JP5300742B2 - 耐病性植物 - Google Patents

Description

本発明は、耐病性植物、特に真菌界および卵菌門の生物、卵菌に抵抗性である植物に関する。本発明はさらに、耐病性を付与する植物遺伝子、および、卵菌門の病原体に対する保護を提供するために、かかる耐病性植物を得る方法に関する。

真菌および卵菌病原体に対する植物の抵抗性は、病原体特異的抵抗性および広域抵抗性の両方について広範囲に研究されてきた。多くの場合、抵抗性は、抵抗性に関する優性遺伝子により特定される。非病原性遺伝子産物または病原体由来のその他の分子と直接的または間接的に相互作用することにより病原体認識を媒介する品種特異的抵抗性遺伝子もしくは遺伝子対遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ）抵抗性遺伝子の多くが同定されている。この病原体認識により、病原体の増殖を停止させる植物の防御応答の広い範囲の活性化が引き起こされる。

植物育種では、主に、一遺伝子性の優性抵抗性遺伝子の新規な供給源を同定するために絶え間ない努力がなされている。新しく導入された単一抵抗性遺伝子を有する栽培品種において、病原体は、高い頻度で進化および適合し、首尾よく宿主植物を感染させる能力を再び獲得するため、病害からの保護は急激に破壊されることが多い。従って、耐病性の新規な供給源を利用できることが非常に求められる。

代わりとなる抵抗性機構は、例えば植物における防御応答、例えば大麦におけるウドンコ病病原菌であるオオムギウドンコ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）に対する、劣性ｍｌｏ遺伝子に媒介される抵抗性など、の調節を介して作用する。野生型ＭＬＯ遺伝子の変異対立遺伝子を保有する植物は、ほぼ完全な抵抗性を示し、一回攻撃された表皮細胞は細胞壁に対する真菌の進入を回避するようになる。野生型ＭＬＯ遺伝子は、従って病原応答の負の調節因子として作用する。これはＷＯ９８０４５８６号に記載されている。

その他の例は、ウドンコ病菌エリシフェ・シコラセアルム（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）に対する感受性の喪失についてのスクリーニングにおいて見出された劣性のウドンコ病抵抗性遺伝子である。これまで３つの遺伝子がクローン化され、ＰＭＲ６（ペクチン酸リアーゼ様タンパク質をコードする）、ＰＭＲ４（カロースシンターゼをコードする）、およびＰＭＲ５（未知の機能をもつタンパク質をコードする）と名付けられた。ｍｌｏおよびｐｍｒ遺伝子の両方が、ウドンコ病に対して特異的に抵抗性を付与する一方、べと病などの卵菌に対しては付与しないと思われる。

広域病原体抵抗性、すなわちＳＡＲなどの全身性の型の抵抗性は、２つの主な方法で獲得されている。第１の方法は、植物防御および細胞死の負の調節因子の変異によるものである（例えばシロイヌナズナのｃｐｒ、ｌｓｄおよびａｃｄ変異株におけるものなど）。第２の方法は、植物防御の誘導物質または調節因子のトランスジェニックによる過剰発現によるものである（例えばＮＰＲ１過剰発現植物におけるものなど）。

これらの既知の抵抗性機構の欠点は、病原体抵抗性のほかに、これらの植物が検出可能なさらなる望ましくない表現型、例えば成育不全または細胞死の自然形成などをしばしば示すことである。

本発明の目的は、広域で、永続的であり、望ましくない表現型を伴わない抵抗性の型を提供することである。

本発明を導く研究において、べと病病原体であるアブラナべと病菌（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）に対する感受性の低下について、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）変異株のスクリーニングを行った。ＥＭＳ変異株を、非常に感受性の高いシロイヌナズナ系統のＬｅｒ ｅｄｓ１−２において作製した。８つのべと病抵抗性（ｄｍｒ）変異株が詳細に解析され、６つの異なる遺伝子座に対応した。顕微鏡分析により、全ての変異株においてアブラナべと病菌（Ｈ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）の増殖がひどく低下したことが示された。ｄｍｒ３、ｄｍｒ４およびｄｍｒ５変異株の抵抗性は、植物防御の恒常的活性化に付随した。さらに、ｄｍｒ３およびｄｍｒ４変異株は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびシロイヌナズナにおけるウドンコ病菌（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｏｒｏｎｔｉｉ）にも抵抗性であったが、ｄｍｒ５変異株は抵抗性でなかった。

対照的に、植物防御の活性化の増強は、ｄｍｒ１、ｄｍｒ２、およびｄｍｒ６変異株において観察されなかった。この研究の結果は、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １８（６）５８３−５９２に記載されている。この文献はＤＭＲ遺伝子の同定および特徴づけを開示していない。

ｄｍｒ６変異株は、シロイヌナズナＬｅｒ ｅｄｓ１−２バックグラウンドでの感受性低下スクリーニングにおいて同定された。現在、ＤＭＲ６遺伝子は、クローン化され、特徴づけされている。従って、ＤＭＲ６は、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子Ａｔ５ｇ２４５３０であることが見出された（ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図２に表される）。オキシドレダクターゼは、１つの分子（酸化体）から、もう一つの分子（還元体）への電子の移動を触媒する酵素である。本発明によれば、機能性ＤＭＲ６タンパク質の欠如は、べと病抵抗性をもたらすことが見出された。

従って本発明は、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に抵抗性である植物であって、該病原体に抵抗性でない植物と比較して該植物がＤＭＲ６タンパク質のレベルが低下、活性が低下、または完全に消失していることを特徴とする植物を提供する。

この抵抗性の型は、卵菌門の病原体、例えばシロサビキン属、アファノミセス属、バシジオホラ（Ｂａｓｉｄｉｏｐｈｏｒａ）属、ブレミア属、ヒアロペロノスポラ（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、パキメトラ（Ｐａｃｈｙｍｅｔｒａ）属、パラペロノスポラ（Ｐａｒａｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）属、ペロファシア（Ｐｅｒｏｆａｓｃｉａ）属、ペロノフィトラ属、ツユカビ属、ペロノスクレロスポラ属、フィチウム属、フィトフトラ属、タンジクツユカビ属、プロトブレミア（Ｐｒｏｔｏｂｒｅｍｉａ）属、ニセツユカビ属、ササラビョウキン属、ビエンノチア（Ｖｉｅｎｎｏｔｉａ）属の種に対して、ならびに真菌に属する病原体に対して、特に効果的である。

本発明に従う抵抗性は、植物におけるＤＭＲ６タンパク質のレベルの変更（特に低下）、活性の低下、または完全な欠如に基づく。この点において用語「ＤＭＲ６タンパク質」は、ＤＭＲ６遺伝子産物、例えばシロイヌナズナのＡｔ５ｇ２４５３０遺伝子によりコードされるタンパク質に関連する。かかる変更は様々な方法で達成することができる。

本発明の一実施形態では、ＤＭＲ６タンパク質のレベルの低下は、内因性ＤＭＲ６遺伝子発現の低下の結果である。ＤＭＲ６遺伝子の発現を低下させることは、直接的に、例えば遺伝子サイレンシングによるか、あるいは、間接的に、その調節配列の修飾によるか、または遺伝子の発現を刺激することにより達成することができる。

ＤＭＲ６遺伝子を調節してその活性または発現を低下させることは様々なレベルで達成することができる。第１に、内在遺伝子を直接に変異させることができる。これは、変異を誘発する処理（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を用いて達成してよい。あるいは、修飾ＤＭＲ６遺伝子をトランスジェニック技法または遺伝子移入を用いて植物に組み込むか、あるいはＤＭＲ６の発現を調節レベルにおいて低下させてよい（例えば、調節配列を修飾するか、または遺伝子サイレンシングによる）。

本発明のもう一つの実施形態では、ＤＭＲ６タンパク質のレベルの低下は、かかる変異が存在しない野生型ＤＭＲ６遺伝子と比較してＤＭＲ６発現の低下をもたらす、またはｍＲＮＡまたはタンパク質安定性の低下をもたらす、ＤＭＲ６遺伝子中の変異の結果としてみられる。特定の実施形態では、これは、非機能性（すなわち酵素活性がないか、または低下した）ＤＭＲ６タンパク質をもたらす、ＤＭＲ６コード配列中の変異により達成される。

本発明のもう一つの実施形態では、発現の低下は、転写もしくは翻訳レベルのいずれかで、例えば遺伝子サイレンシングによるか、またはＤＭＲ６遺伝子の発現に影響を及ぼす変異による、ＤＭＲ６遺伝子発現の下方制御により達成され得る。

本発明は、シロイヌナズナにおけるアブラナべと病菌に対する抵抗性に関して行われた研究に基づくが、より一般には、病原体（例えば卵菌および真菌など）への感染に対して感受性の高い植物、特に作物に適用することのできる一般的な概念である。

本発明は、卵菌類により引き起こされる多数の植物病害、例えば、限定されるものではないが、レタスにおけるレタスべと病菌、ホウレンソウにおけるホウレンソウべと病菌、ウリ科に属する植物、例えばキュウリおよびメロンにおけるキュウリべと病菌、タマネギにおけるタマネギべと病菌、アブラナ科に属する植物、例えばキャベツにおけるアブラナべと病菌、ブドウにおけるブドウべと病菌、トマトおよびジャガイモにおける疫病菌、ならびに、ダイズにおけるダイズ茎疫病菌に適している。

