BR112018001306B1 - Molécula de ácido nucleico, método para a detecção da presença do dna de um evento de soja transgênico dbn9004, kit de detecção de dna, célula ou parte de planta, método para a produção ou cultivo de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, método para a proteção de uma planta contra o dano causado por um herbicida e/ou controle de ervas daninhas em um campo, método para o retardo da resistência a inseto e produto agrícola ou commodity - Google Patents

Molécula de ácido nucleico, método para a detecção da presença do dna de um evento de soja transgênico dbn9004, kit de detecção de dna, célula ou parte de planta, método para a produção ou cultivo de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, método para a proteção de uma planta contra o dano causado por um herbicida e/ou controle de ervas daninhas em um campo, método para o retardo da resistência a inseto e produto agrícola ou commodity Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico para a detecção da existência de um evento de soja transgênico dbn9004 em uma amostra biológica, um kit contendo a mesma e um método de detecção do mesmo.

Description

Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico para a detecção de uma planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta, em particular a uma planta de soja DBN9004 tolerante a glifosato e glufosinato e um método para a detecção de se uma molécula de DNA do evento de soja transgênico particular DBN9004 está contida em uma amostra biológica.
Antecedentes da Invenção
[0002] N-fosfonometilglicina, também conhecida como glifosato, é um herbicida não seletivo de amplo espectro crônico translocado sistemicamente. Glifosato é um inibidor competitivo de ácido fosfoenolpirúvico (PEP), um substrato de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) em síntese e pode inibir a conversão dos dois substratos PEP e 3-fosfochiquimato em 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfochiquimato catalisado por EPSPS, dessa forma, bloqueando o caminho sintético de ácido chiquímico, um precursor de síntese de aminoácido aromático e causando a morte de plantas e bactérias devido à interferência da síntese de proteínas.
[0003] A tolerância ao glifosato pode ser alcançada pela expressão da EPSPS modificada. A EPSPS modificada tem uma menor afinidade com glifosato e, portanto, na presença de glifosato, EPSPS mantém sua atividade catalítica, isto é, obtendo tolerância ao glifosato.
[0004] A soja (Glycine max) é uma das cinco culturas principais do mundo. A tolerância a herbicida, particularmente a tolerância a um herbicida glifosato, é um traço agronômico importante em produção de soja. A tolerância da soja a um herbicida glifosato pode ser obtida por métodos transgênicos para a expressão de genes tolerantes a herbicida glifosato (EPSPS, CP4) em plantas de soja tais como evento de soja GTS40-3-2 e evento de soja MON89788.
[0005] Nos últimos anos, a adoção difundida de sistemas de cultivo tolerantes a glifosato e o uso crescente de glifosato levaram à prevalência de ervas daninhas resistentes a glifosato. Em áreas onde os plantadores encontram ervas daninhas resistentes a glifosato ou ervas daninhas que se transformam em espécies de erva daninha mais difíceis de controlar, os plantadores podem compensar a fraqueza do glifosato pela mistura ou alternância com outros herbicidas capazes de controlar as ervas daninhas que faltam.
[0006] O glufosinato é um herbicida não sistemático e não seletivo em herbicidas de fosfinotricina. Ele é usado principalmente para o controle pós- emergência de ervas daninhas de folhas largas anuais ou perenes e o controle de ervas daninhas é realizado através da inibição reversível de L-fosfonomicina (um ingrediente ativo em glufosinato) em glutamina sintase (uma enzima essencial para a desintoxicação de amônia em plantas). Diferente de glifosato que pode matar as raízes das plantas, glufosinato pode matar as folhas primeiro e translocar no xilema de plantas pela transpiração e sua propriedade de ação rápida está entre paraquat e glifosato.
[0007] L-fosfinotricina é convertida em sua forma inativa através de acetilação catalisada por fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) isolada de Streptomyces. Os genes que expressam formas otimizadas de plantas de PAT foram usados em sojas para conferir tolerância a um herbicida glufosinato para sojas tais como evento de soja A5547-127. Assim, o uso de herbicidas glufosinato em combinação com traços tolerantes a glufosinato pode servir como um meio não seletivo para o gerenciamento eficaz de ervas daninhas resistentes a glifosato.
[0008] No futuro, com a popularização de sojas transgênicas resistentes a inseto e seu plantio em grande escala, um pequeno número de insetos/pragas que sobreviveram podem produzir resistência após várias gerações de propagação. O coplantio de sojas transgênicas tolerantes a herbicida como sojas transgênicas não resistentes a inseto com sojas transgênicas resistentes a inseto em uma proporção pode retardar a indução de resistência a inseto/praga.
[0009] Sabe-se que a expressão de genes exógenos em plantas é afetada por seu local cromossômico, que é possivelmente devido à proximidade das estruturas de cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou elementos reguladores transcricionais (por exemplo, intensificadores) ao local de integração. Com este fim, é frequentemente necessário triar um grande número de eventos antes de ser possível identificar eventos que possam ser comercializados (isto é, eventos onde os genes alvo introduzidos possam ser expressos idealmente). Por exemplo, foi observado nas plantas e outros organismos que possam haver grande diferença nas quantidades de expressão dos genes introduzidos entre eventos; também pode haver diferença em padrões espaciais ou temporais de expressão, tais como diferença na expressão relativa de transgenes dentre diferentes tecidos de planta, tal diferença sendo manifestada pelo fato de que o padrão de expressão atual pode ser inconsistente com o padrão de expressão esperado de acordo com os elementos reguladores transcricionais nos construtos de gene introduzidos. Assim, é geralmente necessário gerar centenas de eventos diferentes e examinar um evento único com quantidades de expressão de transgene e padrões de expressão que são destinados para a comercialização destes eventos. Os eventos com quantidades de expressão e padrões de expressão de transgene esperados podem ser usados para introduzir transgenes em outros históricos genéticos por meio de hibridização heterotípica sexual usando métodos de reprodução convencionais. As descendências produzidas por esta abordagem de hibridização retêm as características de expressão de transgene dos transformantes originais. A aplicação deste padrão de estratégia pode assegurar expressão de gene confiável em muitas variedades e estas variedades podem ser bem adaptadas às condições de crescimento do local.
[0010] Será benéfico que a presença de um evento particular possa ser detectada para determinar se as descendências da hibridização sexual contêm os genes alvo. Em adição, os métodos para a detecção de eventos específicos também ajudarão a cumprir os regulamentos relevantes, por exemplo, a aprovação formal e o rotulamento de alimentos derivados de culturas recombinantes seriam exigidos antes de eles serem colocados no mercado. É possível detectar a presença de transgenes por qualquer método de detecção de polinucleotídeo bem-conhecido, por exemplo, reações de cadeia de polimerase (PCRs) ou hibridização de DNA usando uma sonda de polinucleotídeo. Estes métodos de detecção focam geralmente nos elementos genéticos comuns tais como promotores, terminadores e genes marcadores. Assim, a menos que a sequência de DNA cromossômico (“DNA de flanqueamento”) adjacente ao DNA transgênico inserido seja conhecida, tais métodos acima não seriam capazes de diferenciar eventos diferentes, particularmente aqueles gerados com o mesmo construto de DNA. Portanto, um par de iniciadores que abrangem o local de conjugação do transgene inserido e o DNA de flanqueamento, em particular, um primeiro iniciador contendo a sequência de flanqueamento e um segundo iniciador contendo a sequência inserida são frequentemente usados para identificar eventos transgênicos específicos por PCR atualmente.
Sumário da Invenção
[0011] O objetivo da presente invenção é prover uma sequência de ácido nucleico para a detecção de uma planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta, o evento de soja transgênico DBN9004 tem melhor tolerância a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato e o método de detecção pode identificar rápida e precisamente se uma molécula de DNA do evento de soja transgênico específico DBN9004 estiver contida em uma amostra biológica.
[0012] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção provê uma molécula de ácido nucleico tendo a seguinte sequência de ácido nucleico, a sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar.
[0013] Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar.
[0014] Adicionalmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar.
[0015] Ainda adicionalmente, a sequência de ácido nucleico compreende SEQ ID No: 5 ou sua sequência complementar.
[0016] A SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar é uma sequência com um comprimento de 22 nucleotídeos localizados na posição 5’-terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004 e a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar abrange a sequência de DNA genômico de flanqueamento do local de inserção de soja e a sequência de DNA na posição 5’-terminal da sequência inserida; assim, a inclusão da SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar pode ser identificada como a presença de evento de soja transgênico DBN9004. A SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar é uma sequência com um comprimento de 22 nucleotídeos localizada na posição 3’-terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004 e a SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar abrange a sequência de DNA na posição 3’-terminal da sequência inserida e a sequência de DNA genômico de flanqueamento do local de inserção de soja; assim a inclusão da SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar pode ser identificada como a presença de evento de soja transgênico DBN9004.
[0017] Na presente invenção, a sequência de ácido nucleico pode ser pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos (uma primeira sequência de ácido nucleico) de qualquer parte da sequência transgênica inserida na SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar, ou pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos (uma segunda sequência de ácido nucleico) de qualquer parte da região de DNA genômico de soja de flanqueamento 5’ na SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar. A sequência de ácido nucleico pode ser adicionalmente uma parte homóloga a ou complementar a SEQ ID No: 3 compreendendo a SEQ ID No: 1 intacta. Quando a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico são usadas juntas, estas sequências de ácido nucleico como um par de iniciadores de DNA podem ser usadas no método de amplificação de DNA para a produção de um produto de amplificação. A presença do evento de soja transgênico DBN9004 ou suas descendências pode ser diagnosticada quando o produto de amplificação produzido no método de amplificação de DNA usando o par de iniciadores de DNA é um produto de amplificação compreendendo SEQ ID No: 1. É bem- conhecido pelo técnico no assunto que não é necessário que as primeira e segunda sequências de ácido nucleico consistam somente em DNA, mas também podem compreender RNA, uma mistura de DNA e RNA, ou uma combinação de DNA, RNA, ou outros nucleotídeos ou análogos deste que não são como modelos de uma ou mais polimerases. Adicionalmente, as sondas ou iniciadores descritos na presente invenção devem ser pelo menos cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 nucleotídeos consecutivos em comprimento, que podem ser selecionados de nucleotídeos mostrados como SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5. Quando selecionados dos nucleotídeos mostrados como SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5, as sondas e iniciadores podem ser nucleotídeos consecutivos tendo um comprimento de pelo menos cerca de 21 a cerca de 50 ou mais. A SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar é uma sequência com um comprimento de 1207 nucleotídeos localizada na posição 5’-terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004 e a SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar consiste na sequência de soja de DNA genômico de flanqueamento de 740 nucleotídeos (nucleotídeos 1-740 da SEQ ID No: 3), 74 nucleotídeos na sequência de DNA do construto pDBN4003 (nucleotídeos 741814 de SEQ ID No: 3), sequência terminadora t35S de 195 nucleotídeos (nucleotídeos 815-1009 de SEQ ID No: 3), uma sequência espaçadora de vetor de 21 nucleotídeos (nucleotídeos 1010-1030 de SEQ ID No: 3) e a sequência de DNA na a posição 5’-terminal de fosfinotricina N-acetiltransferase cPAT de 177 nucleotídeos (nucleotídeos 1031-1207 de SEQ ID No: 3) (nucleotídeos 8151207 de SEQ ID No: 3); assim a inclusão da SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar pode ser identificada como a presença de evento de soja transgênico DBN9004.
[0018] A sequência de ácido nucleico pode ser pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos (uma terceira sequência de ácido nucleico) de qualquer parte da sequência transgênica inserida na SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar, ou pelo menos 11 ou mais polinucleotídeos consecutivos (uma quarta sequência de ácido nucleico) de qualquer parte da região de DNA genômico de soja de flanqueamento 3’ na SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar. A sequência de ácido nucleico pode ser adicionalmente uma parte homóloga a ou complementar a SEQ ID No: 4 compreendendo a SEQ ID No: 2 intacta. Quando a terceira sequência de ácido nucleico e a quarta sequência de ácido nucleico são usadas juntas, estas sequências de ácido nucleico como um par de iniciadores de DNA podem ser usadas no método de amplificação de DNA para a produção de um produto de amplificação. A presença do evento de soja transgênico DBN9004 ou suas descendências pode ser diagnosticada quando o produto de amplificação produzido no método de amplificação de DNA usando o par de iniciadores de DNA é um produto de amplificação compreendendo SEQ ID No: 2. A SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar é uma sequência com um comprimento de 631 nucleotídeos localizada na posição 3’-terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004 e a SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar consiste na sequência promotora prGm17gTsf1 de 226 nucleotídeos (nucleotídeos 1-226 de SEQ ID No: 4), 61 nucleotídeos na sequência de DNA do construto pDBN4003 (nucleotídeos 227-287 de SEQ ID No: 4), uma sequência de conjugação de 6 nucleotídeos (nucleotídeos 288-293 de SEQ ID No: 4) e a sequência de soja de DNA genômico de flanqueamento de 338 nucleotídeos (nucleotídeos 294-631 de SEQ ID No: 4); assim a inclusão da SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar pode ser identificada como a presença de evento de soja transgênico DBN9004.
[0019] A SEQ ID No: 5 ou sua sequência complementar é uma sequência de 7059 nucleotídeos em comprimento que caracteriza o evento de soja transgênico DBN9004, os genomas e elementos genéticos contidos especificamente, os quais são como mostrados na Tabela 1. A inclusão da SEQ ID No: 5 ou sua sequência complementar pode ser identificada como a presença de evento de soja transgênico DBN9004. Tabela 1. Genomas e elementos genéticos contidos em SEQ ID No: 5
[0020] As sequências de ácido nucleico ou suas sequências complementares podem ser usadas no método de amplificação de DNA para produzir amplicons, a detecção dos amplicons diagnostica a presença do evento de soja transgênico DBN9004 ou descendências deste em uma amostra biológica; e as sequências de ácido nucleico ou suas sequências complementares podem ser usadas nos métodos de detecção de nucleotídeo para detectar a presença do evento de soja transgênico DBN9004 ou descendências deste em uma amostra biológica.
[0021] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a detecção da presença do DNA de evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, compreendendo:
[0022] - O contato de uma amostra a ser detectada com pelo menos dois tipos de iniciadores para a amplificação de um produto de amplificação de alvo em uma reação de amplificação de ácido nucleico;
[0023] - A realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico e;
[0024] - A detecção da presença do produto de amplificação de alvo;
[0025] O produto de amplificação de alvo compreende pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar.
