CN106086010B - 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9008的核酸序列及其检测方法 - Google Patents

用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9008的核酸序列及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法，所述大豆植物的核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列。本发明转基因大豆事件DBN9008对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件DBN9008的DNA分子。

Description

用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检 测方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种耐受草甘膦和草铵膦的大豆植物DBN9008和检测生物样品中是否包含特定转基因大豆事件DBN9008的DNA分子的方法。
背景技术
N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘膦，是一种内吸传导型慢性广谱灭生性除草剂。草甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争性抑制剂，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸这两种底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的转化，从而阻断芳香族氨基酸合成前体-莽草酸的合成途径，使蛋白质的合成受到干扰导致植物和细菌死亡。
草甘膦耐受性可以通过表达修饰的EPSPS来实现。修饰的EPSPS对草甘膦具有更低的亲和性，因而在草甘膦存在的情况下，EPSPS保持了它们的催化活性，即获得了草甘膦耐受性。
大豆(Glycine max)是世界五大主栽作物之一。在大豆生产中除草剂耐受性是一项重要的农艺性状，特别是对草甘膦除草剂的耐受性。大豆对草甘膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦除草剂耐受型基因(EPSPS，CP4)在大豆植物中表达而获得，例如大豆事件GTS40-3-2、大豆事件MON89788等。
草甘膦耐受性耕种系统的普遍采用和草甘膦使用的日益增加已经导致近年来草甘膦抗性杂草的流行。在种植者面对草甘膦抗性杂草或向更难以控制的杂草物种转变的地区，种植者可以通过与能够控制遗漏杂草的其他除草剂混合或交替使用来补偿草甘膦的弱点。
草铵膦是膦丝菌素类除草剂中的一种非系统性、非选择性除草剂。主要用于一年生或多年生阔叶杂草的出土后控制，是通过L-膦丝菌素(草铵膦中的活性成分)对谷氨酰胺合酶(一种对于植物中的氨解毒必需的酶)的不可逆抑制来控制杂草的。与草甘膦杀根不同，草铵膦先杀叶，通过植物蒸腾作用可以在植物木质部进行传导，其速效性间于百草枯和草甘膦之间。
从链霉菌分离的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)通过乙酰化催化L-膦丝菌素转化为其无活性形式。表达PAT的植物优化形式的基因已经在大豆中使用以赋予大豆对草铵膦除草剂的耐受性，例如大豆事件A5547-127。因此与草铵膦耐受性性状组合使用草铵膦除草剂可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的非选择性手段。
在未来，随着转基因抗虫大豆的推广以及大面积种植，少量存活下来的昆虫/害虫经过几代繁殖后，可能产生抗性。转基因除草剂耐受性大豆作为非抗虫转基因大豆，与转基因抗虫大豆以一定比例一并种植，可以延缓昆虫/害虫产生抗性。
已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好的适应当地的生长条件。
能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法，转基因大豆事件DBN9008对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含特定转基因大豆事件DBN9008的DNA分子。
为实现上述目的，本发明提供了一种具有以下核酸序列的核酸分子，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
优选地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列。
进一步地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。
更进一步地，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互补序列。
所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列和插入序列的5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9008的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的3’末端的DNA序列和大豆插入位点的侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9008的存在。
本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ IDNO:1的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件DBN9008或其后代的存在。本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其他不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为378个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由220个核苷酸的大豆侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-220)、58个pDBN4003构建体DNA序列中的核苷酸(SEQ ID NO:3的核苷酸221-278)和100个核苷酸的t35S终止子序列的5’末端DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸279-378)组成，包含所述SEQ IDNO:3或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9008的存在。
所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列可作为DNA引物对用于产生扩增产物的DNA扩增方法中。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2的扩增产物时，可以诊断转基因大豆事件DBN9008或其后代的存在。所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为432个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由167个核苷酸的prGm17gTsf1启动子序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1-167)、57个pDBN4003构建体DNA序列中的核苷酸(SEQ ID NO:4的核苷酸168-224)和208个核苷酸的大豆整合位点侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:4的225-432)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9008的存在。
所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因大豆事件DBN9008的长度为6883个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因大豆事件DBN9008的存在。
表1、SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件
所述核酸序列或其互补序列可用于DNA扩增法中以产生扩增子，所述扩增子的检测诊断生物样品中转基因大豆事件DBN9008或其后代的存在；所述核酸序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因大豆事件DBN9008或其后代的存在。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸。
进一步地，所述目标扩增产物包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
更进一步地，所述目标扩增产物包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
在上述技术方案中，至少一种所述引物包括所述核酸序列或其片段或者与之互补的序列。
具体地，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10；所述第二引物选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
所述严格条件可为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
进一步地，所述探针包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
更进一步地，所述探针包含选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