植物におけるＤＭＲ６遺伝子発現の修飾がＤＭＲ６遺伝子の遺伝子組換えによるか、またはＤＭＲ６遺伝子中の変異の同定により達成される予定であって、該遺伝子がまだ知られていない場合、該遺伝子を最初に同定しなければならない。ＤＭＲ６遺伝子の遺伝子組換えまたはＤＭＲ６遺伝子中の変異の同定により病原体抵抗性植物、特に作物を作製するため、オーソロガスＤＭＲ６遺伝子を、これらの植物種から単離する必要がある。

その他の植物におけるオーソロガス配列の同定のために様々な方法が利用できる。

植物種におけるＤＭＲ６オーソロガス配列の同定のための方法は、例えば、データベース中の植物種のＤＭＲ６のＥＳＴを同定するステップと、全てのＤＭＲ６転写物またはｃＤＮＡを増幅するためのプライマーを設計するステップと、対応する全ての転写物またはｃＤＮＡを得るためのプライマーを用いる増幅実験を行うステップと、転写物またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定するステップとを含んでよい。コード配列の一部分しか分かっていない状況で完全な転写物またはｃＤＮＡを増幅するために適した方法は、５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、ＲＬＭ−ＲＡＣＥおよびベクトレットＰＣＲなどの改良型ＰＣＲ技法が公知である。

あるいは、目的の植物種に関してヌクレオチド配列が利用できない場合、目的の植物と密接に関連している植物種のＤＭＲ６遺伝子を元に、複数のヌクレオチド配列のアラインメントにより決定される保存されたドメインに基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲを用いてオーソロガス配列を増幅させる。かかるプライマーは、適切には縮重プライマーである。

所与配列をＤＭＲ６オーソログであるとして評価するもう一つの確かな方法は、相互から検索を行った結果の最高値（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂｅｓｔ ｈｉｔ）の同定によるものである。候補オーソロガスＤＭＲ６配列は、Ｂｌａｓｔプログラムを用いて、シロイヌナズナＤＭＲ６タンパク質またはＤＮＡ配列または別の植物種のＤＭＲ６配列を用いて検索した場合、ＤＮＡデータベースからの最良のヒット（ｂｅｓｔ ｈｉｔ）として同定される。得られた所与植物種の候補オーソロガスヌクレオチド配列を用いて、ｂｌａｓｔＸ検索法を用いて、ＤＮＡデータベース（例えばＮＣＢＩまたはＴＡＩＲで）に存在する全てのシロイヌナズナタンパク質との相同性について検索する。最良のヒットおよびスコアがシロイヌナズナＤＭＲ６タンパク質に対するものであれば、その所与ＤＮＡ配列はオーソログまたはオーソロガス配列であると記載することができる。

ＤＭＲ６は、公開されている完全なゲノム配列から推定されるように、シロイヌナズナでは単一の遺伝子によりコードされる。コメのゲノムでは、３つのオーソログ、ポプラでは２つのオーソログが同定されている。これまで試験したその他の植物種の大部分において、公開ＤＮＡデータベースからのｍＲＮＡ配列およびＥＳＴデータの解析により決定されるように、ＤＭＲ６は単一の遺伝子によりコードされると思われる。オーソロガス遺伝子およびタンパク質は、これらの植物において、公開データベースに存在する情報とのヌクレオチドおよびアミノ酸比較により同定される。

あるいは、所望の植物種に関してＤＮＡ配列が利用できない場合、オーソロガス配列を、シロイヌナズナまたは別の植物のＤＭＲ６遺伝子のＤＮＡプローブを用いる異種ハイブリダイゼーションによるか、またはプライマーを定義するためにＤＭＲ６コード配列中の保存されたドメインを利用するＰＣＲ法により単離する。多くの作物種に関して、プライマーを設計し、ＤＮＡ配列分析のための全てのｍＲＮＡまたはゲノム配列をＰＣＲ増幅するために使用することのできる、部分的なＤＭＲ６のｍＲＮＡ配列が利用可能である。

具体的な実施形態では、オーソログは、コードされるタンパク質がシロイヌナズナＤＭＲ６タンパク質（Ａｔ５ｇ２４５３０）またはその他の植物のＤＭＲ６タンパク質の遺伝子と少なくとも５０％の同一性を示す遺伝子である。より具体的な実施形態では、同一性は、少なくとも５５％、より具体的には６０％、さらにより具体的には６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。

図１は、公的に利用可能であるデータベースにおいて同定されていて、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅およびその後の配列決定により獲得された、オーソロガスＤＭＲ６配列（表１に記載）を示す。オーソロガスＤＭＲ６配列が同定された後、遺伝子の調節およびコード配列の完全なヌクレオチド配列が、標準的な分子生物学的技法により同定される。これに関して、植物種のゲノムライブラリーを、既知のＤＭＲ６遺伝子に由来するプローブまたはプライマーを用いるＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによりスクリーニングして、ＤＭＲ６遺伝子を含むゲノムクローンを同定する。あるいは、改良型ＰＣＲ法、例えばＲＮＡリガーゼ媒介ＲＡＣＥ（ＲＬＭ−ＲＡＣＥ）などを用いて、ゲノムＤＮＡまたは逆転写ｍＲＮＡから遺伝子およびｃＤＮＡ配列を直接に増幅する。その後、ＤＮＡ配列決定の結果、完全な遺伝子またはコード配列の特徴づけがもたらされる。

ひとたび遺伝子ＤＮＡ配列が分かると、この情報は、ＤＭＲ６遺伝子の発現を調節する手段に使用される。

ＤＭＲ６タンパク質レベルの低下を達成するため、ＤＭＲ６遺伝子の発現を下方制御してもよいし、ＤＭＲ６タンパク質の酵素活性をＤＭＲ６コード配列のヌクレオチドの変化の結果起こるアミノ酸置換により低下させてもよい。

本発明の特定の実施形態では、ＤＭＲ６遺伝子発現の下方制御は、ＲＮＡｉを用いる遺伝子サイレンシングにより達成される。これに関して、遺伝子サイレンシングを導くＤＭＲ６に対応するｄｓＲＮＡを生成するように、ＤＭＲ６アンチセンス構築物、最適化されたマイクロＲＮＡ構築物、逆方向反復構築物、または組み合わされたセンス−アンチセンス構築物を発現する、トランスジェニック植物が作製される。

代替となる実施形態では、ＤＭＲ６遺伝子の１以上の調節因子がＲＮＡｉにより（転写活性化因子の場合に）下方制御される。

もう一つの実施形態では、調節因子は（抑制タンパク質の場合に）トランスジェニック過剰発現により上方制御される。過剰発現は、特定の実施形態では、ＤＭＲ６遺伝子の抑制タンパク質を強いプロモーター、例えば植物のバイオテクノロジーにおいて慣用される３５Ｓプロモーターから発現させることにより達成される。

ＤＭＲ６遺伝子の下方制御は、プロモーター、ターミネーター領域、または潜在的なイントロン中の調節エレメントの変異誘発によっても達成することができる。多くの場合、ＤＭＲ６コード配列中の変異は、コードされるＤＭＲ６タンパク質の発現または活性にマイナスの影響を及ぼすアミノ酸置換、または中途終止コドンを引き起こす。

これらの変異は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの変異誘発性化学物質を使用することにより、ガンマ線または高速中性子での植物材料の照射により、またはその他の手段により植物に誘導される。結果として起こるヌクレオチドの変化は無作為であるが、変異誘発された植物の大規模なコレクションの中では、ＤＭＲ６遺伝子中の変異はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法を用いることにより容易に同定することができる（ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（２０００） 「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４５５−４５７、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００４） ＴＩＬＬＩＮＧ．「Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｅｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５，６３０−６３６）。この方法の原理は、Ｍ２世代で変異誘発された植物の大規模なコレクションのゲノムＤＮＡからの目的の遺伝子のＰＣＲ増幅に基づく。一本鎖特異的ヌクレアーゼ、例えばＣＥＬ−Ｉヌクレアーゼを用いてＤＮＡ配列決定によるかまたは点変異を探すことにより（Ｔｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００４） 「Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｓｉｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２，２６３２−２６４１）、目的の遺伝子中に変異を有する個別の植物が特定される。

多くの植物をスクリーニングすることにより、各々が遺伝子発現または酵素活性に異なる影響をもたらす、変異型対立遺伝子の大規模なコレクションが得られる。遺伝子発現またはタンパク質レベルは、例えばＤＭＲ６転写物レベルの（例えばＲＴ−ＰＣＲによる）分析によるかまたは抗体を用いるＤＭＲ６タンパク質レベルの定量化により試験することができる。

続いて、望ましくＤＭＲ６レベルまたはＤＭＲ６発現の低下した植物を他の育種系統に戻し交配または交配し、所望の新しい対立遺伝子のみを、求める作物のバックグラウンドに移す。

本発明はさらに、変異ＤＭＲ６遺伝子に関する。

特定の実施形態では、本発明は中途終止コドンをもつｄｍｒ６対立遺伝子、例えばｄｍｒ６−１対立遺伝子に関する。

もう一つの実施形態では、本発明は、図３〜５に示されるレタス、キュウリ、およびホウレンソウの変異型ＤＭＲ６遺伝子に関する。

本発明は、機能性ＤＭＲ６遺伝子産物レベルが消失または低下した植物が、特に卵菌および真菌起源の病原体に対して抵抗性を示すことを実証する。この知識に基づき、当業者は、機能性ＤＭＲ６タンパク質レベルの低下または不在を引き起こすＤＭＲ６遺伝子の変異やＤＭＲ６タンパク質の変異型を有する、今まで未知の所与植物種の自然突然変異体を同定することができ、これらの自然突然変異体を本発明に従って用いることができる。

