ES2562187T3 - Plantas resistentes a enfermedades - Google Patents
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Abstract
Planta de col que es resistente a Hyaloperonospora parasitica, caracterizada por que la planta presenta un nivel reducido, una actividad reducida o una ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con la planta que no es resistente al citado agente patógeno, en donde dicha planta presenta una mutación en su gen DMR6 que da lugar a una proteína DMR6 con actividad enzimática reducida en comparación con la proteína DMR6 codificada por el gen DMR6 de tipo silvestre en el que no está presente dicha mutación; o dicha planta presenta una mutación en su gen DMR6 que da lugar a una expresión reducida de DMR6 en comparación con el gen DMR6 de tipo silvestre en el que no está presente dicha mutación.
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por que la planta presenta un nivel reducido, una actividad reducida o una ausencia completa de la proteína DMR6 en comparación con una planta que no es resistente al citado agente patógeno.
La resistencia a Hyaloperonospora parasitica se basa en un nivel alterado, en particular un nivel reducido, una actividad reducida o una ausencia completa de la proteína DMR6 en una planta.
La modulación del gen DMR6 para reducir su actividad o expresión puede ser llevada a cabo en diferentes niveles. En primer lugar, se puede mutar directamente el gen endógeno. Esto puede ser llevado a cabo por medio de un tratamiento mutagénico. Alternativamente, se puede llevar un gen DMR6 modificado a la planta por medio de técnicas transgénicas o por introgresión, o se puede reducir la expresión de DMR6 a nivel regulador, por ejemplo, modificando las secuencias reguladoras o por silenciamiento génico.
Un nivel reducido de proteína DMR6 es el resultado de una mutación en el gen DMR6 que da lugar a una expresión reducida de DMR6 en comparación con el gen DMR6 de tipo silvestre en el que no está presente tal mutación, o que da lugar a una estabilidad reducida del mRNA o la proteína. En una realización particular, esto se lleva a cabo mediante mutaciones en la secuencia de codificación de DMR6 que dan lugar a una proteína DMR6 no funcional, es decir, sin actividad enzimática o con actividad enzimática reducida.
En otra realización de la invención, se puede alcanzar la expresión reducida por infrarregulación de la expresión del gen DMR6 a nivel transcripcional o a nivel traduccional, por ejemplo, mediante silenciamiento génico o mediante mutaciones que afecten a la expresión del gen DMR6.
Para alcanzar un nivel reducido de proteína DMR6, se puede infrarregular la expresión del gen DMR6 o se puede reducir la actividad enzimática de la proteína DMR6 mediante sustituciones de aminoácidos que den lugar a cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación de DMR6.
En una realización particular de la invención, la infrarregulación de la expresión del gen DMR6 se lleva a cabo por silenciamiento génico usando RNAi. Para esto, se generan plantas transgénicas que expresan una construcción antisentido de DMR6, una construcción optimizada de micro-RNA, una construcción de repeticiones invertidas o una construcción sentido-antisentido combinados, para generar un dsRNA correspondiente a DMR6 que conduzca a silenciamiento génico.
La infrarregulación del gen DMR6 puede ser llevada también a cabo por mutagénesis de los elementos reguladores en el promotor, la región terminadora, o posibles intrones. En muchos casos, las mutaciones en la secuencia de codificación de DMR6 conducen a sustituciones de aminoácidos o codones de parada prematuros que afectan negativamente a la expresión o actividad de la proteína DMR6 codificada.
Estas mutaciones se inducen en las plantas utilizando productos químicos mutagénicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS; del inglés, ethyl methanesulfonate), por irradiación de material vegetal con rayos gamma o neutrones rápidos, o por otros medios. Los cambios nucleotídicos resultantes son aleatorios pero, en una gran colección de plantas sometidas a mutagénesis, las mutaciones en el gen DMR6 pueden ser fácilmente identificadas utilizando el método de "focalización de lesiones inducidas locales en genomas" (TILLING; del inglés, targeting induced local lesions in genomes) [McCallum et al. (2000), Targeted screening for induced mutations, Nat. Biotechnol. 18, 455457; y Henikoff et al. (2004), TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics, Plant Physiol. 135, 630636]. El principio de este método se basa en la multiplicación, por PCR, del gen de interés a partir de DNA genómico de una gran colección de plantas sometidas a mutagénesis en la generación M2. Secuenciando el DNA o buscando mutaciones puntuales utilizando una nucleasa específica de cadena sencilla, tal como la nucleasa CEL-I [Till et al. (2004), Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases, Nucleic Acids Res. 32, 2632-2641], se identifican las plantas individuales que tienen una mutación en el gen de interés.
