ES2658150T3

ES2658150T3 - Plantas resistentes a enfermedades

Info

Publication number: ES2658150T3
Application number: ES12155889.4T
Authority: ES
Inventors: Mireille Maria Augusta Van Damme; Augustinus Franciscus J.M. Van Den Ackerveken
Original assignee: Enza Zaden Beheer BV
Current assignee: Enza Zaden Beheer BV
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2018-03-08
Anticipated expiration: 2028-01-30
Also published as: ES2562187T5; ES2562187T3; US20160326544A1; ES2650169T3; ES2651329T3; ES2560677T5; ES2412257T3; CA2675464A1; PL2455477T5; JP5300742B2; US20100115658A1; US20160326543A1; US20180320191A1; PT2455477E; US20140289897A1; CN101617049B; HK1137480A1; JP2010517518A; PL2455477T3; US8742207B2

Abstract

Una planta de melón que es resistente a Pseudoperonospora cubensis, que se caracteriza porque la planta tiene un nivel reducido o presenta una ausencia completa de la proteína de DMR6, comparada con una planta que no es resistente al patógeno, en la que dicha planta presenta una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una expresión reducida de DMR6, comparado con el gen DMR6 de tipo salvaje en el que no está presente dicha mutación.

Description

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IND_MOP9 en el gen At5G24210; IND_K16H17 en el gen At5G24420; IND_T4C12 en el gen At5G24820; IND_T11H3 entre los genes At5G24950_60 e IND_F21J6 en el gen At5G25270 para el cartografiado (tabla 2). Se inició una búsqueda adicional de nuevos recombinantes en 300 plantas F2 que produjo ocho plantas recombinantes F2 entre los dos marcadores basados en IND IND_MOP9 e IND_T4C12, que flanquean una región de 61 genes. Siete marcadores adicionales (M450-M590; tabla 2) reducen la región a dieciocho genes candidatos para el locus de dmr6, entre At5g24420 y At5g24590. El análisis de la secuencia de At5g24530 indica una mutación puntual que conduce a un codón de fin en el exón 2 en el mutante dmr6-1.

Identificación de una línea de inserción de ADN-T en dmr6

Se identificó un segundo alelo de dmr6, 445D09, una línea de inserción de ADN-T FLAG generada por INRA Versailles en el trasfondo genético del número de registro Ws-4. La inserción del ADN-T se confirmó mediante PCR empleando un cebador diseñado en el gen At5g24530, cebador LP (5'-caggtttatggcatatctcacgtc-3'), en combinación con el cebador del límite derecho del ADN-T, Marcador3' (5'-tgataccagacgttgcccgcataa-3') o RB4 (5'tcacgggttggggtttctacaggac-3'). La inserción exacta del ADN-T en el segundo intrón de At5g24530 se confirmó mediante la secuenciación de amplicones generados con los cebadores de ADN-T del límite izquierdo y derecho en combinación con los cebadores específicos de genes LP o RP (5'-atgtccaagtccaatagccacaag-3').

Síntesis de ADNc

Se aisló el ARN (a partir de aproximadamente 100 mg de tejido foliar procedente de plántulas de 10 días de edad) con el kit RNaesy (Qiagen, Venlo, Países Bajos) y se trató con el kit RNase-free DNase (Qiagen). Se cuantificó el ARN total empleando un espectrofotómetro UVmini-1240 (Shimadzu, Kyoto, Japón). El ADNc se sintetizó con transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y oligo(dT)15 (Promega, Madison, WI, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante.

Complementación del mutante dmr6-1

Se generaron líneas de complementación transformando plantas dmr6 mediante el método de inmersión floral con Agrobacterium tumefaciens (Clough y Bent, 1998) que contenía el gen At5g24530 de Col-0 por detrás del promotor de 35S. La construcción se generó mediante amplificación con PCR de At5g24530 de longitud completa a partir del ADNc de Col-0 con cebadores que incluyen los sitios de restricción que se emplearon para la clonación direccional. Se generó un cebador directo (5'-ttctgggtccaATGGCGGCAAAGCTGATATC-3') que contenía un sitio de restricción BamHl cerca del codón de inicio (ATG), amplificado en el extremo 5' de DMR6 y, en el extremo 3' después del codón de fin, se generó un sitio EcoRI con un cebador inverso (5'-gatatatgaattcttagttgtttagaaaattctcgaggc-3'). El 35S-DMR6-Tn se clonó en pGreenII0229 (Hellens, R.P., Edwards, E.A., Leyland, N.R., Bean, S., y Mullineaux, P.M. (2000), pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation, Plant Mol. Biol., 42, 819-832). Se aislaron plántulas resistentes a DL-fosfinotricina 300 µM (BASTA) y se analizaron para la susceptibilidad a H. parasitica y para los niveles de expresión de DMR6 mediante RT-PCR.

