ES2702903T3 - Gen de resistencia frente a rizomanía - Google Patents

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Abstract

Molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido, que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa el polipéptido, caracterizada por que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que está seleccionada de a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3, b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que se deriva por sustitución, deleción y/o adición de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b), de un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b), d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80 % con una secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b) o e) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos las posiciones de aminoácidos 168-227 de la SEQ ID NO: 2 y al menos las posiciones de aminoácidos 591-613 de la SEQ ID NO: 2 y al menos las posiciones de aminoácidos 1013-1072 de la SEQ ID NO: 2 o que codifica al menos las posiciones de aminoácidos 182-241 de la SEQ ID NO: 3, al menos las posiciones de aminoácidos 605-627 de la SEQ ID NO: 3 y al menos las posiciones de aminoácidos 1027-1086 de la SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Gen de resistencia frente a rizomanía
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido, que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno, en particular frente al “Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (virus de las nervaduras amarillas y necróticas) en una planta, en particular del género Beta, en la que se expresa el polipéptido. Además, la invención se refiere a un polipéptido, que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta, en particular una resistencia frente BNYVV en una planta del género Beta, en la que se expresa el polipéptido y que es codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Además, la invención se refiere a una planta, célula vegetal, órgano vegetal, tejido vegetal, parte vegetal transgénica o a una semilla de una planta, que comprenden la molécula de ácido nucleico o partes de la misma así como a procedimientos para la producción de una planta o célula vegetal transgénica de este tipo. Además, la invención también incluye procedimientos para la detección de la molécula de ácido nucleico que otorga la resistencia así como procedimientos para la selección de plantas o células vegetales que presentan la molécula de ácido nucleico que otorga la resistencia.
Antecedentes de la invención
La rizomanía es la enfermedad económicamente de mayor importancia a nivel mundial de la remolacha azucarera, que puede causar pérdidas del 50 % y más en la cosecha. La enfermedad, que se denomina también “enfermedad de las nervaduras amarillas y necróticas”, es causada por el “virus de las nervaduras amarillas y necróticas” (BNYVV, por sus siglas en inglés) y es transmitida por el protozoo con origen en el suelo Polymyxa betae. Una infección por BNYVV se manifiesta en una proliferación aumentada de las raíces delgadas y las raíces secundarias y en la configuración de un cuerpo radicular de un tamaño muy disminuido con un contenido reducido en azúcar. Las plantas infectadas muestran una menor absorción de agua y, por tanto, son más sensibles frente a estrés por sequía. Cuando la infección se propaga a la totalidad de la planta se produce la coloración amarilla de las venas de la hoja, lesiones necróticas y manchas amarillas sobre las hojas. Ya que no es posible combatir curativamente la enfermedad, como en otras enfermedades víricas, el daño se puede evitar únicamente mediante el cultivo de variedades resistentes. Actualmente se han examinado en esencia tres genes principales contra la rizomanía: RZ-1 (denominado también “Holly”), RZ-2 y RZ-3. Además, en la bibliografía se describen otros genes de resistencia frente a la rizomanía, pero son de importancia menor. A este respecto, el gen de resistencia RZ-1 ya está incorporado en la mayoría de las líneas de cultivo (semilla parental y/o polinizador componentes parentales). Sin embargo, se ha mostrado que en regiones muy infectadas o en regiones con diversos patotipos de BNYVV (por ejemplo, Sohi & Maleki, 2004) la resistencia que es otorgada por RZ-1 no es suficiente. Por este motivo se ha propuesto, ya desde hace bastante tiempo, combinar RZ-1 con, por ejemplo, RZ-2 o RZ-3. RZ-2 y RZ-3 proceden de fuentes de Beta vulgaris subsp. marítima (WB42, WB41) y se mapean genéticamente en la misma región en el cromosoma 3 del genoma de la remolacha azucarera, mientras que RZ-1 se mapea al sur de RZ-2 y RZ-3, pero también en el cromosoma 3. Scholten et al. (1999) determinaron una distancia de 20-25 cM entre los genes principales RZ RZ-1 y RZ-2. Gidner et al. (2005) encuentran una menor distancia de 5 cM entre RZ-1 y RZ-2 y no descartan que RZ-2 y RZ-3 se mapeen en el mismo locus. Schmidlin et al. (2008) habían identificado mediante análisis de expresión en remolachas infectadas diferentes genes inducidos, pero que no se correspondían con RZ-2 o RZ-3. En el estudio de Larson et al. (2008) se detectaron con el método de MALDI-TOF-MS algunas proteínas inducidas por BNYVV en la remolacha azucarera, sin embargo, los investigadores no pudieron identificar las proteínas que son codificadas por RZ-1, RZ-2 o RZ-3. Además, la región de la secuencia, en particular alrededor de estos genes de resistencia, es repetitiva, lo que hace particularmente difícil el desarrollo de marcadores de diagnóstico. Así, hasta ahora no están disponibles públicamente ni mapas de marcadores de alta resolución ni genes candidato verificados para los genes mencionados de resistencia frente a la rizomanía. Además, hasta la fecha sigue siendo completamente desconocido el trasfondo funcional de estos genes de resistencia RZ, es decir, la estructura genética.
Para un cultivo sostenible frente a rizomanía, que debe contrarrestar el riesgo de aislados de BNYVV que rompan la resistencia, es necesario identificar constantemente nuevos genes de resistencia e integrar los mismos en el acervo genético de las plantas de cultivo tales como remolachas azucareras.
Resumen de la invención
La presente invención se efectuó ante el trasfondo del estado de la técnica que se ha descrito anteriormente, siendo el objetivo de la presente invención facilitar una molécula de ácido nucleico y/o un polipéptido que esté en disposición de otorgar resistencia frente a rizomanía en una planta. Además, es objetivo facilitar una planta transgénica resistente a rizomanía así como un método para su producción. Además, es objetivo de la presente invención facilitar métodos para el aprovechamiento y el desarrollo de marcadores moleculares que posibiliten un cultivo eficiente frente a rizomanía y el desarrollo de nuevas líneas de plantas resistentes.
Las configuraciones de la presente invención que resuelven el objetivo se basan en el mapeo fino genético, la identificación, el aislamiento y la caracterización de un gen que procede del donador Beta vulgaris subsp. marítima y que codifica un polipéptido o una proteína que está en disposición de otorgar resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa el polipéptido.
A continuación, en primer lugar se explican con mayor detalle algunas de las expresiones usadas en la presente solicitud: el término “aproximadamente” en relación con la indicación de una longitud de una secuencia de nucleótidos significa una desviación de /- 200 pares de bases, preferentemente de /- 100 pares de bases y de forma particularmente preferente de /- 50 pares de bases.
Una “planta del género Beta” pertenece a la familia de las amarantáceas (Amaranthaceae). Entre estas plantas se encuentran plantas de las especies Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna y Beta nana. Una planta de la especie Beta vulgaris es en particular una planta de la subespecie Beta vulgaris subsp. marítima (acelga silvestre) o Beta vulgaris subsp. vulgaris. Entre estas se encuentran por ejemplo Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (remolacha azucarera en el sentido estricto), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (acelga), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (remolacha roja), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (remolacha forrajera).
