analisada. Os iniciadores para VvWRKY19, VvWRKY27, VvWRKY48 e VvWRKY52 foram tirados de Guo et al. (2014), os iniciadores para VvEDSl, de Gao et al. (2014) e os iniciadores para VvPRl, VvPR6 e VvL0X9, de Dufour et al. (2013). Os novos pares de iniciadores foram projetados com a NCBI Primer Designing Tool (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Tabela 2) . Quatro diluições em série de cADN (1/10 1/100 - 1/1.000 - 1/10.000) foram usadas para calcular a eficiência dos pares de iniciadores e o tamanho dos produtos foi confirmado por eletroforese em gel de agarose. A presença de uma curva de dissociação final específica foi determinada depois de cada corrida de qPCR, com incrementos progressivos de temperatura de 65°C até 95°C (cada etapa de 0,5°C, 5 seg).

[0067] Os genes de referência foram Elongation Factor Ια (número de acesso ao GenBank EC959059), GAPDH (número de acesso ao GenBank CB973647) e Actin (número de acesso ao GenBank AY6807019), conhecidos como sendo referências para parreira (Reid et al., 2006) . Neste trabalho, a estabilidade desses genes foi confirmada usando-se o programa de computador GeNorm (medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). Todos os três genes de referência tinham M-valores menores do que 0,5, em que um M-valor menor do que 1,5 foi, de maneira geral, considerado como estável o suficiente (Ling e Salvaterra, 2011; Van Hiel et al., 2009; Strube et al., 2008) .

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24/49 [0068] Os ciclos limiares (Cl) foram convertidos em expressão relativa com o sistema proposto por Hellemans et al. (2007), usando-se, como entrada, o Cl médio de dois replicados técnicos. O método de Hellemans leva em consideração o valor de eficiência de cada par de iniciadores. Como Cl de referência, os inventores usaram o Cl médio de todas as amostras para a expressão de genes de MLO, enquanto que, para a análise em outros genes envolvidos na defesa de plantas ou em resistência de mio, os inventores usaram o controle de EVB em T = 0. Os dois métodos diferentes foram selecionados por razões gráficas.

Análise estatística

Severidade da doença [0069] Os dados de severidade foram analisados usandose o programa de computador Statistics 9 {StatSoft, Tulsa, EUA) e o pacote estatístico SPSS {LBM, Armonk, EUA) . A menor unidade estatística foi a planta inteira. Os inventores tomaram a média dos valores de severidade de todas as folhas da planta e usaram a severidade média resultante para análise ulterior. Os dados com uma distribuição normal (testes de Kolmogorov-Smirnov e de Shapiro-Wilk P > 0,05) foram validados para homogeneidade de variâncias (teste de Levene, P > 0,05) e subsequentemente usados para ANOVA de um modo com teste post-hoc de Tukey, para detectar diferenças significativas (P < 0,05) em cada ponto de tempo. Os dados foram transformados com a seguinte equação y = arcsen (x), a fim de atender aos pré-requisitos do ANOVA.

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No caso de variâncias não homogêneas, foi usado o teste post-hoc de Games-Howell.

[0070] Os dados a partir dos dois experimentos foram reunidos, e a análise foi realizada, de maneira independente, para os três pontos de tempo (14, 22 e 30 ddi). Os dados de AUDPC foram analisados conforme descrito acima para dados de severidade. Os dados das contagens de conidias foram analisados com o teste de Kruskall-Wallis (P < 0,05).

Análise de dados de qPCR [0071] Para a análise de expressão de gene, valores de expressão relativa foram transformados em escala logarítmica de acordo com a equação Y = In (x) (Pessina et al., 2014) para se obter a distribuição normal e a homogeneidade de variâncias dos resíduos, avaliadas com os testes de Shapiro-Wilk (P d 0,05) e Levene (P d 0,05), enquanto que os dados não homoscedásticos foram analisados com o teste de Howell (P < 0,05) usando-se o pacote estatístico SPSS (IBM) .