本発明はさらに、耐病性（すなわちウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対する抵抗性）を植物に提供するための、ＤＭＲ６プロモーターの使用に関する。本発明によれば、病原体感染に応答した、ＤＭＲ６の転写上方制御が実証された。転写物の解析ならびにプロモーターＤＭＲ６−レポーター系統（ｌｉｎｅｓ）の両方がこの知見を支持する（下の実施例１を参照のこと）。このように、本発明に従う病原体誘導性ＤＭＲ６プロモーターは、植物において耐病性をもたらす誘導性の（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）系の発現を制御するために特に有用である。

植物において耐病性をもたらし、かつ、本発明に従うＤＭＲ６プロモーターが効果的であり得る誘導性の系の一例は、例えば、ＷＯ９９／４５１２５号に記載され、該系ではＣ−５ポルフィリン代謝経路の調節に関与する遺伝子のアンチセンスヌクレオチド配列が、病原体誘導性プロモーターに作動可能なように連結され、植物細胞を形質転換するために用いられている。病原体に応答した、アンチセンスヌクレオチド配列の発現は、形質転換植物細胞のポルフィリン代謝、および病原体の伝播が含まれる限局性損傷の発生を効果的に攪乱する。ＷＯ９６／３６６９７号はまた、植物において耐病性をもたらす誘導性の系も開示し、その系では誘導性プロモーターにより、植物において過敏な応答を惹起することのできるタンパク質の発現が制御される。欧州特許第０４７４８５７号は、さらに、一組の病原体由来非病原性遺伝子／植物由来抵抗性遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列により植物を形質転換することを含み、エリシターペプチドおよび抵抗性遺伝子の一方または両方の発現が病原体誘導性プロモーターにより調節される、植物において病原体抵抗性を誘導するための方法を開示する。植物において病原体に対する抵抗性をもたらす誘導性の系のさらなる例は、例えばＷＯ９８／３２３２５号に記載されている。

特定の好ましい実施形態では、本発明は、植物細胞内で作動可能な病原体誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの発現可能な核酸を含むＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換するステップと、該植物細胞から形質転換植物を再生するステップとを含み、該病原体誘導性プロモーターがＤＭＲ６プロモーターであり、かつ、発現可能な核酸の発現によりそのトランスジェニック植物に耐病性が付与される、植物に耐病性をもたらす方法に関する。

本発明はまた、該方法により得ることのできる耐病性植物、ならびに該植物から得ることのできる植物組織および種子に関する。

本発明は、特に、ウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に抵抗性である植物であって、ゲノム中に病原体誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの発現可能な核酸を含むＤＮＡ構築物を含み、該病原体誘導性プロモーターはＤＭＲ６プロモーターである植物に関するものである。

本発明はまた、病原体誘導性プロモーターに作動可能に連結された、少なくとも１つの発現可能な核酸を含むＤＮＡ構築物自体に関するものであって、ここで、病原体誘導性プロモーターはＤＭＲ６プロモーターである。本発明の構築物を用いて植物細胞を形質転換させることができ、それは形質転換植物に再生され得る。さらに、形質転換された植物組織および種子を得てもよい。本発明の構築物を植物細胞に導入するための適した方法は当業者に公知である。

本発明によれば、「作動可能に連結された」は、プロモーターおよび発現可能な核酸、例えば遺伝子が、プロモーターによる発現可能な核酸（例えば遺伝子）の転写の開始が許可されるような方法でつなげられていることを意味する。

「発現可能な核酸」は、細胞で発現させることのできる核酸、すなわち、ｍＲＮＡに転写することができ、最終的にタンパク質に翻訳され得る核酸（例えば、遺伝子、または遺伝子の部分）を意味する。発現可能な核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または化学的に合成されたＤＮＡあるいは任意のその組合せであってよい。

本発明によれば、ＤＮＡ構築物は、細胞において特定の核酸の発現（すなわち、転写）を可能にする全ての必要な核酸エレメントを含む。一般に、構築物には、発現可能な核酸、すなわち、転写されるべき核酸とプロモーターが含まれる。構築物は、例えばプラスミドまたはベクターに適切に組み込むことができる。

発現可能な核酸は、植物の防御応答に関与する遺伝子、例えば植物の過敏な応答に関連する遺伝子であることが好ましい。植物の過敏な応答（ＨＲ）において、病原体の侵入している植物の部位は、病原体に応答して引き起こされる自殺機構の誘導性発現により、限局性の細胞死を起こす。こうして、ごくわずかの植物細胞が犠牲となり、病原体の伝播は効果的に抑止される。植物の防御応答に関与する該遺伝子の例は、調節タンパク質ＮＰＲ１／ＮＩＭ１（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１４（９）：１１１４−１１２４，２００１）および転写因子ＭＹＢ３０（Ｖａｉｌｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（１５）：１０１７９−１０１８４，２００２）である。

特定の実施形態では、発現可能な核酸は、植物に耐病性を付与することのできる自己由来または異種のポリペプチドをコードする。「自己由来のポリペプチド」は、形質転換植物細胞で自然発生する遺伝子から形質転換植物細胞に発現される任意のポリペプチドを意味する。「異種のポリペプチド」は、形質転換植物細胞に対して部分的にまたは完全に異質な（すなわち、形質転換植物細胞で自然発生しない）遺伝子から形質転換植物細胞に発現される任意のポリペプチドを意味する。かかるポリペプチドの例は、哺乳類のＢａｘタンパク質であり、そのタンパク質はアポトーシス促進性タンパク質をコードし、その結果細胞死を植物（Ｌａｃｏｍｍｅ ａｎｄ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１４）：７９５６−６１，１９９９）および真菌キチナーゼ（ｄｅ ｌａｓ Ｍｅｒｃｅｄｅｓ Ｄａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４２（２）：７２２−７３０，２００６）にもたらす。

好ましくは、ＤＭＲ６プロモーターは、シロイヌナズナＤＭＲ６プロモーターである。ＤＭＲ６プロモーターは、シロイヌナズナＤＭＲ６コード配列（ＡＴＧ開始コドン）の上流であって、５’ＵＴＲを含む３０００ｂｐの領域を含む。好ましくは、ＤＭＲ６プロモーターは、図１１に定義されるヌクレオチド配列、および／またはその任意の機能性断片（すなわち、作動可能に連結されている発現可能な核酸（１または複数）の転写を開始することのできる該配列の任意の断片（または部分））、および／またはその自然突然変異体（すなわち、わずかな遺伝子多型を含む可能性があるが一般に少なくとも９０％同一であるプロモーターの自然突然変異体）を含む。

さらに好ましい実施形態では、ＤＭＲ６プロモーターは、オーソロガスＤＭＲ６プロモーター、すなわち、オーソロガスＤＭＲ６遺伝子のプロモーターである。ＤＭＲ６オーソログを同定するための方法は、下の実施例２に記載されている。ＤＭＲ６オーソログが同定されれば、当業者は、標準的な分子生物学的技法を用いて該オーソログのそれぞれのプロモーターを単離することができる。

本発明によれば、ＤＭＲ６プロモーターは、病原体によって強く誘導されることが示され、ＤＭＲ６プロモーターはその他の非感染組織では高発現でない。従って、ＤＭＲ６プロモーターは、植物においてウイルス起源、細菌起源、真菌起源または卵菌起源の病原体に対する抵抗性を提供するための誘導性の系での使用に非常に適したプロモーターである。本発明のＤＭＲ６プロモーターを用いて誘導性の系に適切に使用することのできる具体的な病原体および植物の例は上に示されている。