Explorando muchas plantas se obtiene una gran colección de alelos mutantes, proporcionando cada uno un efecto diferente sobre la expresión génica o la actividad enzimática. Los niveles de expresión génica o de proteína pueden ser examinados, por ejemplo, mediante el análisis de los niveles de transcritos de DMR6 (por ejemplo, por RT-PCR)
o mediante la cuantificación de los niveles de proteína DMR6 con anticuerpos.
Las plantas con el nivel de DMR6 o la expresión de DMR6 reducidos deseados son luego retrocruzadas o cruzadas con otras líneas de cultivo para transferir sólo el nuevo alelo deseado al fondo genético del cultivo deseado.
Se describe el uso de un promotor DMR6 para proporcionar resistencia a enfermedades a las plantas. Se ha demostrado la suprarregulación transcripcional de DMR6 en respuesta a una infección por Hyaloperonospora parasitica. Tanto el análisis de transcritos como las líneas de promotor DMR6-gen informador apoyan este hallazgo (véase el Ejemplo 1 más adelante). De esta manera, el promotor DMR6 inducible por agentes patógenos es particularmente útil para controlar la expresión de sistemas inducibles que conducen a resistencia a enfermedades en las plantas.
En, por ejemplo, el Documento WO 99/45125 se ha descrito un ejemplo de dicho sistema inducible que conduce a resistencia a enfermedades en las plantas y en el que el promotor DMR6 puede ser eficaz, en donde una secuencia de nucleótidos antisentido para un gen implicado en la regulación de la ruta metabólica C5 de las porfirinas está
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ciclo umbral (ΔCT; del inglés, Δ cycle threshold) refleja el número de ciclos de multiplicación adicionales por PCR requeridos para alcanzar una concentración de producto umbral arbitraria en comparación con ACTIN2. Un menor valor de ΔCT indica un mayor nivel de transcritos.
En la Figura 9 se muestra la expresión de la construcción de promotor DMR6-gen informador (pDMR6::GUS) en líneas transgénicas de Arabidopsis, visualizada sólo con X-gluc como sustrato (Figuras d y e) o Magenta-Xgluc (Figuras a-c) y tinción del crecimiento de H. parasitica con azul de tripano. (a) Ler eds1-2 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasitica, producto de aislamiento Cala2. (b) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasitica, producto de aislamiento Waco9. (c) Ler eds1-2 (pDMR6::GUS) 3 días después de la inoculación con H. parasitica, producto de aislamiento Emoy2. (d) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la formación de heridas. (e) Col-0 (pDMR6::GUS) 3 días después de la aplicación de BTH.
En la Figura 10 se muestra el análisis por Q-PCR de los niveles de transcritos de los genes: At4g14365, At1g14880, ACD6, PR-1, PR-2 y PR-5, seleccionados como suprarregulados en el análisis con micromatrices de dmr6-1. (a) Niveles de transcripción de los seis genes en dmr6-1 en comparación con Ler eds1-2 y además el transcrito de DMR6. (b) Transcritos génicos elevados de seis genes asociados con la defensa en dmr6-2 frente a Ws-4. ΔCT refleja el número de ciclos de multiplicación adicionales por PCR necesarios para alcanzar el nivel de transcritos de ACTIN2. Un menor valor de ΔCT indica un mayor nivel de transcritos.
En la Figura 11 se muestra la secuencia de nucleótidos de la región de 3 kb cadena arriba del codón de inicio del gen DMR6 (at5g24530) de Arabidopsis thaliana, incluyendo el promotor y la 5'-UTR (subrayados).
En la Figura 12 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Solanum lycopersicum.
En la Figura 13 se muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente, del ortólogo DMR6 de Nicotiana benthamiana.
En la Figura 14 se muestra la complementación de Arabidopsis thaliana dmr6-1 con DMR6 procedente de Cucumis sativus (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl).