Por “hibridar” o “hibridación” se entiende un proceso en el que una molécula de ácido nucleico monocatenaria se adosa a una cadena sustancialmente complementaria de ácido nucleico, es decir, establece con la misma emparejamiento de bases. Están descritos procedimientos convencionales para la hibridación, por ejemplo, en Sambrook et al. 2001. Preferentemente, por ello se entiende que al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 % o el 85 %, de forma particularmente preferente el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de las bases de la molécula de ácido nucleico establece un emparejamiento de bases con la cadena sustancialmente complementaria de ácido nucleico. La posibilidad de un adosamiento de este tipo depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones de hibridación. Se da una alta rigurosidad cuando el emparejamiento de bases está dificultado, una baja rigurosidad, cuando está facilitado el emparejamiento de bases. La rigurosidad de las condiciones de hibridación depende, por ejemplo, de la concentración de sal o de la fuerza iónica y la temperatura. En general se puede aumentar la rigurosidad por un aumento de la temperatura y/o una reducción del contenido de sal. Se ha de entender por “condiciones de hibridación rigurosas” aquellas condiciones en las que una hibridación tiene lugar sobre todo solo entre moléculas homólogas de ácido nucleico. A este respecto, la expresión “condiciones de hibridación” no se refiere solo a las condiciones existentes durante el adosamiento en sí de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones existentes en las posteriores etapas de lavado. Son condiciones de hibridación rigurosas, por ejemplo, condiciones en las que hibridan sobre todo solo aquellas moléculas de ácido nucleico que presentan una identidad de secuencia de al menos el 70 %, preferentemente de al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Son condiciones de hibridación rigurosas por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 65 °C y posterior lavado múltiple en 0,1 x SSC a 65 °C durante en total aproximadamente 1 hora. La expresión usada en el presente documento “condiciones de hibridación rigurosas” también puede significar: hibridación a 68 °C en fosfato sódico 0,25 M, pH 7,2, el 7 % de SDS, EDTA 1 mM y el 1 % de BSA durante 16 horas y posterior lavado de dos veces con 2 x SSC y el 0,1 % de SDS a 68 °C. Preferentemente, una hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas.
Por una “molécula de ácido nucleico aislada” se entiende una molécula de ácido nucleico separada de su entorno natural u original. La expresión comprende también una molécula de ácido nucleico producida sintéticamente. Por un “polipéptido aislado” se entiende un polipéptido separado de su entorno natural u original. La expresión comprende también un polipéptido producido sintéticamente.
Un “marcador molecular” es un ácido nucleico que es polimorfo en una población vegetal. Por ello, un marcador de este tipo está en disposición de detectar y de diferenciar distintos estados alélicos (alelos). Para ello se emplean procedimientos analíticos conocidos, tales como por ejemplo RFLP, AFLP, SNP, SSR o KASP. El término “marcador molecular” se refiere también a secuencias de nucleótidos que son complementarias o al menos en esencia complementarias u homólogas con respecto a secuencias genómicas, por ejemplo, ácidos nucleicos que se emplean como sondas o cebadores. Los marcadores que describen polimorfismos genéticos se pueden detectar mediante el uso de métodos bien establecidos. Estos son, por ejemplo, una amplificación específica de secuencia basada en PCR, una detección de 'Restriction Fragment Length Polymorphisms' (RFLP, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción), una detección de polimorfismos de polinucleótidos mediante 'Allele Specific Hybridization' (ASH, hibridación con especificidad de alelos), una detección secuencias variables amplificadas del genoma vegetal, una detección de una 'Self-Sustained Sequence Replication' (replicación de sequencia autosostenida), una detección de 'Simple Sequence Repeats' (SSR, repeticiones de sequencias simples), una detección de 'Single Nucleotide Polymorphisms' (SNP, polimorfismo de un solo nucleótido), o una detección de 'Amplified Fragment Length Polymorphisms' (AFLP, polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados). Además, también se conocen los métodos para la detección de 'Expressed Sequence Tags' (EST, marcadores de secuencia expresada) y marcadores de SSR derivados de secuencias de EST y 'Randomly Amplified Polymorphic DNA' (RAPD, ADN polimórfico amplificado de forma aleatoria).
Un “promotor” quiere decir una secuencia de ADN reguladora no traducida, típicamente cadena arriba de una región codificante, que incluye el sitio de unión para la ARN-polimerasa y que inicia la transcripción del ADN.
Un “patógeno” quiere decir un organismo que, en interacciones con una planta, conduce a síntomas de enfermedad en uno o varios órganos de la planta. Entre estos patógenos se encuentran, por ejemplo, organismos animales, fúngicos, bacterianos o víricos u oomicetos.
Por una “ infección por patógeno” se ha de entender el momento más temprano en el que un patógeno interacciona con un tejido hospedador vegetal. Por ejemplo, en el caso de patógeno vírico BNYVV, el mismo se transmite por el protozoo Polymyxa betae. Polymyxa forma esporas que pueden perdurar en la tierra a lo largo de décadas. En estas esporas perdura también el virus. Cuando estas esporas latentes germinan hasta dar zooesporas móviles, el virus a través de las mismas puede llegar a células del tejido hospedador vegetal e interaccionar allí con el hospedador (Esser 2000).
Los “órganos” vegetales significan por ejemplo hojas, tallo, tronco, raíces, hipocótilo, brotes vegetativos, meristemos, embriones, anteras, óvulos o frutos. “Partes” vegetales quiere decir una agrupación de varios órganos, por ejemplo una flor o una semilla, o una parte de un órgano, por ejemplo, un corte transversal a través del brote. Los “tejidos” vegetales son, por ejemplo, tejido calloso, tejido de almacenamiento, tejido meristemático, tejido foliar, tejido de tallo, tejido radicular, tejido tumoral de planta o tejido reproductor. Por “células” vegetales se ha de entender, por ejemplo, células aisladas con una pared celular o agregados de las mismas o protoplastos.
El término “resistencia” se ha de entender de forma amplia y abarca el intervalo de la protección desde un retardo hasta la completa inhibición del desarrollo de la enfermedad. Un ejemplo de un patógeno de importancia es el virus de las nervaduras amarillas y necróticas (BNYVV). Preferentemente, una célula vegetal resistente de la invención o una planta resistente de la invención consigue una resistencia frente a BNYVV. Una resistencia frente a un patógeno es equivalente a una resistencia frente a la enfermedad que causa este patógeno, por ejemplo, una resistencia frente a BNYVV es también una resistencia frente a rizomanía.
Una “planta transgénica” se refiere a una planta en cuyo genoma se ha integrado al menos un ácido nucleico. A este respecto se puede tratar de un ácido nucleico heterólogo. Preferentemente, el ácido nucleico está integrado de forma estable, lo que significa que el ácido nucleico integrado permanece estable en la planta, se puede expresar y también se puede transmitir hereditariamente a los descendientes de manera estable.
La presente solicitud desvela una molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido, que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta, en la que se expresa el polipéptido. La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que está seleccionada de
a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3,
b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 1,
c) una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b) en condiciones rigurosas,
d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que se deriva por sustitución, deleción y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b), de un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b),
e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 60 % con una secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b) o
f) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un dominio de unión a nucleótidos (NSB o NB-ARC) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 168-227 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 182-241 de la SEQ ID NO: 3, al menos un dominio rico en leucina (LRR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 591-613 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 605­ 627 de la SEQ ID NO: 3 y/o al menos un dominio de repetición interna (IR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1013-1072 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1027-1086 de la SEQ ID NO: 3.
En el caso de la molécula de ácido nucleico se puede tratar de una molécula de ácido nucleico aislada. Preferentemente se trata de ADN y de forma particularmente preferente de ADNc (ADN codificante). Preferentemente, el polipéptido que se codifica por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención otorga una resistencia frente al patógeno vírico “virus de las nervaduras amarillas y necróticas” (BNYVV), que causa la enfermedad de las plantas rizomanía. Además, el polipéptido que se codifica por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención otorga en particular en una planta del género Beta una resistencia frente a un patógeno. Preferentemente, en el caso de la planta se trata de una planta de la especie Beta vulgaris, de forma particularmente preferente de una planta de subespecie Beta vulgaris subsp. marítima o Beta vulgaris subsp. vulgaris; entre estas se encuentran por ejemplo los tipos de cultivo remolacha azucarera, remolacha roja, remolacha forrajera, acelga y acelga amarilla.