Líneas inactivadas de DMR6 con ARNi

Se generaron líneas de ARNi sobre el trasfondo genético de Ler eds1-2 y Col-0. Se generó un amplicón de ADNc de 782 pb de longitud del gen At5g24530 de Col-0. La PCR se realizó con la ADN polimerasa Phusion (2 U/µl) y dos combinaciones diferentes de cebadores. El amplicón de la primera combinación de cebadores específica del gen DMR6 (RNAiDMR6F: 5'-aaaagcaggctGACCGTCCACGTCTCTCTGAA-3' y RNAiDMR6R: 5'-AGAAAGCTGGGTGAAACGATGCGACCGATAGTC-3') se empleó como molde para la segunda amplificación de PCR con cebadores generales que permiten la recombinación en el vector pDONR7 del sistema de clonación GateWay. Para la segunda PCR se emplearon 10 µl de la primera PCR (desnaturalización durante 30 sg a 98 °C, seguida de 10 ciclos de: 10 sg a 98 °C; 30 sg a 58 °C; 30 sg a 72 °C) en un volumen total de 20 µl como molde. La segunda PCR (desnaturalización durante 30 sg a 98 °C, seguida de 5 ciclos de: 10 sg a 98 °C; 30 sg a 45 °C; 30 sg a 72 °C y 20 ciclos de 10 sg a 98 °C; 30 sg a 55 °C; 30 sg a 72 °C, finalizando con una extensión final de 10 min a 72 °C) con attB1 (5'-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') y attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3') se realizó en un volumen de reacción de 50 µl. El producto de la PCR se purificó en gel, y 50 ηg del inserto se recombinaron con 150 ηg del vector pDONR7 con la enzima clonasa BP. El vector se transformó en células de E. coli DH5α electrocompetentes, y los plásmidos que contenían el inserto correcto se aislaron y se emplearon 100 ηg de pDONR7 con el amplicón de DMR6 en la reacción de LR para recombinar el inserto en dos direcciones opuestas en 150 ηg del vector pHellsgate8. Después de la transformación en E. coli se seleccionaron los clones resistentes a espectomicina, y los plásmidos aislados se verificaron mediante una digestión con Notl para el tamaño correcto del inserto y mediante una PCR de colonia con un único cebador interno para At5G24530 (DfragmentoF: 5'gagaagtgggatttaaaatagaggaa-3'). Si los insertos habían sido insertados dos veces en direcciones opuestas puede detectarse un amplicón de 1420 pb. Los plásmidos pHellsgate8 correctos con el inserto doble en direcciones opuestas se transformaron en la cepa electrocompetente de Agrobacterium C58C1. Los plásmidos se aislaron de Agrobacterium y se volvieron a transformar en E. coli para confirmar el tamaño correcto del plásmido y del inserto mediante digestión con Notl. Las cepas de Agrobacterium reconfirmadas se emplearon para la transformación mediante inmersión floral de plantas Col-0 y Ler eds1-2. Las semillas desarrolladas se seleccionaron para la resistencia a kanamicina en placas ½x GM, las plántulas T1 se trasladaron, y la siguiente generación de semillas T2

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se analizó para la expresión de DMR6 y la susceptibilidad a H. parasitica.

Perfil de expresión génica del mutante dmr6

El ARN total se aisló como se describió anteriormente. El ARNm se amplificó con el kit MessageAmp aRNA (Ambion). Se hibridaron portaobjetos de la matriz CATMA (Crowe et al., 2003) que contenían aproximadamente