[0026] Adicionalmente, o produto de amplificação de alvo compreende nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar.
[0027] Ainda adicionalmente, o produto de amplificação de alvo compreende pelo menos um selecionado de: SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar.
[0028] Nas soluções técnicas mencionadas acima, pelo menos um dos iniciadores compreende a sequência de ácido nucleico ou um fragmento desta ou uma sequência complementar a ela.
[0029] Especificamente, os iniciadores compreendem um primeiro iniciador e um segundo iniciador, em que o primeiro iniciador é selecionado de SEQ ID No: 8 e SEQ ID No: 10; e o segundo iniciador é selecionado de SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 11.
[0030] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a detecção da presença do DNA de evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, compreendendo:
[0031] - O contato de uma amostra a ser detectada com uma sonda, a sonda compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar;
[0032] - A hibridização da amostra a ser detectada com a sonda sob condições de hibridização rigorosas; e
[0033] - A detecção do status de hibridização entre a amostra a ser detectada e a sonda.
[0034] As condições rigorosas podem realizar a hibridização em uma solução de 6 x SSC (citrato de sódio) e 0,5% de SDS (lauril sulfato de sódio) a 65 °C, a seguir lavagem da membrana uma vez com 2 x SSC, 0,1% de SDS e 1 x SSC, 0,1% de SDS, respectivamente.
[0035] Adicionalmente, a sonda compreende nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar.
[0036] Ainda adicionalmente, a sonda compreende pelo menos um selecionado de: SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar.
[0037] Opcionalmente, pelo menos uma das sondas é rotulada com pelo menos um fluoróforo.
[0038] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a detecção da presença do DNA de evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, compreendendo: - O contato da amostra a ser detectada com uma molécula de ácido nucleico marcador, a molécula de ácido nucleico marcador compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos em SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar; - A hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcador sob condições de hibridização rigorosas; e - A detecção do status de hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcador e adicionalmente determinação da ligação de gene entre a tolerância a glifosato e/ou tolerância a glufosinato e a molécula de ácido nucleico marcador em genética pela análise de reprodução assistida por marcadores.
[0039] Adicionalmente, a molécula de ácido nucleico marcador compreende nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar.
[0040] Ainda adicionalmente, a molécula de ácido nucleico marcador compreende pelo menos um selecionado de: SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar.
[0041] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um kit de detecção de DNA, compreendendo pelo menos uma molécula de DNA, em que a molécula de DNA compreende pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos de uma sequência homóloga de SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar e/ou pelo menos 11 nucleotídeos consecutivos de uma sequência homóloga de SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar e pode servir como um iniciador de DNA ou uma sonda específica para o evento de soja transgênico DBN9004 ou suas descendências.
[0042] Adicionalmente, a molécula de DNA compreende nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou nucleotídeos consecutivos nas posições 1-11 ou posições 12-22 em SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar.
[0043] Ainda adicionalmente, a molécula de DNA compreende pelo menos um selecionado de: uma sequência homóloga de SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, uma sequência homóloga de SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, uma sequência homóloga de SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e uma sequência homóloga de SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar.
[0044] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê uma célula ou parte de planta, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína EPSPS tolerante a glifosato, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína PAT tolerante a glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica. A sequência de ácido nucleico da região específica compreende pelo menos um selecionado das: sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7.
[0045] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a produção de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, compreendendo introdução no genoma da planta de soja de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína EPSPS tolerante a glifosato e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína PAT tolerante a glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica selecionada de pelo menos uma sequência de ácido nucleico das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7.
[0046] Especificamente, o método para a produção de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato compreende: - A hibridização sexual de uma primeira planta de soja de origem do evento de soja transgênico DBN9004 que é tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato com uma segunda planta de soja de origem que carece de tolerância a glifosato e/ou glufosinato para produzir um grande número de plantas descendentes; - O tratamento das plantas descendentes com um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato; e - A seleção das plantas descendentes que são tolerantes a glifosato e/ou glufosinato.
[0047] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o cultivo de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, compreendendo: - Um plantio de pelo menos uma semente de soja, o genoma da semente de soja compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína EPSPS tolerante a glifosato e/ou uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína PAT tolerante a glufosinato e uma sequência de ácido nucleico de uma região específica; - O desenvolvimento da semente de soja em uma planta de soja; e - A pulverização da planta de soja com uma dose eficaz de um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato e colheita da planta com dano reduzido à planta comparado a outras plantas sem a sequência de ácido nucleico da região específica; - A sequência de ácido nucleico da região específica é selecionada de pelo menos uma sequência de ácido nucleico das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7.
[0048] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para a proteção de uma planta contra o dano causado por um herbicida, compreendendo aplicação de um herbicida contendo uma dose eficaz de glifosato e/ou glufosinato a um campo para o plantio de pelo menos uma planta de soja transgênica, em que a planta de soja transgênica compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 em seu genoma e a planta de soja transgênica tem tolerância ao herbicida glifosato e/ou ao herbicida glufosinato.
[0049] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o controle de ervas daninhas do campo, compreendendo a aplicação de um herbicida contendo uma dose eficaz de glifosato e/ou glufosinato a um campo para o plantio de pelo menos uma planta de soja transgênica, em que a planta de soja transgênica compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionado das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 em seu genoma e a planta de soja transgênica tem tolerância ao herbicida glifosato e/ou ao herbicida glufosinato.
[0050] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o controle de ervas daninhas resistentes a glifosato em um campo para uma planta tolerante a glifosato, compreendendo a aplicação de um herbicida contendo uma dose eficaz de glufosinato a um campo para o plantio de pelo menos uma planta de soja transgênica tolerante a glifosato, em que a planta de soja transgênica tolerante a glifosato compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionado das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 em seu genoma e a planta de soja transgênica tolerante a glifosato tem tolerância ao herbicida glufosinato ao mesmo tempo.
[0051] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um método para o retardo da resistência a inseto, compreendendo o desenvolvimento de pelo menos uma planta de soja transgênica tendo tolerância a glifosato e/ou glufosinato em um campo para o plantio de uma planta de soja resistente a inseto, em que a planta de soja transgênica tendo tolerância a glifosato e/ou glufosinato compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionado das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 em seu genoma.
[0052] A fim de alcançar o objetivo acima, a presente invenção também provê um produto agrícola ou commodity compreendendo um polinucleotídeo de SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2, o produto agrícola ou commodity é lecitina, um ácido graxo, glicerol, um esterol, um floco de soja, farinha de soja, uma proteína de soja ou seu concentrado, um óleo de soja, uma proteína de fibra de soja, um coágulo de leite de soja ou coalhada de feijão.
[0053] Na sequência de ácido nucleico para a detecção da planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta na presente invenção, as seguintes definições e métodos podem definir melhor a presente invenção e orientar um técnico no assunto a praticar a presente invenção e, a menos que especificado o contrário, os termos aqui são compreendidos de acordo com usos convencionais por um técnico no assunto.
[0054] O termo “soja” se refere a Glycine max e compreende todas as espécies de plantas que podem cruzar com as espécies de soja, incluindo de soja selvagem.
[0055] O termo “compreendem” ou “incluem” se referem a “incluindo, mas não limitado a”.
[0056] O termo “planta” inclui uma planta inteira, uma célula da planta, um órgão da planta, um protoplasto da planta, uma cultura de tecido da célula da planta da qual uma planta pode ser regenerada, um calo de planta, um grupo de plantas e uma célula da planta intacta em uma planta ou parte da planta tal como um embrião, um pólen, um óvulo, uma semente, uma folha, uma flor, um ramo, uma fruta, uma haste, uma raiz, uma ponta da raiz e uma antera. Deve- se entender que uma parte de uma planta transgênica dentro do escopo da presente invenção inclui, mas não limitado a, uma célula da planta, um protoplasto, um tecido, um calo, um embrião e uma flor, um caule, uma fruta, uma folha e uma raiz e as partes de acima da planta que são derivados das plantas transgênicas que são transformadas antecipadamente com a molécula de DNA da presente invenção e assim pelo menos compostas parcialmente das células transgênicas ou suas descendências.
[0057] O termo “gene” se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína particular, incluindo uma sequência reguladora (sequência 5’ não codificadora) antes da sequência codificadora e uma sequência reguladora (sequência 3’ não codificadora) após a sequência codificadora.. O termo “gene natural” se refere a um gene que se verifica ter naturalmente suas próprias sequências reguladoras. O termo “gene quimérico” se refere a qualquer gene que não seja um gene natural, que contém sequências reguladoras e codificantes de ocorrência não natural. O termo “gene endógeno” se refere a um gene natural que está localizado em sua posição natural no genoma de um organismo. O termo “gene exógeno” se refere a um gene estranho que está agora presente no genoma de um organismo. Mas não está originalmente presente e também se refere a um gene que é introduzido em uma célula receptora através de etapas transgênicas. O gene exógeno pode compreender um gene natural ou um gene quimérico inserido em um organismo não natural. O termo “transgene” se refere a um gene que foi introduzido em um genoma através de um procedimento de transformação. O local no qual o DNA recombinante foi inserido no genoma da planta pode ser referido como um “local de inserção” ou “local alvo”.
[0058] O termo “DNA de flanqueamento” pode compreender um genoma que existe naturalmente em, por exemplo, um organismo de planta ou um DNA exógeno (heterólogo) introduzido através de um processo de transformação, tal como um fragmento associado com um evento de transformação. Assim, o DNA de flanqueamento pode incluir uma combinação de DNAs naturais e exógenos. Na presente invenção, a “região de flanqueamento” ou “sequência de flanqueamento” ou “região genômica limítrofe” ou “sequência genômica limítrofe” se refere a uma sequência de pelo menos 3, 5, 10, 11, 15, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500, ou 5000 pares de base ou uma sequência mais longa, que se localiza no sentido a montante ou a jusante da molécula de DNA inserida incialmente de modo exógeno e adjacente à molécula de DNA inserida incialmente de modo exógeno. Quando a região de flanqueamento se localiza a jusante, também pode ser referido como “flanco limítrofe esquerdo” ou “flanco 3’” ou “região limítrofe do genoma 3’” ou “sequência limítrofe do genoma 3’” e os similares. Quando a região de flanqueamento se localiza a montante, também pode ser referido como “flanco limítrofe direito” ou “flanco 5’” ou “região limítrofe do genoma 5’” ou “sequência limítrofe do genoma 5’” e os similares.
[0059] O procedimento de transformação que causa uma integração randômica de DNA exógeno resultará em transformantes contendo regiões de flanqueamento diferentes que são especificamente contidas em cada transformante. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta por hibridização convencional, sua região de flanqueamento geralmente não será alterada. Os transformantes também conterão conjugação única entre DNA heterogêneo inserido e um segmento de DNA genômico ou entre dois segmentos de DNAs genômicos ou entre dois segmentos de DNAs heterogêneos. “Conjugação” é o ponto no qual dois fragmentos de DNA específicos são ligados. Por exemplo, a conjugação existe na posição onde o DNA inserido é ligado ao DNA de flanqueamento. Os pontos de conjugação também estão presentes nos organismos transformados, nos quais os dois fragmentos de DNA são ligados juntos de uma maneira que é encontrada em organismos naturais modificados. “DNA de conjugação” ou “região de conjugação” se refere a um DNA contendo um ponto de conjugação.
[0060] A presente invenção provê um evento de soja transgênico denominado DBN9004 e descendências deste, o evento de soja transgênico DBN9004 é uma planta de soja DBN9004 que compreende plantas e sementes do evento de soja transgênico DBN9004 e células de planta ou partes regeneráveis destas. As partes de planta do evento de soja transgênico DBN9004 incluem, mas não são limitados a, células, pólens, óvulos, flores, brotos, raízes, caules, folhas, vagens e produtos derivados da planta de soja DBN9004 tais como tortas, pós e óleos de soja, especificamente, lecitina, ácido graxos, glicerol, esteróis, óleos comestíveis, flocos de soja desengordurados, farinhas de soja desengorduradas e cozidas, coágulos de leite de soja, coalhada de feijão, concentrados de proteína de soja, proteínas de soja isoladas, proteínas vegetais hidrolisadas, proteínas de soja organizadas e fibras de proteína de soja.
[0061] O evento de soja transgênico DBN9004 da presente invenção compreende um construto de DNA, o evento de soja transgênico DBN9004 adquire a tolerância a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato quando o construto de DNA é expresso em células de planta. O construto de DNA compreende dois cassetes de expressão em tandem, em que o primeiro cassete de expressão compreende um promotor adequado e uma sequência sinal de poliadenilação adequada para a expressão em uma planta, o promotor pode ser ligado operavelmente a um gene que codifica 5-enolpiruvilchiquimato- 3-fosfato sintase (EPSPS) e a EPSPS é tolerante a um herbicida glifosato. O segundo cassete de expressão compreende um promotor adequado e uma sequência sinal de poliadenilação adequada para a expressão em uma planta, o promotor pode ser ligado operavelmente a um gene que codifica fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) e a sequência de ácido nucleico da proteína PAT é tolerante a um herbicida glufosinato. Adicionalmente, o promotor pode ser um promotor adequado isolado de uma planta, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e/ou específicos de tecido e o promotor adequado inclui, mas não limitado a, promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, promotor do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) 35S, promotor de Tsf1, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, promotor de octopina sintase (OCS), promotor do vírus do caracol da folha amarela Cestrum, promotor da patatina, promotor de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO), promotor de glutationa S-transferase (GST), promotor de E9, promotor de GOS, promotor de alcA/alcR, promotor de Agrobacterium rhizogenes RolD e promotor de Arabidopsis Suc2. A sequência sinal de poliadenilação pode ser uma sequência sinal de poliadenilação adequada que funciona em plantas e a sequência sinal de poliadenilação adequada inclui, mas não lmitado a, a sequência sinal de poliadenilação derivada do gene de nopalina sintase (NOS) Agrobacterium tumefaciens, as sequências sinal de poliadenilação derivadas do terminador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S e derivadas do terminador da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase / oxigenase E9 da ervilha, a sequência sinal de poliadenilação derivada do gene inibidor de protease II (PINII) e a sequência sinal de poliadenilação derivada do gene α-tubulina.