En una forma de realización de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a). La secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 del polipéptido codificado y/o de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 del polipéptido codificado representa la proteína de resistencia del gen RZ-3. En este caso se trata de un gen/proteína de resistencia de tipo NBS-LRR, que está caracterizado por determinados motivos estructurales. La estructura general de tales proteínas de resistencia en plantas ya se ha examinado bien (Martin et al. 2003). Sin embargo, el principio de la configuración estructural en particular del denominado dominio LRR, que se considera el dominio de detección potencial de efectores patógenos la mayoría de las veces desconocidos, no es predecible. Por consiguiente, es imposible la identificación de un gen o proteína que otorga resistencia a BNYVV únicamente basándose en los motivos estructurales conocidos. La identificación del gen de resistencia RZ-3 tuvo lugar en el transcurso de un procedimiento de map-based-cloning (clonación basada en mapa) que requirió un mapeo y un mapeo fino genéticos intensivos de la región diana en la que se presupuso en primer lugar el gen de resistencia RZ-3. Los trabajos desarrollados se describen con más detalle más adelante.
La proteína de resistencia identificada pertenece al tipo NBS-LRR y presenta un dominio de unión a nucleótidos (NBS, conocido también por NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4)) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 168-227 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 182-241 de la SEQ ID NO: 3, un dominio rico en leucina (LRR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 591-613 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 605-627 de la SEQ ID NO: 3 y al menos un dominio de repetición interna (IR; dominio de Internal Repeat) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1013-1072 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1027-1086 de la SEQ ID NO: 3. El dominio NBS es codificado por los nucleótidos 2019-2882 de la SEQ ID NO: 1, el dominio LRR, por los nucleótidos 3288-3356 de la SEQ ID NO: 1 y el dominio de IR, por los nucleótidos 4554-4871 de la SEQ ID NO: 1. El dominio NB-ARC es un dominio de unión a nucleótido central. Probablemente es un domino ATPasa funcional, que probablemente regula la actividad de una proteína de resistencia. El dominio NB-ARC se compone de tres subdominios: NB, ARC1 y ARC2. Son motivos característicos del dominio NB-ARC APAF-1 (apoptotic protease activating factor-1), que es responsable probablemente de la reacción de hipersensibilidad, hhGRExe, Walker-A o P-loop, Walker-B, GxP, RNBS-A a D y MHD (Ooijen et al., 2008). Algunos de los motivos mencionados ya se han podido identificar. En otra forma de realización de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con b). La secuencia de nucleótidos comprende las secuencias codificantes de la secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, que codifican las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 2 y 3.
En otra forma de realización de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con d). Esta secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que representa un derivado del polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b). Un derivado del polipéptido representa una secuencia de aminoácidos derivada, que presenta al menos una sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, conservándose la funcionalidad del polipéptido/proteína codificado. En el caso de la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido con propiedades físico-químicas iguales o equivalentes o similares, se habla de una “sustitución conservadora” o “sustitución semiconservadora”. Son ejemplos de propiedades físico-químicas de un aminoácido por ejemplo la hidrofobia o la carga. El experto en la materia sabe qué sustitución de aminoácidos representa una sustitución conservadora o semiconservadora. El conocimiento general además permite que el experto en la materia pueda detectar, identificar y comprobar qué deleciones y adiciones de aminoácidos son inocuas para la funcionalidad de la proteína de resistencia RZ-3 y en qué posiciones son posibles las mismas. El experto en la materia es consciente de que en el caso de la presente proteína NBS-LRR para modificaciones de la secuencia de aminoácidos (sustituciones, deleciones o adiciones de uno o varios aminoácidos) se debe conservar en particular la funcionalidad de los dominios conservados que se han definido anteriormente y que, por lo tanto, en esos dominios son posibles solo de forma limitada las anteriores modificaciones. La secuencia de nucleótidos de esta forma de realización codifica entonces un derivado o una secuencia de aminoácidos derivada cuando la secuencia de nucleótidos tiene una homología o una identidad al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 92 %, el 94 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, con la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b). Preferentemente, tales secuencias de nucleótidos que codifican un derivado o una secuencia de aminoácidos derivada se pueden generar directa o indirectamente (por ejemplo, a través de etapas de amplificación o replicación) a partir de una secuencia de nucleótidos de partida, que se corresponde a lo largo de toda la longitud o al menos en parte con la SEQ ID NO: 1 o con otra secuencia desvelada en el presente documento.
En otra forma de realización de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con e). Esta secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 92 %, 94 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, con una secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b).
En otra forma de realización de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con f). La secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que comprende al menos un dominio de unión a nucleótidos (NBS) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 168-227 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 182-241 de la SEQ ID NO: 3, al menos un dominio rico en leucina (LRR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 591-613 de la SEQ ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 605-627 de la SEQ ID NO: 3 y al menos un dominio de repetición interna (IR) correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1013-1072 de la s Eq ID NO: 2 o correspondiente a las posiciones de aminoácidos 1027-1086 de la SEQ ID NO: 3. De forma particularmente preferente, estos dominios están presentes en el polipéptido de forma secuencial del extremo N al C en el orden NBS - LRR - IR, pudiendo estar presentes entre dominios en cada caso uno o varios aminoácidos adicionales.
La presente invención se refiere también a un polipéptido que esta disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa el polipéptido y que se codifica por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, siendo el patógeno preferentemente b Ny VV y/o siendo la planta preferentemente una planta del género Beta, en particular una planta de la especie Beta vulgaris. De forma particularmente preferente, el polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. En el caso del polipéptido se puede tratar de un polipéptido aislado.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En el caso del vector se puede tratar de un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector lanzadera o un vector de clonación, puede ser bi- o monocatenario, lineal o circular o puede transformar un hospedador procariota o eucariota mediante integración en su genoma o de forma extra cromosómica. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención está enlazada operativamente en un vector de expresión con una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en una célula hospedadora procariota o eucariota. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra bajo el control de un promotor adecuado o un terminador. Los promotores adecuados pueden ser promotores que se inducen de forma constitutiva (ejemplo: promotor 35S del “Cauliflower mosaic virus” (virus del mosaico de la coliflor) (Odell et al. 1985), son particularmente adecuados aquellos promotores que se pueden inducir por patógenos (ejemplo: promotor PR1 de perejil (Rushton et al., 1996). Son promotores inducibles por patógenos particularmente adecuados los promotores sintéticos o quiméricos que no se presentan en la naturaleza, están compuestos por varios elementos e incluyen un promotor mínimo y presentan, cadena arriba del promotor mínimo, al menos un elemento regulador en cis que sirve de sitio de unión para factores de transcripción especiales. Los promotores quiméricos se conciben según las exigencias deseadas y se inducen o reprimen mediante diferentes factores. Se encuentran ejemplos de tales promotores en los documentos WO 00/29592, WO 2007/147395 y WO 2013/091612. Un terminador adecuado es, por ejemplo, el terminador nos (Depicker et al., 1982).