25.000 marcadores específicos de gen según las condiciones estandarizadas descritas por de Jong et al. (de Jong, M., van Breukelen, B., Wittink, F.R., Menke, F.L., Weisbeek, P.J., y Van den Ackerveken, G. (2006), Membraneassociated transcripts in Arabidopsis; their isolation and characterization by DNA microarray analysis and bioinformatics, Plant J., 46, 708-721). Para la PCR cuantitativa se generaron moldes de ADNc como se describió previamente. Se determinaron los umbrales de ciclo por transcrito por triplicado empleando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) empleando SYBR Green I (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) como tinte indicador. Los conjuntos de cebadores para los transcritos fueron DMR6 (QDMR6F: 5'-TGTCATCAACATAGGTGACCAG-3' y QDMR6R: 5'-CGATAGTCACGGATTTTCTGTG-3'), At1g14880 (QAt1g14880F: 5'-CTCAAGGAGAATGGTCCACA-3' y QAt1g14880R: 5'-CGACTTGGCCAAATGTGATA3'), At4g14365 (QAt4g14365F: 5'-TGGTTTTCTGAGGCATGTAAA-3' y QAt4g14365R: 5'-AGTGCAGGAACATTGGTTGT-3'), ACD6 (QACD6F: 5'-TGGACAGTTCTGGAGCAGAT-3' y QACD6R: 5'-CAACTCCTCCGCTGTGAG-3'), PR-5 (QPR-5F: 5'-GGCAAATATCTCCAGTATTCACA-3' y QPR-5R: 5'-GGTAGGGCAATTGTTCCTTAGA-3'), PR-2 (QPR-2F: 5'-AAGGAGCTTAGCCTCACCAC-3' y QPR-2R: 5'-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3'), PR-1 (QPR-1F: 5'-GAACACGTGCAATGGAGTTT-3' y QPR-1R: 5'-GGTTCCACCATTGTTACACCT-3') y ACT-2 (QACT2F: 5'-AATCACAGCACTTGCACCA-3' y QACT2R: 5'-GAGGGAAGCAAGAATGGAAC-3') que generaron fragmentos de 100 pares de bases.

Resultados

Caracterización del gen responsable de la resistencia a patógenos en el mutante dmr6

Van Damme et al., 2005, supra, describen un mutante dmr6 que es resistente a H. parasitica. El nivel de resistencia puede estudiarse contando el número de esporangióforos por plántula siete días después de la inoculación con H. parasitica (aislado Waco9 o Cala2, que pueden obtenerse de Dr. G. Van den Ackerveken, Plant-Microbe Interactions Group, University of Utrecht, Utrecht, Países Bajos). La línea parental, Ler eds1-2 (Parker et al., 1996, Plant Cell, 8:2033-2046), que es muy susceptible, se emplea como control positivo (y se considera 100%).

La reducción en la formación de esporangióforos en los mutantes dmr6 infectados comparados con las plántulas de las líneas parentales se muestra en la figura 6a, en la que se muestran los resultados de la cuantificación de Hyaloperonospora parasitica, la esporulación de Waco9 (esporangióforos/plántula) en el mutante dmr6-1 resistente al mildiu, retrocruzado dos veces con la línea parental Ler eds1-2, y en el mutante dmr6-2 (línea de ADN-T FLAG445009), comparado con las líneas control.

Según la invención, el gen responsable de la resistencia a H. parasitica en los mutantes dmr6 de van Damme et al., 2005, supra, ha sido clonado mediante una combinación de cartografiado y secuenciación de los genes candidatos. Previamente, la mutación dmr6 recesiva se cartografió cerca del marcador nga139 en el cromosoma 5 en una región que incluye 74 genes. Un cartografiado preciso conecta el locus de dmr6 con un intervalo de cartografiado que contiene los BAC T13K7 y K18P6 entre los marcadores At5g24420 y At5g24590 localizados en los correspondientes genes. Esto permite que el intervalo de dmr6 esté confinado dentro de una región de 18 genes candidatos. El análisis comparativo de secuencias de los 18 genes en dmr6 y la línea parental Ler eds1-2 reveló una mutación puntual en el segundo axón del gen At5g24530. Este único cambio de base de G a A, típico para una mutación EMS, cambia un TGG (un codón trp) a un TGA (codón de fin prematuro) en la posición de nucleótido 691 de la secuencia codificadora (figura 7). El codón de fin temprano trunca la enzima oxidorreductasa predicha de 342 aa en la posición 141 antes del dominio catalítico conservado, lo cual sugiere que dmr6 es un alelo nulo. Se predice que la secuencia codificadora de At5g24530 (figura 2) codifica una proteína con una masa de 39,4 kDa. Hasta la fecha no se ha descrito ningún papel biológico para At5g24530.

At5g24530 es DMR6

Se identificó un segundo alelo, dmr6-2, en la línea de inserción de ADN-T (FLAG_445D09) a partir de la colección de mutantes de INRA, Versailles. La presencia y la localización del inserto de ADN-T en el segundo intrón de At5g24530 (figura 7) fue confirmada mediante PCR y el análisis de la secuencia (los datos no se muestran). La progenie de la línea Flag_445D09 homocigótica para la inserción de ADN-T fue resistente a H. parasitica, aislado Waco9, mientras que la línea parental (Ws-4) resultó susceptible (figura 6a). El transcrito de At5g24530 puede amplificarse mediante RT-PCR utilizando los cebadores en el exón 2 y 3 en Ws-4, pero no en la línea dmr6-2 homocigótica (los datos no se muestran), lo cual indica que dmr6-2 puede considerarse un segundo alelo nulo.