[0062] Em adição, o cassete de expressão também pode incluir outros elementos genéticos incluindo, mas não limitados a, intensificadores e peptídeos sinal/peptídeos de trânsito. O intensificador pode intensificar o nível de expressão do gene e o intensificador inclui, mas não limitado a, o fator de ativação de translação do vírus da gravura do tabaco (TEV), intensificador de CaMV35S e intensificador de FMV35S. O peptídeo sinal/peptídeo de trânsito pode direcionar a proteína EPSPS e/ou a proteína PAT a ser transportada para uma organela específica ou compartimento específico extracelular ou intracelular, por exemplo, o cloroplasto é direcionado usando uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto ou o retículo endoplasmático é direcionado usando a sequência de retenção ‘KDEL’.
[0063] O gene 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) pode ser isolado da cepa de Agrobacterium tumefaciens CP4 e os polinucleotídeos que codificam EPSPS podem ser alterados pela otimização dos códons ou através de outras maneiras para alcançar o propósito de aumento da estabilidade e disponibilidade de transcritos nas células transformadas. O gene de 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) também pode ser usado como um gene marcador selecionável.
[0064] O “glifosato” se refere à N-fosfonometilglicina e sais desta. O tratamento com um “herbicida glifosato” se refere à realização do tratamento usando qualquer preparação de herbicida contendo glifosato. A escolha da taxa de uso de uma certa preparação de glifosato a fim de alcançar uma dose biológica eficaz não excederá as habilidades de um técnico agronômico. O tratamento de um campo incluindo materiais vegetais derivados da planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 usando qualquer preparação de herbicida contendo glifosato controlará o crescimento de ervas daninhas no campo e não afetará o crescimento ou rendimento dos materiais vegetais derivados da planta de soja tolerante a herbicida DBN9004.
[0065] O gene de fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) isolado de Streptomyces viridochromogenes catalisa a conversão de L-fosfinotricina em sua forma inativa por acetilação para conferir tolerância da planta ao herbicida glufosinato. A fosfinotricina (PTC, ácido 2-amino-4-metilfosfonobutírico) é um inibidor de glutamina sintetase. PTC é uma unidade estrutural de antibiótico 2- amino-4-metilfosfono-alanil-alanina, este tripeptídeo (PTT) tem atividades contra bactérias e fungos Gram-positivos e Gram-negativos, Botrytis cinerea. O gene de fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) também pode servir como um gene marcador selecionável.
[0066] O “glufosinato” (também conhecido como fosfinotricina) se refere a 2-amino-4-[hidroxi(metil)fosfonil]butirato de amônio. O tratamento com um “herbicida glufosinato” se refere à realização do tratamento usando qualquer preparação do herbicida contendo glufosinato. A escolha da taxa de uso de uma certa preparação de glufosinato a fim de alcançar uma dose biológica eficaz não excederá as habilidades de um técnico agronômico comum. O tratamento de um campo incluindo materiais vegetais derivados da planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 usando qualquer preparação do herbicida contendo glufosinato controlará o crescimento de ervas daninhas no campo e não afetará o crescimento ou rendimento dos materiais vegetais derivados da planta de soja tolerante a herbicida DBN9004.
[0067] O construto de DNA é introduzido em uma planta usando um método de transformação incluindo, mas não se limitado a, transformação mediada por Agrobacterium, transformação por pistola de genes e transformação via tubo polínico.
[0068] O método de transformação mediado por Agrobacterium é um método comum para a transformação da planta. O DNA exógeno a ser introduzido na planta é clonado entre as sequências consenso limítrofes à esquerda e à direita do vetor, isto é, a região de T-DNA. Uma célula de Agrobacterium é transformada com o vetor e a seguir usada apara infectar um tecido de planta e a região de T-DNA do vetor compreendendo o DNA exógeno é inserida no genoma da planta.
[0069] O método de transformação por pistola de genes é um método de uso de um veículo contendo o DNA exógeno para bombardear uma célula da planta (transformação de bioprojétil mediado por partícula).
[0070] O método de transformação via tubo polínico é um método de transportar o DNA exógeno para dentro do saco embrionário por meio do caminho do nucelo usando uma via de tubo polínico natural (também denominada tecido guia do tubo polínico) formada por polinização das plantas.
[0071] Após a transformação, as plantas transgênicas devem ser regeneradas do tecido de planta transformado e as descendências com DNA exógeno são selecionadas usando marcadores apropriados.
[0072] O construto de DNA é uma combinação de moléculas de DNA que são ligadas umas às outras e a combinação provê um ou mais cassetes de expressão. O construto de DNA é preferivelmente um plasmídeo capaz de autorreplicação dentro de uma célula bacteriana e contendo locais da enzima de restrição diferentes e os locais da enzima de restrição contidos nele são usados para introduzir moléculas de DNA que proveem elementos de gene funcional, isto é, um promotor, um íntron, uma sequência líder, uma sequência codificadora, numa região 3’-terminal e outras sequências. O cassete de expressão contido no construto de DNA compreende elementos de gene que são necessários para prover transcrição do RNA mensageiro e o cassete de expressão pode ser projetado para ser expresso em células procarióticas ou células eucarióticas. Os cassetes de expressão da presente invenção são projetados para serem mais preferivelmente expressos em células de planta.
[0073] O “evento” transgênico é obtido pela transformação de uma célula da planta com um construto heterólogo de DNA, isto é, compreendendo a geração de uma população de plantas pela inserção de um cassete de expressão de ácido nucleico contendo um gene alvo no genoma da planta por métodos transgênicos, regeneração da população de plantas e seleção de uma planta específica tendo características dos locais genômicos específicos inseridos. O termo “evento” compreende o transformante original do DNA heterólogo e descendências deste transformante. O termo “evento” também inclui descendências obtidas por hibridização sexual dentre o transformante e um indivíduo de outras espécies contendo DNA heterólogo, mesmo se após retrocruzamento repetido com os progenitores de retrocruzamento, o DNA inserido e o DNA genômico de flanqueamento dos progenitores transformantes também estão presentes na mesma posição cromossômica nas descendências híbridas. O termo “evento” também se refere a uma sequência de DNA de um transformante original, a sequência de DNA compreende um DNA inserido e uma sequência genômica de flanqueamento que é intimamente adjacente ao DNA inserido e se espera que seja transferido para uma descendência que é gerada por hibridização sexual de uma linhagem parental compreendendo o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e uma descendência deste gerada por autopolinização) com uma linhagem parental sem o DNA inserido e a descendência recebe o DNA inserido contendo o gene alvo.
[0074] “Recombinante” na presente invenção se refere às formas de DNA e/ou proteína e/ou organismo que geralmente não são encontradas na natureza e, assim, produzidas por intervenção artificial. Tal intervenção artificial pode produzir moléculas de DNA recombinantes e/ou plantas recombinantes. A “molécula de DNA recombinante” é obtida por combinação artificial de dois segmentos de sequência que são isolados em outros casos, tais como segmentos de ácido nucleico sintetizados quimicamente ou isolados por técnicas de manipulação de engenharia genética. As técnicas para realizar as manipulações de ácido nucleico são bem-conhecidas.
[0075] O termo “transgene” compreende qualquer célula, linhagem de célula, calo, tecido, parte de planta ou planta, os genótipos destes variarão devido à presença de um ácido nucleico heterólogo e o transgene compreende um corpo transgênico que é alterado incialmente como tal e uma descendência individual derivada dos corpos transgênicos originais por hibridização sexual ou reprodução assexuada. Na presente invenção, o termo “transgene” não compreende alterações de genomas (cromossomais ou extracromossomais) causados por métodos de reprodução de planta convencionais ou eventos de ocorrência natural e os eventos de ocorrência natural são, por exemplo, fertilização cruzada randômica, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante ou mutação espontânea.
[0076] Na presente invenção, “heterólogo” se refere a uma primeira molécula na natureza que se verifica não ser geralmente combinada com uma segunda molécula. Por exemplo, uma molécula pode se originar de uma primeira espécie e ser inserida no genoma de uma segunda espécie. Assim, esta molécula é heteróloga para o hospedeiro e é artificialmente introduzida no genoma da célula hospedeira.
[0077] O cultivo de um evento de soja transgênico DBN9004 que é tolerante a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato é alcançado pelas seguintes etapas: primeiramente, a hibridização sexual de uma primeira planta de soja parental com uma segunda planta de soja parental para produzir primeira geração filial diversificada de plantas, em que a primeira planta de soja parental consiste em plantas de soja que são cultivadas a partir do evento de soja transgênico DBN9004 e suas descendências que são obtidas por transformação com um cassete de expressão da presente invenção tendo tolerância a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato e a segunda planta de soja parental carece de tolerância a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato; a seguir seleção das plantas descendentes que são tolerantes à aplicação de um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, dessa forma, cultivando uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato. Estas etapas podem compreender adicionalmente retrocruzamento de uma planta descendente tendo tolerância à aplicação do herbicida glifosato e/ou do herbicida glufosinato com a segunda planta de soja parental ou a terceira planta de soja parental, a seguir, seleção das descendências pela aplicação de um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato ou pela identificação dos marcadores moleculares (tais como uma molécula de DNA compreendendo o local de conjugação identificado na posição 5’-terminal e 3’-terminal da sequência inserida no evento de soja transgênico DBN9004) associado com traços, dessa forma, produzindo uma planta de soja que é tolerante ao herbicida glifosato e ao herbicida glufosinato.
[0078] Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser hibridizadas para produzir descendências contendo dois genes exógenos independentes, separadamente adicionados. As plantas descendentes que são homozigotas para os dois genes exógenos adicionados podem ser obtidas a partir da autopolinização de uma descendência apropriada. O retrocruzamento das plantas parentais e a exogamia com plantas não transgênicas como descrito acima também podem ser esperados e a reprodução assexuada também é a mesma.
[0079] As sojas transgênicas Bt podem matar, por exemplo, insetos/pragas de Lepidoptera, mas também existem alguns insetos/pragas sobreviventes que, após várias gerações de propagação, podem produzir insetos/pragas resistentes, resistentes à proteína Bt. A fim de focar no problema de resistência a inseto/praga, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (“US Environmental Protection Agency”) provê orientação sobre o uso de culturas transgênicas, isto é, é necessário prover uma proporção de sojas protegidas (que podem ser sojas transgênicas não resistentes a insetos (que podem ser sojas não transgênicas resistentes a pragas (por exemplo, sojas transgênicas tolerantes ao herbicida ou sojas transgênicas resistentes a pragas não alvo ou sojas não transgênicas)). Quando mais dos insetos/pragas são mortos nas sojas transgênicas resistentes a inseto correspondentes, uma parte dos insetos/pragas não é morta nas sojas protegidas, o que assegura que o número de população de insetos/pragas sem resistência seja dominante. Como tal, mesmo se uma pequena quantidade de insetos/pragas resistentes tiver sobrevivido, os genes resistentes são diluídos significativamente após o acasalamento dos insetos/pragas resistentes com o número dominante de insetos/pragas não resistentes.
[0080] O termo “sonda” se refere a uma molécula isolada de ácido nucleico que se liga a um rótulo detectável convencional ou molécula repórter nela, por exemplo, um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimioluminescente ou enzimas. Tal sonda é complementar a uma fita do ácido nucleico alvo. Na presente invenção, a sonda é complementar a uma fita de DNA a partir do genoma do evento de soja transgênico DBN9004, independentemente do DNA genômico sendo derivado do evento de soja transgênico DBN9004 ou semente deste ou derivado das plantas ou sementes ou extratos do evento de soja transgênico DBN9004. A sonda da presente invenção inclui não apenas ácido desoxirribonucleico ou ácido ribonucleico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e pode ser usada para detectar a presença daquela sequência de DNA alvo.
[0081] O termo “iniciador” se refere a uma molécula isolada de ácido nucleico que se liga a uma fita de DNA alvo complementar por hibridização e recozimento de ácido nucleico forma um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, a seguir se estende ao longo da fita de DNA alvo sob a ação de uma polimerase (por exemplo, polimerase de DNA). Os pares de iniciador da presente invenção se referem a sua aplicação na amplificação de sequências de ácido nucleico alvo, por exemplo, por reação de cadeia polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácido nucleico.
[0082] Os comprimentos da sonda e iniciador são geralmente de 11 polinucleotídeos ou mais, preferivelmente 18 polinucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 24 polinucleotídeos ou mais e mais preferivelmente 30 polinucleotídeos ou mais. Tal sonda e iniciador são especificamente hibridizados com a sequência alvo sob condições de hibridização de alto rigor. Embora as sondas que diferem das sequências de DNA alvo e mantêm capacidade de hibridização nas sequências de DNA alvo possam ser projetadas por métodos convencionais, é preferido que as sondas e iniciadores da presente invenção tenham identidade de sequência de DNA completa com os ácidos nucleicos consecutivos dos ácidos nucleicos alvo.
[0083] Iniciadores e sondas do DNA genômico de flanqueamento e sequências de inserção com base na presente invenção podem ser determinadas por métodos convencionais, por exemplo, pelo isolamento da molécula de DNA correspondente a partir dos materiais vegetais derivados do evento de soja transgênico DBN9004 e determinação da sequência de ácido nucleico da molécula de DNA. A molécula de DNA compreende uma sequência de inserção transgênica e uma sequência de flanqueamento do genoma de soja e um fragmento da molécula de DNA pode ser usado como um iniciador ou uma sonda.
[0084] As sondas e iniciadores de ácido nucleico da presente invenção hibridizam com a sequência alvo de DNA sob condições rigorosas. Qualquer hibridização convencional de ácido nucleico ou método de amplificação pode ser usado para identificar a presença de DNA derivado do evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra. Uma molécula de ácido nucleico ou um fragmento desta é capaz de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Como usado na presente invenção, se duas moléculas de ácido nucleico puderem formar uma estrutura antiparalela de ácido nucleico de dupla fita, então pode-se considerar que estas duas moléculas de ácido nucleico podem ser especificamente hibridizadas umas às outras. Se duas moléculas de ácido nucleico exibirem uma complementaridade completa, então se diz que uma molécula de ácido nucleico das duas é o “complemento” da outra molécula de ácido nucleico. Como usado na presente invenção, quando cada nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é complementar ao nucleotídeo correspondente de outra molécula de ácido nucleico, então estas duas moléculas de ácido nucleico são as que exibem uma “complementaridade completa”. Se duas moléculas de ácido nucleico puderem ser hibridizadas umas às outras com uma estabilidade suficiente para deixá-las recozer e se ligar umas às outras pelo menos sob condições convencionais de “baixo rigor”, então se diz que estas duas moléculas de ácido nucleico são “minimamente complementares”. Similarmente, se duas moléculas de ácido nucleico puderem ser hibridizadas umas às outras com uma estabilidade suficiente para deixá-las recozer e se ligar umas às outras sob condições convencionais de “alto rigor”, então se diz que estas duas moléculas de ácido nucleico são “complementares”. O desvio de uma complementaridade completa é permissível, desde que este desvio não impeça completamente duas moléculas de formarem uma estrutura de dupla fita. A fim de permitir que uma molécula de ácido nucleico atue como um iniciador ou sonda é somente garantido que a molécula tenha uma complementaridade suficiente em sua sequência para permitir que uma estrutura estável de dupla fita seja formada no solvente particular e concentração de sal empregada.