Adicionalmente a los vectores que se han descrito anteriormente, la presente invención facilita también un procedimiento que comprende la incorporación de un vector descrito en una célula hospedadora. El vector se puede introducir por ejemplo mediante conjugación, movilización, transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium, transfección, transducción, infiltración al vacío o electroporación. Tales procedimientos, al igual que procedimientos para la preparación de los vectores descritos, son habituales para el experto en la materia (Sambrook et al. 2001).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el vector de la presente invención. Una célula hospedadora en el sentido de la invención puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o una célula de levadura. Preferentemente, la célula hospedadora es un Agrobacterium, tal como Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o del vector de la presente invención. El experto en la materia conoce numerosos métodos, tales como conjugación o electroporación, con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el vector de la presente invención en un Agrobacterium al igual que métodos, tales como diversos procedimientos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium), con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el vector de la presente invención en una célula vegetal (Sambrook et al. 2001).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula vegetal transgénica, que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención como transgén o el vector de la presente invención. Una célula vegetal transgénica de este tipo es por ejemplo una célula vegetal que se ha transformado con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o con el vector de la presente invención, preferentemente de forma estable. En una configuración preferente de la célula vegetal transgénica, la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente con una o varias secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en la célula vegetal. La construcción total de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y la/las secuencias reguladoras representa entonces el transgén. Tales secuencias reguladoras son por ejemplo un promotor o un terminador. El experto en la materia conoce numerosos promotores y terminadores funcionales que se pueden aplicar en plantas. Preferentemente, una célula vegetal transgénica de la presente invención, en particular una célula de una planta del género Beta, con respecto a un patógeno, en particular BNYVV, presenta una mayor resistencia que una célula vegetal no transformada correspondiente (la célula vegetal sin el transgén). El nivel de la resistencia por ejemplo frente a BNYVV se puede establecer en plantas del género Beta cualitativamente mediante determinación de notas de valoración (se conocen esquemas de notas de valoración para la planta del género Beta por el estado de la técnica, por ejemplo para remolachas azucareras Mechelke (1997)). Una mayor resistencia se muestra en una mejora de la resistencia en al menos una nota de valoración, en al menos dos notas de valoración, en al menos tres o más notas de valoración. Además, la presente invención se refiere también a un procedimiento para la producción de una célula vegetal transgénica de la presente invención que comprende una etapa de la introducción de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o del vector de la presente invención en una célula vegetal. Por ejemplo, la introducción puede tener lugar mediante transformación, preferentemente mediante transformación estable. Las técnicas adecuadas para la introducción, tales como transformación biolística, transformación mediada por Agrobacterium o electroporación, son conocidas por el experto en la materia (Sambrook et al. 2001).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta transgénica o una parte de la misma, que comprende una célula vegetal transgénica que se ha descrito anteriormente. Una parte puede ser a este respecto una célula, un tejido, un órgano o una agrupación de varias células, tejidos u órganos. Una agrupación de varios órganos es por ejemplo una flor o una semilla. En una configuración particular, la invención se refiere a una semilla de la planta transgénica, comprendiendo la semilla la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención como transgén. Preferentemente, una planta transgénica de la presente invención, en particular una planta del género Beta, muestra frente a un patógeno, en particular BNYVV, una mayor resistencia que una planta no transformada correspondiente (planta sin el transgén). Se puede establecer el nivel de la resistencia por ejemplo frente a BNYVV en plantas del género Beta cualitativamente mediante la determinación de notas de valoración (se conocen esquemas de notas de valoración para la planta del género Beta por el estado de la técnica, por ejemplo para remolachas azucareras Mechelke (1997)). Una mayor resistencia se muestra en una mejora de la resistencia en al menos una nota de valoración, en al menos dos notas de valoración, en al menos tres o más notas de valoración. Además, la invención facilita un procedimiento para la producción de una planta transgénica, que comprende una etapa de la introducción de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o del vector de la presente invención en una célula vegetal y opcionalmente una etapa de la selección de una célula vegetal transgénica. Además, un procedimiento de este tipo para la producción de una planta transgénica está caracterizado por una etapa posterior, que incluye la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica generada en la primera etapa. El experto en la materia conoce métodos para la regeneración por el estado de la técnica.
En otro aspecto, la presente invención se refiere también a un procedimiento para otorgar o aumentar una resistencia frente a un patógeno, en particular BNYVV, en una planta, preferentemente una planta del género Beta, que comprende una etapa de la transformación de una célula vegetal con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el vector de la presente invención. Preferentemente, este procedimiento conduce a una mejora de la resistencia en al menos una nota de valoración, de forma particularmente preferente a una mejora de la resistencia en al menos dos, tres o más notas de valoración. Se conocen esquemas de notas de valoración para la planta del género Beta por el estado de la técnica, por ejemplo para remolachas azucareras Mechelke (1977).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia reguladora de un promotor que controla la expresión de un gen, que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, caracterizada por que la secuencia reguladora está en disposición de mediar en o modular la expresión de una secuencia de ADN heteróloga como consecuencia de una infección por patógeno y la secuencia reguladora comprende una molécula de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 de los nucleótidos 1-1403. Preferentemente, la secuencia de ADN heteróloga es una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de la defensa vegetal frente a patógenos (ejemplo: genes de resistencia (genes R) o genes que codifican enzimas que intervienen en la transferencia de señales, tales como cinasas o fosfatasas, así como proteína G) o que codifica un efecto patógeno (denominados genes de avirulencia (avr)). Además, la presente invención abarca una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia reguladora que se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la molécula de ADN recombinante está enlazada operativamente con una secuencia de ADN heteróloga.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora que está transformada con la secuencia reguladora que se ha descrito anteriormente o con la molécula de ADN recombinante mencionada, así como a una planta transgénica, tejido vegetal o célula vegetal que comprende la secuencia reguladora o la molécula de ADN recombinante como transgén. Además, la invención facilita un procedimiento para la producción de una célula vegetal transgénica, que comprende una etapa de la introducción de la secuencia reguladora de la invención o de la molécula de ADN recombinante y opcionalmente una etapa de la selección de una célula vegetal transgénica. Además, la invención facilita un procedimiento para la producción de una planta transgénica, que comprende una etapa de la introducción de la secuencia reguladora de la invención o de la molécula de ADN recombinante en una célula vegetal y opcionalmente una etapa de la selección de una célula vegetal transgénica. Además, un procedimiento de este tipo para la producción de una planta transgénica está caracterizado por una etapa posterior, que incluye la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica generada en la primera etapa.
Como ya se ha indicado anteriormente, la identificación del gen de resistencia RZ-3 tuvo lugar en el transcurso de un proceso de clonación basada en mapa. El proceso realizado comprendía por ejemplo las etapas: mapeo fino genético, mapeo físico, generación de una población de escisión muy grande de más de 8000 descendientes de escisión F2, detección de recombinantes, desarrollo de marcadores en la región diana, secuenciación BAC comparativa en los genotipos resistentes y sensibles, análisis bioinformáticos, predicciones de proteínas y comparaciones de las proteínas. Tales tediosos trabajos de desarrollo siempre son muy caros y es incierto si realmente se consigue identificar el gen. Después de la integración del locus de RZ-3 de Beta vulgaris subsp. marítima en una planta del género Beta, en concreto en la remolacha azucarera (Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima), para realizar el seguimiento del segmento genómico RZ-3 en el mapeo fino se desarrollaron marcadores con un buen valor de diagnóstico, lo que resultó particularmente difícil, ya que la región diana es repetitiva a lo largo de amplias regiones. A pesar de esto se consiguió sorprendentemente el desarrollo de algunos pocos marcadores de diagnóstico, que en parte también funcionaban solo con una determinada técnica de marcador, tal como pirosecuencias, es decir, como un marcador PSQ o eran de alelos cero.
A pesar de estas dificultades técnicas, a través de un exhaustivo análisis mediante el uso de estos marcadores se pudo conseguir la limitación del locus de RZ-3 a una región genómica de 0,67 cM. Esto se corresponde con una longitud física de aproximadamente 340.000 pb. A pesar de intensos perfeccionamientos ya solo fue posible de forma limitada reducir adicionalmente la introgresión de Beta vulgaris subsp. marítima alrededor del gen con respaldo de marcador e identificar genes candidatos para el gen RZ-3. Sin embargo, en cualquier caso es deseable un acortamiento adicional de la introgresión desde el punto de vista de la cría para eliminar el “arrastre de ligamiento” (Linkage Drag) potencialmente presente, estrechamente acoplado con el gen RZ-3. En varias etapas mediante mapeo fino y con inclusión de información de secuencia de mapas físicos se pudo estrechar finalmente hasta una región diana de ya solo aproximadamente 0,07 cM. Sin embargo, esto solo fue posible al examinarse en total 8004 plantas, entre ellas plantas recombinantes informativas BC2S1 o BC2S2 que se analizaron de forma intensa con en cada caso 90­ 180 descendientes. Esto fue necesario debido a que la intensidad de la resistencia por motivos desconocidos no siempre fue inequívoca. Estos descendientes se genotiparon por plantas individuales y en paralelo se fenotiparon. Mediante procedimientos estadísticos (prueba t, análisis de potencia) se comprobaron los fenotipos de los recombinantes informativos (homocigotos resistentes - RR; heterocigotos resistentes - Rs; homocigotos sensibles -ss) y por tanto se realizaron deducciones con respecto al genotipo de los recombinantes informativos.