本発明は、本発明を何ら制限することを意図しない以下の実施例において例証される。実施例において、以下の図面が参照される。

表１は、シロイヌナズナＤＭＲ６ｍＲＮＡおよびその他の植物種由来のオーソロガス配列のＧｅｎｂａｎｋ受託番号およびＧｅｎＩｎｆｏ識別子を示す。

表２は、ＤＭＲ６のマップに基づくクローニングに用いるマーカーのＰＣＲプライマーを示す。

表３は、適した植物発現ベクターにおいてｄｍｒ６オーソログをクローニングするためのプライマー対を示す。

ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ （１．８３）多重配列アラインメントプログラム（ＥＢＩ）を用いて、シロイヌナズナならびにオダマキ属の種、スイートオレンジ、ロブスタコーヒーノキ、キュウリ、ワタ、レタス、タルウマゴヤシ、イネ（３）、ブラックコットンウッド（２）、トマト（２）、モロコシ、ホウレンソウ、ブドウ、トウモロコシ、およびショウガ由来のオーソログのＤＭＲ６タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。配列の下に、保存されたアミノ酸が点で示され、同一のアミノ酸がアスタリスクで示される。 それぞれ、シロイヌナズナのＤＭＲ６遺伝子（Ａｔ５ｇ２４５３０、ｇｉ ４２５６８０６４、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ＿１２２３６１）およびタンパク質（ｇｉ １５２３８５６７、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿１９７８４１）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ、レタスのＤＭＲ６オーソログのヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ、ホウレンソウのＤＭＲ６オーソログのヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ、キュウリおよびメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）のＤＭＲ６オーソログのヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列を示す図である。 シロイヌナズナｄｍｒ６変異株のべと病抵抗性を示す図である。（ａ）接種後７日、その親系統Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２と比較したｄｍｒ６−１変異株（ＢＣ２、Ｅ３７系統）およびその親系統Ｗｓ−４と比較したｄｍｒ６−２変異株（ＦＬＡＧ＿４４５Ｄ０９ Ｔ−ＤＮＡ系統）での、アブラナべと病菌単離物Ｗａｃｏ９の胞子嚢柄の定量化。（ｂ）ｄｍｒ６−１変異株のＡｔ５ｇ２４５３０遺伝子で相補することによる感受性の回復。実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）重量１ｍｇあたりのアブラナべと病菌胞子を、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２、ｄｍｒ６−１および５つの相補系統（＃１２１、１２２、２１１、２３１、および２４１）で定量した。 シロイヌナズナＤＭＲ６遺伝子ならびにｄｍｒ６−１およびｄｍｒ６−２変異の構造を示す図である。ＤＭＲ６遺伝子は、４つのエキソンと１０２６塩基のコード配列を含む。２つの対立遺伝子、すなわちエキソン２に塩基変化を含むｄｍｒ６−１、およびイントロン２にＴ−ＤＮＡ挿入を含むｄｍｒ６−２が同定されている。 偽処理したか、または親和性もしくは非親和性のアブラナべと病菌単離物を接種したＬｅｒ植物におけるＤＭＲ６の相対的な転写物レベルを示す図である。転写物レベルは、接種後の異なる日に決定した。サイクル閾値（ΔＣＴ）の値の差異は、ＡＣＴＩＮ２と比較して任意の閾値産物濃度に達するために必要な、さらなるＰＣＲ増幅サイクルの数を反映する。低いΔＣＴ値は高い転写物レベルを示す。 アブラナべと病菌増殖を、基質としてＸ−ｇｌｕｃのみ（図ｄおよびｅ）またはマゼンタ−Ｘｇｌｕｃ（図ａ〜ｃ）およびトリパンブルー染色で視覚化した、トランスジェニックシロイヌナズナ系統におけるＤＭＲ６プロモーター−レポーター（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）構築物の発現を示す図である。（ａ）アブラナべと病菌Ｃａｌａ２単離物を含む、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）３ｄｐｉ。（ｂ）アブラナべと病菌Ｗａｃｏ９単離物を含む、Ｃｏｌ−０（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）３ｄｐｉ。（ｃ）アブラナべと病菌Ｅｍｏｙ２単離物を含む、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）３ｄｐｉ。（ｄ）Ｃｏｌ−０（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）３ｄｐ 創傷（ｗｏｕｎｄｉｎｇ）。（ｅ）Ｃｏｌ−０（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）３ｄｐ ＢＴＨ適用。 ｄｍｒ６−１マイクロアレイ解析において上方制御されたとして選択される遺伝子（Ａｔ４ｇ１４３６５、Ａｔ１ｇ１４８８０、ＡＣＤ６、ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５）の転写物レベルのＱ−ＰＣＲ解析を示す図である。（ａ）Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２およびさらにＤＭＲ６転写物と比較した、ｄｍｒ６−１における６つの遺伝子の転写レベル。（ｂ）Ｗｓ−４に対するｄｍｒ６−２における６つの防御関連防御関連遺伝子の遺伝子転写物の上昇。ΔＣＴは、ＡＣＴＩＮ２転写物のレベルに達するために必要な、さらなるＰＣＲ増幅サイクルの数を反映する。低いΔＣＴ値は高い転写物レベルを示す。 プロモーターおよび５’−ＵＴＲ（下線部分）を含む、シロイヌナズナのＤＭＲ６遺伝子（ａｔ５ｇ２４５３０）の開始コドンの上流の３ｋｂの領域のヌクレオチド配列を示す図である。 それぞれ、トマトのＤＭＲ６オーソログのヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列を示す図である。 それぞれ、ベンサミアナタバコのＤＭＲ６オーソログのヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸配列を示す図である。 キュウリ（Ｃｓ）、ホウレンソウ（Ｓｉ）、レタス（Ｌｓ）およびトマト（Ｓｏ）から誘導されるＤＭＲ６によるシロイヌナズナｄｍｒ６−１の補完性を示す図である。

シロイヌナズナＤＭＲ６（Ａｔ５ｇ２４５３０）遺伝子はべと病感受性に必要である
試験手順
＜アブラナべと病菌の増殖および感染＞
単離アブラナべと病菌Ｗａｃｏ９は、Ｍ．Ａａｒｔｓ博士（ＷＵＲ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，ＮＬ）により提供され、単離Ｃａｌａ２は、Ｅ．Ｈｏｌｕｂ博士（Ｗａｒｗｉｃｋ ＨＲＩ，Ｗｅｌｌｓｂｏｕｒｎｅ，ＵＫ）により提供され、それぞれシロイヌナズナＷｓ−０およびＬｅｒで維持された。接種菌液（４００，０００胞子／ｍｌ）を毎週、１０日齢の健常な実生（Ｈｏｌｕｂ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．７：２２３−２３９，１９９４）に、スプレーガンを用いて移した。実生をおよそ４５分間空気乾燥させ、１日９時間の光条件（１００ｍＥ／ｍ２／ｓ）で１６℃の増殖チャンバ中で相対湿度１００％にて密閉された蓋の下でインキュベートした。接種後（ｄｐｉ）７日の胞子形成レベルを、試験した系統あたり少なくとも４０の実生について、実生あたりの胞子嚢柄の数を計数することによるか（図６Ａ）、または５ｄｐｉの水中の胞子を単離し、胞子濃度を決定して葉組織１ｍｇあたりの数を得ることにより（図６Ｂ）定量化した。

＜戻し交配したｄｍｒ６系統の生成＞
ｄｍｒ６変異株を、Ｌｅｒと同様に親系統Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２に２回（ＢＣ２）戻し交配した。Ｌｅｒを用いて作製したＢＣ₂系統が、ＰＣＲ解析により野生型ＥＤＳ１遺伝子が存在するために選択された。

＜ＤＭＲ６のクローニング＞
ｄｍｒ６遺伝子のファインマッピングを、Ｃｅｒｅｏｎデータベースを用いてＣｏｌ−０とＬｅｒの間の挿入および欠失（ＩＮＤ）差を同定するように設計されたＰＣＲマーカーを用いて行った。マーカー：遺伝子Ａｔ５Ｇ２４２１０のＩＮＤ＿ＭＯＰ９；遺伝子Ａｔ５Ｇ２４４２０のＩＮＤ＿Ｋ１６Ｈ１７；遺伝子Ａｔ５Ｇ２４８２０のＩＮＤ＿Ｔ４Ｃ１２；遺伝子Ａｔ５Ｇ２４９５０〜６０間のＩＮＤ＿Ｔ１１Ｈ３および遺伝子Ａｔ５Ｇ２５２７０のＩＮＤ＿Ｆ２１Ｊ６を、マッピングに使用した（表２）。新規な組換え体についてのさらなる選別を３００のＦ₂植物で開始し、６１遺伝子の領域に隣接する２つのＩＮＤに基づくマーカー、ＩＮＤ＿ＭＯＰ９とＩＮＤ＿Ｔ４Ｃ１２の間に、８つのＦ₂組換え植物がもたらされた。７つのさらなるマーカー（Ｍ４５０〜Ｍ５９０；表２）により、該領域はＡｔ５ｇ２４４２０〜Ａｔ５ｇ２４５９０間のｄｍｒ６遺伝子座の１８個の候補遺伝子に減らされた。Ａｔ５ｇ２４５３０の配列解析により、ｄｍｒ６−１変異株においてエキソン２に終止コドンを導く点変異が示された。

＜ｄｍｒ６ Ｔ−ＤＮＡ挿入系統の同定＞
２番目のｄｍｒ６対立遺伝子である、Ｗｓ−４アクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）バックグラウンドにおいてＩＮＲＡ Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓにより生成された、４４５Ｄ０９、ＦＬＡＧ Ｔ−ＤＮＡ挿入系統を同定した。Ｔ−ＤＮＡ挿入は、Ａｔ５ｇ２４５３０遺伝子に設計されたプライマーである、ＬＰプライマー（５’−ｃａｇｇｔｔｔａｔｇｇｃａｔａｔｃｔｃａｃｇｔｃ−３’）を、Ｔ−ＤＮＡ右側境界配列（ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ）プライマーのＴａｇ３’（５’−ｃｔｇａｔａｃｃａｇａｃｇｔｔｇｃｃｃｇｃａｔａａ−３’）またはＲＢ４（５’−ｔｃａｃｇｇｇｔｔｇｇｇｇｔｔｔｃｔａｃａｇｇａｃ−３’）と組み合わせて用いるＰＣＲにより確認された。Ａｔ５ｇ２４５３０の２番目のイントロン中の正確なＴ−ＤＮＡ挿入は、左側および右側境界配列の両方からのＴ−ＤＮＡプライマーを、遺伝子特異的プライマーＬＰまたはＲＰ（５’−ａｔｇｔｃｃａａｇｔｃｃａａｔａｇｃｃａｃａａｇ−３’）と組み合わせて作製したアンプリコンの配列決定により確認された。

＜ｃＤＮＡ合成＞
ＲＮＡを、ＲＮａｅｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて（１０日齢の実生からの葉組織およそ１００ｍｇから）単離し、ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼセット（Ｑｉａｇｅｎ）で処理した。ＵＶｍｉｎｉ−１２４０分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて全ＲＮＡを定量化した。スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびオリゴ（ｄＴ）１５（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、ｃＤＮＡを合成した。