可选择地，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
为实现上述目的，本发明还提供了一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，包括：
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:3或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列中至少11个连续的核苷酸；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定草甘膦耐受性和/或草铵膦耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。
进一步地，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
更进一步地，所述标记物核酸分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种DNA检测试剂盒，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ ID NO:3的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸、和/或SEQID NO:4的同源序列或其互补序列中至少11个连续的核苷酸，其可以作为对于转基因大豆事件DBN9008或其后代具有特异性的DNA引物或探针。
进一步地，所述DNA分子包括SEQ ID NO:1或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列中第1-11位或第12-22位连续核苷酸。
更进一步地，所述DNA分子包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1的同源序列或其互补序列、SEQ ID NO:2的同源序列或其互补序列、SEQ ID NO:6的同源序列或其互补序列、和SEQ ID NO:7的同源序列或其互补序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种植物细胞或部分，包含编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白的核酸序列、编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列和特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列包括选自以下的至少一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植株的方法，包括向所述大豆植株的基因组中引入编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。
具体地，所述产生对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植株的方法包括：
将对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的转基因大豆事件DBN9008第一亲本大豆植株与缺少草甘膦和/或草铵膦耐受性的第二亲本大豆植株有性杂交，从而产生大量子代植株；
用草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂处理所述子代植株；和
选择耐受草甘膦和/或草铵膦的所述子代植株。
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植物的方法，包括：
种植至少一粒大豆种子，所述大豆种子的基因组中包括编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白的核酸序列和/或编码草铵膦耐受性PAT蛋白的核酸序列、以及特定区域的核酸序列；
使所述大豆种子长成大豆植株；和
用有效剂量草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂喷洒所述大豆植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株；
所述特定区域的核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括将含有有效剂量草甘膦和/或草铵膦的除草剂施加到种植至少一种转基因大豆植物的大田中，所述转基因大豆植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因大豆植物具有对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的耐受性。
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制田间杂草的方法，包括将含有有效剂量草甘膦和/或草铵膦的除草剂施加到种植至少一种转基因大豆植物的大田中，所述转基因大豆植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列，所述转基因大豆植物具有对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的耐受性。
为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，包括将含有有效剂量草铵膦的除草剂施加到种植至少一种草甘膦耐受性的转基因大豆植物的大田中，所述草甘膦耐受性的转基因大豆植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQID NO:7所示序列中至少一种核酸序列，所述草甘膦耐受性的转基因大豆植物同时具有对草铵膦除草剂的耐受性。
为实现上述目的，本发明还提供了一种延缓昆虫抗性的方法，包括在种植抗虫大豆植物的大田中种植至少一种具有草甘膦和/或草铵膦耐受性的转基因大豆植物，所述具有草甘膦和/或草铵膦耐受性的转基因大豆植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列中至少一种核酸序列。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸的农产品或商品，所述农产品或商品为卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、大豆片、大豆粉、大豆蛋白或其浓缩物、大豆油、大豆蛋白纤维、豆浆凝块或豆腐。
在本发明用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。
所述“大豆”是指黄豆(Glycine max)，并且包括可以与大豆交配的所有植物品种，包括野生大豆种。
术语“包含”、“包括”是指“包括但不限于”。
术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。
术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。
“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组边界区”或“基因组3’边界序列”等。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组边界区”或“基因组5’边界序列”等。
引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化体，所述不同侧翼区是每个转化体所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化体也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”、“接合区域”是指包含接合点的DNA。
本发明提供了称为DBN9008的转基因大豆事件及其后代，所述转基因大豆事件DBN9008即为大豆植物DBN9008，其包括转基因大豆事件DBN9008的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因大豆事件DBN9008的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、叶、荚和来自大豆植物DBN9008的产物，例如大豆饼、粉和油，具体可以为卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脱脂大豆片、包括脱脂的和烘烤的大豆粉、豆浆凝块、豆腐、大豆蛋白浓缩物、分离的大豆蛋白、水解植物蛋白、组织化大豆蛋白和大豆蛋白纤维。
本发明转基因大豆事件DBN9008包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因大豆事件DBN9008获得对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂的耐受性。所述DNA构建体包含两个串联的表达盒，第一个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，所述EPSPS对草甘膦除草剂具有耐受性。第二个表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)的基因，所述PAT蛋白的核酸序列对草铵膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异性启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、Tsf1启动子、泛素蛋白(Ubiquitin)启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)启动子、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(Patatin)启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(GST)启动子、E9启动子、GOS启动子、alcA/alcR启动子、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)RolD启动子和拟南芥属(Arabidopsis)Suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、来源于豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶E9终止子、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(PINⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活因子、CaMV35S增强子和FMV35S增强子。所述信号肽/转运肽可以引导EPSPS蛋白和/或PAT蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网。