[0085] Como usado na presente invenção, uma sequência substancialmente homóloga é um segmento de uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico pode ser especificamente hibridizada com a fita complementar de outro segmento de uma molécula de ácido nucleico combinada sob condições de alto rigor. As condições rigorosas adequadas que promovem hibridização de DNA são, por exemplo, tratamento com 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) sob a condição de cerca de 45 °C e então lavagem com 2,0 x SSC sob a condição de 50 °C, cujas condições são bem conhecidas por um técnico no assunto. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de cerca de 2,0 x SSC a 50 °C sob condições de baixo rigor, a cerca de 0,2 x SSC a 50 °C sob condições de alto rigor. Em adição, as condições de temperatura na etapa de lavagem podem ser aumentadas de cerca de 22 °C de temperatura ambiente sob condições de baixo rigor a cerca de 65 °C sob condições de alto rigor. Ambas a condição da temperatura e a concentração de sal podem ser alteradas ou uma delas pode ser inalterada enquanto a outra variável pode ser alterada. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser especificamente hibridizada sob condições de moderado rigor, por exemplo, em cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65 °C com uma ou mais moléculas de ácido nucleico de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 ou uma sequência complementar deste, ou quaisquer dos fragmentos das sequências acima. Mais preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser especificamente hibridizada sob condições de alto rigor com uma ou mais moléculas de ácido nucleico de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 ou uma sequência complementar deste, ou quaisquer dos fragmentos das sequências acima. Na presente invenção, a molécula de ácido nucleico marcador preferida tem SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 7 ou uma sequência complementar deste, ou qualquer fragmento das sequências acima. Outra molécula de ácido nucleico marcador preferida da presente invenção tem 80% a 100%, ou 90% a 100% de identidade de sequência com SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 6 ou SEQ ID No: 7 ou uma sequência complementar deste, ou qualquer fragmento das sequências acima. SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 podem ser usadas como marcadores em um método de reprodução de plantas para identificar as descendências de hibridização genética. A hibridização de uma sonda com uma molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer método bem-conhecido por um técnico no assunto incluindo, mas não limitado a, marcação com fluorescência, marcação radioativa, marcação de anticorpo e marcação quimioluminescente.
[0086] Com relação à amplificação (por exemplo, por PCR) de uma sequência alvo de ácido nucleico usando iniciadores de amplificação específicos, “condições rigorosas” se referem a condições que apenas permitem que os iniciadores hibridizem com a sequência alvo de ácido nucleico em uma reação de amplificação térmica de DNA, com um iniciador da sequência de tipo selvagem (ou sua sequência complementar) correspondendo à sequência alvo de ácido nucleico sendo capaz de se ligar à sequência alvo de ácido nucleico e preferivelmente permitem a produção de um produto de amplificação único, isto é, o amplicon.
[0087] O termo “ligando especificamente a (uma sequência alvo)” se refere à hibridização de uma sonda ou iniciador somente com uma sequência alvo em uma amostra contendo a sequência alvo sob condições de hibridização rigorosas.
[0088] Como usado na presente invenção, “DNA amplificado” ou “amplicon” se refere a um produto de amplificação de ácido nucleico de uma sequência alvo de ácido nucleico que é uma parte de um modelo de ácido nucleico. Por exemplo, a fim de determinar se uma planta de soja é produzida por hibridização sexual do evento de soja transgênico DBN9004 da presente invenção ou se uma amostra de soja coletada de um campo contém um evento de soja transgênico DBN9004 ou se um extrato de soja, tal como farelo de soja, pó ou óleos, contém o evento de soja transgênico DBN9004, o DNA extraído de uma amostra de tecido da planta de soja ou extrato desta pode gerar amplicons que são diagnóstico para a presença de DNA do evento de soja transgênico DBN9004 por um método de amplificação de ácido nucleico usando um par de iniciadores. O par de iniciadores compreende um primeiro iniciador derivado de uma sequência de flanqueamento adjacente ao local de inserção do DNA inserido exógeno no genoma da planta e um segundo iniciador derivado do DNA inserido exógeno. O amplicon tem um comprimento e uma sequência que também são diagnósticos para o evento de soja transgênico DBN9004. A faixa de comprimento do amplicon pode ser o comprimento de ligação do par de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeo, preferivelmente mais cerca de 50 pares de bases de nucleotídeo, mais preferivelmente mais cerca de 250 pares de bases de nucleotídeo, mais preferivelmente mais cerca de 450 pares de bases de nucleotídeo ou mais.
[0089] Opcionalmente, os pares de iniciador podem ser derivados de sequências genômicas de flanqueamento em ambos os lados do DNA inserido para produzir um amplicon compreendendo a sequência de nucleotídeo inserida total. Um par de iniciadores derivados da sequência do genoma da planta pode ser localizado em uma distância da sequência de DNA inserida e a distância pode variar de um par de bases de nucleotídeo a cerca de 20.000 pares de bases de nucleotídeo. O uso do termo “amplicon” especificamente exclui os dímeros de iniciador formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[0090] A reação de amplificação de ácido nucleico pode ser alcançada por quaisquer dos métodos de amplificação de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo reação de cadeia polimerase (PCR). Vários métodos de amplificação de ácido nucleico foram bem-conhecidos por um técnico no assunto. O método de amplificação PCR foi desenvolvido para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA bacteriófago. Estes métodos e outros métodos de amplificação de DNA na técnica podem ser usados na presente invenção. O genoma do evento de soja transgênico DBN9004 pode ser amplificado usando a sequência de DNA exógeno inserido e a sequência de DNA de flanqueamento derivada do evento de soja transgênico DBN9004 com as sequências do iniciador fornecidas e sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR ou o DNA clonado pode ser realizado após a amplificação.
[0091] Os kits de detecção de DNA com base nos métodos de amplificação de DNA contêm moléculas do iniciador de DNA que hibridizam especificamente com um DNA alvo sob condições de reação apropriadas e amplificam os amplicons de diagnóstico. O kit pode prover um método de detecção com base no gel de agarose ou vários métodos conhecidos na técnica para a detecção de amplicons de diagnóstico. Um kit compreendendo um iniciador de DNA que é homólogo ou complementar a qualquer parte da região genômica da soja de SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 4 e homólogo ou complementar a qualquer parte da região de inserção de transgene de SEQ ID No: 5 é provido pela presente invenção. Em particular, SEQ ID No: 8 e SEQ ID No: 9 são identificadas como o par de iniciadores útil no método de amplificação de DNA e amplificam o amplicon de diagnóstico que é homólogo a uma parte da região do transgene 5’/genômica do evento de soja transgênico DBN9004, em que o amplicon compreende SEQ ID No: 1. Outras moléculas de DNA usadas como iniciadores de DNA podem ser selecionadas de SEQ ID No: 5.
[0092] Os amplicons produzidos por estes métodos podem ser detectados por uma variedade de técnicas. Um destes métodos é a análise genética de bits, na qual uma fita de oligonucleotídeo de DNA que abrange a sequência de DNA inserida e a sequência de DNA genômico de flanqueamento adjacente é projetado. A fita de oligonucleotídeo é imobilizada em microcavidades de uma placa de microcavidades e, após a amplificação PCR da região alvo (usando um iniciador para cada uma da sequência inserida e da sequência genômica de flanqueamento adjacente), o produto PCR de fita única pode ser hibridizado com a fita de oligonucleotídeo imobilizado e serve como um modelo para a reação de extensão de base única que usa polimerase de DNA e especificamente ddNTPs marcados para a próxima base esperada. Os resultados podem ser obtidos por fluorescência ou métodos do tipo ELISA. O sinal representa a presença de uma sequência de flanqueamento/inserida, que indica que amplificação, hibridização e reação de extensão de base única são bem-sucedidas.
[0093] Outro método é uma técnica de pirossequenciamento. Este método projeta uma fita de oligonucleotídeo que abrange a sequência de DNA inserida e o local de conjugação de DNA genômico adjacente. A fita de oligonucleotídeo é hibridizada com o produto de PCR de fita única da região alvo (usando um iniciador para cada uma da sequência inserida e da sequência genômica de flanqueamento adjacente), então incubado com polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’-fosfossulfato e luciferina. Os dNTPs são adicionados, respectivamente, e os sinais ópticos gerados são medidos. O sinal óptico representa a presença de uma sequência de flanqueamento/inserida, que indica que a amplificação, hibridização e reação de extensão de base única ou bases múltiplas são bem-sucedidas.
[0094] O fenômeno de polarização de fluorescência descrito por Chen et al. (Genome Res. 9: 492-498, 1999) também é um método que pode ser usado para detectar os amplicons da presente invenção. O uso deste método precisa projetar uma fita de oligonucleotídeo que abrange a sequência de DNA inserida e o local de conjugação de DNA genômico adjacente. A fita de oligonucleotídeo é hibridizado com o produto de PCR de fita única da região alvo (usando um iniciador para cada uma da sequência inserida e a sequência genômica de flanqueamento adjacente), então incubado com polimerase de DNA, e um ddNTP marcado por fluorescência. A extensão de base única resultará na inserção de ddNTP. A alteração na polarização de tal inserção pode ser medida usando um fluorímetro. A alteração na polarização representa a presença de uma sequência de flanqueamento/inserida, que indica que a amplificação, hibridização e reação de extensão de base única são bem- sucedidas.
[0095] Taqman é descrito como um método para a detecção e análise quantitativa da presença de uma sequência de DNA e é descrito em detalhes nas instruções providas pelo fabricante. Agora, é ilustrado brevemente abaixo uma sonda de oligonucleotídeo FRET que abrange a sequência de DNA inserida e o local de conjugação de flanqueamento genômico adjacente é projetado. A reação circular é realizada usando a sonda FRET e os iniciadores de PCR (usando um iniciador para cada uma da sequência inserida e a sequência genômica de flanqueamento adjacente) na presença de polimerases termoestáveis e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na divisão de uma porção fluorescente e uma porção resfriada na sonda FRET e a liberação da porção fluorescente. A geração de um sinal fluorescente representa a presença de uma sequência de flanqueamento/inserida, que indica que a amplificação e hibridização são bem-sucedidas.
[0096] As técnicas adequadas para a detecção de materiais vegetais derivados do evento de soja transgênico tolerante ao herbicida DBN9004 também podem incluir hibridização Southern blot, hibridização Northern blot e hibridização in situ com base no princípio da hibridização. Em particular, a técnica adequada inclui a incubação da sonda e da amostra, lavagem para remover a sonda não ligada e detecção de se a sonda foi hibridizada. O método de detecção descrito acima depende do tipo de marcador fixado à sonda, por exemplo, uma sonda radiomarcada pode ser detectada pela exposição e desenvolvimento de uma película de raios X ou uma sonda marcada com enzima pode ser detectada pela obtenção da alteração da cor através da conversão de substratos.
[0097] Tyangi et al. (Nat. Biotech. 14: 303-308, 1996) introduziram a aplicação de marcadores moleculares na detecção de sequência. É brevemente ilustrada abaixo uma sonda de oligonucleotídeo FRET que abrange a sequência de DNA inserida e o local de conjugação de flanqueamento genômico adjacente é projetado. A estrutura única da sonda FRET resulta em sua estrutura secundária, que mantém a porção fluorescente e a porção resfriada dentro de uma distância próxima. A reação circular é realizada usando a sonda FRET e os iniciadores de PCR (usando um iniciador para cada uma da sequência inserida e da sequência genômica de flanqueamento adjacente) na presença de polimerases termoestáveis e dNTPs. Após a amplificação PCR bem-sucedida, a hibridização da sonda FRET e a sequência alvo levará à perda da estrutura secundária da sonda, de modo que a porção fluorescente e a porção resfriada sejam separadas espacialmente para produzir um sinal fluorescente. A geração de um sinal fluorescente representa a presença de uma sequência de flanqueamento/inserida, que indica que a amplificação e hibridização são bem-sucedidas.
[0098] Outros métodos descritos, tais como microfluídicos, proveem métodos e dispositivos para o isolamento e amplificação de uma amostra de DNA. Corantes luminescentes são usados para detectar e determinar moléculas de DNA específicas. Um dispositivo de nanotubo compreendendo um sensor eletrônico para a detecção de uma molécula de DNA ou nanoesferas às quais a molécula de DNA específica é ligada, o qual pode ser assim detectado, é útil para a detecção da molécula de DNA da presente invenção.
[0099] O kit de detecção de DNA pode ser desenvolvido usando as composições descritas na presente invenção e os métodos descritos ou conhecidos no campo de detecção de DNA. O kit facilita a identificação da presença do DNA do evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra e também pode ser usado para cultivar as plantas de soja contendo o DNA do evento de soja transgênico DBN9004. O kit pode conter iniciadores de DNA ou sondas homólogas a ou complementares a pelo menos uma parte de SEQ ID No: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou conter outros iniciadores de DNA ou sondas homólogas a ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos transgênicos do DNA e estas sequências de DNA podem ser usadas para reações de amplificação de DNA ou como sondas em métodos de hibridização de DNA. A estrutura do DNA, contida no genoma de soja, do local de conjugação da sequência transgênica inserida e do genoma de soja descrito nas Figuras 1 e Tabela 1 compreende: a região genômica de flanqueamento de planta de soja DBN9004 localizada na posição 5’-terminal da sequência transgênica inserida; uma parte da sequência inserida a partir da região limítrofe à esquerda (LB) do Agrobacterium; um primeiro cassete de expressão consistindo no promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S (pr35S) contendo uma repetição em tandem de uma região intensificadora, que pode ser ligada operavelmente à fosfinotricina N-acetiltransferase tolerante a glufosinato (cPAT) de Streptomyces e então ligada operavelmente ao terminador 35S (t35S) do vírus do mosaico da couve-flor; um segundo cassete de expressão consistindo no promotor do gene de soja Tsf1 (que codifica o fator de alongamento EF-1α) (prGm17gTsf1), que pode ser ligado operavelmente à sequência codificante (spAtCTP2) do peptídeo de trânsito do cloroplasto EPSPS de Arabidopsis, então ligado operavelmente à 5-enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase tolerante a glifosato (cEPSPS) de cepa CP4 de Agrobacterium e então ligado operavelmente à sequência não traduzida 3’ (tPse9) derivada de ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase de ervilha; uma parte da sequência inserida da região limítrofe à direita (RB) da Agrobacterium e a região genômica de flanqueamento de planta de soja DBN9004 localizada na posição 3’-terminal da sequência transgênica inserida (SEQ ID No: 5). No método de amplificação de DNA, a molécula de DNA como um iniciador pode ser qualquer parte derivada da sequência transgênica inserida na planta de soja DBN9004 ou pode ser qualquer parte derivada da região de DNA do genoma de soja de flanqueamento no evento de soja transgênico DBN9004.