＜ｄｍｒ６−１変異株の相補性＞
相補系統を、Ｃｏｌ−０由来のＡｔ５ｇ２４５３０遺伝子を３５Ｓプロモーターの後ろに含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，１９９８）を用いるフローラルディップ法によってｄｍｒ６植物を形質転換することにより作製した。方向性クローニングに使用される制限部位を含むプライマーを用いて、Ｃｏｌ−０のｃＤＮＡからＡｔ５ｇ２４５３０全長をＰＣＲ増幅することにより構築物を作製した。開始コドン（ＡＴＧ）の近傍のＢａｍＨＩ制限部位を含む正方向プライマー（５’−ｔｔｃｔｇｇｇａｔｃｃａＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣ−３’）はＤＭＲ６の５’末端を増幅し、終止コドンの後の３’末端で逆方向プライマー（５’−ｇａｔａｔａｔｇａａｔｔｃｔｔａｇｔｔｇｔｔｔａｇａａａａｔｔｃｔｃｇａｇｇｃ−３’）を用いてＥｃｏＲＩ部位が生成された。３５Ｓ−ＤＭＲ６−Ｔｎを、ｐＧｒｅｅｎＩＩ０２２９にクローニングした（Ｈｅｌｌｅｎｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｅ．Ａ．，Ｌｅｙｌａｎｄ，Ｎ．Ｒ．，Ｂｅａｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ，Ｐ．Ｍ．（２０００））。ｐＧｒｅｅｎ：アグロバクテリウムに媒介される植物形質転換のための多用途かつ柔軟なバイナリーＴｉベクター。Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２，８１９−８３２）。３００μＭ ＤＬ−ホスフィノトリシン（ＢＡＳＴＡ）抵抗性の実生を単離し、ＲＴ−ＰＣＲによりアブラナべと病菌感受性およびＤＭＲ６発現レベルについて解析した。

＜ＲＮＡｉによるＤＭＲ６系統のノックダウン＞
Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２およびＣｏｌ−０バックグラウンドにおいてＲＮＡｉ系を生成した。Ｃｏｌ−０ Ａｔ５ｇ２４５３０遺伝子の長さ７８２ｂｐのｃＤＮＡアンプリコンを生成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）および２つの異なるプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った。１回目のＤＭＲ６遺伝子特異的プライマーの組合せ（ＲＮＡｉＤＭＲ６Ｆ：５’−ａａａａｇｃａｇｇｃｔＧＡＣＣＧＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡ−３’およびＲＮＡｉＤＭＲ６Ｒ：５’−ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＧＡＣＣＧＡＴＡＧＴＣ−３’）からのアンプリコンを、ＧａｔｅＷａｙクローニング系のｐＤＯＮＲ７ベクターへの組換えを可能にする一般的なプライマーでの２回目のＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。２回目のＰＣＲについて、２０μｌの総容積中、１０μｌの１回目のＰＣＲ（９８℃にて３０秒間の変性に続いて、１０サイクルの９８℃にて１０秒、５８℃にて３０秒、７２℃にて３０秒）を鋳型として用いた。２回目のＰＣＲ（９８℃にて３０秒間の変性に続いて、５サイクルの９８℃にて１０秒、４５℃にて３０秒、７２℃にて３０秒、および、２０サイクルの、９８℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて３０秒、７２℃にて１０分の最終伸長で終了）は、ａｔｔＢ１（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ−３’）およびａｔｔＢ２（５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔ−３’）を用いて、５０μｌの反応容積で行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢＰクロナーゼ酵素を用いて５０ｎｇのインサートを１５０ｎｇのｐＤＯＮＲ７ベクターに組み込んだ。ベクターをエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｏｔｅｎｔ）ＤＨ５α大腸菌細胞に形質転換し、正確なインサートを含有するプラスミドを単離し、１００ｎｇのｐＤＯＮＲ７をＤＭＲ６アンプリコンとともにＬＲ反応に用いて、１５０ｎｇのｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８ベクターに２つの反対方向にインサートを組み込んだ。大腸菌に形質転換した後、スペクトマイシン耐性クローンを選択し、単離したプラスミドを、正しいインサートサイズについてのＮｏｔＩ消化と、Ａｔ５ｇ２４５３０の単一の内部プライマー（Ｄ断片Ｆ：５'−ｇａｇａａｇｔｇｇｇａｔｔｔａａａａｔａｇａｇｇａａ−３'）を用いるコロニーＰＣＲにより検証し、インサートが反対方向に２回挿入されていたならば、１４２０ｂｐのアンプリコンが検出され得る。反対方向に２倍のインサートを含む、正しいｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８プラスミドを、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｏｔｅｎｔ）アグロバクテリウム系統、Ｃ５８Ｃ１に形質転換した。プラスミドをアグロバクテリウムから単離し、大腸菌に再び形質転換して、プラスミドおよびインサートの正しいサイズをＮｏｔＩ消化により確認した。再び確認されたアグロバクテリウム系統を、Ｃｏｌ−０およびＬｅｒ ｅｄｓ１−２植物のフローラルディップ形質転換に用いた。成育した種子を、１／２×ＧＭプレートでカナマイシン耐性についてスクリーニングし、Ｔ₁の実生を移動させて、次の世代の種子であるＴ₂をＤＭＲ６発現およびアブラナべと病菌感受性について分析した。

＜ｄｍｒ６変異株の遺伝子発現プロファイリング＞
全ＲＮＡを上記の通り単離した。ｍＲＮＡをＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ａＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ）で増幅させた。およそ２５，０００の遺伝子特異的タグを含有する、ＣＡＴＭＡアレイ（Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）スライドを、ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．により記載される標準化された条件に従ってハイブリダイズした（ｄｅ Ｊｏｎｇ Ｍ．，ｖａｎ Ｂｒｅｕｋｅｌｅｎ Ｂ．，Ｗｉｔｔｉｎｋ，Ｆ．Ｒ．，Ｍｅｎｋｅ，Ｆ．Ｌ．，Ｗｅｉｓｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ Ｇ．（２００６）．「Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ； ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」．Ｐｌａｎｔ Ｊ．４６，７０８−７２１））。定量的ＰＣＲのために、ｃＤＮＡ鋳型を既に記載される通り作製した。１転写物あたりのサイクル閾値を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）をレポーター染料として用いて使用して、三重反復で決定した。転写物のためのプライマーの組は、ＤＭＲ６（ＱＤＭＲ６Ｆ：５’−ＴＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧ−３’および ＱＤＭＲ６Ｒ：５’−ＣＧＡＴＡＧＴＣＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＴＧ−３’）、Ａｔ１ｇ１４８８０（ＱＡｔ１ｇ１４８８０Ｆ：５’−ＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＡＣＡ−３’およびＱＡｔ１ｇ１４８８０Ｒ：５’−ＣＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＧＡＴＡ−３’）、Ａｔ４ｇ１４３６５（ＱＡｔ４ｇ１４３６５Ｆ：５’−ＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＴＧＴＡＡＡ−３’およびＱＡｔ４ｇ１４３６５Ｒ：５’−ＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＴＴＧＴ−３’）、ＡＣＤ６（ＱＡＣＤ６Ｆ：５’−ＴＧＧＡＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴ−３’およびＱＡＣＤ６Ｒ：５’−ＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧ−３’）、ＰＲ−５（ＱＰＲ−５Ｆ：５’−ＧＧＣＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＴＴＣＡＣＡ−３’およびＱＰＲ−５Ｒ：５’−ＧＧＴＡＧＧＧＣＡＡＴＴＧＴＴＣＣＴＴＡＧＡ−３’）、ＰＲ−２（ＱＰＲ−２Ｆ：５’−ＡＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣ−３’およびＱＰＲ−２Ｒ：５’−ＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣ−３’）、ＰＲ−１（ＱＰＲ−１Ｆ：５’−ＧＡＡＣＡＣＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＧＴＴＴ−３’およびＱＰＲ−１Ｒ：５’−ＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＡＣＡＣＣＴ−３’）およびＡＣＴ−２（ＱＡＣＴ２Ｆ：５’−ＡＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＡ−３’およびＱＡＣＴ２Ｒ：５’−ＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＣ−３’）であり、１００塩基対断片を生成する。

結果
＜ｄｍｒ６変異株における病原体抵抗性の原因となる遺伝子の特徴づけ＞
Ｖａｎ Ｄａｍｍｅら、２００５（前掲）は、アブラナべと病菌に抵抗性であるｄｍｒ６変異株を開示する。抵抗性のレベルは、アブラナべと病菌の接種後７日の実生あたりの胞子嚢柄の数を計数することにより調べることができる（単離Ｗａｃｏ９またはＣａｌａ２、オランダ国ユトレヒトのユトレヒト大学、Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｄｒ．Ｇ．Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎより入手可能）。親系統である、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２０３３−２０４６）は、非常に感受性が高く、陽性対照として使用する（そして１００％に設定する）。

親系統の実生と比較した、感染したｄｍｒ６変異株での胞子嚢柄形成の低下が、図６Ａに示される。この図では、対照系統と比較した、べと病抵抗性ｄｍｒ６−１変異株、親系統Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２に２回戻し交配したもの、およびｄｍｒ６−２変異株（ＦＬＡＧ＿４４５Ｄ０９ Ｔ−ＤＮＡ系統）でのアブラナべと病菌、Ｗａｃｏ９胞子形成（胞子嚢柄／実生）の定量の結果が示される。