Ejemplos
Ejemplo 1
El gen DMR6 (At5g24530) de Arabidopsis es necesario para la susceptibilidad al mildiu velloso
Procedimientos experimentales
Crecimiento e infección de Hyaloperonospora parasitica
El producto de aislamiento Waco9 de H. parasitica fue proporcionado por el Dr. M. Aarts (WUR, Wageningen, Holanda) y el producto de aislamiento Cala2 fue proporcionado por el Dr. E. Holub (Warwick HRI, Wellsbourne, Reino Unido), y fueron mantenidos sobre Arabidopsis Ws-0 y Ler, respectivamente. Se transfirieron semanalmente inóculos (400.000 esporas por mililitro) a plantones sanos de 10 días de edad (E. B. Holub et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 7: 223-239, 1994) mediante el uso de una pistola pulverizadora. Los plantones fueron dejados secar al aire durante aproximadamente 45 minutos y fueron incubados bajo una cubierta sellada con una humedad relativa del 100% en una cámara de crecimiento a 16 °C con 9 horas de luz al día (100 mE/m2/s). Se cuantificaron los niveles de esporulación 7 días después de la inoculación (dpi; del inglés, days post inoculation) contando el número de esporangióforos por plantón para al menos 40 plantones por línea examinada (Figura 6a), o aislando esporas en agua 5 dpi y determinando la concentración de esporas para obtener el número por miligramo de tejido foliar (Figura 6b).
Generación de líneas dmr6 retrocruzadas
Los mutantes dmr6 fueron retrocruzados (BC; del inglés, backcrossed) dos veces (BC2) con la línea parental Ler eds1-2 así como con Ler. Las líneas BC2 generadas con Ler fueron seleccionadas en cuanto a la presencia del gen EDS1 de tipo silvestre mediante análisis por PCR.
Clonación de DMR6
Se realizó un mapeo fino del gen dmr6 con marcadores de PCR diseñados utilizando la base de datos Cereon para identificar diferencias de inserción y deleción (IND) entre Col-0 y Ler. Para el mapeo se utilizaron los marcadores (Tabla 2): IND_MOP9 en el gen At5G24210; IND_K16H17 en el gen At5G24420; IND_T4C12 en el gen At5G24820; IND_T11H3 en medio de los genes At5G24950_60, e IND_F21J6 en el gen At5G25270. Se inició una exploración adicional de nuevos recombinantes sobre 300 plantas F2 que dio lugar a ocho plantas recombinantes F2 entre los dos marcadores basados en IND: IND_MOP9 e IND_T4C12, que flanqueaban una región de 61 genes. Siete marcadores adicionales (M450-M590; Tabla 2) redujeron la región a dieciocho candidatos génicos para el locus dmr6, entre At5g24420 y At5g24590. El análisis de la secuencia de At5g24530 indicó una mutación puntual que conducía a un codón de parada en el exón 2 en el mutante dmr6-1.
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Identificación de una línea de inserción de T-DNA en dmr6
Se identificó un segundo alelo de dmr6, 445D09, una línea FLAG de inserción de T-DNA generada por INRA Versailles en el fondo genético de acceso Ws-4. La inserción de T-DNA fue confirmada por PCR usando un cebador diseñado en el gen At5g24530, el cebador LP (5'-caggtttatggcatatctcacgtc-3'), en combinación con el cebador del borde derecho del T-DNA, Tag3' (5'-tgataccagacgttgcccgcataa-3') o RB4 (5'-tcacgggttggggtttctacaggac-3'). La inserción exacta del T-DNA en el segundo intrón de At5g24530 fue confirmada por secuenciación de amplicones generados con los cebadores de T-DNA de ambos bordes, el izquierdo y el derecho, en combinación con los cebadores génicamente específicos LP o RP (5'-atgtccaagtccaatagccacaag-3').
Síntesis de cDNA
Se aisló RNA (de aproximadamente 100 mg de tejido foliar de plantones de 10 días de edad) con el kit RNeasy (Qiagen, Venlo, Holanda) y se trató con el sistema RNase-Free DNase (Qiagen). Se cuantificó el RNA total usando un espectrofotómetro UVmini-1240 (Shimadzu, Kyoto, Japón). Se sintetizó cDNA con la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) y oligo(dT)15 (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Complementación del mutante dmr6-1
Se generaron líneas de complementación transformando plantas dmr6 por el método de inmersión floral con Agrobacterium tumefaciens (Clough y Bent, 1998) que contenía el gen At5g24530 de Col-0 detrás del promotor 35S. La construcción se generó mediante multiplicación por PCR del gen At5g24530 de longitud completa procedente de cDNA de Col-0 con cebadores que incluían sitios de restricción que se emplearon para clonación direccional. Un cebador directo (5'-ttctgggatccaATGGCGGCAAAGCTGATATC-3') que contenía un sitio de restricción para BamHI cerca del codón de inicio (ATG) multiplicaba el extremo 5' de DMR6 y, en el extremo 3' detrás del codón de parada, se generó un sitio EcoRI con un cebador inverso (5'-gatatatgaattcttagttgtttagaaaattctcgaggc-3'). El 35S-DMR6-Tn fue clonado en el pGreenII0229 [R. P. Heliens, E. A. Edwards, N. R. Leyland, S. Bean y P. M. Mullineaux (2000), "pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-832]. Se aislaron plantones resistentes a DL-fosfinotricina (BASTA) 300 µM y se analizaron en cuanto a susceptibilidad a H. parasitica y en cuanto a niveles de expresión de DMR6 por RT-PCR.