En la región diana relativamente pequeña de aproximadamente 38.000 pb se pudieron anotar en el genotipo sensible diez genes. Para esta región diana, de una biblioteca BAC resistente se identificaron clones solapantes con ayuda de nuevos marcadores que describen específicamente la región diana y finalmente se secuenciaron. Debido a la repetitividad de la región diana, la secuencia del genotipo sensible mostró numerosas secciones pequeñas con un contenido de secuencia desconocido. Por este motivo, el ensamblaje de las secuencias RR y ss fue particularmente exigente. A pesar de esto se pudo identificar un supuesto gen de resistencia. Este contenía en prácticamente todos los genotipos ss un retrotransposón con una longitud de aproximadamente 8000 pb entre el dominio LRR y el dominio IR, lo que no se pudo detectar en genotipos RR. Una secuencia de aminoácidos, predicha a partir de una supuesta secuencia de gen de resistencia muestra que el gen codifica probablemente una proteína NB-ARC-LRR. Se puede suponer que esta inserción del retrotransposón destruye la función del gen en genotipos ss sensibles, ya que separa el dominio de repetición interna (IR) de los otros dos dominios (NB-ARC y LRR).
La comparación del gen NBS-LRR en genotipos ss con aquel de genotipos RR mostró además polimorfismos de diagnóstico que se pueden obtener de las Figuras 1,2 y 3. Basándose en estos polimorfismos en el gen NBS-LRR se desarrollaron marcadores y se ensayaron en un conjunto amplio de prácticamente 100 genotipos ss y RR. El patrón de marcadores, pero también la secuenciación comparativa en el gen diana han confirmado que la inserción está acoplada prácticamente siempre a la sensibilidad. Sin embargo, se encontraron pocos genotipos ss que no presentaban la inserción de retrotransposón y a pesar de ello eran sensibles. Estos genotipos ss se pudieron diferenciar sin embargo inequívocamente, mediante marcadores que describen los polimorfismos de diagnóstico de acuerdo con las Figuras 1, 2 y/o 3, de los genotipos RR.
En la población analizada se identificaron recombinantes en la región diana que muestran una recombinación entre el gen NBS-LRR y el supuesto gen anotado adyacente, situado cadena arriba, que podría codificar una proteína de repetición de anquirina. En el caso de dos plantas, las recombinaciones se pueden encontrar entre el gen NBS-LRR y el supuesto gen anotado adyacente, situado cadena arriba, que podría codificar una proteína DUF565 (proteína con función desconocida). Mediante el análisis de resistencia de la descendencia de todas estas plantas recombinantes (eliminación de un gen cadena arriba y cadena abajo del gen NBS-LRR) se pudo demostrar de forma muy inequívoca que el gen entre el gen de repetición de anquirina y el gen DUF565, en concreto el gen NBS-LRR caracterizado en este documento, es responsable de la resistencia en el genotipo RR. La Figura 4 muestra el mapa físico de la región diana RZ-3 con los marcadores desarrollados. Los datos de genotipos de ocho líneas recombinantes estrechas así como el análisis estadístico de su descendencia están representados en la Figura 5.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la identificación de una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína, que está en disposición de otorgar una resistencia frente al patógeno BNYVV en una planta del género Beta, en la que se expresa la proteína. El procedimiento comprende la detección de la ausencia de una inserción en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido nucleico. Preferentemente, el procedimiento comprende la detección de la ausencia de una inserción, en particular de un retrotransposón, en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido nucleico. El retrotransposón puede tener la longitud por ejemplo de aproximadamente 500 pb, de aproximadamente 1000 pb, de aproximadamente 2000 pb, aproximadamente 4000 pb, aproximadamente 8000 pb o más de aproximadamente 8000 pb. En una configuración particular del procedimiento, la molécula de ácido nucleico es la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención tal como se ha descrito anteriormente y codifica en gen RZ-3 que otorga resistencia o un homólogo funcional de RZ-3. Preferentemente, en el caso de la planta del género Beta se trata Beta vulgaris subsp. marítima o Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (remolacha azucarera). El experto en la materia sabe los métodos que son 5 adecuados para detectar la ausencia de la inserción. Por ejemplo, el experto en la materia, conociendo las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención desveladas en el presente documento, puede desarrollar marcadores moleculares que detecten la presencia o la ausencia de una inserción en la región que se ha descrito anteriormente en el gen NBS-LRR (procedimiento ilustrativo véase ejemplos). La presente invención incluye marcadores así como su uso para la detección de la presencia o ausencia de la inserción para la selección de plantas resistentes, 0 particularmente resistentes a BNYVV, en particular Beta vulgaris subsp. marítima o Beta vulgaris subsp. vulgaris var.
altissima (remolacha azucarera). Preferentemente, tales marcadores describen loci en los puntos de inserción del retrotransposón. Puntos de inserción quiere decir puntos de transición entre el ADN genómico y el retrotransposón en el lado 5' y/o 3' de la inserción. Los puntos de transición se tienen que definir ampliamente y los loci de marcador se pueden encontrar alejados menos de 1 0 0 0 nucleótidos, preferentemente menos de 800 o 600 nucleótidos, de forma 5 particularmente preferente menos de 400, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos cadena arriba o cadena abajo de un punto de inserción en el ADN. Como alternativa o de forma complementaria a la etapa de la detección de la presencia o ausencia de una inserción en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido nucleico, el procedimiento puede comprender también la detección de al menos un polimorfismo de acuerdo con la Figura 1,2 y/o 3, preferentemente de al menos dos o tres polimorfismos de acuerdo con la Figura 1,2 y/o 3, de forma particularmente 0 preferente de al menos cuatro o cinco o más polimorfismos de acuerdo con la Figura 1, 2 y/o 3 en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención mediante el uso de marcadores moleculares que detectan polimorfismos, en particular polimorfismos de diagnóstico. Preferentemente, esta detección tiene lugar mediante el uso de al menos un marcador molecular por polimorfismo, en particular por polimorfismo de diagnóstico. El experto en la materia sabe qué técnicas de marcador se deben aplicar para la detección de un 5 correspondiente polimorfismo y cómo se construyen marcadores moleculares para ello (bibliografía). Además, la presente invención abarca marcadores moleculares que describen o detectan un polimorfismo de acuerdo con la Figura 1, 2 y/o 3 al igual que el uso de un marcador molecular para la detección de un polimorfismo de acuerdo con la Figura 1, 2 y/o 3. Además, los procedimientos de identificación anteriores representan también procedimientos para la selección de una planta que presenta una resistencia frente a BNYVV. El procedimiento para la selección comprende 0 en una etapa final de la selección de una planta resistente.
Además, también se ha podido mostrar que el genotipo RR examinado , cadena arriba con respecto a RZ-3 (SEQ ID NO: 1), un segmento de secuencia de a Dn genómico limitante de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y, cadena abajo con respecto a RZ-3 (SEQ ID NO: 1), un segmento de secuencia de ADN genómico limitante de acuerdo con la SEQ ID 5 NO: 5, que están estrechamente acoplados al gen RZ-3 y, por tanto, son excelentemente adecuados como regiones de ADN para desarrollar marcadores de diagnóstico para RZ-3. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la selección de una planta que presenta una resistencia frente a BNYVV. El procedimiento para la selección comprende el uso de un marcador molecular en una secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y/o en una secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 y una etapa final de la selección de una planta 0 resistente. El experto en la materia sabe cómo, basándose en las informaciones de secuencia desveladas, desarrolla y emplea marcadores.
Mediante la presente invención se pueden conseguir además las siguientes ventajas para el cultivo y el desarrollo de nuevas líneas de plantas resistentes del género Beta: las informaciones de secuencias así como los polimorfismos 5 identificados, que permiten una diferenciación entre alelos RR resistentes y SS sensibles del gen desvelado, hacen posible el desarrollo del marcador directamente en el gen, lo que, en particular en vista del desarrollo de líneas de élite optimizadas sin “arrastre de ligamiento”, representa una facilitación significativa para el cultivador de plantas. Además, se puede usar el conocimiento acerca de la estructura secuencial para la identificación de otros genes de resistencia, en particular frente a rizomanía, que por ejemplo, en parte son homólogos.