[0072] As expressões relativas de genes de MLO a partir de dois experimentos foram analisadas, de maneira independente, e subsequentemente reunidas. Para avaliar diferenças de expressão, ANOVA de um modo com teste post-hoc de Tukey (P < 0,05) foi usado para detectar diferenças significativas em cada ponto de tempo. Em adição, um ANOVA de dois modos com teste post-hoc de Tukey (P < 0,05) foi usado em todos os dados, para considerar, ao mesmo tempo, os efeitos da linhagem transgênica e do ponto de tempo. Os inventores extraíram conclusões a partir desse teste somente quando não havia

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26/49 interações significativas (P > 0,05) entre os fatores ponto de tempo e linhagem transgênica. Para a caracterização da expressão de gene de TLB4, os inventores usaram Fisher como teste post-hoc.

Correlação [0073] Os inventores usaram o teste de correlação de Pearson de duas caudas para investigar duas possíveis correlações: entre a severidade da doença e a quantidade de conídias em 30 ddi e entre a severidade da doença em 14 ddi e a expressão relativa de genes de MLO em 10 ddi. Em ambos os casos, todos os dados, severidade e expressão relativa foram transformados com a seguinte equação y = arcsen(x) , para se conseguir a distribuição normal.

Resultados

Transformação, seleção e aclimatação de linhagens transgênicas de MLO [0074] Um total de cinco transferências de genes foi realizado. Quatro objetivaram a derrubada (knock-down) (KD) de genes de MLO específicos (i = KD-VvML06, ii = KD-VvMLOl, iii = ΚΌ-VvMLOll, iv = KO-VvML013) , o quinto objetivou inserir um vetor vazio. Trinta e quatro linhagens regeneradas foram obtidas, com 26 das quais confirmadas a conterem o inserto (Tabela S3) . O resultado da análise com PCR de seis linhagens é mostrado na Figura Sl. Vinte e seis linhagens transgênicas foram propagadas in vitro e testadas em relação ao silenciamento de genes de MLO com qPCR. Isso foi evidente para três linhagens de oito a partir da

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27/49 transferência de gene (iii) (KD-VvMLOll) , e três de nove a partir da transferência de gene (iv) (KD-VvMLOl3) . As transferências de genes (i) (KD-VvML06) e (ii) (KDVvML07) resultaram em um pequeno número de linhagens regeneradas, que não mostraram redução de expressão (Tabela S3). As linhagens regeneradas também foram testadas em relação ao silenciamento fora de alvo, mostrando que os fragmentos de ARNi tiveram por alvo outros genes de MLO da classe V. Seis linhagens com várias combinações de genes silenciados e indicados com acrônimos TLB1 (Linhagem Transgênica de Brachetto) a TLB6 (Tabela S3) . As linhagens de TLB1 até 3 provieram da transferência de gene (iii) (KD-VvMLOll) , as linhagens de TLB4 até TLB6 provieram da transferência de gene (iv) (~KD-VvML013) (Tabela S3) . 0 controle foi a linhagem de EVB (Vetor Vazio de Brachetto). Em adição, TLB7, uma linhagem regenerada sem redução de expressão, também foi considerada. A todas as linhagens, incluindo o controle, referir-se-á, no texto, como linhagens transgênicas. As linhagens de TLB1 até 7 são adicionalmente indicadas como linhagens de ARNi e de TLB1 até 6 como linhagens mio.

[0075] A taxa de sobrevivência de plantas ao processo de aclimatação foi de cerca de 85%. Sob condições de estufa, as plantas transgênicas exibiram crescimento normal e sem fenótipos pleiotrópicos.

Resistência a míldio pulverulento de linhagens transgênicas [0076] A inoculação com míldio pulverulento foi realizada nas sete linhagens de ARNi (TLB1, TLB2, TLB3,

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TLB4, TLB5, TLB6, TLB7), e na linhagem de controle transgênica de EVB, em dois experimentos independentes. Três linhagens de mio, TLB4, TLB5 e TLB6, exibiram uma redução significativa de infecção por E. necator (Figura 1), que foi maior do que 60% em 30 ddi (Tabela 3).

Tabela 3: Redução da doença de sete linhagens de ARNi.