所述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因可以是从土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp.)CP4菌株中分离得到的，且可以通过优化密码子或者以其他方式改变编码EPSPS的多核苷酸，以达到增加转化细胞中转录物的稳定性和可利用性的目的。所述5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因也可以作为选择性标记基因。
所述“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐，用“草甘膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草甘膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草甘膦的除草剂制剂处理包含了来源于除草剂耐受性大豆植物DBN9008的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于除草剂耐受性大豆植物DBN9008的植物材料的生长或产量。
从链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)分离的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(phosphinothricin N-acetyltransferase，PAT)基因通过乙酰化催化L-膦丝菌素转化为其无活性形式，以赋予植物对草铵膦除草剂的耐受性。Phosphinothricin(PTC，2-氨基-4-甲膦酰丁酸)是谷氨酰胺合成酶的抑制剂。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦酰-丙氨酰-丙氨酸的结构单位，此三肽(PTT)具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及抗真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的活性。膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)基因也可以作为选择性标记基因。
所述“草铵膦”又名草丁膦，是指2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，用“草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草铵膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂处理包含了来源于除草剂耐受性大豆植物DBN9008的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于除草剂耐受性大豆植物DBN9008的植物材料的生长或产量。
所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。
所述基因枪转化法即为用包含外源DNA的载体轰击植物细胞(粒子介导的生物弹击转化)。
所述花粉管通道转化法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道(又名花粉管引导组织)，经珠心通道，将外源DNA携带入胚囊。
转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。
DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。
转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生的植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”包括异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”还包括转化体和含有异源DNA的其他品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于转化体亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化体的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA的亲本系(例如原始转化体和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。
本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其他情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。
术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。
本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。
培养对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有耐受性的转基因大豆事件DBN9008，通过以下步骤：首先使第一亲本大豆植物与第二亲本大豆植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本大豆植物由培育自转基因大豆事件DBN9008及其后代的大豆植物组成，该转基因大豆事件DBN9008及其后代是通过利用本发明的对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本大豆植物缺乏对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的耐受性；然后选择对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的施用具有耐受性的子代植株，可以培育出对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植物。这些步骤可以进一步包括使对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的施用具有耐受性的子代植株与第二亲本大豆植物或第三亲本大豆植物进行回交，然后通过施用草甘膦除草剂、草铵膦除草剂或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因大豆事件DBN9008中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植物。
还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。
转Bt基因的大豆能杀死例如鳞翅目的昆虫/害虫，但也存在少量存活下来的昆虫/害虫，经过几代繁殖后，可能产生抗Bt蛋白的抗性昆虫/害虫。为了解决昆虫/害虫产生抗性这个问题，美国环境保护局针对转基因作物的使用给出了如下指导，需提供一定比例的庇护所大豆(可以是非抗虫转基因大豆(如除草剂耐受性转基因大豆，或抗非目标害虫的转基因大豆，或非转基因大豆)。当绝大部分的昆虫/害虫在相应的转基因抗虫大豆上被杀死后，还有一部分昆虫/害虫在庇护所大豆上没有死，保证了没有抗性的昆虫/害虫群体占统治数量。这样即使有少量存活的抗性昆虫/害虫，与占统治数量的非抗性昆虫/害虫交配后抗性基因也被显著的稀释了。
术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因大豆事件DBN9008基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因大豆事件DBN9008或种子还是来源于转基因大豆事件DBN9008的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。
术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。
基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因大豆事件DBN9008的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和大豆基因组侧翼序列，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因大豆事件DBN9008的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。
关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。
术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。