Para corroborar la idea de que At5g24530 es necesario para la susceptibilidad a H. parasitica, el mutante dmr6-1 se transformó con el ADNc de At5g24530 clonado bajo el control del promotor de 35S. En cinco plántulas T2 dmr6-1 independientes, la fuerte sobreexpresión de At5g24530 fue confirmada mediante RT-PCR (los datos no se muestran). Todas las líneas T3, homocigóticas para el transgén, mostraron restablecimiento de la susceptibilidad a

H. parasitica, aislado Cala2 (figura 6b), lo cual confirma que At5g24530 es DMR6. La complementación, junto con la

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identificación de dos mutantes dmr6 independientes claramente indica que es necesario un gen DMR6 funcional para la susceptibilidad a H. parasitica.

DMR6 se activa transcripcionalmente durante una infección por H. parasitica

Para estudiar la expresión de DMR6 durante una infección por H. parasitica se midieron los niveles relativos de transcritos mediante PCR cuantitativa en seis momentos diferentes desde el día 0 (2 horas) después de la inoculación en el día 5 después de la inoculación ("days post inoculation", dpi) (figura 8). Se aisló el ARN de plántulas Ler de diez días de edad que había sido inoculados con pulverización de agua (simulación), y aislado compatible o incompatible de H. parasitica. A las 2 horas después de la inoculación (0 dpi), los niveles de transcritos de DMR6 fueron iguales en los diferentes tratamientos. Comenzando desde 1 dpi, el nivel de transcritos de DMR6 aumentó significativamente en la interacción compatible e incompatible comparado con las plántulas tratadas de modo simulado. El nivel de transcritos de DMR6 fue ligera pero significativamente mayor a 1 dpi en la interacción incompatible (ΔCT de 3,5, inducción en aproximadamente 11 veces) que en la interacción compatible (ΔCT de 3,0, inducción de aproximadamente 8 veces). El nivel de expresión aumenta aún más a lo largo del tiempo para alcanzar un nivel alto estable a 4-5 dpi. En estos momentos, el nivel de transcritos de DMR6 fue mayor en la interacción compatible que en la interacción incompatible. Los elevados niveles de transcritos de DMR6 durante las interacciones compatibles e incompatibles de H. parasitica sugieren un papel de DMR6 en la defensa de la planta. La expresión asociada a la defensa de DMR6 puede confirmarse en los tres mutantes de los inventores potenciados para la defensa, dmr3, dmr4, y dmr5 (Van den Ackerveken et al., no publicado). Además, el análisis informático de los niveles de DMR6 con Genevestigator Mutant Surveyor (Zimmermann, P., Hennig, L., y Gruissem, W. (2005), Gene-expression analysis and network discovery using Genevestigator, Trends Plant Sci., 10,407-409) demostró que el gen está fuertemente inducido en los mutantes resistentes a patógenos mpk4 y cpr5. En el mutante doble cpr5/npr1, el nivel de transcritos de DMR6 permanece alto, lo cual indica que la inducción de la expresión de DMR6 es fundamentalmente independiente de NPR1. El ácido salicílico parece ser una importante señal en la inducción de la expresión de DMR6 durante la senescencia, puesto que las plantas transgénicas nahG (que expresan el gen de salicilato hidroxilasa bacteriano) muestran solo niveles bajos de transcrito de DMR6.

Para investigar con más detalle el modo en que la expresión de DMR6 es activada durante un estrés biótico y abiótico se generaron líneas indicadoras de DMR6. Se estudió la localización de la expresión de DMR6 en plantas transgénicas Col-0 y Ler eds1-2 que contenían el promotor de DMR6 unido al gen indicador uidA (β-glucuronidasa, GUS) (pDMR6::GUS). Para visualizar el crecimiento de las hifas de H. parasitica mediante tinción con azul de tripano, así como la actividad GUS, se empleó magenta-Xgluc como sustrato de la β-glucuronidasa, que produce un precipitado de color magenta. En plantas no infectadas no puede detectarse expresión de GUS en los diferentes orgánulos de la planta: raíces, meristemo, flores, polen y semillas. La expresión de DMR6 resultó inducida en las interacciones compatibles de Ler eds1-2 infectada con Cala2 (figura 9a) y Col-0 infectada con el aislado Waco9 (figura 9b). La expresión de GUS también resultó inducida en la interacción incompatible de Ler eds1-2 inoculada con el aislado Emoy2 (figura 9c). Tal como se muestra en las figuras 9a y 9b, la expresión de DMR6 está confinada a las células en las que H. parasitica ha formado haustorios. Las células de la planta que contienen los haustorios formados más recientemente no muestran niveles detectables de actividad GUS (figura 9a, indicado por asteriscos). Durante la interacción incompatible (figura 9c), la actividad del promotor de DMR6 solo puede detectarse en las células que estaban en contacto con las hifas invasoras iniciales. En las células muertas, que resultan de la respuesta de hipersensibilidad (HR, visualizadas mediante tinción con azul de tripano indicadas en la figura 9c por un asterisco) no se pudo detectar actividad GUS, probablemente debido a la degradación de las proteínas en estas células. Para ensayar si la expresión de DMR6 en células que contienen haustorios está provocada por una respuesta de tipo herida, se hirieron plántulas mediante una incisión con tijeras y se tiñeron para determinar la actividad GUS tres días después. No se observó expresión del promotor de DMR6 de GUS, lo cual indica que la expresión de DMR6 no es inducida por las heridas (figura 9d). Además, la inducción local de la expresión de DMR6 se ensayó en respuesta al tratamiento con benzotiadiazol (BTH), un análogo funcional del ácido salicílico (SA). A los 3 días después del tratamiento con BTH, la actividad GUS se localizaba principalmente en las hojas recién formadas, pero no en las hojas maduras (figura 9e). El análisis de las líneas pDMR6::GUS confirma los datos de expresión descritos anteriormente y enfatiza la inducción estrictamente localizada de DMR6 en respuesta a una infección por H. parasitica.