	Número de plantas	% Redução da doença*	Redução da Doença Média (%)
14 ddi	22 ddi	30 ddi
TLB1	8	22,8	32,3	34,3	29,8
TLB2	15	49,2	37,2	23,8	36,8
TLB3	15	17,9	14,8	2,0	11,6
TLB4	19	60,8	71,7	72,8	68,4
TLB5	14	76,7	79,1	74,0	76,6
TLB6	11	71,8	63,1	60,3	65,1
TLB7	13	-8,0#	-21,5#	-21,2#	-16,9#

* A linhagem de EVB foi usada como controle (12 replicados) e a redução da doença foi calculada como (Severidade da doença de EVB - Severidade da doença da linhagem transgênica)/Severidade da doença de EVB x 100.

# Os valores negativos de TLB7 significam que a linhagem exibiu nível de infecção mais elevado comparado a EVB.

[0077] A redução da doença de TLB6 diminuiu com a progressão da infecção (Tabela 3) , possivelmente por causa das infecções secundárias provenientes de plantas infectadas próximas. TLB2, TLB3 e TLB7 exibiram um nível de suscetibilidade a míldio pulverulento comparável ao controle de EVB (Figura 1 e Tabela 2) . As folhas na Figura 1 exibiram as diferenças entre linhagens resistentes e suscetíveis. Todas as linhagens de mio mostraram redução de conídias nas superfícies das folhas em 30 ddi, e a diminuição foi estatisticamente significativa somente para TLB4, TLB5 e TLB6. TLB4 exibiu uma redução de 93% de conídias, TLB5 de 95% e TLB6 de 72%, comparadas às plantas de EVB. As contagens

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29/49 de conídias e a severidade da doença foram correlacionadas de maneira positiva (P = 0,001), com um coeficiente de correlação de Pearson de 0,578. Isso significa que a redução de sintomas nas folhas refletiu o menor número de conídias em linhagens resistentes.

[0078] A linhagem TLB4 foi adicionalmente caracterizada por análise histológica, demonstrando uma redução progressiva de infecção por míldio pulverulento comparada às plantas de EVB em 3 ddi (Figura 2). Em EVB, os primeiros conidióforos apareceram em 10 ddi, e em 21 ddi eles se espalharam sobre toda a superfície da folha (Figura 2A). Por outro lado, os conidióforos foram visíveis somente em 21 ddi e em um número limitado em folhas de TLB4 (Figura 2B) . A formação de papilas foi observada em TLB4 e EVB em 3 ddi (Figura 3). A papila de EVB definiu bordas e ela estava presente somente em correspondência ao sítio de infeção de E. necator (Figura 3B). Inversamente, as papilas detectadas em TLB4 eram mais difusas, maiores e formadas em mais do que um sítio de infecção do fungo, comparada a EVB (Figura 3D). Expressão de genes de MLO nas linhagens transgênicas de MLO e correlação com severidade [0079] Seis linhagens de mio (TLB1, TLB2, TLB3, TLB4, TLB5, TLB6) e o controle de EVB foram examinados por análise de expressão de gene. A análise de expressão de gene dos quatro genes de MLO da classe V nas linhagens transgênicas confirmou o silenciamento fora de alvo visto in vitro e mostrou alguma variabilidade entre os pontos de tempo (Figura 4) . As linhagens TLB1, TLB2 e TLB3, todas transformadas com o construto tendo por

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30/49 objetivo silenciar VvMLOll, de fato, teve o gene alvo

VvMLOll silenciado. TLB1 exibiu também o silenciamento de VvML013 e TLB3 o de VvML06 (Tabela 4).

Tabela 4: Expressão relativa* de quatro genes de MLO.

	VvMLO6	VvMLO7	VvMLOl 1	VvMLOl 3
TLB1	67%	72%	25%**	49%**
TLB2	79%	94%	40%**	156%
TLB3	71 %*	93%	27%**	69%
TLB4	38%**	49%**	34%**	33%**
TLB5	35%**	55%**	50%**	88%
TLB6	42%**	53%**	55%**	45%**

* Cada valor de expressão relativa (ER%) é a média dos valores de três pontos de tempo (0 ddi, 1 ddi, 10 ddi) em dois experimentos. A ER% foi calculada como se segue: ER% = (ER de controle de EVB / ER da linhagem de mio) x 100.