Líneas de DMR6 infraexpresado mediante RNAi
Se generaron líneas de RNAi en los fondos genéticos Ler eds1-2 y Col-0. Se generó un amplicón de cDNA de 782 pares de bases de longitud de Col-0 At5g24530. La PCR se realizó con la DNA polimerasa Phusion (2U/µl) y dos diferentes combinaciones de cebadores. El amplicón de la primera combinación de cebadores específicos para el gen DMR6 (RNAiDMR6F: 5'-aaaagcaggctGACCGTCCACGTCTCTCTGAA-3' y RNAiDMR6R: 5'-AGAAAGCTGGGTGAAACGATGCGACCGATAGTC-3') se usó como un molde para la segunda multiplicación por PCR con cebadores generales que permitían la recombinación en el vector pDONR7 del sistema de clonación GateWay. Para la segunda PCR se usaron como molde 10 µl de la primera PCR (desnaturalización durante 30 segundos a 98 °C seguida de 10 ciclos de: 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 58 °C; 30 segundos a 72 °C) en un volumen total de 20 µl. La segunda PCR (desnaturalización durante 30 segundos a 98 °C seguida de 5 ciclos de: 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 45 °C; 30 segundos a 72 °C y 20 ciclos de 10 segundos a 98 °C; 30 segundos a 55 °C; 30 segundos a 72 °C, acabando con una extensión final de 10 minutos a 72 °C) con el attB1 (5'-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3') y el attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt -3') se llevó a cabo en un volumen de reacción de 50 µl. Se purificó el producto de PCR en gel y se recombinaron 50 ng de inserto en 150 ng de vector pDONR7 con la enzima Clonase BP. Se transformaron células de E. coli DH5α electrocompetentes con el vector y se aislaron plásmidos que contenían el inserto correcto y se emplearon 100 ng del vector pDONR7 con el amplicón de DMR6 en la reacción LR para recombinar el inserto en dos direcciones opuestas en 150 ng del vector pHellsgate8. Después de la transformación de E. coli, se seleccionaron clones resistentes a espectinomicina y se verificaron los plásmidos aislados en cuanto al tamaño de inserto correcto mediante una digestión con NotI y mediante PCR de colonias con un solo cebador interno para At5G24530 (DfragmentF: 5'gagaagtgggatttaaaatagaggaa-3'); si los insertos estaban insertados dos veces en direcciones opuestas se podía detectar un amplicón de 1420 pares de bases. Se transformó la cepa electrocompetente C58C1 de Agrobacterium con plásmidos pHellsgate8 correctos con el inserto doble en direcciones opuestas. Se aislaron plásmidos de la cepa de Agrobacterium y se volvieron a transformar células de E. coli para confirmar el tamaño correcto del plásmido y el inserto mediante digestión con NotI. Las cepas de Agrobacterium nuevamente confirmadas se utilizaron para la transformación de las plantas Col-0 y Ler eds1-2 por inmersión floral. Se exploraron las semillas desarrolladas en cuanto a resistencia a kanamicina en placas ½x GM, se transfirieron los plantones T1 y se analizó la siguiente generación de semillas, la T2, en cuanto a expresión de DMR6 y susceptibilidad a H. parasitica.
Perfil de expresión génica del mutante dmr6
Se aisló el RNA total del modo anteriormente descrito. Se multiplicó el mRNA con el kit MessageAmp aRNA (Ambion). Se hibridaron portaobjetos matriciales CATMA (Crowe et al., 2003) que contenían aproximadamente
25.000 etiquetas génicamente específicas de acuerdo con las condiciones normalizadas descritas por de Jong et al.