[0100] O evento de soja transgênico DBN9004 pode ser combinado com outras variedades de soja transgênica tais como sojas com tolerância a herbicida (por exemplo, 2,4-D, dicamba, etc.) ou variedades de soja transgênica transportando outros genes resistentes a inseto (por exemplo, Cry1Ac, Cry2Ab, etc.). Várias combinações de todos estes eventos transgênicos diferentes, com o evento de soja transgênico DBN9004 da presente invenção podem ser reproduzidas juntas para prover uma variedade de soja transgênica híbrida melhorada resistente a várias pragas e tolerantes a vários herbicidas. Estas variedades podem exibir características superiores tais como rendimento aumentado em comparação com uma variedade não transgênica e uma variedade transgênica de traço único.
[0101] A presente invenção provê uma sequência de ácido nucleico para a detecção de planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta. O evento de soja transgênico DBN9004 é tolerante a efeitos fitotóxicos de herbicidas agrícolas contendo glifosato e/ou glufosinato. A planta de soja de traço duplo expressa a proteína de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase resistente a glifosato (EPSPS) da cepa de Agrobacterium CP4, que confere à planta tolerância a glifosato e expressa a proteína de fosfinomicina N- acetiltransferase (PAT) resistente a glufosinato de Streptomyces, que confere à planta tolerância a glufosinato. A soja de traço duplo tem as seguintes vantagens: 1) ela tem a capacidade de controlar a erva daninha de amplo espectro pela aplicação de herbicidas agrícolas contendo glifosato a culturas de soja; 2) o uso de herbicidas glufosinato em combinação com traços tolerantes a glufosinato (misturados ou alternados com herbicidas glifosato) pode servir como um meio não seletivo para o gerenciamento eficaz de ervas daninhas resistentes a glifosato; 3) o coplantio de sojas transgênicas tolerantes ao herbicida como sojas transgênicas não resistentes a inseto com sojas transgênicas resistentes a inseto em uma proporção pode retardar a indução de resistência a inseto/praga; e 4) não há qualquer redução no rendimento de soja. Em adição, os genes que codificam traços tolerantes a glifosato e tolerantes a glufosinato são ligados no mesmo segmento de DNA e estão presentes em um único local do genoma da soja genômica DBN9004, que provê eficiência de reprodução intensificada e permite que o uso de marcadores moleculares rastreie os fragmentos inseridos transgênicos na população de reprodução e descendências desta. Enquanto que, a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar, ou SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar podem ser usadas como iniciadores de DNA ou sondas no método de detecção da presente invenção para produzir um produto de amplificação que é diagnosticado como o evento de soja transgênico DBN9004 ou descendências deste e, identificam rapidamente, precisamente e estavelmente a presença dos materiais vegetais derivados do evento de soja transgênico DBN9004.
Breve Descrição das Sequências
[0102] SEQ ID No: 1 - Uma sequência com um comprimento de 22 nucleotídeos na posição 5’- términal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004, em que nucleotídeos nas posições 1-11 e nucleotídeos nas posições 12-22 se localizam em ambos os lados do local de inserção no genoma de soja, respectivamente;
[0103] SEQ ID No: 2 - Uma sequência com um comprimento de 22 nucleotídeos na posição 3’ - terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004, em que nucleotídeos nas posições 1-11 e nucleotídeos nas posições 12-22 se localizam em ambos os lados do local de inserção no genoma de soja, respectivamente;
[0104] SEQ ID No: 3 uma sequência com um comprimento de 1207 nucleotídeos na posição 5’ - terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004;
[0105] SEQ ID No: 4 - Uma sequência com um comprimento de 631 nucleotídeos na posição 3’ - terminal da sequência inserida próximo ao local de conjugação de inserção no evento de soja transgênico DBN9004;
[0106] SEQ ID No: 5 - Sequência de T-DNA inteira, sequências de genoma de soja de flanqueamento 5’ e 3’;
[0107] SEQ ID No: 6 - Uma sequência que é localizada dentro de SEQ ID No: 3 e abrange a sequência de nucleotídeo na sequência de DNA de construto pDBN4003 e sequência de terminação de transcrição t35S;
[0108] SEQ ID No: 7 - Uma sequência que é localizada dentro de SEQ ID No: 4 e abrange a sequência promotora prGm17gTsf1 e a sequência de nucleotídeo na sequência de DNA de construto pDBN4003;
[0109] SEQ ID No: 8 - Um primeiro iniciador amplificando SEQ ID No: 3;
[0110] SEQ ID No: 9 - Um segundo iniciador amplificando SEQ ID No: 3;
[0111] SEQ ID No: 10 - Um primeiro iniciador amplificando SEQ ID No: 4;
[0112] SEQ ID No: 11 - Um segundo iniciador amplificando SEQ ID No: 4;
[0113] SEQ ID No: 12 - Um iniciador na sequência de genoma de flanqueamento 5’;
[0114] SEQ ID No: 13 - Um iniciador localizado no T-DNA e emparelhado com SEQ ID No: 12;
[0115] SEQ ID No: 14 - Um iniciador na sequência de genoma de flanqueamento 3’, que é emparelhado com SEQ ID No: 12 para detectar se o transgene é um homozigoto ou um heterozigoto;
[0116] SEQ ID No: 15 - Um iniciador localizado no T-DNA e emparelhado com SEQ ID No: 14;
[0117] SEQ ID No: 16 - Iniciador de Taqman 1 para a detecção de EPSPS;
[0118] SEQ ID No: 17 - Iniciador Taqman 2 para a detecção de EPSPS;
[0119] SEQ ID No: 18 - Sonda Taqman 1 para a detecção de EPSPS;
[0120] SEQ ID No: 19 - Iniciador Taqman 3 para a detecção de PAT;
[0121] SEQ ID No: 20 - Iniciador Taqman 4 para a detecção de PAT;
[0122] SEQ ID No: 21 - Sonda Taqman 2 para a detecção de PAT;
[0123] SEQ ID No: 22 - Um primeiro iniciador de gene endógeno de soja de ubiquitina;
[0124] SEQ ID No: 23 - Um segundo iniciador de gene endógeno de soja de ubiquitina;
[0125] SEQ ID No: 24 - Uma sonda de EPSPS em detecção de hibridização de Southern blot;
[0126] SEQ ID No: 25 - Uma sonda de PAT em detecção de hibridização de Southern blot;
[0127] SEQ ID No: 26 - Um iniciador localizado no T-DNA na mesma direção com SEQ ID No: 13;
[0128] SEQ ID No: 27 - Um iniciador localizado no T-DNA na direção oposta a SEQ ID No: 13 e usado para obter uma sequência de flanqueamento;
[0129] SEQ ID No: 28 - Um iniciador localizado no T-DNA na direção oposta a SEQ ID No: 13 e usado para obter uma sequência de flanqueamento;
[0130] SEQ ID No: 29 - Um iniciador localizado no T-DNA na mesma direção com SEQ ID No: 15;
[0131] SEQ ID No: 30 - Um iniciador localizado no T-DNA na direção oposta a SEQ ID No: 15 e usado para obter uma sequência de flanqueamento;
[0132] SEQ ID No: 31 - Um iniciador localizado no T-DNA na direção oposta a SEQ ID No: 15 e usado para obter uma sequência de flanqueamento.
[0133] A solução técnica da presente invenção é adicionalmente descrita em detalhes através de desenhos e exemplos abaixo.
Breve descrição das figuras
[0134] A Figura 1 é uma representação estrutural do local de conjugação entre a sequência transgênica inserida e o genoma de soja de acordo com a sequência de ácido nucleico para a detecção de planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta da presente invenção;
[0135] A Figura 2 é uma representação estrutural do vetor de expressão recombinante pDBN4003 de acordo com a sequência de ácido nucleico para a detecção de planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta da presente invenção.
Realização Preferencial
[0136] As soluções técnicas de uma sequência de ácido nucleico para a detecção de uma planta de soja tolerante a herbicida DBN9004 e um método de detecção desta de acordo com a presente invenção serão ilustrados adicionalmente abaixo através das realizações particulares.
Exemplo 1. Clonagem e transformação 1.1. Clonagem do vetor
[0137] O vetor de expressão recombinante pDBN4003 foi construído usando técnicas de clonagem de gene padrão (como mostrado na Figura 2). O vetor pDBN4003 contém dois cassetes de expressão transgênicos em tandem, em que o primeiro cassete de expressão consiste no promotor do gene de soja Tsf1 (que codifica o fator de alongamento EF-1α) (prGm17gTsf1), que pode ser ligado operavelmente à sequência codificante (spAtCTP2) do peptídeo de trânsito do cloroplasto EPSPS de Arabidopsis, então ligado operavelmente à 5- enol-piruvilchiquimato-3-fosfato sintase tolerante a glifosato (cEPSPS) de cepa de Agrobacterium CP4 e ligado operavelmente à sequência não traduzida 3’ (tPse9) derivada de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase de ervilha; e o segundo cassete de expressão consiste no promotor 35S (pr35S) do vírus do mosaico da couve-flor contendo uma repetição em tandem de uma região intensificadora, que pode ser ligada operavelmente à fosfinotricina N- acetiltransferase (cPAT) tolerante a glufosinato de Streptomyces e então ligado operavelmente ao terminador 35S (t35S) do vírus do mosaico da couve-flor.
[0138] LBA4404 de Agrobacterium (Invitrgen, Chicago, USA; Cat. No: 18313-015) foi transformado com o vetor pDBN4003 pelo método de nitrogênio líquido e as células transformadas foram triadas usando 5-enol- piruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) como um marcador seletivo.
1.2. Transformação da Planta
[0139] A transformação é realizada pelo método de infecção por Agrobacterium convencional e o tecido de nó cotiledonar de soja cultivado estéril foi cocultivado com Agrobacterium descrito no Exemplo 1.1 para introduzir o T-DNA no vetor de expressão recombinante construído pDBN4003 no cromossoma de soja para produzir o evento de soja transgênico DBN9004.
[0140] No que se refere à transformação da soja mediada por Agrobacterium, em suma, as sementes de soja maduras germinadas em um meio de cultura de germinação de soja (3,1 g/L de sal de B5, vitamina B5, 20 g/L de sacarose, e 8 g/L de ágar, pH 5,6) e as sementes foram inoculadas em um meio de cultura de germinação e cultivadas sob as condições de: uma temperatura de 25 ± 1 °C; e um fotoperíodo (claro/escuro) de 16 h/8 h. Após 46 dias de germinação, mudas estéreis de soja intumescidos em nós cotiledonares verdes brilhantes foram tiradas, eixos hipocotiledonares foram cortados 3-4 milímetros abaixo dos nós cotiledonares, os cotilédones foram cortados longitudinalmente e brotos apicais, broto lateral e raízes seminais foram removidos. Uma ferida foi feita em um nó cotiledonar usando a parte de trás da faca de um bisturi, os tecidos do nó cotiledonar ferido foram contatados com uma suspensão de Agrobacterium, em que o Agrobacterium pode transferir a sequência de nucleotídeo do gene EPSPS e a sequência de nucleotídeo do gene PAT para os tecidos do nó cotiledonar ferido (etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, os tecidos do nó cotiledonar foram imersos preferivelmente na suspensão de Agrobacterium (OD660 = 0,5-0,8, um meio de cultura de infecção (2,15 g/L de sal de MS, vitamina B5, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 40 mg/L de acetossiringona (AS), 4 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), e 2 mg/L de zeatina (ZT), pH 5,3)) para iniciar a infecção. Os tecidos do nó cotiledonar foram cocultivados com Agrobacterium por um período de tempo (3 dias) (etapa 2: etapa de co-cultivo). Preferivelmente, os tecidos do nó cotiledonar foram cultivados em um meio de cultura sólido (4,3 g/L de sal de MS, vitamina B5, 20 g/L de sacarose, 10 g/L de glicose, 4 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), 2 mg/L de zeatina e 8 g/L de ágar, pH 5,6) após a etapa de infecção. Após o estágio de co-cultivo, houve uma etapa de “recuperação” opcional. Na etapa de “recuperação”, pode haver pelo menos um antibiótico (150-250 mg/L de cefalosporina) conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium em um meio de cultura de recuperação (3,1 g/L de sal de B5, vitamina B5, 1 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de zeatina (ZT), 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 100 mg/L de ácido glutâmico e 100 mg/L de ácido aspártico, pH 5,6), sem a adição de um agente seletivo para um transformante vegetal (etapa 3: etapa de recuperação). Preferivelmente, blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura sólido com um antibiótico, mas sem um agente seletivo para eliminar Agrobacterium e prover um estágio de recuperação para as células infectadas. Subsequentemente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura contendo um agente seletivo (glifosato) e calos transformados em desenvolvimento foram selecionados (etapa 4: etapa de seleção). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares foram cultivados em um meio de cultura sólido de triagem (3,1 g/L de sal de B5, vitamina B5, 1 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de 6-benziladenina (6- BAP), 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 100 mg/L de ácido glutâmico, 100 mg/L de ácido aspártico e 10 mg/L de glifosato-sal de isopropilamina, pH 5,6) com um agente seletivo, resultando em crescimento contínuo de células transformadas. Então, as plantas foram regeneradas das células transformadas (etapa 5: etapa de regeneração). Preferivelmente, os blocos de tecido regenerados dos nós cotiledonares desenvolvidos em um meio de cultura contendo um agente seletivo foram cultivados em meio de cultura sólido (meio de cultura de diferenciação de B5 e meio de cultura para o enraizamento de B5) para regenerar as plantas.