* Diferença estatisticamente significativa em P = 0,05, de acordo com o teste post-hoc de Tu key.

* Diferença estatisticamente significativa em P = 0,01, de acordo com o teste post-hoc de Tu key.

[0080] As linhagens TLB4, TLB5 e TLB6, provenientes da transformação tendo por objetivo silenciar VvML013, exibiram mais silenciamento fora de alvo. Em TLB4 e TLB6, todos os quatro genes de MLO da classe V foram silenciados, enquanto que, em TLB5, VvMLOô, VvMLOl e VvMLOll, foram silenciados (Tabela 4).

[0081] Uma correlação de Pearson positiva estatisticamente significativa (P = 0,05) foi encontrada entre a expressão relativa de VvMLOl e a severidade de sintomas de míldio pulverulento, mas não para os outros três genes de MLO. O coeficiente de correlação de Pearson para VvMLOl foi de 0,272, significando que a correlação, embora significativa, foi fraca.

[0082] A análise de expressão de gene da linhagem de mio TLB4

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31/49 [0083] O perfil de expressão de 13 genes conhecidos, a serem modulados seguindo as infecções por míldio pulverulento, foi realizado na linhagem resistente TLB4, em três pontos de tempo (Figura 5). A linhagem TLB4 foi selecionada porque ela apresenta todos os quatro genes da classe V de MLO silenciados. Em EVB, os inventores observaram uma regulação à montante geral de genes, especialmente em 10 ddi. Ao invés disso, na linhagem transgênica TLB4, menos genes foram regulados à montante e a intensidade de regulação à montante, em termos de mudança em vezes, foi limitada. Além disso, três genes foram regulados à jusante em TLB4 depois de inoculação, a saber, VvPR6 (RELACIONADO A PATÓGENO) em 1 ddi e VvNPF3.2 (FAMÍLIA DE TRANSPORTADOR DE

NITRATO/TRANSPORTADOR DE PEPTÍDEO) e VvALSl (ACETOLACTATO SINTASE) em 10 ddi. É digno de nota que, antes da inoculação, não houve diferenças em expressão entre TLB4 e o controle de EVB.

Discussão [0084] As mutações de perda de função de genes de MLO reduzem a suscetibilidade ao míldio pulverulento em cevada (Büschges et al. , 1997), Arabidopsis (Consonni et al., 2006), ervilha (Pavan et al., 2011), tomate (Bai et al. , 2008), trigo (Wang et al., 2014) e pimenta (Zheng et al., 2013) . Porque, em dicotiledôneas, todos os Sgenes de MLO da Classe V estão implicados na suscetibilidade ao míldio pulverulento (Consonni et al., 2006; Bai et al., 2008; Feechan et al. , 2008; Winterhagen et al., 2008), o objetivo desse trabalho era identificar, qual dos genes de MLO da classe V de

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32/49 parreira tem um papel na suscetibilidade ao míldio pulverulento, e pode, portanto, ser inativado para desenvolver genótipos resistentes. Das 26 linhagens transgênicas, seis de transferências de genes (iii) (KDVvMLOll) e (iv) (KD-VvML013) suportaram derrubada de gene significativa. Nas linhagens regeneradas obtidas de transferências de genes (i) (KD-WML06j e (ii) (KDVvMLOl) , a redução de expressão não foi evidente. Não pode ser excluído que isso foi devido aos fragmentos de ARNi curtos presentes nos construtos (Preuss e Pikaard, 2003) . A detecção de silenciamento fora de alvo em cinco das seis linhagens mencionadas era esperada, uma vez que os genes de MLO da classe V apresentam elevados níveis de identidade de sequências (36-60%, 46% em média; Feechan et al., 2008; Winterhagen et al., 2008) . Encontrar um equilíbrio entre especificidade (fragmentos de ARNi curtos) e efetividade (fragmentos de ARNi longos) é particularmente difícil em famílias de genes com elevada similaridade de sequências (Zhao et al., 2005) . Uma vez que o objetivo era estudar o efeito da derrubada de quatro genes de MLO muito similares uns aos outros, os inventores optaram por fragmentos de ARNi longos, de modo que o silenciamento fora de alvo não foi somente esperado, mas também desejado.