El mutante dmr6-1 expresa constitutivamente transcritos asociados con la defensa

Para aclarar el modo en que la carencia de DMR6 da como resultado una resistencia a H. parasitica, se analizó el transcriptoma del mutante dmr6-1 comparado con la línea parental Ler eds1-2. Se hibridaron sondas derivadas del ARNm de las partes epigeas de plántulas de 14 días de edad de dmr6-1 y Ler eds1-2 con micromatrices del genoma completo de CATMA. Se descubrió que un total de 58 genes eran significativamente expresados diferencialmente en dmr6-1, de los cuales 51 genes tienen unos niveles elevados de transcritos y 7 genes tienen unos niveles reducidos de transcritos. Se ha identificado un conjunto pronunciado de 51 transcritos inducidos como genes asociados con respuestas activadas de defensa de la planta, por ejemplo, ACD6, PR-5, PR-4/HEL y PAD4. Estos datos indican que la falta de DMR6 da como resultado la activación de un conjunto específico de transcritos asociados a la defensa. El descubrimiento de que DMR6 está entre los genes inducidos por dmr6-1 corrobora la idea de que DMR6 está asociado a la defensa. Para determinar si la expresión inducida de los genes asociados a la defensa es debida a la falta de DMR6 y no a mutaciones de etanmetilsulfonato (EMS) adicionales que permanecen en el mutante

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1.: Se aísla el ARNm empleando métodos convencionales.

2.: Se sintetiza el ADNc empleando un cebador dT oligonucleotídico y métodos convencionales.

3.: Empleando oligonucleótidos directos e inversos degenerados se realiza una reacción de PCR.

4.: Se separan los fragmentos de la PCR mediante una electroforesis en gel de agarosa convencional y se aíslan del gel los fragmentos con el tamaño esperado.

5.: Los fragmentos de la PCR aislados se clonan en un vector plasmídico empleando métodos convencionales.

6.: Los plásmidos con los tamaños de inserto correctos, según se determina mediante PCR, se analizan mediante secuenciación de ADN.

7.: El análisis de la secuencia empleando blastX revela los fragmentos que contienen las secuencias de DMR6 internas correctas.

8.: La secuencia de ADN interna después puede emplearse para diseñar cebadores específicos de gen y de especie para 5' y 3' RACE para obtener la secuencia codificadora completa de DMR6 mediante RLM-RACE (tal como se describió anteriormente).

Como ejemplo, se proporciona la secuenciación del ADNc de DMR6 de Cucumis sativus (pepino). Para el pepino, varias combinaciones de cebadores seleccionados entre los siguientes cebadores tuvieron éxito en la amplificación de un tramo de la secuencia codificadora interna del ADNc: cebadores directos dmr6_deg_fw1B (TTCCAGGTDATTAAYCAYGG), dmr6_deg_fw2B CATAAYTGGAGRGAYTAYCT), dmr6_deg_fw3B (GARCAAGGRCARCAYATGGC) y dmr6_deg_fw4 (AATCCTCCTTCHTTCAAGGA), y cebadores inversos dmr6_deg_rv3B (AGTGCATTKGGGTCHGTRTG), dmr6_deg_rv4 (AATGTTRATGACAAARGCAT) y dmr6_deg_rv5 (GCCATRTGYTGYCCTTGYTC). Después de la clonación y la secuenciación de los fragmentos amplificados se diseñaron cebadores específicos de DMR6 de pepino para 5' RACE (Cuc_dmr6_rv1: TCCGGACATTGAAACTTGTG y Cuc_dmr6_rv2: TCAAAGAACTGCTTGCCAAC) y 3' RACE (Cuc_dmr6_fw1: CGCACTCACCATTCTCCTTC y Cuc_dmr6_fw2: GGCCTCCAAGTCCTCAAAG). Por último, la secuencia de ADNc de DMR6 de pepino completa se amplificó y se secuenció (figura 5). Se empleó una estrategia similar para la espinaca, Spinacia oleracea (figura 4), Solanum lycopersicum (figura 12) y Nicotiana benthamiana (figura 13).