[0141] Os tecidos resistentes examinados foram transferidos para o meio de cultura de diferenciação de B5 (3,1 g/L de sal de B5, vitamina B5, 1 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de zeatina (ZT), 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina, 50 mg/L de ácido glutâmico, 50 mg/L de ácido aspártico, 1 mg/L de giberelina, 1 mg/L de auxina e 10 mg/L de glifosato-sal de isopropilamina, pH 5,6) e cultivados a 25 °C para diferenciação. As mudas diferenciadas foram transferidas para o meio de cultura para o enraizamento de B5 (3,1 g/L de sal de B5, vitamina B5, 1 g/L de ácido 2-morfolina etanossulfônico (MES), 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, 150 mg/L de cefalosporina e 1 mg/L de ácido indol-3-butírico (IBA)), cultivadas no meio de cultura para o enraizamento ser de uma altura de cerca de 10 cm a 25 °C e transferidas para uma estufa para o cultivo até a frutificação. Na estufa, as plantas foram cultivadas a 26 °C por 16 horas e então cultivadas a 20 °C por 8 horas todo dia.
1.3. Identificação e triagem de eventos transgênicos
[0142] Um total de 288 plantas T0 transgênicas independentes foram produzidas.
[0143] A presença ou ausência dos genes EPSPS e PAT nas plantas de soja transgênicas regeneradas foi examinada por análise TaqManTM (vide Exemplo 2) e os números de cópias nas cepas tolerantes a glifosato e glufosinato foram caracterizados. Por triagem, o evento DBN9004 foi selecionado por ser excelente em seu desempenho com transgene de cópia única, boa tolerância a herbicida glifosato, tolerância a herbicida glufosinato e traços agronômicos (vide o Exemplo 6).
Exemplo 2. Detecção do evento de soja transgênico DBN9004 por TaqMan.
[0144] Cerca de 100 mg de folhas foram tiradas do evento de soja transgênico DBN9004 como uma amostra e extraídas por seu DNA genômico usando um kit de extração de DNA da planta (DNeasy Plant Maxi Kit, Qiagen). Os números de cópias do gene EPSPS e do gene PAT foram detectados por método de PCR quantitativa de fluorescência por sonda Taqman. Ao mesmo tempo, as plantas de soja do tipo selvagem foram usadas como controles e detectadas e analisadas de acordo com o método mencionado acima. Repetições triplas foram ajustadas para os experimentos e medidas.
[0145] Os procedimentos específicos foram como a seguir:
[0146] Etapa 11. 100 mg de folhas foram tiradas do evento de soja transgênico DBN9004 e moídas em um homogenado em um almofariz com nitrogênio líquido e repetições triplas foram ajustadas para cada amostra;
[0147] Etapa 12. DNAs genômicos das amostras mencionadas acima foram extraídos usando um DNeasy Plant Mini Kit de Qiagen e o método particular pode se referir ao manual do produto deste;
[0148] Etapa 13. As concentrações dos DNAs genômicos das amostras mencionadas acima foram detectadas usando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific);
[0149] Etapa 14. As concentrações dos DNAs genômicos das amostras mencionadas acima foram ajustadas até um valor de concentração consistente que varia de 80 a 100 ng/μL;
[0150] Etapa 15. Os números de cópias das amostras foram identificados usando o método de PCR quantitativa de fluorescência por sonda Taqman, em que as amostras para as quais os números de cópias foram identificados e conhecidos foram tiradas como padrões, as amostras das plantas de soja do tipo selvagem foram tiradas como o controle e repetições triplas foram tiradas para cada amostra e medidas; as sequências de iniciadores de PCR quantitativa de fluorescência e uma sonda foram como a seguir, respectivamente:
[0151] Os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar a sequência de gene EPSPS:
[0152] iniciador 1: TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG, mostrado como SEQ ID No: 16 na listagem de sequência;
[0153] iniciador 2: GCTTACCACGACCTTCAAGACG, mostrado como SEQ ID No: 17 na listagem de sequência;
[0154] sonda 1: CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC, mostrado como SEQ ID No: 18 na listagem de sequência;
[0155] os seguintes iniciadores e sonda foram usados para detectar a sequência de gene PAT:
[0156] iniciador 3: CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG, mostrado como SEQ ID No: 19 na listagem de sequência;
[0157] iniciador 4: TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG, mostrado como SEQ ID No: 20 na listagem de sequência;
[0158] sonda 2: CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG, mostrado como SEQ ID No: 21 na listagem de sequência;
[0159] Sistema de reação PCR:
[0160] JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma) ............................10 µL
[0161] mistura de iniciador/sonda 50 x ........................................1 µL
[0162] DNA genômico ...................................................................3 µL
[0163] água (dd H2O) ....................................... ..............................6 µL
[0164] A mistura de iniciador/sonda 50 x compreende 45 μL de cada iniciador em uma concentração de 1 mM, 50 μL da sonda em uma concentração de 100 μM e 860 μL de tampão L1 x TE e foi armazenada a 4 °C em um tubo de âmbar.
[0165] Condições de reação de PCR: Etapa ............................Temperatura ....................... Tempo 21 .................................. 95 °C ........................ 5 minutos 22 ................................. 95 °C ........................ 30 segundos 23 ................................. 60 °C ......................... 1 minuto 24 .................... de volta à etapa 22, 40 vezes repetidas
[0166] Os dados foram analisados usando SDS 2.3 software (Applied Biosystems), e o evento de soja transgênico de cópia única DBN9004 foi obtido.
Exemplo 3. Detecção do evento de soja transgênico DBN9004
[0167] 3.1. Extração de DNA genômico
[0168] A extração de DNA foi realizada de acordo com o método de CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio) usado convencionalmente: tirando 2 g de folhas jovens do evento de soja transgênico DBN9004 e moagem em pó no nitrogênio líquido, seguido pela adição de 0,5 mL de tampão de CTAB de extração de DNA (20 g/L de CTAB, NaCl 1,4 M, Tris-HCl 100 mM, EDTA 20 mM (ácido etilenodiaminatetra-acético), com pH ajustado a 8,0 com NaOH) preaquecido em uma temperatura de 65 °C e mistura total e então extração em uma temperatura de 65 °C por 90 minutos; adição de volume de fenol 0,5 vez e volume de clorofórmio 0,5 vez, então inversão para a mistura uniforme; centrifugação a 12000 rpm (revoluções por minuto) por 10 minutos; pipetagem do sobrenadante, volume de etanol anidro 2 vezes, agitação suave do tubo de centrífuga, e permanência em uma temperatura de 4 °C por 30 minutos; centrifugação em uma velocidade rotacional de 12000 rpm por 10 minutos novamente; coleta do DNA no fundo do tubo; descarte do sobrenadante e lavagem do precipitado com 1 mL de etanol com uma concentração de massa de 70%; centrifugação em uma velocidade rotacional de 12000 rpm por 5 minutos; secagem por sucção sob vácuo ou secagem por sopro em uma bancada super limpa; e dissolução do precipitado de DNA em uma quantidade apropriada de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e armazenamento em uma condição de temperatura de -20 °C.
3.2. Análise de sequência de DNA de flanqueamento
[0169] A concentração da amostra de DNA extraída acima foi medida de modo que a concentração da amostra a ser testada esteja entre 80-100 ng/μL. O DNA genômico foi digerido com as enzimas de restrição selecionadas PsiI, DraI e TaqI (para análise da posição 5’ - terminal) e AflII, TaqI e PsiI (para análise da posição 3’ - terminal), respectivamente. 26,5 μL de DNA genômico, 0,5 μL das enzimas de restrição selecionadas acima e 3 μL de tampão de digestão de enzima foram adicionados em cada sistema de digestão de enzima e digeridos por 1 hora. Após a conclusão da digestão de enzima, 70 μL de etanol, absoluto foram adicionados ao sistema de digestão de enzima, então colocados em um banho de gelo por 30 minutos, centrifugados em uma velocidade rotacional de 12000 rpm por 7 minutos, o sobrenadante foi descartado, seco por sopro, após o que 8,5 μL de água destilada dupla (dd H2O), 1 μL de 10 X tampão de T4 DNA ligase (tampão de reação de NEB T4 DNA ligase e sua fórmula específica pode ser referir ao website de NEB ou https://www.neb.com/produtos/restriction-endonucleases e https://www.neb.com/produtos/b0202-t4-dna-ligase-reação-tampão) e 0,5 μL de T4-DNA ligase foram adicionados para a ligação em uma temperatura de 4 °C durante a noite. A amplificação do PCR foi realizada com uma série de iniciadores aninhados para o isolamento de DNAs genômicos/transgênicos 5’ e 3’. Especificamente, a combinação de iniciador para o isolamento de DNA genômico/transgênico 5’ compreende SEQ ID No: 13 e SEQ ID No: 26 como um primeiro iniciador, SEQ ID No: 27 e SEQ ID No: 28 como um segundo iniciador e SEQ ID No: 13 como um iniciador de sequenciamento. Especificamente, a combinação de iniciador para o isolamento de DNA genômico/transgênico 3’ compreende SEQ ID No: 15 e SEQ ID No: 29 como um primeiro iniciador, SEQ ID No: 30 e SEQ ID No: 31 como um segundo iniciador, e SEQ ID No: 15 como um iniciador de sequenciamento e PCR condições de reação foram mostradas como na Tabela 3.
[0170] Os amplicons obtidos sofreram eletroforese em um gel de agarose a 2,0% para separar o produto de reação de PCR, subsequentemente, os fragmentos alvo foram isolados da matriz de agarose usando um kit de recuperação de gel (QIAquick Gel Extraction Kit, Cat. No. 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA). Então, o produto de PCR purificado foi sequenciado (por exemplo, ABI PrismTM 377, PE Biosystems, Foster City, CA) e analisado (por exemplo, software de análise de sequência DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).
[0171] As sequências de flanqueamento 5’ e 3’ e sequências de contato foram identificadas usando um método PCR padrão. A sequência de flanqueamento 5’ e a sequência de contato pode ser identificada usando SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 12, em combinação com SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 13, ou SEQ ID No: 26. A sequência de flanqueamento 3’ e a sequência de contato pode ser identificada usando SEQ ID No: 11 ou SEQ ID No: 14, em combinação com SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 15, ou SEQ ID No: 29. O sistema de reação de PCR e as condições de amplificação foram mostradas como na Tabela 2 e Tabela 3. Um técnico no assunto apreciaria que outras sequências iniciadoras também podem ser usadas para identificar sequências de flanqueamento e sequências de contato.
[0172] O sequenciamento de DNA do produto de PCR provê DNA que pode ser usado para projetar outras moléculas de DNA que podem ser usadas como iniciadores e sondas para a identificação de plantas de soja ou sementes derivadas do evento de soja transgênico DBN9004.
[0173] Verificou-se que as posições 1-1268 dos nucleotídeos de SEQ ID No: 5 mostraram ser o flanco limítrofe direito (sequência de flanqueamento 5’) da sequência inserida do evento de soja transgênico DBN9004 na sequência do genoma de soja e as posições 6068-7059 dos nucleotídeos de SEQ ID No: 5 mostraram ser o flanco limítrofe esquerdo (sequência de flanqueamento 3’) sequência inserida do evento de soja transgênico DBN9004 na sequência do genoma de soja. A sequência de conjugação 5’ foi listada na SEQ ID No: 1 e a sequência de conjugação 3’ foi listada na SEQ ID No: 2.
3.3. Ensaio de Conjugação de PCR
[0174] A sequência de conjugação é uma molécula de polinucleotídeo relativamente curta, que é uma nova sequência de DNA que é diagnóstica para o DNA do evento de soja transgênico DBN9004 quando a sequência de conjugação é detectada em um ensaio de ácido polinucleico. As sequências de conjugação em SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2 são 11 polinucleotídeos em cada lado do local de inserção dos fragmentos transgênicos e o DNA genômico de soja no evento de soja transgênico DBN9004. Uma sequência de conjugação de polinucleotídeos mais longa ou mais curta pode ser selecionada de SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 4. As sequências de conjugação (região de ligação 5’ SEQ ID No: 1 e região de ligação 3’ SEQ ID No: 2) são úteis como sondas de DNA ou moléculas do iniciador de DNA nos métodos de detecção de DNA. As sequências de conjugação SEQ ID No: 6 e SEQ ID No: 7 também são novas sequências de DNA no evento de soja transgênico DBN9004 e também podem ser usadas como sondas de DNA ou moléculas do iniciador de DNA para detectar a presença do DNA do evento de soja transgênico DBN9004. A SEQ ID No: 6 (posições 741-872 de nucleotídeos de SEQ ID No: 3) abrange a sequência de DNA de construto pDBN4003 e sequência de terminador t35S e a SEQ ID No: 7 (posições 170-287 de nucleotídeos de SEQ ID No: 4) abrange a sequência promotora prGm17gTsf1 e sequência de DNA de construto pDBN4003.
[0175] Em adição, um amplicon é gerado usando pelo menos um iniciador da SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 4 e o iniciador quando usado no método de PCR é usado para a geração de um amplicon de diagnóstico do evento de soja transgênico DBN9004.
[0176] Especificamente, um produto de PCR é gerado da posição 5’ - terminal da sequência transgênica inserida e é uma parte do DNA genômico que flanqueia na posição 5’ - terminal da sequência inserida de T-DNA no genoma contendo os materiais vegetais derivados do evento de soja transgênico DBN9004. Este produto de PCR compreende SEQ ID No: 3. A fim de realizar a amplificação PCR, o iniciador 5 (SEQ ID No: 8) hibridizado com a sequência de DNA genômico flanqueando na posição 5’ - terminal da sequência transgênica inserida e o iniciador 6 (SEQ ID No: 9) que é emparelhado com o iniciador 5 e localizado na sequência de terminação de transcrição t35S transgênica são projetados.
[0177] Um produto de PCR é gerado da posição 3’ - terminal da sequência transgênica inserida e compreende uma parte do DNA genômico que flanqueia na posição 3’ - terminal da sequência inserida de T-DNA no genoma contendo os materiais vegetais derivados do evento de soja transgênico DBN9004. Este produto de PCR compreende SEQ ID No: 4. A fim de realizar a amplificação PCR, o iniciador 8 (SEQ ID No: 11) hibridizado com a sequência de DNA genômico flanqueando na posição 3’ - terminal da sequência transgênica inserida e o iniciador 7 (SEQ ID No: 10), que é emparelhado com o iniciador 8 e localizado na posição 3’ - terminal do inserção da sequência promotora prGm17gTsf1.