[0085] O nocaute e a derrubada de genes de MLO podem induzir fenótipos pleiotrópicos, como ponto necrótico em folhas e rendimento em grãos reduzido em cevada (Jorgensen, 1992), crescimento lento em Arabidopsis (Consonni et al., 2006) e tamanho de planta reduzido em pimenta (Zheng et al., 2013) . Em parreiras, não foram

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33/49 observados fenótipos pleiotrópicos sob as condições experimentais adotadas.

[0086] As linhagens de TLB4, 5 e 6, que mostraram clara resistência ao míldio pulverulento, permitiram estudar a ligação entre a resistência e a expressão de genes de MLO específicos. A expressão de VvMLOll foi reduzida, de maneira significativa, em linhagens de mio suscetíveis e resistentes: concluiu-se que sua derrubada não estava diretamente ligada à suscetibilidade da parreira ao míldio pulverulento. VvMLOô foi silenciado, de maneira significativa, nas linhagens resistentes de TLB4, 5 e 6 e na linhagem suscetível de TLB3. Como para VvMLOll, a derrubada de VvMLOô, em linhagens tanto suscetíveis quanto resistentes, indica que este não deve ser um S-gene. Similarmente a VvMLOô, VvML013 foi derrubado nas linhagens resistentes de TLB4 e 6, mas também na linhagem suscetível TLB1. VvML07 foi derrubado somente nas três linhagens resistentes TLB4, 5 e 6; a conclusão é que VvML07 representa o principal candidato para causar a suscetibilidade ao míldio pulverulento em V. vinifera. A correlação positiva significativa entre a expressão relativa de VvML07 e a severidade da doença nas linhagens transgênicas de MLO, estimula a conclusão de que cada sítio de mutagênese dirigida ou busca por alelos não funcionais naturais podem ser usados em programas de procriação, para se obter genótipos resistentes ao míldio pulverulento. No entanto, observou-se que VvML07 era sempre derrubado em conjunto com outros dois ou três genes de MLO. Também em Arabidopsis, o nocaute contemporâneo de três genes de

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MLO é necessário para se obter resistência completa: o nocaute de AtML02 resulta em um nível de resistência moderado, enquanto que o nocaute de AtMLOô e de AtML012, isoladamente ou combinados, não diminui a intensidade da infecção. Quando AtML02 for nocauteado em conjunto com AtMLOõ ou AtML012, o nível de resistência se elevará, para se tornar completo quando os três genes forem nocauteados em conjunto (Consonni et al. , 2006) . Em parreiras, VvML07 parece atuar como AtML02 de Arabidopsis. Dois candidatos para um papel aditivo e sinergístico na suscetibilidade ao míldio pulverulento em parreiras são VvMLOô e VvMLOl 1, uma vez que sua expressão foi reduzida, de maneira significativa, em todas as três linhagens resistentes. Em Arabidopsis, o nocaute de três genes de MLO induz a resistência completa (Consonni et al., 2006), uma situação não observada em parreiras, em acordo com o silenciamento incompleto de genes de MLO obtido pela abordagem com ARNi. Um teste de complementação, realizado em mutante triplo de mio de Arabidopsis, mostrou que VvMLOll e VvML013 induzem a suscetibilidade ao míldio pulverulento, enquanto que VvMLOl apresenta somente um efeito parcial e VvMLOô não apresenta efeito, absolutamente (Feechan et al., 2013b). No entanto, mutantes de derrubada de VvMLOll e VvMLOl3, simples e duplos, de V. vinifera, obtidos por ARNi, não exibiram redução significativa de penetração de míldio pulverulento (Qiu et al., 2015) . Consequentemente, os dados dos inventores indicaram VvML07 como o S-gene principal de parreira, com um efeito aditivo putativo

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35/49 fornecido por VvMLOll e VvML06. 0 papel de VvML06 seria particularmente surpreendente, já que ele não era regulado à montante durante a infecção por míldio pulverulento (Feechan et al., 2008; Winterhagen et al., 2008) . Inversamente, VvMLOl 3, cuja derrubada era esperada a fornecer um efeito significativo sobre a suscetibilidade ao míldio pulverulento, verificou-se ser ineficaz. No entanto, deve ser considerado que Feechan et al. (2013b) operaram em um sistema heterólogo (Arabidopsis) não reproduzindo com fidelidade a infecção por míldio pulverulento em plantas de parreira.