Los ortólogos identificados según se describe en este ejemplo pueden modificarse empleando técnicas muy conocidas para inducir mutaciones que reducen la expresión o la actividad de DMR6 para obtener plantas no genéticamente modificadas resistentes a Fungi u Oomycota. Como alternativa, la información genética de los ortólogos puede emplearse para diseñar vehículos para el silenciamiento de genes y para transformar las correspondientes plantas de cultivo para obtener plantas que son resistentes a Oomycota.

Ejemplo 3: Mutación de semillas

Se tratan semillas de la especie vegetal de interés con un mutágeno para introducir mutaciones puntuales aleatorias en el genoma. Las plantas mutadas se cultivan para producir semillas y la siguiente generación se selecciona para la ausencia de reducción de actividad o de los niveles de transcritos de DMR6. Esto se logra controlando el nivel de la expresión del gen DMR6 o mediante la búsqueda de cambios en nucleótidos (mutaciones) mediante el método TILLING, mediante secuenciación de ADN o mediante cualquier otro método para identificar cambios en nucleótidos. Las plantas seleccionadas son homocigóticas o se hacen homocigóticas por autopolinización o intercruzamiento. Las plantas homocigóticas seleccionadas con actividad del transcrito de DMR6 reducida o ausente se ensayan para la mayor resistencia al patógeno de interés para confirmar el aumento en la resistencia a la enfermedad.

Ejemplo 4: Transferencia de un alelo mutado al trasfondo genético de un cultivo deseado

La introgresión de un alelo mutante deseado en un cultivo se logra mediante el cruzamiento y la selección genotípica del alelo mutante. Este es un procedimiento convencional en la reproducción asistida por marcadores actual de los cultivos.

Ejemplo 5: Uso del promotor de DMR6 para la expresión de genes inducida por patógenos y la generación deplantas resistentes a enfermedades

El control preciso de la expresión de transgenes es crucial para la modificación de plantas con mayor resistencia a enfermedades. En el pasado, la sobreexpresión constitutiva de transgenes con frecuencia ha producido plantas de baja calidad. Por tanto, se ha sugerido utilizar promotores inducibles por patógenos, con los cuales los transgenes se expresan solo cuándo y dónde son necesarios: en los sitios de la infección.

La expresión local e inducible de genes modificados, por ejemplo, genes de activación maestra, genes evocadores o Avr, genes antimicrobianos o genes tóxicos, produce la activación de la defensa o la muerte celular que conducen a la resistencia al patógeno, tal como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology, 23:275-282, 2005). Un buen ejemplo es proporcionado por De wit (Annu. Rev. Phytopathol., 30:391-418, 1992) que propone el uso de la

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combinación de Avr9-Cf9 para lograr la muerte celular inducida que conduce a la resistencia a la enfermedad. La especificidad de tejido y la inducibilidad de la expresión tienen una enorme importancia en estas estrategias, tal como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology, 23:283-290, 2005).

Según la presente invención, se ha demostrado que el promotor de DMR6 muestra una expresión fuerte, inducible y localizada basándose en el análisis de promotor-GUS. Por tanto, el promotor de DMR6 resulta muy adecuado para modificar la resistencia a enfermedades en plantas transgénicas. El promotor de DMR6 consiste en una región de 2,5 kb que se encuentra cadena arriba de la secuencia codificadora de DMR6 de Arabidopsis (codón de inicio ATG) e incluye la 5'UTR (según se muestra en la figura 11). Este promotor inducible por patógeno después se emplea para modificar construcciones de transgenes adecuadas empleando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