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relativos por PCR cuantitativa en seis diferentes puntos temporales, desde 0 días (2 horas) después de la inoculación hasta 5 días después de la inoculación (dpi) (Figura 8). Se aisló RNA de plantones Ler de diez días de edad a los que se inoculó agua (simulación), o producto de aislamiento compatible o incompatible de H. parasitica por pulverización. 2 horas después de la inoculación (0 dpi), los niveles de transcritos de DMR6 eran iguales en los diferentes tratamientos. A partir de 1 dpi, el nivel de transcrito de DMR6 resultó significativamente aumentado tanto en la interacción compatible como en la incompatible en comparación con los plantones simuladamente tratados. El nivel de transcritos de DMR6 1 dpi era ligera pero significativamente mayor en la interacción incompatible (ΔCT de 3,5; factor de inducción de aproximadamente 11) que en la compatible (ΔCT de 3,0; factor de inducción de aproximadamente 8). El nivel de expresión aumentaba más con el tiempo hasta alcanzar un elevado nivel estable a los 4-5 dpi. En estos puntos temporales el nivel de transcritos de DMR6 era mayor en la interacción compatible que en la incompatible. Los elevados niveles de transcritos de DMR6 durante las interacciones compatibles e incompatibles de H. parasitica sugieren un papel de DMR6 en la defensa de las plantas. La expresión de DMR6 asociada con la defensa pudo ser confirmada en nuestros tres mutantes de defensa potenciada, dmr3, dmr4 y dmr5 (Van den Ackerveken et al., no publicado). Además, un análisis bioinformático de los niveles de DMR6 en el Genevestigator Mutant Surveyor [P. Zimmermann, L. Hennig y W. Gruissem (2005), "Gene-expression analysis and network discovery using Genevestigator", Trends Plant Sci. 10, 407-409] mostró que el gen es intensamente inducido en los mutantes mpk4 y cpr5 resistentes a agentes patógenos. En el doble mutante cpr5/npr1, el nivel de transcritos de DMR6 permanecía elevado, lo que indica que la inducción de la expresión de DMR6 es en su mayor parte independiente de NPR1. Parece que el ácido salicílico es una señal importante en la inducción de la expresión de DMR6 durante la vejez ya que plantas transgénicas nahG (que expresan el gen bacteriano salicilato hidrolasa) sólo mostraban bajos niveles de transcrito de DMR6.
Para investigar con más detalle cómo se activa la expresión de DMR6 durante los estreses biótico y abiótico, se generaron líneas informadoras de DMR6. Se estudió la localización de la expresión de DMR6 en plantas transgénicas Col-0 y Ler eds1-2 que contenían el promotor DMR6 unido al gen informador uidA (β-glucuronidasa, GUS) (pDMR6::GUS). Para visualizar tanto el crecimiento de hifas de H. parasitica, mediante tinción con azul de tripano, como la actividad GUS, se usó magenta-Xgluc como un sustrato de β-glucuronidasa que produce un precipitado magenta. En las plantas no infectadas no se pudo detectar expresión de GUS en los diferentes orgánulos vegetales: raíz, meristemo, flor, polen y semilla. Se indujo la expresión de DMR6 en las interacciones compatibles: Ler eds1-2 infectadas con Cala2 (Figura 9a) y Col-0 infectadas con el producto de aislamiento Waco9 (Figura 9b). También se indujo la expresión de GUS en la interacción incompatible: inoculación del producto de aislamiento Emoy2 en Ler eds1-2 (Figura 9c). Como se muestra en las Figuras 9a y 9b, la expresión de DMR6 estaba confinada a las células en que H. parasitica había formado haustorios. Las células vegetales que contenían los haustorios más recientemente formados no mostraban niveles detectables de actividad GUS (Figura 9a, indicado mediante un asterisco). Durante la interacción incompatible (Figura 9c), sólo se pudo detectar actividad del promotor DMR6 en las células que habían estado en contacto con las hifas invasoras iniciales. En células muertas, como resultado de la respuesta de hipersensibilidad (HR; del inglés, hypersensitivity response) (visualizada mediante tinción con azul de tripano e indicada en la Figura 9c mediante un asterisco), no se pudo detectar actividad GUS, posiblemente debido a una degradación proteica en estas células. Para probar si la expresión de DMR6 en células que contienen haustorios es causada por una respuesta de tipo herida, se hicieron heridas en los plantones mediante una incisión con tijeras y se tiñeron los plantones para actividad GUS 3 días más tarde. No se vio ninguna expresión detectable de promotor DMR6-GUS, lo que indica que no se induce la expresión de DMR6 por formación de heridas (Figura 9d). Además, se examinó la inducción local de expresión de DMR6 en respuesta a un tratamiento con benzotiadiazol (BTH), un compuesto funcional análogo al ácido salicílico (SA). 3 días después del tratamiento con BTH, la actividad GUS se localizaba principalmente en las hojas recién formadas pero no en las maduras (Figura 9e). El análisis de las líneas pDMR6::GUS confirma los datos de expresión anteriormente descritos y resalta la inducción estrictamente localizada de DMR6 en respuesta a una infección por H. parasitica.