本発明によれば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅら、２００５（前掲）のｄｍｒ６変異株におけるアブラナべと病菌に対する抵抗性の原因となる遺伝子は、候補遺伝子のマッピングおよび配列決定の組合せによりクローン化されている。これまでに、劣性のｄｍｒ６変異が、染色体５上のｎｇａ１３９マーカーの近傍の７４遺伝子を包含する領域にマッピングされた。ファインマッピングにより、ｄｍｒ６遺伝子座を、対応する遺伝子に位置するマーカーであるＡｔ５ｇ２４４２０とＡｔ５ｇ２４５９０の間のＢＡＣｓ Ｔ１３Ｋ７およびＫ１８Ｐ６を含むマッピング間隔に関連付けた。これにより、ｄｍｒ６のインターバルは、１８候補遺伝子の領域に限定された。ｄｍｒ６および親系統であるＬｅｒ ｅｄｓ１−２の１８遺伝子の比較配列解析により、Ａｔ５ｇ２４５３０遺伝子の２番目のエキソンにおける点変異が明らかとなった。この単一のＧからＡへの塩基の変化（ＥＭＳ変異には典型的である）は、コード配列のヌクレオチド位置６９１でＴＧＧ（ｔｒｐコドン）をＴＧＡ（中途終止コドン）に変える（図７）。早期の終止コドンにより、保存された触媒ドメインよりも前の位置１４１で、３４２ａａの予測されたオキシドレダクターゼ酵素を切断し、ｄｍｒ６がヌル対立遺伝子であることが示唆される。Ａｔ５ｇ２４５３０コード配列（図２）は、質量３９．４ｋＤａのタンパク質をコードすると予測される。Ａｔ５ｇ２４５３０の生物学的役割は、今までのところ記載されていない。

＜Ａｔ５ｇ２４５３０はＤＭＲ６である＞
第２の対立遺伝子である、ｄｍｒ６−２を、ＩＮＲＡ、Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓの提供する変異株コレクションからのＴ−ＤＮＡ挿入系統（ＦＬＡＧ＿４４５Ｄ０９）において同定した。Ａｔ５ｇ２４５３０（図７）の２番目のイントロン中のＴ−ＤＮＡインサートの存在および位置を、ＰＣＲおよび配列解析により確認した（データは示さず）。Ｔ−ＤＮＡ挿入のためのＦＬＡＧ＿４４５Ｄ０９系統同型接合体の後代は、アブラナべと病菌単離物Ｗａｃｏ９に抵抗性であったが、親系統（Ｗｓ−４）は感受性が高かった（図６Ａ）。Ａｔ５ｇ２４５３０転写物は、Ｗｓ−４のエキソン２および３でプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより増幅することができたが、同型接合体ｄｍｒ６−２系統ではできず（データは示さず）、ｄｍｒ６−２が第２のヌル対立遺伝子と考えられ得ることが示される。

Ａｔ５ｇ２４５３０はアブラナべと病菌の感受性に必要とされるという考えを実証するため、３５Ｓプロモーターの制御下でクローン化されたＡｔ５ｇ２４５３０のｃＤＮＡでｄｍｒ６−１変異株を形質転換した。５つの独立するｄｍｒ６−１のＴ₂実生において、Ａｔ５ｇ２４５３０の強い過剰発現がＲＴ−ＰＣＲにより確認された（データは示さず）。導入遺伝子の同型接合体であるＴ₃系統は全てアブラナべと病菌単離物Ｃａｌａ２に対する感受性の回復を示し（図６Ｂ）、Ａｔ５ｇ２４５３０がＤＭＲ６であることを確認した。相補性は、２つの独立したｄｍｒ６変異株の同定とともに、機能性ＤＭＲ６遺伝子がアブラナべと病菌の感受性に必要であることを明確に示す。

＜ＤＭＲ６はアブラナべと病菌感染中に転写によって活性化される＞
アブラナべと病菌に感染中のＤＭＲ６の発現を研究するため、相対的な転写物レベルを定量的ＰＣＲにより接種後０日（２時間）から接種後（ｄｐｉ）５日までの６つの異なる時点で測定した（図８）。ＲＮＡを、水（偽）、親和性または非親和性アブラナべと病菌単離物を噴霧接種した１０日齢のＬｅｒ実生から単離した。接種後２時間に（０ｄｐｉ）、ＤＭＲ６転写物のレベルは異なる処理において同等であった。１ｄｐｉから開始して、ＤＭＲ６転写物のレベルは、偽処理した実生に比較して、親和性および非親和性相互作用の両方で著しく増加した。ＤＭＲ６転写物レベルは、親和性（３．０のΔＣＴ、およそ８倍の誘導）よりも、非親和性相互作用において１ｄｐｉでわずかであるが有意に高かった（３．５のΔＣＴ、およそ１１倍の誘導）。発現レベルは、やがてさらに増大して、４〜５ｄｐｉで安定な高いレベルに達した。これらの時点で、ＤＭＲ６転写物レベルは、非親和性相互作用よりも親和性相互作用において高かった。親和性および非親和性のアブラナべと病菌の相互作用の間にＤＭＲ６転写物レベルが上昇したことは、植物防御におけるＤＭＲ６の役割を示唆する。ＤＭＲ６の防御に関連する発現は、本発明者らの３つの強化された防御（ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｄｅｆｅｎｃｅ）変異株、ｄｍｒ３、ｄｍｒ４、およびｄｍｒ５において確認することができた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、未発表）。さらに、ＤＭＲ６レベルの、Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｍｕｔａｎｔ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｈｅｎｎｉｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．（２００５）．「Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｎｅｔｗｏｒｋ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ」．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０，４０７−４０９）でのコンピュータ解析により、病原体抵抗性変異株ｍｐｋ４およびｃｐｒ５において遺伝子が強く誘導されることが示された。ｃｐｒ５／ｎｐｒ１の二重の変異株において、ＤＭＲ６転写物レベルは高いままであり、ＤＭＲ６発現の誘導が主にＮＰＲ１非依存性であることが示される。ｎａｈＧトランスジェニック植物（細菌のサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する）は低レベルのＤＭＲ６転写物しか示さないため、サリチル酸が、老化の中でＤＭＲ６発現の誘導において重要なシグナルであると思われる。

生物的および非生物的ストレスの中でＤＭＲ６の発現がどのように活性化されるかをより詳細に調査するため、ＤＭＲ６レポーター系統を作製した。ＤＭＲ６発現の局在化を、ｕｉｄＡ（β−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）レポーター遺伝子に連結されたＤＭＲ６プロモーター（ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ）を含むトランスジェニックＣｏｌ−０およびＬｅｒ ｅｄｓ１−２植物において調べた。アブラナべと病菌の菌糸成長（トリパンブルーで染色される）、ならびにＧＵＳ活性の両方を可視化するため、マゼンタ−Ｘｇｌｕｃをβ−グルクロニダーゼ基質として使用して、マゼンタ沈殿物を生じた。非感染植物では、異なる植物器官（すなわち根、分裂組織、花、花粉および種子）においてＧＵＳ発現を検出することができた。ＤＭＲ６の発現は、親和性相互作用である、Ｃａｌａ２に感染したＬｅｒ ｅｄｓ１−２（図９Ａ）、および単離物Ｗａｃｏ９に感染したＣｏｌ−０（図９Ｂ）において誘導された。ＧＵＳ発現も非親和性相互作用である、単離物Ｅｍｏｙ２を接種されたＬｅｒ ｅｄｓ１−２において誘導された（図９Ｃ）。図９Ａおよび９Ｂに示されるように、ＤＭＲ６発現は、アブラナべと病菌が吸器を形成した細胞に限定された。直近に形成された吸器を含む植物細胞は、検出可能なレベルのＧＵＳ活性を示さなかった（図９Ａ、アスタリスクで図示）。非親和性相互作用の中（図９Ｃ）、ＤＭＲ６プロモーターの活性は、初期侵入菌糸に接触していた細胞においてのみ検出することができた。過敏性応答（ＨＲ、図９Ｃにおいてアスタリスクで示されるトリパンブルー染色により可視化される）の結果もたらされる死細胞では、おそらくこれらの細胞におけるタンパク質分解に起因して、ＧＵＳ活性を検出することができなかった。吸器を含む細胞でのＤＭＲ６発現が創傷様応答により引き起こされるかどうかを試験するために、実生を剪刀で切開することにより傷を付け、３日後にＧＵＳ活性について染色した。検出可能なプロモーターＤＭＲ６ＧＵＳの発現は見られず、ＤＭＲ６の発現が創傷により誘導されないことが示される（図９Ｄ）。さらに、サリチル酸（ＳＡ）の機能類似体である、ベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）での処理に応答する、ＤＭＲ６発現の局所誘導を試験した。ＢＴＨ処理後３日に、ＧＵＳ活性は主に新規に形成された部分に局在したが、成熟した葉には局在しなかった（図９Ｅ）。ｐＤＭＲ６：：ＧＵＳ系統の解析により、上記の発現データが確認され、アブラナべと病菌感染に応答したＤＭＲ６の厳密な（ｓｔｒｉｃｔｌｙ）限局性の誘導が強調された。