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El empleo desvelado en el presente documento del alelo génico resistente en enfoques genéticos cis o trans establece la posibilidad de desarrollar nuevas variedades resistentes del género Beta, que presentan mediante el efecto de dosis una mayor resistencia o en las que, mediante el apilamiento del gen desvelado con otros genes de resistencia, evitan una rotura de la resistencia y se puede optimizar la intensidad de la resistencia. Además son concebibles 5 modificaciones del gen mediante tilling (lesiones locales inducidas de forma específica en genomas) o ingeniería genética dirigida para desarrollar nuevos alelos de resistencia.
Además, la presente invención se refiere al uso del alelo génico RZ-3 resistente identificado en una pila genética o molecular con otros elementos genéticos que pueden otorgar propiedades agronómicamente ventajosas en una 0 planta. Por ello se puede aumentar claramente el valor económico de plantas de cultivo, al aumentarse por ejemplo el rendimiento de la cosecha o al generarse nuevas superficies de cultivo para una planta que previamente, entre otras cosas debido a factores bióticos tales como intensa presión por patógenos o factores abióticos tales como sequía, no quedaban disponibles para el cultivo de esta planta. Una propiedad agronómicamente ventajosa es por ejemplo una tolerancia frente a un herbicida tal como glifosato, glufosinato o inhibidores de ALS. El experto en la materia conoce 5 por el estado de la técnica numerosos herbicidas adicionales y su aplicabilidad. Puede recurrir al estado de la técnica para obtener conocimiento acerca de los elementos genéticos que se deben usar y de qué forma para implementar una correspondiente tolerancia a las plantas. Otro ejemplo de una propiedad agronómicamente ventajosa es una resistencia a patógenos adicional, pudiendo ser los patógenos por ejemplo insectos, virus, nematodos, bacterias u hongos. Mediante la combinación de diferentes resistencias/tolerancias a patógenos se puede conseguir por ejemplo una amplia defensa frente a patógenos para una planta, ya que los elementos genéticos pueden presentar efectos 5 complementarios entre sí. Para esto, el experto en la materia conoce como elementos genéticos, por ejemplo, numerosos genes de resistencia. Otro ejemplo de una propiedad agronómicamente ventajosa es una tolerancia a frío o heladas. Las plantas que presentan esta propiedad se pueden sembrar ya antes en el año o podrían permanecer por ejemplo también durante más tiempo incluso a lo largo de periodos de heladas en el campo, lo que puede conducir por ejemplo a rendimientos aumentados. También en este caso el experto en la materia puede recurrir al estado de la 0 técnica para encontrar elementos genéticos adecuados. Otros ejemplos de propiedades agronómicamente ventajosas son la eficiencia del uso de agua, eficiencia del uso de nitrógeno así como rendimiento. En el estado de la técnica se pueden encontrar elementos genéticos que se pueden emplear para otorgar tales propiedades.
El experto en la materia conoce además numerosas modificaciones para la defensa frente a patógenos. Aparte de las 5 familias descritas con frecuencia con los genes R se podrían emplear ventajosamente el enfoque Avr/R, la complementación de gen Avr (documento WO 2013/127379), la autoactivación de un gen R (documento WO 2006/128444), el enfoque HIGS (host induced gene silencing, silenciamiento génico inducido por hospedador) (por ejemplo documento WO 2013/050024) o el enfoque VIGS (virus induced gene silencing, silenciamiento génico inducido por virus). En particular la autoactivación de un gen R podría ser de importancia para la presente invención. Para esto 0 se debe crear un ácido nucleico que codifique una proteína de resistencia autoactivada para la generación de una resistencia frente a patógenos en plantas. Entonces, este ácido nucleico presenta solo una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR como el gen RZ3, que se extiende desde el extremo 5' de la región codificante del gen de resistencia NBS-LRR cadena abajo hasta el comienzo del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR ningún gen de resistencia TIR-NBS-LRR.
5
Además, la invención incluye también el uso del alelo génico RZ3 resistente, identificado con un procedimiento que se ha descrito anteriormente, para la combinación con una modificación anterior o con un elemento genético que se ha descrito anteriormente, que puede otorgar en una planta una o varias propiedades agronómicamente ventajosas.
0 Las configuraciones y formas de realización de la presente invención se describen a modo de ejemplo en referencia a las figuras y secuencias adjuntas:
Secuencias:
5 SEQ ID NO: 1 secuencia de ADN genómico del gen de resistencia RZ-3. La secuencia comprende del nucleótido 1 a 1403 la región reguladora del promotor
SEQ ID NO: 2 secuencia proteica predicha de la proteína de resistencia RZ-3_1
0 SEQ ID NO: 3 secuencia proteica predicha de la proteína de resistencia RZ-3_2
SEQ ID NO: 4 región cromosómica limitante con RZ-3 (SEQ ID NO: 1) cadena arriba
SEQ ID NO: 5 región cromosómica limitante con RZ-3 (SEQ ID NO: 1) cadena abajo
5
SEQ ID NO: 6 secuencia consenso de la secuencia genómica del gen RZ-3 en genotipos ss
SEQ ID NO: 7 secuencia diana en el gen RZ-3 de la construcción ARNi en el vector pZFN-C48-ARNi.
0 Figuras:
Fig. 1 A-I: comparación de secuencias de nucleótidos entre la secuencia consenso de la secuencia genómica del gen RZ-3 en genotipos ss (SEQ ID NO: 6 ) y el gen RZ-3 de los genotipos RR (SEQ ID NO: 1). Los polimorfismos de diagnóstico están aplicados en gris y resaltados en negrita. Están subrayados los 5 polimorfismos que no son de diagnóstico. Los potenciales puntos de inicio de la transcripción en el gen están indicados con flechas. Conducen a dos variantes de polipéptidos RZ-3_1 y r Z-3_2. El punto del retrotransposón está indicado con un triángulo negro en la punta.
Fig. 2 A-L: comparación de secuencias de aminoácidos del polipéptido predicho de los genotipos RR (RZ-3_1; 0 SEQ ID NO: 2) y polipéptidos de 22 genotipos ss diferentes. Los polimorfismos de diagnóstico están aplicados en gris y resaltados en negrita. Están subrayados los polimorfismos que no son de diagnóstico.
Fig. 3 A-L: comparación de secuencias de aminoácidos del polipéptido predicho de los genotipos RR (RZ-3_2; SEQ ID NO: 3) y polipéptidos de 22 genotipos ss diferentes. Los polimorfismos de diagnóstico están aplicados 5 en gris y resaltados en negrita. Están subrayados los polimorfismos que no son de diagnóstico.
Fig. 4: Mapa físico de la región diana RZ-3. En la región diana representada del genotipo de referencia sensible se anotaron cinco genes (“2” (DUF565), “3” (proteína hipotética), “4” (gen candidato NBS-LRR), “5” (retrotransposón) y “6 ” (repetición de anquirina)). El gen candidato NBS-LRR (“4”) incluye en la secuencia de referencia sensible una inserción de retrotransposón (“5”). Este retrotransposón está completamente ausente 5 en la secuencia resistente, de tal manera que en el genotipo resistente ya solo se pueden anotar cuatro genes (“2 ”, “3 ”, “4 ” y “6 ”). Las posiciones de las recombinaciones más estrechas (recombinantes: 111T_3515/ Z11007_03075 con cifra “7” y 111PB3645/ZR08093_05621 con cifra “8 ”) están representadas por encima. Con su ayuda se pudo delimitar la región diana más corta “1”. Los marcadores desarrollados para ello del análisis de recombinantes están reproducidos como rayas negras en la parte inferior de la figura. Para la validación del 0 gen el enfoque de ARNi se seleccionó para el silenciamiento génico del alelo génico RZ-3 resistente un segmento génico (“9”) en parte de la región de dominio “10” como secuencia diana.