如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定大豆植物是否由含有本发明转基因大豆事件DBN9008通过有性杂交方式产生，或采集自田地的大豆样品是否包含转基因大豆事件DBN9008，或大豆提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因大豆事件DBN9008，从大豆植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因大豆事件DBN9008的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因大豆事件DBN9008也是诊断性的。扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。
可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。PCR扩增方法已经发展到可扩增多达22kb的基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的外源DNA序列和来自转基因大豆事件DBN9008的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因大豆事件DBN9008的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的大豆基因组区的任何部分同源或互补的、以及与SEQ ID NO:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其扩增与转基因大豆事件DBN9008的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:1。用作DNA引物的其他DNA分子可选自SEQ ID NO:5。
这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是遗传位分析(Genetic Bit Analysis)，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
另一种方法是焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。
Chen等(基因组研究(Genome Res.)9:492-498，1999)描述的荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。
Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
基于杂交原理，用于检测来源于除草剂耐受性转基因大豆事件DBN9008的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。
Tyangi等(自然生物技术(Nat.Biotech.)14:303-308，1996)介绍了分子标记在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。
其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。
可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因大豆事件DBN9008的DNA，还可以用于培育含有转基因大豆事件DBN9008的DNA的大豆植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、2、3、4或5的至少一部分，或含有其他DNA引物或探针，其同源于或互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在大豆基因组中含有的以及在图1和表1中说明的转基因插入序列与大豆基因组结合部位的DNA结构包含：位于转基因插入序列5’末端的大豆植物DBN9008侧翼基因组区域，来自农杆菌的左侧边界区域(LB)的一部分插入序列，第一个表达盒由含有增强子区域的串联重复的花椰菜花叶病毒35S启动子(pr35S)，可操作地连接到链霉菌的草铵膦耐受性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(cPAT)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒35S终止子(t35S)上而组成，第二个表达盒由大豆Tsf1基因(编码延伸因子EF-1α)启动子(prGm17gTsf1)，可操作连接到拟南芥EPSPS叶绿体转运肽的编码序列(spAtCTP2)上，可操作连接到土壤杆菌属CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(cEPSPS)上，可操作连接到来自豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的3’非翻译序列(tPse9)上而组成，来自农杆菌的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的大豆植物DBN9008侧翼基因组区域(SEQ ID NO:5)。在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于大豆植物DBN9008中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因大豆事件DBN9008中侧翼大豆基因组的DNA区域的任何部分。
转基因大豆事件DBN9008可以与其他转基因大豆品种组合，例如除草剂耐受性(如2,4-D、麦草畏等)的大豆，或携带其他抗虫基因(如Cry1Ac、Cry2Ab等)的转基因大豆品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因大豆事件DBN9008一起育种，可以提供抗多种虫害并耐受多种除草剂的改良杂种转基因大豆品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。
本发明提供了一种用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法，转基因大豆事件DBN9008耐受含草甘膦和/或草铵膦的农业除草剂的植物毒性作用。该双重性状的大豆植株表达土壤杆菌属菌株CP4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)蛋白，其赋予植物对草甘膦的耐受性，并表达链霉菌的草铵膦抗性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(PAT)蛋白，其赋予植物对草铵膦的耐受性。双重性状大豆具有如下优点：1)施加含草甘膦的农业除草剂给大豆作物用于广谱杂草控制的能力；2)草铵膦耐受性性状组合使用草铵膦除草剂(与草甘膦除草剂混合或交替使用)可以作为一种有效管理草甘膦抗性杂草的非选择性手段；3)除草剂耐受性转基因大豆作为非抗虫转基因大豆，与转基因抗虫大豆以一定比例一并种植，可以延缓昆虫/害虫产生抗性；4)大豆产量没有降低。此外，编码草甘膦耐受性和草铵膦耐受性性状的基因连锁在同一DNA区段上，并且存在于转基因大豆事件DBN9008基因组的单一基因座上，这一点提供了增强的育种效率并使得能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明检测方法中SEQ IDNO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、或者SEQ IDNO:7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因大豆事件DBN9008或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因大豆事件DBN9008的植物材料的存在。
序列简述
SEQ ID NO:1 转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22位核苷酸分别位于大豆基因组上插入位点的两侧；
SEQ ID NO:2 转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，其中第1-11位核苷酸和第12-22位核苷酸分别位于大豆基因组上插入位点的两侧；
SEQ ID NO:3 转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为378个核苷酸的序列；
SEQ ID NO:4 转基因大豆事件DBN9008中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为432个核苷酸的序列；
SEQ ID NO:5 整个T-DNA序列、5’和3’的侧翼大豆基因组序列；
SEQ ID NO:6 位于SEQ ID NO:3内部的序列，跨越了pDBN4003构建体DNA序列中的核苷酸序列和t35S转录终止序列；
SEQ ID NO:7 位于SEQ ID NO:4内部的序列，跨越了prGm17gTsf1启动子序列和pDBN4003构建体DNA序列中的核苷酸序列；
SEQ ID NO:8 扩增SEQ ID NO:3的第一引物；
SEQ ID NO:9 扩增SEQ ID NO:3的第二引物；
SEQ ID NO:10 扩增SEQ ID NO:4的第一引物；
SEQ ID NO:11 扩增SEQ ID NO:4的第二引物；
SEQ ID NO:12 5’侧翼基因组序列上的引物；
SEQ ID NO:13 与SEQ ID NO:12配对的位于T-DNA上的引物；
SEQ ID NO:14 3’侧翼基因组序列上的引物，其与SEQ ID NO:12配对可以检测转基因是纯合子或是杂合子；
SEQ ID NO:15 与SEQ ID NO:14配对的位于T-DNA上的引物；
SEQ ID NO:16 Taqman检测EPSPS的引物1；
SEQ ID NO:17 Taqman检测EPSPS的引物2；