Con el uso de secuencias de ADN ortólogo procedente de especies vegetal concretas, se diseñan cebadores para la PCR. Estos entonces se emplean para la selección de bancos genómicos de la especie vegetal de interés para identificar los clones genómicas que contienen el ortólogo de DMR6 con sus secuencias de promotor y reguladoras. Como alternativa, los clones genómicos se aíslan mediante la selección de un banco con un fragmento de PCR marcado que se corresponde con el gen de DMR6 ortólogo. La secuenciación revela la secuencia de nucleótidos del promotor. La región de 2-5 kb cadena arriba de la secuencia codificadora del DMR6 ortólogo (codón de inicio ATG), que incluye la 5'UTR, después se amplifica mediante PCR para modificar las construcciones de transgenes para la transformación de plantas.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la complementación del mutante dmr6-1 en Arabidopsis thaliana por los ortólogos de DMR6 procedentes de 4 especies de cultivo diferentes. Para ello, se clonan ortólogos de DMR6 de Cucumis sativa (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl) en un vector de expresión en plantas bajo el control del promotor 35S y, después, este vector se transforma en un mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana.

Brevemente, se aísla el ARNm empleando métodos convencionales y se sintetiza el ADNc empleando un cebador dT oligonucleotídico y métodos convencionales. Después se generan fragmentos de PCR empleando parejas de cebadores para cada cultivo, según se indica en la siguiente tabla 3. Los productos de la PCR generados se clonan en un vector pENTR/D-TOPO empleando el kit de clonación pENTR/D-TOPO de Invitrogen, y los plásmidos resultantes con los tamaños de inserto correctos, según se determina mediante PCR, se analizan mediante secuenciación de ADN. La recombinación con el vector pB7WG2,0 se realiza empleando LR clonasa II de Invitrogen, y los plásmidos resultantes se analizan mediante PCR y digestión con enzimas de restricción. Los plásmidos adecuados se transforman en Agrobacterium tumefaciens C58C1 PGV2260, y los plásmidos de Agrobacterium se analizan mediante PCR y digestión con enzimas de restricción.

Las plantas de Arabidopsis thaliana dmr6-1 se transforman con las anteriores construcciones sumergiéndolas en una disolución de Agrobacterium y se verifica la sobreexpresión de los cultivos DMR6 en plantas T1 de Arabidopsis mediante RT-PCR utilizando los cultivos con los cebadores de clonación de DMR6 (tabla 3). Por último, plantas T2 y T3 de Arabidopsis fueron infectadas con Hyaloperonospora parasitica Cala2 para confirmar la complementación. Los resultados se muestran en la figura 14.

Tal como se muestra en la figura 14, todos los ortólogos de DMR6 ensayados fueron capaces de complementar el mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana, lo cual indica que los ortólogos de DMR6 identificados codifican proteínas de DMR6 con una funcionalidad similar al DMR6 de Arabidopsis thaliana.

Tablas

La tabla 1 lista los números GI (identificador de Genlnfo) y el número de registro de Genbank para los marcadores de secuencia expresados ("Expressed Sequence Tags", EST) y las secuencias de ARNm o de proteína del ARNm de DMR6 de Arabidopsis y secuencias ortólogas de otras especies vegetales. Un número GI (identificador de Genlnfo, a veces escrito en minúsculas, "gi") es un número entero exclusivo que identifica una secuencia concreta. El número GI consiste en una serie de dígitos que se asignan consecutivamente a cada registro de secuencia procesada por NCBI. Por tanto, el número GI cambia cada vez que cambia la secuencia. El NCBI asigna números GI a todas las secuencias procesadas en Entrez, incluyendo las secuencias de nucleótidos de DDBJ/EMBL/GenBank, las secuencias de proteínas de SWISS-PROT, PIR y muchos otros. Por tanto, el número GI proporciona un identificador de secuencia exclusivo que es independiente de la base de datos original, que especifica una secuencia exacta. Si una secuencia en GenBank se modifica, incluso en un único par de bases, se asigna un nuevo número GI a la secuencia actualizada. El número de registro sigue siendo el mismo. El número GI siempre es estable y recuperable. Por tanto, la referencia a números GI en la tabla proporciona una identificación clara e inequívoca de la correspondiente secuencia.