El mutante dmr6-1 expresa constitutivamente transcritos asociados con la defensa
Para elucidar cómo la falta de DMR6 da lugar a resistencia a H. parasitica, se analizó el transcriptoma del mutante dmr6-1 en comparación con la línea parental Ler eds1-2. Se hibridaron sondas derivadas de mRNA de las partes aéreas de plantones dmr6-1 y Ler eds1-2 de 14 días de edad sobre micromatrices CATMA de genoma completo. Se halló que un total de 58 genes se expresaban significativa y diferencialmente en dmr6-1, de los cuales 51 genes presentaban niveles de transcritos elevados y 7 genes presentaban niveles de transcritos reducidos. Un notable conjunto de los 51 transcritos inducidos han sido identificados como genes asociados con respuestas de defensa activadas de la planta, por ejemplo, ACD6, PR-5, PR-4/HEL y PAD4. Estos datos indican que la pérdida de DMR6 da lugar a la activación de un conjunto específico de transcritos asociados con la defensa. El hallazgo de que DMR6 está entre los genes inducidos en dmr6-1 corrobora la idea de que DMR6 está asociado con la defensa. Para probar si la expresión inducida de los genes asociados con la defensa se debía a la pérdida de DMR6 y no se debía a mutaciones adicionales por metanosulfonato de etilo (EMS) que quedaban en el mutante dmr6-1 retrocruzado, se verificó el nivel de transcritos de una selección de genes (At4g14365, At1g14880, ACD6, PR-1, PR-2 y PR-5) por PCR cuantitativa tanto en el mutante dmr6-1 como en el mutante dmr6-2 (Figura 10). Sólo pudimos probar niveles de transcritos de DMR6 en el mutante dmr6-1 (Figura 10a) ya que el mutante dmr6-2 (Figura 10b) tiene una inserción de T-DNA que altera el transcrito de DMR6. La inducción de DMR6 que se observa en el análisis por micromatrices fue confirmada por Q-PCR en dmr6-1 en comparación con Ler eds1-2 (Figura 10a). En las Figuras
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- Se lleva a cabo una reacción PCR usando oligonucleótidos directos e inversos degenerados;
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- Se separan los fragmentos de la PCR mediante electroforesis estándar en gel de agarosa y se aíslan del gel los fragmentos con el tamaño esperado;
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- Se clonan los fragmentos de PCR aislados en un vector plasmídico usando métodos estándares;
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- Se analizan los plásmidos con tamaños de inserto correctos, según se determinan por PCR, mediante secuenciación de DNA;
- 7.
- Un análisis de secuencias utilizando blastX revela qué fragmentos contienen las secuencias internas de DMR6 correctas;
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- La secuencia de DNA interna puede ser luego utilizada para diseñar cebadores específicos de genes y especies para 5' y 3' RACE, para obtener la secuencia de codificación completa de DMR6 mediante RLM-RACE (como se describió anteriormente).
Se proporciona la secuenciación del cDNA de DMR6 de Cucumis sativus (pepino) como un ejemplo. Para el pepino, diversas combinaciones de cebadores entre los cebadores siguientes resultaron exitosas a la hora de multiplicar un tramo de secuencia de codificación interna de cDNA: cebadores directos dmr6_deg_fw1B (TTCCAGGTDATTAAYCAYGG), dmr6_deg_fw2B CATAAYTGGAGRGAYTAYCT), dmr6_deg_fw3B (GARCAAGGRCARCAYATGGC) y dmr6_deg_fw4 (AATCCTCCTTCHTTCAAGGA), y cebadores inversos dmr6_deg_rv3B (AGTGCATTKGGGTCHGTRTG), dmr6_deg_rv4 (AATGTTRATGACAAARGCAT) y dmr6_deg_rv5 (GCCATRTGYTGYCCTTGYTC). Después de la clonación y secuenciación de los fragmentos multiplicados, se diseñaron cebadores específicos para DMR6 de pepino para 5' RACE (Cuc_dmr6_rv1: TCCGGACATTGAAACTTGTG y Cuc_dmr6_rv2: TCAAAGAACTGCTTGCCAAC) y 3' RACE (Cuc_dmr6_fw1: CGCACTCACCATTCTCCTTC y Cuc_dmr6_fw2: GGCCTCCAAGTCCTCAAAG). Finalmente, se multiplicó y secuenció la secuencia completa de cDNA de DMR6 de pepino (Figura 5). Se utilizó un planteamiento similar para espinaca, Spinacia oleracea (Figura 4), Solanum lycopersicum (Figura 12) y Nicotiana benthamiana (Figura 13).