[0087] O mecanismo preciso, através do qual a redução de expressão de genes de MLO termina em resistência a patógenos de míldio pulverulento, não é completamente claro. A resistência parece ligada ao tráfego de vesículas secretoras (Miklis et al., 2007; Feechan et al., 2011) e à formação de aposições à parede celular chamadas papilas (Consonni et al., 2006) . Essas estruturas consistem em uma matriz de calose enriquecida em proteínas e compostos fenólicos autofluorogênicos (Vanacker et al. 2000), e sua formação depende de transporte endomembrana (Hückelhoven, 2014) . Os resultados mostrados nesse artigo indicam que todas as linhagens transgênicas acumulam materiais autofluorogênicos superimpostos à estrutura de papila, embora o formato e as dimensões de papilas fossem diferentes em linhagens resistentes e suscetíveis. Sabese que a resposta de defesa com base em papilas difere entre genótipos resistentes e suscetíveis em cronograma de formação, composição e tamanho (Chowdhury et al.,

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2014; Hückelhoven, 2014; Lyngkjeer et al. 2000). A rápida formação de papilas em cevada resistente a mlo (Lyngkjger et al. 2000) e tamanho aumentado (Stolzenburg et al., 1984) se correlaciona com a resistência a mlo. Em parreiras, a formação de papila é restrita ao sitio de infecção em plantas de controle, enquanto que ela é difusa na linhagem resistente TLB4. Chowdhury et al. (2014) mostraram que a diferença entre papilas efetivas e não efetivas é devida à concentração mais elevada de calose, celulose e arabinoxilano daquelas efetivas. Isso sugere que, no caso de parreira, tipos diferentes de fluorescência poderíam refletir diferenças na composição das papilas. A proteína de MLO tem sido proposta a ser um regulador negativo de vias de defesa associadas a vesículas e dependentes de actina, no sítio de penetração de míldio pulverulento tentado (Panstruga, 2005) . Além disso, Miklis et al. (2007) propuseram que, uma vez que as proteínas de MLO estão sob o controle do fungo, os filamentos de actina servem à finalidade de suprir nutrientes para o crescimento das hifas através de transporte vesicular. É como se o patógeno fosse capaz de controlar o transporte de material para a parede celular, com a finalidade de mudar a composição das papilas e torna-las de efetivas em não efetivas.

[0088] A formação de papilas não é o único processo instigado pela atividade de genes de MLO. Para se entender o efeito da derrubada de MLO sobre outros genes envolvidos na interação planta-patógeno, foi analisada a expressão de 13 genes conhecidos a serem expressos, de maneira diferencial, depois da inoculação de míldio

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37/49 pulverulento. Na linhagem resistente TLB4, a derrubada de genes de MLO não afetou o nível de expressão dos 13 genes em ausência de infecção por míldio pulverulento. Sob infecção de E. necator (Guo et al., 2014), os fatores de transcrição VvWRKY19, VvWRKY48 e VvWRKY52 são regulados à montante: os mesmos genes apareceram regulados à montante em EVB, nos experimentos dos inventores, mas eles estavam em um nível tão muito mais baixo em TLB4. VvNPF3.2, um transportador de nitrito/nitrato regulado à montante em parreiras infectadas com E. necator (Pike et al. , 2014), era regulado à jusante em TLB4 em 10 ddi, indicando que, nesta linhagem, somente uma infecção severa provoca a regulação à montante de VvNPF3.2. VvEDSl (suscetibilidade à doença intensificada) e VvPAD4 (deficiente em fitoalexina) são genes de defesa da parreira envolvidos na via do ácido salicílico (AS) (Gao F. et al., 2014) . O AS ativa os genes relacionados à patogênese e induz a resistência à doença (Ward et al., 1991). Ambos os genes eram regulados à montante na linhagem de controle de EVB em 10 ddi (VvPAD4 também em 1 ddi). Isso pode indicar que somente uma pesada infecção por E. necator desencadeia a defesa da planta dependendo de AS. VvEDSl não era regulado à montante em TLB4, enquanto que VvPAD4 era regulado à montante somente em 10 ddi, como se o nível de infecção por míldio pulverulento fosse insuficiente para ativar a reação na planta. A regulação à montante no controle e nenhuma regulação à montante em TLB4 foram também observadas tanto para VvPRl quanto para VvPR6, genes