Tabla 1

Especies: Nombre común Detalle Número GI Genbank

Arabidopsis thaliana: Arabidopsis ARNm 42568064 NM_122361

Aquilegia sp.: aguileña EST 75461114 DT768847.1

74538666: DT745001.1

74562677: DT760187.1

75461112: DT768846.1

74562675: DT760186.1

Citrus sinensis: naranjo dulce EST 5793134 CX672037.1

57933368: CX673829.1

63078039: CX309185.1

Coffea canephora: café EST 82485203 DV705375.1

82458236: DV684837.1

82461999: DV688600.1

82487627: DV707799.1

Gossypium hirsutum: algodón EST 109842586 DW241146.1

48751103: CO081622.1

Sorghum bicolor: sorgo EST 45992638 CN150358.1

57813436: CX614669.1

45985339: CN145819.1

57821006: CX622219.1

45989371: CN148311.1

57821495: CX622708.1

45959033: CN130459.1

45985193: CN145752.1

18058986: BM322209.1

45958822: CN130381.1

30164583: CB928312.1

Medicago truncatula: carretón de rodaja boceto de genoma MtrDRAFT_AC119415g1v1

proteína: 92878635 ABE85154

Oryza sativa 1: arroz genoma OSJNBb0060l05.4

proteína: 18057095 AAL58118.1

Oryza sativa 2: ARNm 115450396 NM_001055334

proteína: 115450397 NP_001048799

Oryza sativa 3: ARNm 115460101 NM_001060186

proteína: 115460102 NP_001053651

Populus trichocarpa 1: álamo Genoma: LG-XII:3095392-3103694

proteína: Poptr1_1:569679, eugene3.00120332

Populus trichocarpa 2: álamo Genoma: LG_XV:201426-209590

proteína: Poptr1_1:732726, estExt_Genewise1_v1.C_LG_XV0083

Solanum lycopersicum 1: tomate EST 62932307 BW689896.1

58229384: BP885913.1

117682646: DB678879.1

5894550: AW035794.1

117708809: DB703617.1

62934028: BW691617.1

15197716: BI422913.1

4381742: AI486371.1

5601946: AI896044.1

4387964: AI484040.1

4383017: AI487646.

5278230: AI780189.1

12633558: BG133370.1

76572794: DV105461.1

117692514: DB718569.1

4385331: AI489960.1

4383253: AI487882.1

4384827: AI489456.1

Solanum lycopersicum 2: tomate EST 47104686 BT013271.1

14685038: BI207314.1

14684816: BI207092.1

Zea mays: maíz EST 110215403 EC897301.1

76291496: DV031064.1

91050479: EB160897.1

91874282: EB404239.1

110540753: EE044673.1

78111856: DV530253.1

94477588: EB706546.1

71441483: DR822533.1

78111699: DV530096.1

78107139: DV525557.1

76017449: DT944619.1

91048249: EB158667.1

78104908: DV523326.1

78088214: DV516607.1

76291495: DV031063.1

71441482: DR822532.1

78088213: DV516606.1

Vitis vinifera: vid EST 33396402 CF202029.1

33399765: CF205392.1

45770972: CN006824.1

45770784: CN006636.1

45770528: CN006380.1

45770631: CN006483.1

33400623: CF206250.1

33396335: CF201962.1

30134763: CB920101.1

30305300: CB982094.1

71857419: DT006474.1

30305235: CB982029.1

Zingiber officinale: jengibre EST 87108948 DY375732.1

87095447: DY362231.1

87095448: DY362232.1

87094804: DY361588.1

87095449: DY362233.1

87094803: DY361587.1

Lactuca sativa: lechuga Secuencia descrita en esta solicitud de patente

Spinacia oleracea: espinaca Secuencia descrita en esta solicitud de patente

Cucumis sativus: pepino Secuencia descrita en esta solicitud de patente

Nicotiana benthamiana: tabaco Secuencia descrita en esta solicitud de patente

Tabla 2 -Secuencias de cebadores de marcadores de inserción/deleción (diferencia de tamaño entre paréntesis) empleados en el cartografiado y la clonación del gen DMR6

Nombre del cebador: Gen INDEL/enzima Cebador directo Cebador inverso

IND_MOP9: At5G24210

IND_K16H17: At5g24420

IND_T4C12: At5g24820

IND_T11H3: At5g24950-60 cggcttttaacaacatattttcca

IND_F21J6: At5g25270 imagen8 imagen9

M450: At5G24450 18

M490: At5g24490 Taql

M525: At5g24520-30 Taql tcaagatcttcatattctcattcca

M545: At5G24540/50 41

M555: At5G24550/60 14 imagen10 imagen11

M470: At5g24470 Hphl

M590: At5g24590 Pdml

Tabla 3 -Parejas de cebadores para la clonación de ortólogos de dmr6 en un vector de expresión en plantas adecuado

Arabidopsis thaliana: AtDMR6_fw CACCATGGCGGCAAAGCTGATA

AtDMR6UTR_rv: GACAAACACAAAGGCCAAAGA

Cucumis sativa: cuc_fw CACCATGAGCAGTGTGATGGAGAT

cucUTR_rv: TGGGCCAAAAAGTTTATCCA

Spinacia oleracea: spi_fw

spiUTR_rv: TTGCTGCCTACAAAAGTACAAA

Lactuca sativa: Leat_fw CACCATGGCCGCAAAAGTCATCTC

LsatUTR_rv: CATGGAAACACATATTCCTTCA

Claims

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