[0178] As condições da amplificação de DNA descritas nas Tabelas 2 e 3 podem ser usadas para a conjugação de PCR mencionada acima para produzir um amplicon de diagnóstico do evento de soja transgênico DBN9004. A detecção de amplicons pode ser realizada usando Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 ou Eppendorf Mastercycler Gradien termociclador, etc. ou por métodos e dispositivos conhecidos por um técnico no assunto. Tabela 2. As etapas de PCR e condições de mistura de reação para a identificação da região de conjugação genômica/de inserção transgênico 5’ do evento de soja transgênico DBN9004 Tabela 3. Condições do termociclador Perkin-Elmer 9700
[0179] Os materiais foram misturados suavemente, se não houve qualquer tampa de isolamento no termociclador, 1-2 gotas de óleo mineral poderiam ser adicionadas acima de cada solução de reação. PCR foi realizada usando os parâmetros do ciclo acima (Tabela 3) no termociclador Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJ R-Biorad, Hercules, CA) Perkin- Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA) ou Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). O termociclador MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient deve ser executado no modo de cálculo. A velocidade da rampa de temperatura deve ser ajustada no valor máximo ao executar o termociclador Perkin-Elmer 9700.
[0180] Os resultados experimentais sugeriram que: quando iniciadores 5 e 6 (SEQ ID NOs: 8 e 9) foram usados na reação PCR do DNA genômico do evento de soja transgênico DBN9004, um produto de amplificação do fragmento com 1207 bp será produzido; quando os iniciadores foram usados nas reações PCR do DNA genômico de soja não transformado e DNA genômico de soja não DBN9004, nenhum fragmento será amplificado; quando iniciadores 7 e 8 (SEQ ID NOs: 10 e 11) foram usados na reação PCR do DNA genômico do evento de soja transgênico DBN9004, um produto de amplificação do fragmento com 631 bp será produzido; quando os iniciadores foram usados nas reações PCR do DNA genômico de soja não transformado e DNA genômico de soja não DBN9004, nenhum fragmento será amplificado.
[0181] O ensaio de conjugação de PCR também pode ser usado para identificar se um material derivado do evento de soja transgênico DBN9004 é um homozigoto ou um heterozigoto. O iniciador 9 (SEQ ID No: 12), iniciador 10 (SEQ ID No: 13) e iniciador 11 (SEQ ID No: 14) foram usados para a reação de amplificação para produzir um amplicon de diagnóstico do evento de soja transgênico DBN9004. A amplificação das condições de DNA descritas nas Tabelas 4 e 5 pode ser usada para o ensaio de conjugação mencionado acima para produzir um amplicon de diagnóstico do evento de soja transgênico DBN9004. Tabela 4. Solução de reação do ensaio de conjugação Tabela 5. Condições do termociclador Perkin-Elmer 9700 do ensaio de conjugação
[0182] PCR foi realizada usando os parâmetros do ciclo acima (Tabela 5) no termociclador Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, CA), MJ Engine (MJ R-Biorad, Hercules, CA) Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA) ou Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). O termociclador MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient deve ser executado no modo de cálculo. A velocidade da rampa de temperatura deve ser ajustada ao valor máximo ao executar o termociclador Perkin-Elmer 9700.
[0183] Na reação de amplificação, a amostra biológica contendo o DNA modelo contém DNA para diagnosticar a presença do evento de soja transgênico DBN9004 na amostra; ou a reação produzirá dois amplicons de DNA diferentes da amostra biológica contendo DNA derivado do genoma de soja, o DNA derivado do genoma de soja é heterozigoto com relação ao alelo que corresponde ao DNA inserido presente no evento de soja transgênico DBN9004. Estes dois amplicons diferentes corresponderão a um primeiro amplicon derivado do local do genoma de soja do tipo selvagem e um segundo amplicon que diagnostica a presença do DNA de evento de soja transgênico DBN9004. Somente a amostra do DNA de soja que corresponde a um único amplicon do segundo amplicon descrito para o genoma heterozigoto é produzida, a presença do evento de soja transgênico DBN9004 na amostra pode ser assim diagnosticada e determinada e a amostra é produzida pelas sementes de soja que são homozigotas com relação ao alelo que corresponde ao DNA inserido presente na planta de soja transgênica DBN9004.
[0184] Deve-se observar que os pares de iniciador do evento de soja transgênico DBN9004 foram usados para gerar amplicons que são diagnósticos para o DNA genômico do evento de soja transgênico DBN9004. Estes pares de iniciadores incluem mas não se limita a, iniciadores 5 e 6 (SEQ ID NOs: 8 e 9) e iniciadores 7 e 8 (SEQ ID NOs: 10 e 11) para o uso no método de amplificação de DNA descrito acima. Em adição, um par de iniciadores de controle dos iniciadores 12 e 13 (SEQ ID NOs: 22 e 23) usados para amplificar o gene endógeno de soja foi incluído como um padrão interno para as condições de reação. A análise da amostra da extração de DNA do evento de soja transgênico DBN9004 deve incluir um controle do extrato de DNA de tecido positivo do evento de soja transgênico DBN9004, um controle do extrato de DNA negativo derivado do evento de soja não transgênico DBN9004 e um controle negativo livre do extrato de DNA da soja modelo. Em adição a estes pares de iniciadores, quaisquer dos pares de iniciador de SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 4 ou sequências complementares deste também podem ser usados e, quando eles são usados nas reações de amplificação de DNA, amplicons contendo SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2 os quais são diagnósticos com relação aos tecidos derivados da planta de soja do evento transgênico DBN9004 serão produzidos, respectivamente. As condições de amplificação de DNA descritas nas Tabelas 2-5 podem ser usadas para produzir amplicons de diagnóstico do evento de soja transgênico DBN9004 com pares de iniciadores adequados. Quando testado no método de amplificação de DNA, o extrato contendo DNA da planta ou sementes de soja que produz um diagnóstico de amplicon para o evento de soja transgênico DBN9004 e assim se presume compreender o evento de soja transgênico DBN9004 ou o produto derivado do evento de soja transgênico DBN9004 pode ser usado como um modelo para a amplificação para determinar a presença do evento de soja transgênico DBN9004.
Exemplo 4. Detecção do evento de soja transgênico DBN9004 por hibridização de Southern blot 4.1. Extração de DNA para hibridização de Southern blot
[0185] A análise Southern blot foi realizada usando eventos transformados homozigotos de gerações de T4, T5 e T6. O tecido vegetal foi moído em nitrogênio líquido usando um almofariz e um pilão. 4-5 g do tecido vegetal moído foram ressuspensos em 20 mL de tampão de lise CTAB (Tris 100 mM pH 8,0, EDTA 20 mM pH 8,0, NaCl 1,4 M, 0,2% em v/v de β-mercaptoetanol, 2% em p/v de polivinil-pirrolidona) e incubados em uma temperatura de 65 °C por 60 minutos. Durante o período de incubação, a amostra foi invertida para mistura uniformemente uma vez a cada 10 minutos. Após a incubação, um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico (24 : 1) foi adicionado e misturado suavemente por inversão, então centrifugado em uma velocidade rotacional de 4000 rpm por 20 minutos. A fase aquosa foi coletada e deixada em uma temperatura de -20 °C por 1 hora após a adição de um volume igual de isopropanol, de modo a precipitar o DNA, então centrifugado em uma velocidade rotacional de 4000 rpm por 5 minutos para obter o precipitado de DNA que foi então ressuspenso em 1 mL de tampão TE. A fim de degradar qualquer RNA existente, o DNA foi incubado em uma temperatura de 37 °C por 30 minutos com 5 μL de RNAase A com uma concentração de 30 mg/mL, então centrifugado em uma velocidade rotacional de 4000 rpm por 5 minutos e então centrifugado em uma velocidade rotacional de 14.000 rpm por 10 minutos para precipitar o DNA na presença de 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2 volumes de etanol anidro. Após o sobrenadante ser descartado, o precipitado foi lavado com 1 mL de 70% (v/v) de etanol, seco e então redissolvido em 1 mL de tampão TE. As concentrações dos DNAs genômicos das amostras mencionadas acima foram detectadas usando um ultramicroespectrofotômetro (NanoDrop 2000, Thermo Scientific).
4.2. Digestão com enzimas de restrição
[0186] Em um sistema de reação de 100 μL, 5 μg de DNA foram digeridos de cada vez. O DNA genômico foi digerido com enzimas de restrição EcoRI e EcoRV, respectivamente, com sequências parciais de EPSPS e PAT em T- DNA como sondas. Para cada enzima, os produtos de digestão foram incubados durante a noite em uma temperatura apropriada. A amostra foi girada com um concentrador de vácuo centrífugo (speed vacuum, Thermo Scientific) para reduzir o volume a 20 μL.
4.3. Eletroforese em Gel
[0187] O corante azul de bromofenol de carregamento foi adicionado a cada amostra do Exemplo 4.2 e cada amostra foi carregada em 0,7% de gel de agarose contendo brometo de etídio, então separada por eletroforese em tampão de eletroforese TAE (ácido Tris-acético 40 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) e a eletroforese em gel foi executada durante a noite em 20 volts.
[0188] O gel foi tratado com uma solução de desnaturação (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) e uma solução de neutralização (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M, pH 7,2) por 30 min, respectivamente. 5 x SSC foi derramado em uma placa de porcelana, uma peça de vidro foi coberta e então uma ponte de papel de filtro úmido, um gel, uma película de náilon carregada positivamente (Roche, Cat. No. 11417240001), um papel filtro de três camadas, uma torre de papel e um objeto pesado foram colocados sucessivamente. Após o trans-blotting durante a noite à temperatura ambiente, a membrana de náilon foi enxaguada em 2 x SSC por 10 segundos e o DNA foi imobilizado na membrana por reticulação por UV.
4.4. Hibridização
[0189] A sequência de DNA apropriada foi amplificada por PCR para a preparação da sonda. As sondas de DNA são SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 ou são homólogas ou complementares às sequências acima. A marcação DIG de sondas, hibridização southern blot, detecção de sinal e outras operações foram realizadas usando o kit II de marcação e detecção de digoxina altamente eficiente de DNA (kit DIG High Prime DNA labelling and Detection Starter Kit II, Roche, Cat. No. 1585614910) e os métodos específicos podem se referir a suas especificações de produto.
[0190] Cada Southern contém duas amostras de controle: (1) DNA de um segregante negativo (não transformado), que é usado para identificar qualquer sequência de soja endógena que pode hibridizar em uma sonda específica do elemento; (2) um plasmídeo pDBN4003 digerido por Hind III equivalente a um número de cópias com base em um comprimento da sonda, que é usado como um controle positivo para hibridização e usado para ilustrar a sensibilidade do experimento.
[0191] Os dados de hibridização proveram evidência corroborativa para suportar a análise de PCR TaqManTM, isto é, a planta de soja DBN9004 contém cópias únicas dos genes EPSPS e PAT. As bandas únicas de cerca de 11 kb e 13 kb foram geradas pela digestão de EcoR I e EcoR V usando a sonda EPSPS, respectivamente; as bandas únicas de cerca de 8 kb e 3,2 kb foram geradas pela digestão de EcoR I e EcoR V usando a sonda PAT, respectivamente. Isto indicou que cada cópia de EPSPS e PAT estão presentes no evento transformado de soja DBN9004.
Exemplo 5. Detecção do evento de soja transgênico denominado proteína por ELISA
[0192] A faixa de expressão de EPSPS e proteínas PAT no evento de soja transgênico DBN9004 pode ser detectada por ELISA.
[0193] 2 mg de folhas frescas de evento de soja transgênico DBN9004 foram tirados como a amostra e moídos em nitrogênio líquido, seguido pela adição de 1 mL do tampão do extrato (8 g/L de NaCl, 0,27 g/L de KH2PO4, 1,42 g/L de Na2HPO4, 0,2 g/L de KCl e 5,5 mL/L de Tween-20, pH 7,4), então centrifugação em uma velocidade rotacional de 4000 rpm por 10 minutos, diluição do sobrenadante 40 vezes com o tampão do extrato e retirada de 80 μL do sobrenadante diluído para a detecção de ELISA.
[0194] As proporções das quantidades de proteínas (proteína EPSPS e proteína PAT) na amostra em peso das folhas frescas foram medidas e analisadas por kits ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima) (ENVIRLOGIX Company, kit EPSPS e kit PAT). Os métodos específicos podem se referir a suas especificações do produto. Ao mesmo tempo, as folhas das plantas de soja do tipo selvagem (não transgênico, NGM) foram usadas como controles e detectadas e analisadas de acordo com o método mencionado acima e, repetições sêxtuplas foram ajustadas para cada planta.
[0195] Os resultados experimentais dos conteúdos de proteínas (proteína EPSPS e proteína PAT) do evento de soja transgênico DBN9004 são como mostrados na Tabela 6. As proporções de quantidades de expressão médias de proteínas EPSPS em folhas frescas de evento de soja transgênico DBN9004 e plantas de soja do tipo selvagem em peso de folhas frescas (μg/g) foram determinadas como sendo 230,9 e 0, respectivamente; e as proporções de quantidades de expressão médias de proteínas PAT em folhas frescas de evento de soja transgênico DBN9004 e plantas de soja do tipo selvagem em peso de folhas frescas (μg/g) foram 200,1 e 0, respectivamente. Tabela 6. Resultados médios da medição de quantidades de expressão (μg/g) de proteínas de evento de soja transgênico DBN9004
Exemplo 6. Detecção da tolerância a herbicida de evento de soja transgênico DBN9004
[0196] Neste experimento, herbicida Roundup (41% de agente aquoso de sal de glifosato de isopropilamônio) e herbicida Basta (com um ingrediente ativo de 18% de glufosinato) foram usados para pulverizar. O design de bloco aleatório foi usado com 3 réplicas. A área do gráfico é 18 m2 (5 m x 3,6 m), com um espaçamento entre fileiras de 60 cm, um espaçamento entre as plantas de 8 cm, o cultivo convencional e gerenciamento são usados e há uma zona de isolamento ampla de 1 m entre os gráficos. Os seguintes 3 tipos de tratamento foram realizados no evento de soja transgênico DBN9004: 1) nenhum herbicida foi pulverizado e as ervas daninhas foram controladas artificialmente; 2) herbicida Roundup foi pulverizado em uma dose de 1680 g de a.e./ha. (a.e./ha se refere ao “ingrediente ativo ácido equivalente por hectare”) durante o estágio de folha V3, então herbicida Roundup foi pulverizado novamente durante o estágio R2 (estágio de floração total) na mesma dose; 3) herbicida Basta foi pulverizado em uma dose de 800 g de a.i./ha. (a.i./ha se refere ao “ingrediente ativo por hectare”) durante o estágio de folha V3, então herbicida Basta foi pulverizado novamente durante o estágio V6 na mesma dose; 4) herbicida Basta foi pulverizado em uma dose de 800 g de a.i./ha durante o estágio de folha V3, então herbicida Roundup foi pulverizado em uma dose de 1680 g de a.e./ha durante o estágio R2. Um experimento de controle paralelo foi realizado com plantas de soja do tipo selvagem (não transgênicas, NGM). Deve-se observar que a conversão de herbicidas glifosato de conteúdos diferentes e formas de dosagem na forma de equivalente de ácido glifosato e a conversão de soluções de glufosinato de concentrações diferentes no equivalente de ingrediente ativoglufosinato descrito acima foram aplicadas às seguintes conclusões.