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38/49 relacionados à patogênese envolvidos na defesa da planta e que se sabe são regulados à montante em folhas de parreira infectadas por míldio pulverulento, previamente tratadas com um análogo de AS (Dufour et al., 2013) . VvLOXl codifica uma lipoxigenase e é o homólogo para AtL0X2 de Arabidopsis, que é regulado à montante em plantas infectadas com esporos de míldio pulverulento (Lorek, 2012) . De maneira surpreendente, esse gene era regulado à montante em TLB4 em 10 ddi, mas não em EVB. Uma segunda lipoxigenase, VvLOX9, não mostrou, nas linhagens de parreira consideradas, qualquer mudança de expressão, apesar de se saber estar envolvida na defesa da planta (Dufour et al., 2013) . VvPENl (penetração) codifica uma proteína SNARE homóloga a AtPENl de Arabidopsis e R.0R.2 de cevada, que têm papéis importantes na resistência à penetração do míldio pulverulento (Collins et al., 2003). Sabe-se que VvPENl, quando expresso em um sistema heterólogo (Arabidopsis), se colocaliza com VvMLOll em sítios de penetração de míldio pulverulento tentados (Feechan et al., 20013b). No entanto, a infecção com E. necator não causa qualquer mudança dessa expressão. VvALSl é o homólogo de uma aceto-lactato sintase de tomate, uma enzima chave na biossíntese dos aminoácidos valina, leucina e isoleucina, e envolvida na resistência mediada por mio (Gao D. et al., 2014) . O silenciamento de S1ALS1 em mio de tomate compromete sua resistência, sugerindo que a homeostase de aminoácidos é um processo importante conectado à resistência de mio (Gao D. et al., 2014) . A falta completa de mudança transcricional indicou que a

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39/49 função desse gene em parreiras não depende do nível de transcrito.

[0089] 0 nocaute de genes de mio aumentou a suscetibilidade a outros patógenos em cevada (Jarosch et al. , 1999; Kumar et al. , 2001) e Arabidopsis (Consonni et al., 2006) . A infecção com P. viticola, um fungo biótrofo obrigatório, como E. necator, revelou que a derrubada de genes de MLO não mudou a suscetibilidade da parreira ao míldio de penugem, suportando a conclusão de que S-genes de MLOs são específicos para E. necator e que não estão envolvidos na interação da planta com P. viticola.

Conclusões [0090] A derrubada de genes de MLO reduz, de maneira substancial, a suscetibilidade ao míldio pulverulento de Vitis vinifera. A redução de expressão de VvML07 foi o fator principal envolvido na resistência, mas os efeitos aditivos da derrubada de VvMLOó e de VvMLOll contribuem adicionalmente na redução da severidade do míldio pulverulento. A resistência absoluta não foi observada, conforme esperado com base no silenciamento incompleto de genes de MLO via ARNi. Em linhagens de mio, não foram detectados fenótipos pleiotrópicos, sob condições de estufa. Este trabalho fornece uma informação crucial, que pode ser usada na reprodução de variedades de parreira resistentes a E. necator. A marcação, via edição de genoma, dos genes de MLO identificados nesta invenção, particularmente de VvML07, deve resultar em mutantes de nocaute altamente resistentes ao míldio pulverulento. Alternativamente, a pesquisa em V.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, caracterizado por a sequência de aminoácidos codificada pelo gene que confere resistência ser a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 1, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 1, e sendo que o gene que confere resistência está prejudicado.
2. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, caracterizado por a sequência de aminoácidos codificada pelo gene que confere resistência ser a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 2, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 2, e sendo que o gene que confere resistência está prejudicado.
3. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, caracterizado por a sequência de aminoácidos codificada pelo gene que confere resistência ser a sequência de aminoácidos primária representada por SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente,