Fig. 5: análisis de marcador de los recombinantes más estrechos en la región diana RZ-3 (las letras minúsculas con región enmarcada en negrita son datos de marcador generados por ordenador). Las ocho líneas 5 recombinantes se fenotiparon y genotiparon con en total 1051 descendientes. Los descendientes se clasificaron mediante los datos de marcador en el gen candidato NBS-LRR o la región flanqueante de escisión en el caso de que el gen candidato NBS-RR fuese homocigoto RR o ss en 3 grupos (resistente homocigoto RR, heterocigoto Rs, sensible homocigoto ss). Al lado están reproducidos los correspondientes valores de ELISA. Una escisión o no escisión de los descendientes se comprobó con la prueba de T y la estadística de Wilcoxon 0 según significancia. Mediante los resultados se pudo delimitar el gen candidato de forma muy inequívoca entre los marcadores s3e5800s01 y s3e5873s01.
Fig. 6 : vector de transformación pZFN-C48-ARNi: promotor d35S; C48 s: orientación codificante de la secuencia C48; AtAAP6 intron2: intrón de aminoácido permeasa 6 de Arabidopsis thaliana; C48 as: orientación antisentido 5 de la secuencia C48; Nos-T: terminador nos; sitio flanqueante LB: sitio flanqueante del borde izquierdo; sitio ZFN: sitio de reconocimiento de nucleasa con dedos de zinc (complementario); Pnos: promotor Nos; NPT: secuencia codificante; gen de neomicina fosfotransferasa (npt); pAG7: terminador pAG7; Bvpal3'UTR: región no traducida 3' del gen de Beta vulgaris Pal; LB: borde izquierdo; aadA: secuencia codificante; aminoglicósido-3”-adenililtransferasas (AAD); pVS1-REP: origen de replicación pVS1; ColE1 ori: origen de replicación ColE1; 0 RB: borde derecho.
Ejemplos
Mapeo y mapeo fino del gen RZ-3 / mapa genético-físico La resistencia RZ-3 (denominada también resistencia C48 o 5 C48) se mapeó en varias etapas mediante mapeo y mapeo fino en el cromosoma 3 entre 57,1 y 57,8 cM (mapa de referencia interna), es decir, a una distancia genética entre dos marcadores flanqueantes de 0,0741 cM en el mapa genético. Para el mapeo se examinaron en total 8004 plantas del cruce S504 (genotipo sensible) x T74 (genotipo resistente). En paralelo al mapeo QTL de C48 se desarrollaron, después de cada etapa de mapeo, de forma específica al objetivo nuevos marcadores informativos y se emplearon para limitar la región diana de C48.
0
Las coordenadas de mapeo fino se confirmaron adicionalmente con el análisis de los descendientes de los recombinantes informativos. Para esto se analizaron de forma intensiva plantas BC2S1 o BCS2S recombinantes informativas con, en cada caso, 90-180 descendientes. Estos descendientes se genotiparon por plantas individuales y se fenotiparon en paralelo. Mediante procedimientos estadísticos (prueba de t, análisis de potencia) se comprobaron 5 los fenotipos de los recombinantes informativos (homocigoto resistente RR/heterocigoto Rs/homocigoto sensible ss) y, con ello, se realizaron deducciones con respecto al genotipo de los recombinantes informativos. Siempre que las clases de homocigotos de los descendientes (RR frente a ss) se diferencian en la resistencia, el gen se encuentra en la región heterocigota (Rs) de la planta parental; en caso contrario, en la región homocigota (RR o ss) de la planta parental.
0
Se generó un mapa físico para un genotipo sensible a rizomanía al proyectarse marcadores y sus posiciones genéticas en las secuencias de cromosomas. Con la limitación de la región QTL de C48, mediante la secuencia de referencia y secuenciaciones comparativas adicionales en genotipos resistentes (secuenciación de nueva generación y secuenciación de Sanger) se desarrollaron nuevos marcadores informativos.
5
La región identificada mediante el mapeo fino comprende una longitud de secuencia de 37996 pares de bases (posiciones de marcadores SNP flanqueantes) en la secuencia de referencia sensible. La colinealidad entre el mapa genético y el físico en la región diana no tiene contradicciones (secuencia de 1 2 marcadores en la región diana).
0 Identificación y secuenciación de clones BAC resistentes
Se ha desarrollado una genoteca BAC para un genotipo resistente RZ-3 (C48) seleccionado. Este banco BAC se muestreó con los marcadores aplicados en la región QTL de C48. Se encontraron varios clones BAC para la región diana que se ha identificado anteriormente. De los mismos se seleccionaron tres clones BAC de diferente longitud 5 para la secuenciación, que abarcaron por completo la región diana. Los clones BAC se secuenciaron y mediante las lecturas de secuencia producidas se realizó un ensamblaje “de novo”. Entre los cóntigos de secuencia resistentes producidos, la mayor secuencia tenía una longitud de 110909 pb (34537 lecturas) y comprendía por completo la región diana.
Comparación de las secuencias sensibles y resistentes - evaluación de secuencia
La colinealidad de las dos secuencias ss y RR se comparó con la aplicación de diferentes herramientas de software. Para las dos secuencias resistentes y sensibles se llevó a cabo una anotación génica con los softwares Maker y Pedant. La anotación génica en las dos secuencias mostró el mismo orden de genes supuestos. Sin embargo, sorprendentemente se pudo detectar una marcada diferencia en uno de estos genes, en concreto en el gen de la presente invención (RZ-3). En el genotipo sensible, en este gen NBS-LRR identificado se pudo anotar un retrotransposón. La inserción del retrotransposón ocurrió en el gen entre los dos dominios del dominio LRR y el dominio IR. El genotipo resistente no presenta esta inserción y se reproduce en la SEQ ID NO: 1. Además, a continuación las secuencias polipeptídicas predichas se compararon y se valoraron (representadas en parte en, véase, las Fig. 2 y 3).
Secuenciación comparativa del gen candidato NB-ARC-LRR
El gen candidato NB-ARC-LRR se secuenció de forma comparativa en dos etapas. El punto de inserción de retrotransposón se verificó en un conjunto de genotipado con en total 92 genotipos resistentes y sensibles. Este análisis mostró que la totalidad de los genotipos resistentes no tenían inserción alguna de retrotransposón. De los genotipos sensibles se pudo detectar la inserción en más del 90 % de los casos. Con ello, la detección de la inserción parece estar acoplada al genotipo sensible. A causa de las contradicciones halladas (aproximadamente el 10 % de los genotipos sensibles remanentes sin inserción), sin embargo, la secuenciación en la segunda etapa se amplió para todo el gen delante del punto de inserción con región de promotor (SEQ ID NO: 1). En total se secuenciaron y compararon 31 genotipos resistentes y sensibles seleccionados, inclusive los genotipos contradictorios. Como resultado, todos los genotipos resistentes, que se debían a siete fuentes de resistencia diferentes, tenían una identidad del 100 % para los aproximadamente 4100 pares de bases comparados. Además se hallaron polimorfismos por completo de diagnóstico en la secuencia de nucleótidos, de los cuales varios conducen a sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la proteína (véase las Figuras 1, 2 y 3). Algunas de estas sustituciones, particularmente en las regiones de dominio, podrían causar la pérdida de función de la proteína de resistencia identificada en los genotipos ss. Además se hallaron, asimismo en la región promotora, tres INDEL acoplados por completo con la resistencia (desequilibrio de ligamiento = 1) (Fig. 1). Estos INDEL se han de considerar también potenciales candidatos de la pérdida de función.
Verificación del gen mediante recombinantes estrechos
En la población analizada con 8004 plantas se identificaron 16 recombinantes en la región diana (región de mapeo fino con 37996 pares de bases). De estos 16 genotipos, 9 plantas contenían la recombinación entre la proteína NB-ARC-LRR y la proteína de repetición de anquirina adyacente en el lado derecho. En el caso de dos plantas, las recombinaciones son entre la proteína NB-ARC-LRR y la proteína DUF565 adyacente a la izquierda (proteína con función desconocida). Mediante el análisis de la descendencia de todas estas plantas recombinantes (distancia de un gen a la izquierda y a la derecha) se pudo demostrar de forma muy inequívoca que el gen se encuentra entre DUF565 y la proteína de repetición de anquirina, en concreto que solo es responsable de la resistencia la proteína NB-ARC.