Los ortólogos identificados del modo descrito en este ejemplo pueden ser modificados utilizando técnicas bien conocidas para inducir mutaciones que reduzcan la expresión o actividad de DMR6, para obtener plantas resistentes a hongos u oomicetos no genéticamente modificadas. Alternativamente, se puede emplear la información genética de los ortólogos para diseñar vehículos para silenciamiento génico, y para transformar las correspondientes plantas de cultivo para obtener plantas que sean resistentes a oomicetos.
Ejemplo 3
Mutación de semillas
Se tratan semillas de las especies vegetales de interés con un mutágeno con objeto de introducir mutaciones puntuales aleatorias en el genoma. Se cultivan las plantas mutadas para producir semillas y se explora la siguiente generación en cuanto a la ausencia o reducción de los niveles o actividad de transcritos de DMR6. Esto se lleva a cabo determinando el nivel de expresión del gen DMR6 o buscando cambios de nucleótidos (mutaciones) mediante el método TILLING, mediante secuenciación de DNA o mediante cualquier otro método para identificar cambios de nucleótidos. Las plantas seleccionadas son homocigóticas o se hacen homocigóticas mediante autofecundación o fecundación cruzada. Las plantas homocigóticas seleccionadas con actividad ausente o reducida de transcritos de DMR6 son examinadas en cuanto a una resistencia aumentada hacia el agente patógeno de interés para confirmar la resistencia aumentada a la enfermedad.
Ejemplo 4
Transferencia de un alelo mutado al fondo genético de un cultivo deseado
La introgresión del alelo mutante deseado a un cultivo se lleva a cabo mediante cruce y exploración genotípica del alelo mutante. Éste es un procedimiento estándar en la reproducción actual de cultivos con ayuda de marcadores.
Ejemplo 5
Uso del promotor DMR6 para una expresión génica inducida por agentes patógenos y la generación de plantas resistentes a enfermedades
Un control preciso de la expresión transgénica es esencial para la modificación genética de plantas con resistencia aumentada a enfermedades. En el pasado, la sobreexpresión constitutiva de transgenes ha dado frecuentemente lugar a plantas de mala calidad. Por lo tanto, se ha sugerido utilizar promotores inducibles por agentes patógenos, mediante los cuales sólo se expresan los transgenes cuando y donde son necesarios -en sitios de infección.
La expresión local e inducible de genes genéticamente modificados, por ejemplo, genes conmutadores maestro, genes provocadores o Avr, genes antimicrobianos o genes tóxicos, da lugar a la activación de defensa o muerte
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celular que conducirá a resistencia a agentes patógenos, tal como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology 23: 275-282, 2005). Un buen ejemplo es proporcionado por de Wit (Annu. Rev. Phytopathol. 30: 391418, 1992), quien propone el uso de la combinación Avr9-Cf9 para conseguir una muerte celular inducida que conduzca a resistencia a enfermedades. La especificidad tisular y la capacidad para inducir expresión son de importancia capital para tales planteamientos, como describen Gurr y Rushton (Trends in Biotechnology 23: 283290, 2005).
De acuerdo con la presente invención, basándose en un análisis de promotor-GUS, se ha demostrado que el promotor DMR6 muestra una expresión intensa, inducible y localizada. De este modo, el promotor DMR6 es muy adecuado para modificar genéticamente la resistencia a enfermedades en plantas transgénicas. El promotor DMR6 consiste en una región de 2,5 kb que está cadena arriba de la secuencia de codificación de DMR6 de Arabidopsis (codón de inicio: ATG) e incluye la 5'-UTR (como se representa en la Figura 11). Este promotor inducible por agentes patógenos es luego utilizado para crear construcciones transgénicas adecuadas utilizando técnicas estándares conocidas por la persona experta en este campo técnico.