SEQ ID NO:18 Taqman检测EPSPS的探针1；
SEQ ID NO:19 Taqman检测PAT的引物3；
SEQ ID NO:20 Taqman检测PAT的引物4；
SEQ ID NO:21 Taqman检测PAT的探针2；
SEQ ID NO:22 大豆内源基因泛素蛋白(Ubiquitin)的第一引物；
SEQ ID NO:23 大豆内源基因泛素蛋白(Ubiquitin)的第二引物；
SEQ ID NO:24 Southern印迹杂交检测中EPSPS的探针；
SEQ ID NO:25 Southern印迹杂交检测中PAT的探针；
SEQ ID NO:26 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向一致；
SEQ ID NO:27 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:28 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:13方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:29 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向一致；
SEQ ID NO:30 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得侧翼序列；
SEQ ID NO:31 位于T-DNA上的引物，与SEQ ID NO:15方向相反，用作获得侧翼序列。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法的转基因插入序列与大豆基因组接合部位的结构示意图；
图2为本发明用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法的重组表达载体pDBN4003的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明用于检测除草剂耐受性大豆植物DBN9008的核酸序列及其检测方法的技术方案。
第一实施例、克隆与转化
1.1、载体克隆
使用标准的基因克隆技术构建重组表达载体pDBN4003(如图2所示)。所述载体pDBN4003包含两个串联的转基因表达盒，第一个表达盒由大豆Tsf1基因(编码延伸因子EF-1α)启动子(prGm17gTsf1)，可操作连接到拟南芥EPSPS叶绿体转运肽的编码序列(spAtCTP2)上，可操作连接到土壤杆菌属CP4菌株的草甘膦耐受性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(cEPSPS)上，可操作连接到来自豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的3’非翻译序列(tPse9)上而组成；第二个表达盒由含有增强子区域的串联重复的花椰菜花叶病毒35S启动子(pr35S)，可操作地连接到链霉菌的草铵膦耐受性的膦丝菌素N-乙酰基转移酶(cPAT)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒35S终止子(t35S)上而组成。
将所述载体pDBN4003用液氮法转化到农杆菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA；Cat.No：18313-015)中，并且以5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)为选择性标记对转化细胞进行筛选。
1.2、植物转化
采用常规的农杆菌侵染法进行转化，将无菌培养的大豆子叶节组织与本实施例1.1中所述的农杆菌共培养，以将构建的重组表达载体pDBN4003中的T-DNA转入到大豆染色体组中，以产生转基因大豆事件DBN9008。
对于农杆菌介导的大豆转化，简要地，将成熟的大豆种子在大豆萌发培养基(B5盐3.1g/L，B5维他命，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.6)中进行萌发，将种子接种于萌发培养基上，按以下条件培养：温度25±1℃；光周期(光/暗)为16/8h。萌发4-6天后取鲜绿的子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4毫米处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根。用解剖刀的刀背在子叶节处进行创伤，用农杆菌悬浮液接触创伤过的子叶节组织，其中农杆菌能够将EPSPS基因的核苷酸序列和PAT基因的核苷酸序列传递至创伤过的子叶节组织(步骤1：侵染步骤)。在此步骤中，子叶节组织优选地浸入农杆菌悬浮液(OD660＝0.5-0.8，侵染培养基(MS盐2.15g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2-吗啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L，pH5.3)中以启动侵染。子叶节组织与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地，子叶节组织在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、B5维他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2-吗啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素2mg/L、琼脂8g/L，pH5.6)上培养。在此共培养阶段后，有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)2mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，pH5.6)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素150-250mg/L)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，子叶节再生的组织块在含选择剂(草甘膦)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，子叶节再生的组织块在有选择剂的筛选固体培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、琼脂8g/L，头孢霉素150mg/L，谷氨酸100mg/L，天冬氨酸100mg/L，草甘膦异丙胺盐10mg/L，pH5.6)上培养，导致转化的细胞可以继续生长。然后，转化的细胞再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的子叶节再生的组织块在固体培养基(B5分化培养基和B5生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性组织块转移到所述B5分化培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT)1mg/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生长素1mg/L、草甘膦异丙胺盐10mg/L，pH5.6)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述B5生根培养基(B5盐3.1g/L、B5维他命、2-吗啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L、头孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA)1mg/L)，在生根培养上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于26℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。
1.3、转基因事件的鉴定和筛选
一共产生了288个独立转基因T0植株。
通过TaqManTM分析(参见第二实施例)检测再生的转基因大豆植株是否存在EPSPS和PAT基因，并表征耐受草甘膦和草铵膦品系的拷贝数。通过筛选，选定了事件DBN9008是优异的，其具有单拷贝转基因、良好的草甘膦除草剂耐受性、草铵膦除草剂耐受性和农艺性状的表现(参见第六实施例)。
第二实施例、用TaqMan进行转基因大豆事件DBN9008检测
取转基因大豆事件DBN9008的叶片约100mg作为样品，用植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Maxi Kit，Qiagen)提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测EPSPS基因和PAT基因的拷贝数。同时以野生型大豆植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
具体方法如下：
步骤11、取转基因大豆事件DBN9008的叶片100mg，在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；
步骤13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型大豆植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测EPSPS基因序列：
引物1：TTGGTGCTAACCTTACCGTTGAG如序列表中SEQ ID NO:16所示；
引物2：GCTTACCACGACCTTCAAGACG如序列表中SEQ ID NO:17所示；
探针1：CTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATC如序列表中SEQ ID NO:18所示；
以下引物和探针用来检测PAT基因序列：