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Ί/3 mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 3, e sendo que o gene que confere resistência está prejudicado.
4. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é uma ou mais mutações no gene, resultando na ausência de um produto de expressão de proteína com a sequência de aminoácidos

primária de SEQ ID N° 1 ou um mARN compreendendo SEQ ID N° 4 . 5. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é uma ou mais

mutações no gene, resultando na ausência de um produto de expressão de proteína com a sequência de aminoácidos

primária de SEQ ID N° 2 ou um mARN compreendendo SEQ ID N° 5 . 6. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é uma ou mais

mutações no gene, resultando na ausência de um produto de expressão de proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 3 ou um mARN compreendendo SEQ ID N° 6 .

7. Gene que confere resistência a

Erysiphe necator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é uma ou mais mutações no gene, resultando em um produto de expressão de proteína não funcional. 8. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 1,

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3/6 caracterizado pelo fato de que o prejuízo é um nível de transcrição reduzido, resultando em um nível reduzido de um mARN compreendendo SEQ ID N° 4.

9. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é um nível de transcrição reduzido, resultando em um nível reduzido de um mARN compreendendo SEQ ID N° 5.

10. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é um nível de transcrição reduzido, resultando em um nível reduzido de um mARN compreendendo SEQ ID N° 6.

11. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o prejuízo é um nível de tradução reduzido.

12. Gene que confere resistência a Erysiphe necator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o gene é derivado de Vitis vinifera.

13. Planta de Vitis vinifera, caracterizada por compreender, em seu genoma, um gene prejudicado que confere resistência, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, sendo que o prejuízo fornece resistência a Erysiphe necator.

14. Planta de Vitis vinifera, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a expressão, ou a transcrição, do gene que confere resistência a Erysiphe necator é reduzida em pelo menos

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4/6

10%, quando comparada a uma planta de Vitis vinifera suscetível a Erysiphe necator.

15. Planta de Vitis vinifera, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a expressão, ou a transcrição, do gene que confere resistência a Erysiphe necator é reduzida em pelo menos 20%, quando comparada a uma planta de Vitis vinifera suscetível a Erysiphe necator, de preferência, em pelo menos 30%, mais preferivelmente, em pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente, em pelo menos 70%, e, muitíssimo preferivelmente, em pelo menos 80%.

16. Planta de Vitis vinifera, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada pelo fato de que a expressão, ou a transcrição, do gene que confere resistência a Erysiphe necator, está ausente • 17. Planta de Vitis vinifera, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende, em seu

genoma, um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 1, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 1; e, em adição, um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 2, ou uma sequência de

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5/6 aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 2; e/ou um gene prejudicado que confere resistência a Erysiphe necator, que codifica uma proteína com a sequência de aminoácidos primária de SEQ ID N° 3, ou uma sequência de aminoácidos primária com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com a SEQ ID N° 3.

18. Sementes partes de plantas ou material de propagação, caracterizadas por compreender, em seu genoma, ou dois ou três genes prejudicados que conferem resistência a Erysiphe necator, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, sendo que o prejuízo fornece resistência a Erysiphe necator.

19. Sequência de nucleotídeos isolada caracterizada por ser representada por SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 6, ou sequências de nucleotídeos com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com elas.

2 0. Sequências de aminoácidos isoladas caracterizadas por serem representadas por SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3, ou sequências de

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6/6 aminoácidos com mais do que 70% de identidade, de preferência, mais do que 80% de identidade, mais preferivelmente, mais do que 90% de identidade, e, muitíssimo preferivelmente, mais do que 95% de identidade com elas.

21. Aplicação de pelo menos um gene que confere resistência a Erysiphe necator, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, de uma sequência de nucleotídeos isolada de acordo com a reivindicação 19, ou uma sequência de aminoácidos isolada de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato que é para seleção, ou identificação, de uma planta de Vitis vinifera resistente a Erysiphe necator.