Utilizando secuencias de DNA ortólogas de una especie vegetal dada, se diseñan cebadores para PCR. Estos son luego utilizados para explorar bancos genómicos de la especie vegetal de interés para identificar los clones genómicos que contienen el ortólogo DMR6 con sus secuencias promotoras y reguladoras. Alternativamente, los clones genómicos son aislados explorando un banco con un fragmento de PCR etiquetado que corresponde al gen ortólogo DMR6. Una secuenciación revela la secuencia de nucleótidos del promotor. La región de 2-5 kb cadena arriba de la secuencia de codificación del ortólogo DMR6 (codón de inicio: ATG), incluyendo así la 5'-UTR, es luego multiplicada por PCR para crear construcciones transgénicas para la transformación de plantas.
Ejemplo 6
En este ejemplo se demuestra la complementación del mutante dmr6-1 en Arabidopsis thaliana por ortólogos DMR6 de 4 especies de cultivo diferentes. Para esto, se clonaron ortólogos DMR6 de Cucumis sativus (Cs), Spinacia oleracea (So), Lactuca sativa (Ls) y Solanum lycopersicum (Sl) en un vector de expresión vegetal bajo el control del promotor 35S y, posteriormente, se utilizó este vector para transformar un mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana.
En resumen, se aisló mRNA usando métodos estándares y se sintetizó cDNA utilizando un cebador de oligo-dT y métodos estándares. Posteriormente se generaron fragmentos de PCR usando pares de cebadores para cada cultivo, como se representan más adelante en la Tabla 3. Se clonaron los productos de PCR generados en un vector pENTR/D-TOPO usando el kit de clonación pENTR/D-TOPO de Invitrogen y se analizaron los plásmidos resultantes con tamaños de inserto correctos, según se determinaron por PCR, mediante secuenciación de DNA. Se realizó la recombinación con el vector pB7WG2.0 usando LR Clonase II de Invitrogen y se analizaron los plásmidos resultantes mediante PCR y digestión con enzimas de restricción. Se transformaron bacterias Agrobacterium tumefaciens C58C1 PGV2260 con plásmidos adecuados y se analizaron los plásmidos de Agrobacterium mediante PCR y digestión con enzimas de restricción.
Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana dmr6-1 con las construcciones anteriores por inmersión en disolución de bacterias Agrobacterium y se verificó la sobreexpresión de DMR6 de cultivos en plantas de Arabidopsis T1 mediante RT-PCR utilizando los cebadores de clonación para DMR6 de cultivos (Tabla 3). Finalmente, se infectaron plantas de Arabidopsis T2 y T3 con Hyaloperonospora parasitica Cala2 para confirmar la complementación. Los resultados se muestran en la Figura 14.
Como se muestra en la Figura 14, todos los ortólogos DMR6 examinados eran capaces de complementar el mutante dmr6-1 de Arabidopsis thaliana, lo que indica que los ortólogos DMR6 identificados codifican proteínas DMR6 con una funcionalidad similar a la de DMR6 de Arabidopsis thaliana.
Tablas
En la Tabla 1 se enumeran los números GI (identificador de GenInfo) y el número de acceso de GenBank para marcadores de secuencia expresada (ESTs; del inglés, expressed sequence tags) y secuencias de mRNA o proteína del mRNA de DMR6 de Arabidopsis y secuencias ortólogas de otras especies vegetales. Un número GI (identificador de GenInfo, a veces escrito en minúsculas, "gi") es un número entero único que permite identificar una secuencia concreta. El número GI es una serie de guarismos que se asignan consecutivamente a cada registro secuencial procesado por el NCBI. De este modo, el número GI cambia cada vez que cambia la secuencia. El NCBI asigna números GI a todas las secuencias procesadas en Entrez, incluyendo secuencias de nucleótidos de DDBJ/EMBL/GenBank, secuencias proteicas de SWISS-PROT, PIR y muchas otras. Por lo tanto, el número GI proporciona un identificador de secuencia único que es independiente de la fuente de la base de datos, que especifica una secuencia exacta. Si una secuencia de GenBank resulta modificada, incluso por un solo par de bases, se asigna un nuevo número GI a la secuencia actualizada. El número de acceso sigue siendo el mismo. El número GI es siempre estable y recuperable. De este modo, la referencia a números GI en la tabla proporciona una identificación clara e inequívoca de la secuencia correspondiente.
Tabla 2
Secuencias cebadoras de marcadores de inserción/deleción (diferencia de tamaños entre paréntesis) usados en el mapeo y la clonación del gen DMR6
Tabla 3
Pares de cebadores para clonar ortólogos dmr6 en un vector de expresión vegetal adecuado
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