＜ｄｍｒ６−１変異株は防御関連転写物を恒常的に発現する＞
ＤＭＲ６の欠如がどのようにアブラナべと病菌抵抗性をもたらすのかを解明するため、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２親系統と比較してｄｍｒ６−１変異株のトランスクリプトームを解析した。１４日齢のｄｍｒ６−１およびＬｅｒ ｅｄｓ１−２実生の地上部分のｍＲＮＡから導かれたプローブを、全ゲノムＣＡＴＭＡマイクロアレイでハイブリダイズした。合計５８遺伝子が、ｄｍｒ６−１において有意に異なって発現することが見出され、その中の５１遺伝子が転写物レベルを上昇させ、７遺伝子が転写物レベルを低下させた。５１の誘導された転写物の顕著なセット（ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｓｅｔ）が、活性化した植物の防御応答に関連する遺伝子として同定された（例えば、ＡＣＤ６、ＰＲ−５、ＰＲ−４／ＨＥＬおよびＰＡＤ４）。これらのデータは、ＤＭＲ６の欠如の結果、防御関連転写物の具体的なセットの活性化がもたらされることを示す。ＤＭＲ６がｄｍｒ６−１に誘導される遺伝子であるという知見は、ＤＭＲ６が防御に関連しているという考えを実証する。誘導された防御関連遺伝子の発現が、ＤＭＲ６の欠如に起因するものであって、戻し交配したｄｍｒ６−１変異株に残存するさらなるエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）変異に起因するものでないかどうかを試験するため、遺伝子（Ａｔ４ｇ１４３６５、Ａｔ１ｇ１４８８０、ＡＣＤ６、ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５）の選択の転写物レベルを、ｄｍｒ６−１およびｄｍｒ６−２変異株の両方における定量的ＰＣＲにより検証した（図１０）。ｄｍｒ６−２変異株（図１０Ｂ）はＤＭＲ６転写物を崩壊させるＴ＿ＤＮＡ挿入を有するので、本発明者らはｄｍｒ６−１変異株（図１０Ａ）でのＤＭＲ６転写物レベルだけを試験することができた。マイクロアレイ解析において観察されるように、ＤＭＲ６の誘導を、Ｌｅｒ ｅｄｓ１−２（図１０Ａ）と比較した、ｄｍｒ６−１でのＱ−ＰＣＲにより確認した。図１０ＡおよびＢは、６つ全ての選択された遺伝子が、親系統と比較して両方のｄｍｒ６変異株において上昇したことを示す。ｄｍｒ６変異株における選択された防御関連遺伝子の観察された発現の増加は、ＤＭＲ６の欠如が植物の防御応答を活性化させることを示す。このセットの防御関連転写物の活性化は、ｄｍｒ６変異株におけるアブラナべと病菌に対する抵抗性の主な原因であり得る。

作物中のＤＭＲ６オーソログの同定
１．配列相同性に基づくライブラリーのスクリーニング
シロイヌナズナのＤＭＲ６コード配列およびタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２に示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の公開ライブラリーを図２の配列と比較した。この比較の結果、完全なＤＭＲ６コード配列、ならびに、オダマキ属の種、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ロブスタコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｉｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（３）、ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）（２）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（２）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、およびショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）において予測されたアミノ酸配列が同定された。このようにして同定されたオーソロガスタンパク質の配列情報は表１に示され、図１の多重アラインメントにおいて視覚化される。多くのその他の植物種オーソロガスＤＮＡ断片は、ｂｌａｓｔＸにより、シロイヌナズナまたはその他の植物ＤＭＲ６タンパク質配列に対する相互の最良のヒット（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂｅｓｔ ｈｉｔ）として同定することができた。

２．異種ハイブリダイゼーションを用いるオーソログの同定
図２に示されるシロイヌナズナのＤＭＲ６ＤＮＡ配列をプローブとして用いて、標準的な分子生物学的方法を用いる任意の植物種のＤＮＡに対するハイブリダイゼーションにより相同配列を探索する。この方法を用いて、オーソロガス遺伝子を、制限酵素消化ＤＮＡでのサザンハイブリダイゼーションによるか、またはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションにより検出する。これらの技法は当業者に周知である。代替プローブとして、任意のその他のより近縁の植物種のＤＭＲ６ＤＮＡ配列をプローブとして用いてもよい。

３．ＰＣＲを用いるオーソログの同定
多くの作物種に関して、プライマーを設計し、その後に完全なｃＤＮＡまたはゲノム配列をＰＣＲ増幅するために使用される、部分ＤＭＲ６ｍＲＮＡまたは遺伝子配列が利用可能である。５’および３’配列が利用可能である場合、欠損した内部配列はＤＭＲ６特異的５’正方向プライマーおよび３’逆方向プライマーによりＰＣＲ増幅される。５’配列、内部配列または３’配列だけしか利用できない場合、正方向プライマーと逆方向プライマーの両方が設計される。利用可能なプラスミドポリリンカープライマーと組み合わせて、インサートを目的の植物種のゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーから増幅する。同様の方法で、欠損した５’配列または３’配列は改良型ＰＣＲ技法；５’ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥ、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、ＲＬＭ−ＲＡＣＥまたはベクトレットＰＣＲにより増幅させる。

例として、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ：英名ｌｅｔｔｕｃｅ）ＤＭＲ６のｃＤＮＡの配列決定を提供する。ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのＥＳＴデータベースから、シロイヌナズナＤＭＲ６アミノ酸配列から出発するｔｂｌａｓｔｎツールを用いて、いくつかのレタスＤＭＲ６のＥＳＴを同定した。ＥＳＴのクラスタリングおよびアラインメントの結果、５’ＤＭＲ６断片のコンセンサス配列がもたらされた。完全なレタスＤＭＲ６のｃＤＮＡを得るため、ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）をレタス実生由来のｍＲＮＡで用いた。３’ｍＲＮＡ配列は、ＥＳＴ由来の５’ＤＭＲ６コンセンサス配列で設計された２つのプライマー（Ｌｓａｔ＿ｄｍｒ６＿ｆｗ１：ＣＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＧ、およびＬｓａｔ＿ｄｍｒ６＿ｆｗ２：ＴＣＡＡＣＣＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣ）とキットの３’ＲＡＣＥプライマーを用いることにより得た。構築された配列に基づいて、新しいプライマーを設計して、ｃＤＮＡから完全なＤＭＲ６コード配列を増幅し、図３に表されるヌクレオチド配列および誘導されたタンパク質配列をもたらした。

１０を超える異なる植物種由来の完全なＤＭＲ６コード配列が、ゲノムおよびＥＳＴのデータベースから同定されている。ＤＮＡ配列のアラインメントから、コード配列中の保存された領域を縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計用に選択した。（縮重ヌクレオチドに関して、略語は、オリゴヌクレオチドを合成する全ての会社が使用する標準的なコードであるＩＵＢヌクレオチド記号に従い、Ｇ＝グアニン、Ａ＝アデニン、Ｔ＝チミン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ、Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。

所与植物種の内部ＤＭＲ６のｃＤＮＡ配列を得るための手順は以下の通りである。
１．標準的な方法を用いてｍＲＮＡを単離し、
２．オリゴｄＴプライマーおよび標準法を用いてｃＤＮＡを合成し、
３．縮重した正方向および逆方向オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を実行し、
４．標準的なアガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ断片を分離し、予測されるサイズの断片をゲルから単離し、
５．単離したＰＣＲ断片をプラスミドベクターに標準的な方法を用いてクローニングし、
６．ＰＣＲにより決定された正確なインサートサイズのプラスミドを、ＤＮＡ配列決定により解析し、
７．ｂｌａｓｔＸを用いる配列解析によりどの断片が正確な内部ＤＭＲ６配列を有するかを明らかにし、
８．内部ＤＮＡ配列を用いて５’および３’ＲＡＣＥのための遺伝子および種特異的プライマーを設計して、ＲＬＭ−ＲＡＣＥ（上記の通り）により完全なＤＭＲ６コード配列を得ることができる。

例として、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ：英名ｃｕｃｕｍｂｅｒ）ＤＭＲ６のｃＤＮＡの配列決定を提供する。キュウリのための、以下のプライマー同士のいくつかのプライマーの組合せは、ｃＤＮＡ由来の内部コード配列のストレッチを増幅することに成功した。正方向プライマーｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｆｗ１Ｂ（ＴＴＣＣＡＧＧＴＤＡＴＴＡＡＹＣＡＹＧＧ）、ｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｆｗ２Ｂ（ＣＡＴＡＡＹＴＧＧＡＧＲＧＡＹＴＡＹＣＴ）、ｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｆｗ３Ｂ（ＧＡＲＣＡＡＧＧＲＣＡＲＣＡＹＡＴＧＧＣ）およびｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｆｗ４（ＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＨＴＴＣＡＡＧＧＡ）ならびに逆方向プライマーｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｒｖ３Ｂ（ＡＧＴＧＣＡＴＴＫＧＧＧＴＣＨＧＴＲＴＧ）、ｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｒｖ４（ＡＡＴＧＴＴＲＡＴＧＡＣＡＡＡＲＧＣＡＴ）およびｄｍｒ６＿ｄｅｇ＿ｒｖ５（ＧＣＣＡＴＲＴＧＹＴＧＹＣＣＴＴＧＹＴＣ）。増幅断片のクローニングおよび配列決定の後、キュウリＤＭＲ６特異的プライマーを、５’ＲＡＣＥについて設計した（Ｃｕｃ＿ｄｍｒ６＿ｒｖ１：ＴＣＣＧＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＧおよびＣｕｃ＿ｄｍｒ６＿ｒｖ２：ＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＣ）および３’ＲＡＣＥ（Ｃｕｃ＿ｄｍｒ６＿ｆｗ１：ＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣおよびＣｕｃ＿ｄｍｒ６＿ｆｗ２：ＧＧＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＧ）。最後に、完全なキュウリＤＭＲ６のｃＤＮＡ配列を増幅し、配列決定した（図５）。同様のアプローチを、ホウレンソウ（図４）、トマト（図１２）およびベンサミアナタバコ（図１３）に用いた。

この実施例に記載されるように同定されたオーソログは、周知の技法を用いて修飾してＤＭＲ６発現または活性を低下させる変異を誘導し、真菌または卵菌に抵抗性の非遺伝子組換え植物を得ることができる。あるいは、オーソログの遺伝情報を用いて遺伝子サイレンシングの媒体を設計し、対応する作物に形質転換して卵菌に抵抗性である植物を得ることができる。