Detección ilustrativa de la ausencia de la inserción de transposón
Para la detección de la inserción de retrotransposón se desarrollaron 3 combinaciones de cebador dominantes especiales. La primera y la segunda combinación de cebador están en disposición de detectar la inserción, ya que en cada caso un cebador de los dos pares de cebadores se encuentra en el retrotransposón (flanco izquierdo o derecho del retrotransposón) y el segundo cebador se une directamente delante o detrás del retrotransposón. Un tercer par de cebadores detecta la ausencia del retrotransposón al encontrar los cebadores delante y detrás del retrotransposón un sitio de unión. Un producto de PCR en condiciones convencionales solo se puede producir cuando falta el retrotransposón, de lo contrario con el retrotransposón el producto de PCR un tamaño demasiado grande y, de este modo, no se produciría ningún amplicón.
Verificación del gen mediante el enfoque de ARNi
Aparte de la verificación que se ha descrito anteriormente del gen mediante recombinantes estrechos se produjo también una detección adicional del efecto de resistencia del gen mediante ARN de interferencia. Para esto se transformó un genotipo de remolacha azucarera convencional resistente con una construcción de ADN que codifica un ARN en horquilla bicatenario. Este ARNbc estaba en disposición de causar después de la transcripción un silenciamiento génico que reduciría en su acción o inactivaría el alelo génico RZ-3 resistente, por lo que el genotipo de remolacha azucarera previamente resistente se haría sensible frente a rizomanía.
Para facilitar una construcción de ADN adecuada se seleccionó una región de secuencia diana definida del alelo génico RZ-3 resistente de 434 pares de bases de longitud (SEQ ID NO: 7; Figura 4), se amplificó mediante PCR y se clonó tanto en dirección codificante como antisentido en el vector pZFN, que es adecuado para la síntesis de estructuras en horquilla (Fig. 6 ). Este vector presenta una promotor 35S de CaMV, un sitio de clonación múltiple, un intrón del gen AtAAP6 , que codifica en Arabidopsis thaliana una aminoácido permeasa, otro sitio de clonación múltiple así como un terminador nos. La transformación de las remolachas azucareras con el vector facilitado se produjo según el protocolo de Lindsey y Gallois (1990) mediante el uso del antibiótico kanamicina como marcador de selección.
5 Después de varias etapas de selección se comprobó la transformación exitosa en el brote transgénico a través de PCR mediante la detección de la presencia del gen nptll, del intrón AAP6 y las dos secuencias de borde de ADN-t (LB/RB) y la ausencia de vir. Los brotes positivos se multiplicaron de forma clonal in vitro hasta en cada caso 30 brotes, se arraigaron y se traspasaron en el invernadero a tierra. Aproximadamente 2 semanas después se trasplantaron las plantas transgénicas de remolacha azucarera a tierra contaminada con rizomanía, en la que se cultivaron durante 8 a 0 10 semanas. Como control en las mismas condiciones se cultivaron plantas no transformadas con el mismo trasfondo de transformación convencional genético resistente. Para la detección de la manifestación de rizomanía se cosecharon las raíces de las plantas de remolacha azucarera y se cuantificó mediante el ensayo de ELISA la infestación por BNYVV, indicando un bajo valor de ELISA una resistencia y un valor alto una sensibilidad (Mechelke 1997, Clark & Adams 1977). El valor de ELISA de las remolachas azucareras transformadas con un valor medio de 3,55 era 5 significativamente mayor que el valor de ELISA del control que seguía siendo resistente con un valor medio de 1,27 y comparable al patrón sensible D108_ss (Tabla 1). Después, los resultados de los ensayos ELISA mostraron que mediante el silenciamiento génico específico del alelo RZ-3 resistente en el fondo de transformación, una planta previamente resistente se hizo sensible frente a BNYVV. Por consiguiente, el gen de la presente invención se pudo verificar inequívocamente como el gen de resistencia RZ3.
0
Tabla 1: Resultados del ensayo ELISA después análisis estadísticos (D108_ss = patrón sensible; 6921_RR = trasfondo de transformación resistente; 6921_ARNi = trasfondo de transformación resistente con ARNbc dirigido contra el gen RZ3).
Figure imgf000013_0001
5
Referencias
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0 ed. 2 0 0 1 .

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Molécula de ácido nucleico, que codifica un polipéptido, que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa el polipéptido, caracterizada por que la molécula de ácido nucleico 5 comprende una secuencia de nucleótidos que está seleccionada de
    a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3,
    b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante de la secuencia de ADN de acuerdo con 0 la SEQ ID NO: 1,
    c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que se deriva por sustitución, deleción y/o adición de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b), de un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b),
    d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene 5 una identidad de al menos el 8 0 % con una secuencia de aminoácidos que se codifica por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con a) o b) o
    e) una secuencia de nucleótidos que codifica al menos las posiciones de aminoácidos 168-227 de la SEQ ID NO: 2 y al menos las posiciones de aminoácidos 591-613 de la SEQ ID NO: 2 y al menos las posiciones de aminoácidos 1013-1072 de la SEQ ID NO: 2 o que codifica al menos las posiciones de aminoácidos 182-241 de la SEQ ID 0 NO: 3, al menos las posiciones de aminoácidos 605-627 de la SEQ ID NO: 3 y al menos las posiciones de aminoácidos 1027-1086 de la SEQ ID NO: 3.
    2. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
    5 3. Célula procariota o célula de levadura que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o el vector de acuerdo con la reivindicación 2 .
    4. Polipéptido que está en disposición de otorgar una resistencia frente a un patógeno en una planta en la que se expresa el polipéptido y que es codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1. 0
    5. Célula vegetal transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 como transgén o el vector de acuerdo con la reivindicación 2 .
    6 . Planta transgénica o una parte de la misma que comprende una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 5.
    5
    7. Semilla de la planta de acuerdo con la reivindicación 6 , comprendiendo la semilla la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 como transgén.
    8 . Procedimiento para la producción de una célula vegetal transgénica, caracterizado por que el procedimiento 0 comprende una etapa de la introducción de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o del vector de acuerdo con la reivindicación 2 en la célula vegetal.
    9. Procedimiento para la producción de una planta transgénica, caracterizado por que el procedimiento comprende las siguientes etapas
    5
    a) introducción de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o del vector de acuerdo con la reivindicación 2 en una célula vegetal y
    b) regeneración de la planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica de la etapa a).
    0 10. Procedimiento para la identificación de una molécula de ácido nucleico, que codifica una proteína, que está en disposición de otorgar una resistencia frente al patógeno BNYVV en una planta del género Beta en la que se expresa la proteína, caracterizado por que el procedimiento comprende la siguiente etapa
    i. detección de la ausencia de una inserción en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido 5 nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o
    ii. detección de al menos un polimorfismo de acuerdo con la Figura 1, 2 y/o 3 en la secuencia de nucleótidos codificante de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 mediante el uso de marcadores moleculares que detectan el polimorfismo.
    0 11. Planta o una parte de la misma, que comprende una célula vegetal que presenta la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, perteneciendo la planta o una parte de la misma al género Beta y a la subespecie Beta vulgaris ssp. vulgaris y no habiéndose obtenido la planta en exclusiva por un procedimiento en esencia biológico.
    12. Marcador molecular para la selección de plantas resistentes a BNYVV que detecta un polimorfismo de acuerdo 5 con la Figura 1,2 o 3.
    13. Uso de un marcador molecular de acuerdo con la reivindicación 12 para la selección de plantas resistentes a BNYVV que comprende
    i) la detección de un polimorfismo de acuerdo con la Figura 1, 2 o 3
    o
    ii) que comprende la comprobación de la presencia o ausencia de una inserción en la secuencia de nucleótidos codificante de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
    14. Uso de un marcador molecular estrechamente acoplado con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en una secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 o en una secuencia de ADN de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 en un procedimiento para la selección de una planta que presenta una resistencia frente a BNYVV.
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