引物3：CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQ ID NO:19所示；
引物4：TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQ ID NO:20所示；
探针2：CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQ ID NO:21所示；
PCR反应体系为：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μL，100μM浓度的探针50μL和860μlL1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀色试管中。
PCR反应条件为：
利用SDS2.3软件(Applied Biosystems)分析数据，获得单拷贝的转基因大豆事件DBN9008。
第三实施例、转基因大豆事件DBN9008检测
3.1、基因组DNA提取
DNA提取按照常规采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法：取2克幼嫩的转基因大豆事件DBN9008的叶片在液氮中研磨成粉后，加入0.5mL于温度65℃预热的DNA提取CTAB缓冲液(20g/L CTAB，1.4M NaCl，100mM Tris-HCl，20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用NaOH调pH至8.0)，充分混匀后，于温度65℃抽提90分钟；加入0.5倍体积苯酚，0.5倍体积氯仿，颠倒混匀；12000rpm(每分钟转数)转速下离心10分钟；吸取上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻柔晃动离心管，于温度4℃静置30分钟；12000rpm转速下再离心10分钟；收集DNA到管底；弃上清液，用1mL质量浓度为70％的乙醇，洗涤沉淀；12000rpm转速下离心5分钟；真空抽干或在超净台吹干；DNA沉淀溶解于适量的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，保存在温度-20℃条件下。
3.2、侧翼DNA序列的分析
对上述提取的DNA样品进行浓度测定，使待测样品的浓度位于80-100ng/μL之间。用选择出的限制性内切酶PsiI、DraI和TaqI(5’端分析)和AflII、TaqI和PsiI(3’端分析)分别酶切基因组DNA。每个酶切体系中加入26.5μL基因组DNA、0.5μL上述选择出的限制性内切酶、以及3μL酶切缓冲液，酶切1小时。待酶切结束后，向酶切体系中加入70μL无水乙醇，冰浴30分钟，转速12000rpm离心7分钟，弃上清，吹干，之后加入8.5μL双蒸水(dd H2O)、1μL 10XT4-DNA连接酶缓冲液(NEB T4DNA Ligase Reaction Buffer，其具体配方可访问NEB网站或参考https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases、https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer)以及0.5μL T4-DNA连接酶在温度4℃连接过夜。用一系列嵌套引物进行PCR扩增分离5’和3’转基因/基因组DNA。具体的，分离5’转基因/基因组DNA引物组合包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:26作为第一引物，SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28作为第二引物，SEQ ID NO:13作为测序引物。分离3’转基因/基因组DNA引物组合包括SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:29作为第一引物，SEQ ID NO:30、SEQID NO:31作为第二引物，SEQ ID NO:15作为测序引物，PCR反应条件如表3所示。
所获得的扩增子在2.0％琼脂糖凝胶上电泳以分离PCR反应物，随后使用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit，目录#_28704，Qiagen Inc.，Valencia，CA)从琼脂糖基质分离目的片段。然后对纯化的PCR产物测序(例如，ABI PrismTM 377，PE Biosystems，Foster City，CA)并分析(例如，DNASTAR序列分析软件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)。
使用标准PCR方法确认5’和3’侧翼序列和接点序列。5’侧翼序列和接点序列可使用SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12，组合SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:26来确认。3’侧翼序列和接点序列可使用SEQ ID NO:11或SEQID NO:14，组合SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:29来确认。PCR反应体系和扩增条件如表2和表3所示。本领域技术人员将理解，其他引物序列也可用于确认侧翼序列和接点序列。
PCR产物的DNA测序提供了可以用于设计其他DNA分子的DNA，所述其他DNA分子作为引物和探针用于来源于转基因大豆事件DBN9008的大豆植物或种子的鉴定。
发现在SEQ ID NO:5的核苷酸1-1041位显示的为大豆基因组序列在转基因大豆事件DBN9008插入序列的右边界侧翼(5’侧翼序列)，在SEQ ID NO:5的核苷酸5815-6883位显示的为大豆基因组序列在转基因大豆事件DBN9008插入序列的左边界侧翼(3’侧翼序列)。5’接合序列在SEQ ID NO:1中列出，3’接合序列在SEQ ID NO:2中列出。
3.3、PCR接合性测定
接合序列是相对短的多核苷酸分子，其是新的DNA序列，当在多核酸检测分析中检测到时对于转基因大豆事件DBN9008的DNA是诊断性的。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的接合序列为转基因大豆事件DBN9008中转基因片段的插入位点和大豆基因组DNA的每一侧的11个多核苷酸。更长或更短的多核苷酸接合序列可以从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中选择。接合序列(5’连接区域SEQ ID NO:1，和3’连接区域SEQ ID NO:2)作为DNA探针或作为DNA引物分子在DNA检测方法中是有用的。接合序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7也是转基因大豆事件DBN9008中新的DNA序列，其也可以作为DNA探针或作为DNA引物分子检测转基因大豆事件DBN9008DNA的存在。所述SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:3的核苷酸第221-378位)跨越了pDBN4003构建体DNA序列和t35S终止子序列，所述SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:4的核苷酸第1-224位)跨越了prGm17gTsf1启动子序列和pDBN4003构建体DNA序列。
此外，通过使用来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少一个引物来产生扩增子，所述引物用于PCR方法中时产生转基因大豆事件DBN9008的诊断性扩增子。
具体地，从转基因插入序列的5’末端产生PCR产物，该PCR产物为包含来源于转基因大豆事件DBN9008的植物材料的基因组中侧翼于T-DNA插入序列的5’末端的基因组DNA的一部分。这个PCR产物包含SEQ ID NO:3。为了进行PCR扩增，设计与侧翼于转基因插入序列的5’末端的基因组DNA序列杂交的引物5(SEQ ID NO:8)，和与之配对的位于转基因t35S转录终止序列的引物6(SEQ ID NO:9)。
从转基因插入序列的3’末端产生PCR产物，该PCR产物包含来源于转基因大豆事件DBN9008的植物材料的基因组中侧翼于T-DNA插入序列的3’末端的基因组DNA的一部分。这个PCR产物包含SEQ ID NO:4。为了进行PCR扩增，设计与侧翼于转基因插入序列的3’末端的基因组DNA序列杂交的引物8(SEQ ID NO:11)，和与之配对的位于插入物的3’末端的prGm17gTsf1启动子序列的引物7(SEQ IDNO:10)。
表2和表3中说明的DNA扩增条件可以用于上述PCR接合性试验以产生转基因大豆事件DBN9008的诊断性扩增子。扩增子的检测可以通过使用Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradien热循环仪等进行，或通过本领域技术人员已知的方法和设备进行。
表2、用于转基因大豆事件DBN9008的5’转基因插入物/基因组接合区域鉴定的PCR步骤和反应混合物条件
表3、Perkin-Elmer9700热循环仪条件
轻轻地混合，如果热循环仪上没有保温帽，可以在每个反应液上方添加1-2滴矿物油。使用以上循环参数(表3)在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、MJEngine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin-Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)热循环仪上进行PCR。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪应当在计算的模式下运行。Perkin-Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速率(ramp speed)设定为最大值。