種子の変異
ゲノムにランダム点変異を導入するために、目的の植物種の種子を変異誘発物質で処理する。変異した植物を生育させて種子を生成し、次の世代をＤＭＲ６転写物レベルまたは活性の低下がみられないことについてスクリーニングする。これは、ＤＭＲ６遺伝子発現のレベルをモニターすることによるか、あるいはＴＩＬＬＩＮＧ法により、ＤＮＡ配列決定により、またはヌクレオチド変化を特定する任意のその他の方法により、ヌクレオチド変化（変異）を検索することにより達成される。選択される植物は同型接合体であるか、または自家受粉または種間交雑（ｉｎｔｅｒ−ｃｒｏｓｓｉｎｇ）により同型接合体となる。選択される、ＤＭＲ６転写物活性が存在しないかまたは低下した同型接合植物は、目的の病原体に対する抵抗性の増加について試験され、耐病性の増加が確認される。

変異した対立遺伝子の所望の作物のバックグラウンドへの移入
所望の変異対立遺伝子の作物への遺伝子移入は、変異対立遺伝子の交配および遺伝子型スクリーニングにより達成される。これは、今日のマーカーを利用した（ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔａｎｔ）作物の育種において標準的な手順である。

病原体誘導性遺伝子発現および耐病性植物の生成のためのＤＭＲ６プロモーターの使用
導入遺伝子発現の正確な制御は、耐病性の増加した植物の操作に極めて重要である。従来、導入遺伝子の恒常的な過剰発現はしばしば低品質の植物をもたらしてきた。そのため、導入遺伝子が感染部位で必要とされる場合および場所にのみ発現する、病原体誘導性プロモーターの使用が提案されてきた。

操作された遺伝子（例えば、マスタースイッチ遺伝子、エリシターまたはＡｖｒ遺伝子、抗菌性遺伝子、または毒性遺伝子）の局所性かつ誘導性の発現は、例えばＧｕｒｒおよびＲｕｓｈｔｏｎ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：２７５−２８２，２００５）に記載されるような、病原体抵抗性を導く、防御力の活性化または細胞死をもたらす。良い例が、Ｄｅ ｗｉｔ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．３０：３９１−４１８，１９９２）により提供され、耐病性をもたらす誘導された細胞死を達成するためにＡｖｒ９−Ｃｆ９の組合せの使用が提案される。発現の組織特異性および誘導能は、ＧｕｒｒおよびＲｕｓｈｔｏｎ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：２８３−２９０，２００５）に記載されるように、かかるアプローチに対して最も重要である。

本発明によれば、ＤＭＲ６プロモーターは、プロモーター−ＧＵＳ解析に基づいて、強力かつ誘導性の局所発現を示すことが実証されている。従って、ＤＭＲ６プロモーターは、トランスジェニック植物において耐病性を操作することに非常に適している。ＤＭＲ６プロモーターは、シロイヌナズナＤＭＲ６コード配列（ＡＴＧ開始コドン）の上流の２．５ｋｂの領域からなり、５’ＵＴＲを含む（図１１に表される通り）。次に、この病原体誘導性プロモーターを使用して、当業者に公知の標準的な技法を用いて、適した導入遺伝子構築物を操作する。

所与の植物種由来のオーソロガスＤＮＡ配列を用いて、ＰＣＲのためのプライマーを設計する。次に、これらを用いて目的の植物種のゲノムライブラリーをスクリーニングして、ＤＭＲ６オーソログをそのプロモーターおよび調節配列とともに含むゲノムクローンを同定する。あるいは、ＤＭＲ６オーソロガス遺伝子に対応する標識ＰＣＲ断片でライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムクローンを単離する。配列決定により、プロモーターのヌクレオチド配列が明らかになる。ＤＭＲ６オーソロガスコード配列（ＡＴＧ開始コドン）の２〜５ｋｂ上流の（すなわち５’ＵＴＲを含む）領域を、次にＰＣＲにより増幅して、植物形質転換のための導入遺伝子構築物を操作する。

この実施例は、４つの異なる作物種由来のＤＭＲ６オーソログによる、シロイヌナズナにおける変異株ｄｍｒ６−１の相補性を実証する。これに関して、キュウリ（Ｃｓ）、ホウレンソウ（Ｓｏ）、レタス（Ｌｓ）およびトマト（Ｓｌ）のＤＭＲ６オーソログを、３５Ｓプロモーターの制御下で植物発現ベクターにクローニングし、その後、このベクターをシロイヌナズナ変異株ｄｍｒ６−１に形質転換した。

端的には、標準的な方法を用いてｍＲＮＡを単離し、オリゴｄＴプライマーおよび標準法を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、下の表３に示されるように、各々の作物に対するプライマー対を用いてＰＣＲ断片を生成した。生成されたＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットを用いてｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、得られる正確なインサートサイズ（ＰＣＲにより決定される）のプラスミドを、ＤＮＡ配列決定により解析した。ｐＢ７ＷＧ２，０ベクターへの組換えを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＬＲクロナーゼＩＩを用いて行い、得られるプラスミドをＰＣＲおよび制限酵素での消化により解析した。適したプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８Ｃ１ ＰＧＶ２２６０に形質転換し、アグロバクテリウム由来のプラスミドをＰＣＲおよび制限酵素での消化により解析した。

シロイヌナズナｄｍｒ６−１植物を、上記構築物を用いてアグロバクテリウム溶液に浸漬することにより形質転換し、シロイヌナズナＴ１植物の作物ＤＭＲ６の過剰発現を、作物ＤＭＲ６クローニングプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより検証する（表３）。最後に、シロイヌナズナＴ２およびＴ３植物をアブラナべと病菌Ｃａｌａ２に感染させて補完性を確認した。結果を図１４に示す。

図１４に示されるように、試験した全てのＤＭＲ６オーソログは、シロイヌナズナ変異株ｄｍｒ６−１を補完することができ、同定されたＤＭＲ６オーソログがシロイヌナズナＤＭＲ６と同様の機能性をもつＤＭＲ６タンパク質をコードすることが示された。

表
表１には、シロイヌナズナＤＭＲ６ｍＲＮＡおよびその他の植物種由来のオーソロガス配列の発現配列ＴＡＧ（ＥＳＴ）およびｍＲＮＡまたはタンパク質配列についてのＧＩ番号（ＧｅｎＩｎｆｏ識別子）およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号が記載される。ＧＩ番号（ＧｅｎＩｎｆｏ識別子、小文字で「ｇｉ」と書かれることもある）は、特定の配列を同定する一意の整数である。ＧＩ番号は、ＮＣＢＩにより処理される各々の配列記録に対して連続的に割り当てられる一連の数字である。従って、ＧＩ番号は配列が変わるたびに変化する。ＮＣＢＩは、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋからのヌクレオチド配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲおよび多くのその他からのタンパク質配列をはじめ、Ｅｎｔｒｅｚに処理される全ての配列にＧＩ番号を割り当てる。従って、ＧＩ番号は、正確な配列を指定するデータベース源とは無関係の、一意の配列識別子を提供する。たった１つの塩基対であってもＧｅｎＢａｎｋ中の配列が変更されれば、更新された配列に新しいＧＩ番号が割り当てられる。受託番号は同じままである。ＧＩ番号は常に不変であり、かつ検索可能である（ｒｅｔｒｉｅｖａｂｌｅ）。従って、表中のＧＩ番号を参照すると、対応する配列の明白かつ一義的な照合一致（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が得られる。

Claims (5)

1. 病原体に対して抵抗性である植物であって、前記植物と前記病原体が、レタスにおけるレタスべと病菌、ホウレンソウにおけるホウレンソウべと病菌、キュウリまたはメロンにおけるキュウリべと病菌、タマネギにおけるタマネギべと病菌、キャベツにおけるアブラナべと病菌、ブドウにおけるブドウべと病菌、トマトまたはジャガイモにおける疫病菌、および、ダイズにおけるダイズ茎疫病菌から選択され、
   前記植物がＤｏｗｎｙ Ｍｉｄｅｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ６（ＤＭＲ６）遺伝子に人為的に導入された変異を有し、その結果、かかる変異が存在しない野生型ＤＭＲ６遺伝子にコードされるＤＭＲ６タンパク質と比較して、酵素活性の低下したＤＭＲ６タンパク質がもたらされる、または、
   ＤＭＲ６遺伝子に変異を有し、その結果、かかる変異が存在しない野生型ＤＭＲ６遺伝子と比較して、ＤＭＲ６発現の低下がもたらされる、
   植物。
2. 前記植物がＤＭＲ６遺伝子に人為的に導入された変異を有し、その結果、かかる変異が存在しない野生型ＤＭＲ６遺伝子にコードされるＤＭＲ６タンパク質と比較して、酵素活性の低下したＤＭＲ６タンパク質がもたらされ、このとき、前記ＤＭＲ６遺伝子中の変異は、前記コードされるタンパク質においてアミノ酸置換を引き起こす、請求項１に記載の植物。
3. Ｄｏｗｎｙ Ｍｉｄｅｗ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ６（ＤＭＲ６）遺伝子の変異により前記植物のＤＭＲ６タンパク質の内在レベルを低下させるステップを含む、病原体に抵抗性である植物を得るための方法であって、前記植物と前記病原体が、レタスにおけるレタスべと病菌、ホウレンソウにおけるホウレンソウべと病菌、キュウリまたはメロンにおけるキュウリべと病菌、タマネギにおけるタマネギべと病菌、キャベツにおけるアブラナべと病菌、ブドウにおけるブドウべと病菌、トマトまたはジャガイモにおける疫病菌、および、ダイズにおけるダイズ茎疫病菌から選択される、方法。
4. 前記変異が、変異誘発物質または放射線を用いた前記植物の変異を誘発する処理によりもたらされる、請求項３に記載の方法。
5. 前記植物のＤＭＲ６タンパク質の内在レベルを低下させるステップが、遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉにより前記植物のＤＭＲ６遺伝子の発現を低下させることにより達成される、請求項３に記載の方法。

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