[0197] Os sintomas de fitotoxicidade foram investigados em 1 semana e 2 semanas após a administração e o rendimento de soja no gráfico foi medido no momento da colheita. A classificação dos sintomas de fitotoxicidade foi mostrada como na Tabela 7. A taxa de dano do herbicida foi usada como um índice para avaliar a tolerância a herbicida do evento transformado. Especificamente, a taxa de dano do herbicida (%) = ∑ (número de plantas danificadas do mesmo nível x número de nível) / (número total de plantas x o nível mais alto); em que a taxa de dano do herbicida inclui a taxa de dano do glifosato e a taxa de dano do glufosinato e a taxa de dano do herbicida foi determinada com base nos resultados da investigação de fitotoxicidade 2 semanas após o tratamento com glifosato ou glufosinato. O rendimento de soja em cada gráfico é o rendimento total (peso) dos grãos de soja pesados nas três fileiras do meio de cada gráfico. A diferença em rendimento entre os tratamentos diferentes é medida em uma forma de percentual de rendimento, em que percentual de rendimento (%) = rendimento com pulverização/rendimento sem pulverização. Os resultados da tolerância a herbicida de evento de soja transgênico DBN9004 e rendimento de soja foram como mostrados na Tabela 8. Tabela 7. Padrões de classificação do grau de fitotoxicidade causado por herbicidas a sojas. Tabela 8. Os resultados da tolerância a herbicida de evento de soja transgênico DBN9004 e resultados do teste de rendimento
[0198] Os resultados mostraram que, no que se refere à taxa de dano do herbicida (glifosato e glufosinato): 1) a taxa de dano de evento de soja transgênico DBN9004 foi substancialmente 0 sob o tratamento do herbicida glifosato (1680 g de a.e./ha); 2) a taxa de dano de evento de soja transgênico DBN9004 também foi substancialmente 0 sob o tratamento de herbicida glufosinato (800 g de a.i./ha); 3) a taxa de dano de evento de soja transgênico DBN9004 também foi substancialmente 0 sob o tratamento de herbicida glufosinato (800 g de a.i./ha) e herbicida glifosato (1680 g de a.e./ha); assim, o evento de soja transgênico DBN9004 tem boa tolerância a herbicida (glifosato e glufosinato).
[0199] No que se refere ao rendimento: o rendimento do evento de soja transgênico DBN9004 foi levemente aumentado sob três tratamentos de pulverização com herbicida glifosato (1680 g de a.e./ha), herbicida glufosinato (800 g de a.i./ha), e herbicida glufosinato (800 g de a.i./ha) + herbicidas glifosato (1680 g de a.e./ha) comparado com o tratamento sem pulverização, dessa forma, indicando adicionalmente que o evento de soja transgênico DBN9004 tinha boa tolerância a herbicida (glifosato e glufosinato).
Exemplo 7.
[0200] Por exemplo, produtos agrícolas ou commodities podem ser produzidos a partir do evento de soja transgênico DBN9004. Se quantidade de expressão suficiente é detectada nos produtos agrícolas ou commodities, espera-se que os produtos agrícolas ou commodities contenham uma sequência de nucleotídeo capaz de diagnosticar a presença do material do evento de soja transgênico DBN9004 nos produtos agrícolas ou commodities. O alimento ou commodities incluem, mas não se limita a, produtos derivados da planta de soja DBN9004, tais como tortas, pós e óleos de soja, especificamente lecitinas, ácidos graxos, glicerol, esteróis, óleos comestíveis, flocos de soja desengordurados, farinhas de soja desengorduradas e cozidas, coágulos de leite de soja, coalhada de feijão, concentrados de proteína de soja, proteínas de soja isoladas, proteínas vegetais hidrolisadas, proteínas de soja organizadas, fibras de proteína de soja, etc. Um método e/ou kit de detecção de ácido nucleico com base em uma sonda ou par de iniciadores pode ser desenvolvido para detectar uma sequência de nucleotídeo do evento de soja transgênico DBN9004 como mostrado em, por exemplo, SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 2 em uma amostra biológica, em que a sequência de sonda ou sequência do iniciador é selecionada das sequências como mostrado em SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 ou um fragmento desta ou uma sequência complementar desta, para diagnosticar a presença de evento de soja transgênico DBN9004.
[0201] Concluindo, o evento de soja transgênico DBN9004 da presente invenção tem melhor tolerância a um herbicida glifosato e um herbicida glufosinato e não tem qualquer influência sobre o rendimento e o método de detecção pode identificar rápida e precisamente se uma molécula de DNA do evento de soja transgênico DBN9004 está contida em uma amostra biológica.
[0202] As sementes que correspondem ao evento de soja transgênico DBN9004 tinham sido conservadas no China General Microbiological Culture Collection Center (abreviado como CGMCC, endereço: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 3, No. 1 Courtyard, West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing, código postal: 100101) em 27 de novembro de 2015, com classificação e nomenclatura sendo soja (Glycine max) e um número de acesso sendo CGMCC No. 11171. As coleções serão mantidas no depósito por 30 anos.
[0203] Finalmente, deve-se afirmar que as realizações acima são meramente usadas para ilustração em vez de limitação da solução técnica da presente invenção; e embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com referência às realizações preferidas, um técnico no assunto deve compreender que modificações ou substituições equivalentes podem ser feitas na solução técnica da presente invenção sem se afastar do espírito e escopo da solução técnica da presente invenção.

Claims (19)

1. Molécula de ácido nucleico caracterizada pela molécula de ácido nucleico compreender a sequência de ácido nucleico compreendo a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou a SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, em que a molécula de ácido nucleico é derivada de um evento de soja transgênico DBN9004, que está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China; e em que a SEQ ID No: 1 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 2 e sua sequência complementar são completamente complementares.
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sequência de ácido nucleico compreender a SEQ ID No: 3 ou sua sequência complementar, e/ou SEQ ID No: 4 ou sua sequência complementar; e em que a SEQ ID No: 3 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No 4 e sua sequência complementar são completamente complementares.
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela sequência de ácido nucleico compreender a SEQ ID No: 5 ou sua sequência complementar; e em que a SEQ ID No 5 e sua sequência complementar são completamente complementares.
4. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, caracterizado por compreender: - o contato de uma amostra a ser detectada com pelo menos dois tipos de iniciadores para a amplificação de um produto de amplificação de alvo em uma reação de amplificação de ácido nucleico; - a realização da reação de amplificação de ácido nucleico e; - a detecção da presença do produto de amplificação de alvo; em que o produto de amplificação de alvo compreende a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar e/ou a SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, em que o produto de amplificação de alvo é derivado de um evento de soja transgênico DBN9004, que está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China; e em que a SEQ ID No: 1 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 2 e sua sequência complementar são completamente complementares.
5. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo produto de amplificação de alvo compreender adicionalmente a SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar; em que a SEQ ID No: 6 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 7 e sua sequência complementar são completamente complementares.
6. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelos iniciadores compreenderem a SEQ ID No: 8 e SEQ ID No: 9, ou a SEQ ID No: 10 e SEQ ID No: 11.
7. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, caracterizado pelo método compreender: - o contato de uma amostra a ser detectada com uma sonda, em que a sonda compreende a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar ou a SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar e a sonda é derivada de um evento de soja transgênico DBN9004, que está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China; e em que a SEQ ID No: 1 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 2 e sua sequência complementar são completamente complementares; - a hibridização da amostra a ser detectada com a sonda sob condições de hibridização rigorosas e; - a detecção da hibridização da amostra a ser detectada com a sonda.
8. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela sonda compreender adicionalmente pelo menos um selecionado de SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e a SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar; e em que a SEQ ID No: 6 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 7 e sua sequência complementar são completamente complementares.
9. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado por pelo menos uma das sondas ser rotulada com pelo menos um fluoróforo.
10. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, caracterizado por compreender: - o contato da amostra a ser detectada com uma molécula de ácido nucleico marcadora, em que a molécula de ácido nucleico marcadora compreende a SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar, ou a SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar e a molécula de ácido nucleico marcadora é derivada de um evento de soja transgênico DBN9004, que está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China; e em que a SEQ ID No: 1 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 2 e sua sequência complementar são completamente complementares; - a hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcadora sob condições de hibridização rigorosas e; - a detecção da hibridização da amostra a ser detectada com a molécula de ácido nucleico marcadora, e adicionalmente realizar a análise de reprodução assistida por marcadores para a determinação da linkage genética entre a tolerância a glifosato e/ou a tolerância a glufosinato e a molécula de ácido nucleico marcadora em genética.
11. Método para a detecção da presença do DNA de um evento de soja transgênico DBN9004 em uma amostra, de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pela molécula de ácido nucleico marcadora compreender adicionalmente pelo menos um selecionado de SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar; em que a SEQ ID No: 6 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 7 e sua sequência complementar são completamente complementares.
12. Kit de detecção de DNA caracterizado por compreender pelo menos uma molécula de DNA, em que a molécula de DNA compreende SEQ ID No: 1 ou sua sequência complementar ou SEQ ID No: 2 ou sua sequência complementar, e a molécula de DNA pode agir como um iniciador de DNA ou uma sonda específica para o evento de soja transgênico DBN9004 ou suas descendentes, em que a molécula de DNA é derivada de um evento de soja transgênico DBN9004, que está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China; e em que a SEQ ID No: 1 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 2 e sua sequência complementar são completamente complementares.
13. Kit de detecção de DNA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por quando agindo como uma sonda, a molécula de DNA compreende adicionalmente pelo menos um selecionado de SEQ ID No: 6 ou sua sequência complementar e SEQ ID No: 7 ou sua sequência complementar; e em que a SEQ ID No: 6 e sua sequência complementar, e a SEQ ID No: 7 e sua sequência complementar são completamente complementares.
14. Método para a produção de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato caracterizado por compreender - cruzar uma planta de soja compreendendo, em seu genoma, SEQ ID No: 1, nucleotídeos 1343-6000 da SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 2 em sequência, com outra planta de soja, produzindo assim uma pluralidade de plantas descendentes; - tratar as plantas descentes com herbicida glifosato e/ou herbicida glufosinato; e, - selecionar as plantas descendentes que são tolerantes a glifosato e/ou glufosinato, e compreendem SEQ ID No: 1, nucleotídeos 1343-6000 da SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 2 em sequência em seu genoma, ou compreendem SEQ ID No: 5 em seu genoma.
15. Método para a produção de uma planta de soja tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender: - a hibridização sexual de um primeiro parente de planta de soja do evento de soja transgênico DBN9004 que é tolerante a um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato com um segundo parente de planta de soja que carece de tolerância a glifosato e/ou glufosinato para produzir um grande número de plantas descendentes; - o tratamento das plantas descendentes com um herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato e; - a seleção das plantas descendentes as quais são tolerantes a glifosato e/ou glufosinato em que o evento de soja transgênico DBN9004 está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China.
16. Método para o cultivo de uma planta de soja tolerante a herbicida glifosato e/ou um herbicida glufosinato, caracterizado por compreender: - o plantio de pelo menos uma semente de soja, em que a semente de soja compreende em seu genoma a sequência de ácido nucleico de uma região específica, e a sequência de ácido nucleico de uma região específica compreendendo a SEQ ID No: 1, nucleotídeos 1343-6000 da SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 2 em sequência, ou a sequência de ácido nucleico de uma região específica que compreende SEQ ID No: 5; - o crescimento da semente de soja em uma planta de soja e; - a pulverização da planta de soja com uma quantidade eficaz de um herbicida glifosato e/ou herbicida glufosinato, e colheita da planta com dano reduzido à planta comparado a outras plantas que não compreendem a sequência de ácido nucleico da região específica.
17. Método para a proteção de uma planta contra o dano causado por um herbicida caracterizado por compreender a aplicação de um herbicida contendo uma dose eficaz de glifosato e/ou glufosinato a um campo para o plantio de pelo menos uma planta de soja transgênica, em que a planta de soja transgênica compreende, em seu genoma, a SEQ ID No: 1, nucleotídeos 13436000 da SEQ ID No: 5 e SEQ ID No: 2 em sequência, ou a planta de soja transgênica compreende a SEQ ID No: 5 em seu genoma, e a planta de soja transgênica tem tolerância ao herbicida glifosato e/ou o herbicida glufosinato.
18. Método para o controle de ervas daninhas em um campo de planta de soja, caracterizado por compreender o evento de soja transgênico DBN9004, em que compreende a aplicação de um herbicida contendo uma dose eficaz de glifosato e/ou glufosinato a um campo, em que a planta de soja transgênica tem tolerância a herbicida glifosato e/ou a herbicida glufosinato, em que o evento de soja transgênico DBN9004 está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China.
19. Método para o controle de ervas daninhas resistentes à glifosato em um campo de planta tolerante a glifosato, caracterizado por compreender o evento de soja transgênico DBN9004, em que compreende aplicação de um herbicida contendo uma quantidade eficaz de glufosinato a um campo, em que a planta de soja transgênica tolerante ao glifosato tem tolerância ao herbicida glufosinato ao mesmo tempo, em que o evento de soja transgênico DBN9004 está depositado como uma semente sob o número de acesso CGMCC No. 11171 no Centro Microbiológico Geral do Comitê de Gerenciamento de Coleção de Culturas Microbiológicas da China.
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