实验结果表明：引物5和6(SEQ ID NO:8和9)，当其用在转基因大豆事件DBN9008基因组DNA的PCR反应中时，产生378bp片段的扩增产物，当其用在未转化大豆基因组DNA和非DBN9008大豆基因组DNA的PCR反应中时，没有片段被扩增；引物7和8(SEQ ID NO:10和11)，当其用在转基因大豆事件DBN9008基因组DNA的PCR反应中时，产生432bp片段的扩增产物，当其用在未转化大豆基因组DNA和非DBN9008大豆基因组DNA的PCR反应中时，没有片段被扩增。
PCR接合性测定还可用于鉴定来源于转基因大豆事件DBN9008的材料是纯合子或是杂合子。将引物9(SEQ ID NO:12)、引物10(SEQ ID NO:13)和引物11(SEQ ID NO:14)用于扩增反应以产生转基因大豆事件DBN9008的诊断性扩增子。表4和表5中说明的DNA扩增条件可以用于上述接合性试验以产生转基因大豆事件DBN9008的诊断性扩增子。
表4、接合性测定反应液
表5、接合性测定Perkin-Elmer9700热循环仪条件
使用以上循环参数(表5)在Stratagene Robocycler(Stratagene，La Jolla，CA)、MJ Engine(MJ R-Biorad，Hercules，CA)、Perkin-Elmer 9700(Perkin Elmer，Boston，MA)或Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)热循环仪上进行PCR。MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪应当在计算的模式下运行。Perkin-Elmer 9700热循环仪运行时要将变温速率(ramp speed)设定为最大值。
在所述扩增反应中，含有模板DNA的生物样品含有诊断该样品中转基因大豆事件DBN9008的存在情况的DNA。或者反应将由含有来源于大豆基因组的DNA的生物样品产生两个不同的DNA扩增子，所述来源于大豆基因组的DNA相对于转基因大豆事件DBN9008中存在的插入DNA对应的等位基因是杂合的。这两个不同的扩增子将对应于来源于野生型大豆基因组基因座的第一扩增子和诊断转基因大豆事件DBN9008DNA的存在情况的第二扩增子。仅产生对应于针对杂合基因组描述的第二扩增子的单个扩增子的大豆DNA样品，可诊断确定该样品中转基因大豆事件DBN9008的存在，且该样品由相对于转基因大豆植物DBN9008中存在的插入DNA对应的等位基因为纯合的大豆种子所产生。
需要说明的是，转基因大豆事件DBN9008的引物对被用于产生对转基因大豆事件DBN9008基因组DNA为诊断性的扩增子。这些引物对包括但不限于，引物5和6(SEQ ID NO:8和9)，和引物7和8(SEQ ID NO:10和11)，用于所述的DNA扩增方法中。另外，用于扩增大豆内源基因的一个对照引物12和13(SEQ ID NO:22和23)被包括在内，作为反应条件的一个内在标准。对转基因大豆事件DBN9008的DNA抽提样品分析应该包括一个转基因大豆事件DBN9008的阳性组织DNA抽提物对照，一个来源于非转基因大豆事件DBN9008的阴性DNA抽提物对照和一个不含有模板大豆DNA抽提物的阴性对照。除了这些引物对之外，还可以使用来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、或其互补序列的任何引物对，当它们被用于DNA扩增反应时分别产生对于来源于转基因事件大豆植物DBN9008的组织为诊断性的包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的扩增子。表2-表5中说明的DNA扩增条件可以用于使用合适的引物对以产生转基因大豆事件DBN9008的诊断性扩增子。当在DNA扩增方法中测试时产生对转基因大豆事件DBN9008为诊断性的扩增子的、推定含有包含转基因大豆事件DBN9008的大豆植物或种子DNA的提取物，或来源于转基因大豆事件DBN9008的产物，可以被用作扩增的模板，来确定是否存在转基因大豆事件DBN9008。
第四实施例、通过Southern印迹杂交进行转基因大豆事件DBN9008检测
4.1、用于Southern印迹杂交的DNA提取
利用T4、T5和T6代纯合的转化事件进行Southern印迹分析。利用研钵和研杵，在液氮中中将植物组织磨碎。在20mLCTAB裂解缓冲液(100mM Tris pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl，0.2％v/vβ-疏基乙醇，2％w/v聚乙烯-吡咯烷酮)中重悬浮4-5g研磨过的植物组织，并且在温度65℃下温育60分钟。温育期间，每10分钟将样品颠倒混匀一次。温育后，添加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，通过倒置轻轻混合，以转速4000rpm离心20分钟。收集水相，在添加等体积异丙醇后在温度-20℃下放置1小时以沉淀DNA，再以转速4000rpm离心5分钟得到DNA沉淀，然后在1mL TE缓冲液中重悬浮DNA沉淀。为了降解任何存在的RNA，在温度37℃下，将DNA和浓度为30mg/mL的5μL RNAase A温育30分钟，以转速4000rpm离心5分钟，然后在0.1体积3M醋酸钠和2体积无水乙醇存在的情况下，以转速14000rpm离心10分钟沉淀DNA。弃掉上清液后，用70％(v/v)的1mL乙醇洗涤沉淀，使其干燥后在1mL TE缓冲液中重新溶解。用超微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度。
4.2、限制酶消化
在100μL反应体系中，每次消化5μg DNA。用限制性内切酶EcoRI和EcoRV分别消化基因组DNA，以T-DNA上EPSPS和PAT的部分序列作为探针。对于每种酶，在适当的温度下过夜温育消化物。利用真空离心蒸发浓缩器(speed vacuum，Thermo Scientific)旋转样品以减少体积至20μL。
4.3、凝胶电泳
向来源于本实施例4.2中的每个样品添加溴酚蓝加样染料，并且将每个样品加样到含有溴化乙锭的0.7％琼脂糖凝胶上，在TAE电泳缓冲液(40mM Tris-醋酸，2mM EDTA，pH8.0)中电泳分离，在20伏特下电泳凝胶过夜。
分别用变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)和中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris，pH7.2)处理凝胶各30分钟。在瓷盘中倒入5×SSC，搭上一块玻璃板，然后依次放浸湿的滤纸桥，凝胶，带正电的尼龙膜(Roche，Cat.No.11417240001)，三层滤纸，纸塔，重物。在室温下转膜过夜后，在2×SSC中漂洗尼龙膜10秒，通过UV交联将DNA固定在膜上。
4.4、杂交
用PCR扩增适合的DNA序列用于探针制备。所述DNA探针为SEQ ID NO:24和SEQ IDNO:25，或者与上述序列部分同源或互补。用DNA高效地高辛标记及检测试剂盒II(DIG HighPrime DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒，Roche，Cat.No.11585614910)进行探针的DIG标记、Southern印迹杂交以及信号检测等操作，具体方法参考其产品说明书。
每个Southern上包括两种对照样品：(1)来自阴性(未转化的)的分离子的DNA，其用于鉴定任何可与元件-特异性探针杂交的内源大豆序列；(2)基于探针长度等价于一个拷贝数的Hind III-消化的pDBN4003质粒，其作为杂交的阳性对照并用于说明实验的灵敏度。
杂交数据提供了确证的证据支持TaqManTM PCR分析，即大豆植物DBN9008含有EPSPS和PAT基因的单拷贝。利用该EPSPS探针，EcoR I和EcoR V酶解分别产生大小约4kb和8.5kb的单一条带；利用该PAT探针，EcoR I和EcoR V酶解分别产生大小约6kb和9kb的单一条带。这表明EPSPS和PAT各一个拷贝存在于大豆转化事件DBN9008中。
第五实施例、通过ELISA检测转基因大豆事件DBN9008蛋白质
EPSPS和PAT蛋白质在转基因大豆事件DBN9008中的表达范围，可通过ELISA进行检测。
取2mg转基因大豆事件DBN9008的新鲜叶片作为样品，液氮研磨后加入1mL所述萃取缓冲液(8g/L NaCl，0.27g/L KH2PO4，1.42g/L Na2HPO4，0.2g/L KCl，5.5ml/L Tween-20，pH7.4)，4000rpm的转速下离心10分钟，取上清液用所述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。
用ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒(ENVIRLOGIX公司，EPSPS试剂盒和PAT试剂盒)对样品中蛋白质(EPSPS蛋白和PAT蛋白)量占叶片鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明书。同时以野生型大豆植株叶片(非转基因，NGM)作为对照，按照上述方法进行检测分析，每株重复6次。
转基因大豆事件DBN9008的蛋白质(EPSPS蛋白和PAT蛋白)含量的实验结果如表6所示。分别测得转基因大豆事件DBN9008和野生型大豆植株的新鲜叶片中EPSPS蛋白平均表达量占叶片鲜重的比例(μg/g)分别为210.6和0；转基因大豆事件DBN9008和野生型大豆植株的新鲜叶片中PAT蛋白平均表达量占叶片鲜重的比例(μg/g)分别为320.2和0。
表6、转基因大豆事件DBN9008的蛋白表达量(μg/g)测定平均结果
第六实施例、转基因大豆事件DBN9008的除草剂耐受性检测
本试验选用农达除草剂(41％草甘膦异丙铵盐水剂)和保试达(Basta)除草剂(有效成分18％的草铵膦)进行喷施。采用随机区组设计，3次重复。小区面积为18m2(5m×3.6m)，行距60cm，株距8cm，常规栽培管理，小区之间有1m的宽隔离带。将转基因大豆事件DBN9008分别进行如下3种处理：1)不喷施，人工控草；2)按1680g a.e./ha(a.e./ha是指“活性成分当量酸每公顷”)剂量在V3叶期喷洒农达除草剂，然后在R2期(盛花期)按相同剂量再次喷洒农达除草剂；3)按800g a.i./ha(a.i./ha是指“活性成分每公顷”)剂量在V3叶期喷洒保试达除草剂，然后在V6期按相同剂量再次喷洒保试达除草剂；4)按800g a.i./ha剂量在V3叶期喷洒保试达除草剂，然后在R2期按1680g a.e./ha剂量喷洒农达除草剂。用野生型大豆植株(非转基因，NGM)做平行对照实验。需要说明的是，不同含量和剂型的草甘膦除草剂换算成等量草甘膦酸的形式，以及不同浓度的草铵膦溶液换算成上述等量有效成分草铵膦均适用于以下结论。
分别在用药后1周和2周调查药害症状，并在收获时测定小区的大豆产量。药害症状分级如表7所示。用除草剂受害率作为评价转化事件的除草剂耐受性的指标，具体地，除草剂受害率(％)＝∑(同级受害株数×级别数)/(总株数×最高级别)；其中除草剂受害率包括草甘膦受害率和草铵膦受害率，除草剂受害率是根据草甘膦或草铵膦处理后2周的药害调查结果而确定的。每个小区的大豆产量是称量各小区中间3行的大豆粒总产量(重量)，不同处理间的产量差异以产量百分率的形式进行度量，产量百分率(％)＝喷施产量/不喷施产量。转基因大豆事件DBN9008对除草剂耐受性的结果和大豆产量结果如表8所示。
表7、除草剂对大豆药害程度的分级标准
药害级别 症状描述
1 生长正常，无任何受害症状
2 轻微药害，药害少于10％
3 中等药害，以后能恢复，不影响产量
4 药害较重，难以恢复，造成减产
5 药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产
表8、转基因大豆事件DBN9008对除草剂耐受性的结果和产量测试结果
结果说明，在除草剂(草甘膦和草铵膦)受害率方面：1)转基因大豆事件DBN9008在草甘膦除草剂(1680g a.e./ha)处理下受害率基本为0；2)转基因大豆事件DBN9008在草铵膦除草剂(800g a.i./ha)处理下受害率也基本为0；3)转基因大豆事件DBN9008在草铵膦除草剂(800g a.i./ha)和草甘膦除草剂(1680g a.e./ha)处理下受害率也基本为0；由此，转基因大豆事件DBN9008具有良好的除草剂(草甘膦和草铵膦)耐受性。
在产量方面：转基因大豆事件DBN9008在喷施草甘膦除草剂(1680g a.e./ha)、草铵膦除草剂(800g a.i./ha)和草铵膦除草剂(800g a.i./ha)+草甘膦除草剂(1680g a.e./ha)3种处理下的产量与不喷施处理相比略有增加，由此，进一步表明转基因大豆事件DBN9008具有良好的除草剂(草甘膦和草铵膦)耐受性。
第七实施例
可由转基因大豆事件DBN9008生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的表达量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因大豆事件DBN9008材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述食品或商品包括但不限于来自大豆植物DBN9008的产物，例如大豆饼、粉和油，具体可以为卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇、食用油、脱脂大豆片、包括脱脂的和烘烤的大豆粉、豆浆凝块、豆腐、大豆蛋白浓缩物、分离的大豆蛋白、水解植物蛋白、组织化大豆蛋白和大豆蛋白纤维等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的转基因大豆事件DBN9008核苷酸序列，其中探针序列或引物序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所示的序列或其片段或者与之互补的序列，以诊断转基因大豆事件DBN9008的存在。
综上所述，本发明转基因大豆事件DBN9008对草甘膦除草剂和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，对产量无影响，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因大豆事件DBN9008的DNA分子。
对应于转基因大豆事件DBN9008的种子已于2015年11月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：大豆(Glycine max)，保藏编号为CGMCCNo.11449。保藏物将在保藏处保藏30年。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (23)

1.一种具有以下核酸序列的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列，所述核酸分子源自转基因大豆事件DBN9008，所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或其互补序列、和/或SEQ ID NO:4或其互补序列。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID NO:5或其互补序列。
4.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与用于扩增目标扩增产物的至少两种引物在核酸扩增反应中接触；
进行核酸扩增反应；和
检测所述目标扩增产物的存在；
所述目标扩增产物包括SEQ ID NO:1或其互补序列、和/或SEQ ID NO:2或其互补序列，所述目标扩增产物源自转基因大豆事件DBN9008，所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
5.根据权利要求4所述检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，所述目标扩增产物还包括选自以下的至少一种： SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQID NO:7或其互补序列。
6.根据权利要求4或5所述检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，所述两种引物包括SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9、或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。
7.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与探针接触，所述探针包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列，所述探针源自转基因大豆事件DBN9008，所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
使所述待检测样品和所述探针在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述探针的杂交情况。
8.根据权利要求7所述检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，所述探针还包含选自以下的至少一种： SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
9.根据权利要求7或8所述检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，至少一个所述探针用至少一种荧光基团标记。
10.一种检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，包括：
使待检测样品与标记物核酸分子接触，所述标记物核酸分子包括SEQ ID NO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列，所述标记物核酸分子源自转基因大豆事件DBN9008，所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
使所述待检测样品和所述标记物核酸分子在严格杂交条件下杂交；和
检测所述待检测样品和所述标记物核酸分子的杂交情况，进而通过标记物辅助育种分析以确定草甘膦耐受性和/或草铵膦耐受性与标记物核酸分子在遗传学上是连锁的。
11.根据权利要求10所述检测样品中转基因大豆事件DBN9008的DNA存在的方法，其特征在于，所述标记物核酸分子还包括选自以下的至少一种： SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
12.一种DNA检测试剂盒，其特征在于，包括至少一个DNA分子，所述DNA分子包括SEQ IDNO:1或其互补序列、或者SEQ ID NO:2或其互补序列，其可以作为对于转基因大豆事件DBN9008或其后代具有特异性的DNA引物之一或探针；所述DNA分子源自转基因大豆事件DBN9008，所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
13.根据权利要求12所述DNA检测试剂盒，其特征在于，所述DNA分子作为探针时还包括选自以下的至少一种： SEQ ID NO:6或其互补序列、和SEQ ID NO:7或其互补序列。
14.一种产生对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植株的方法，其特征在于，包括将基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ ID NO:2的大豆植株，与另一种大豆植株杂交，从而产生大量子代植株；选择基因组依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者基因组包含SEQ ID NO:5的子代植株，且所述子代植株具有草甘膦和/或草铵膦耐受性。
15.根据权利要求14所述产生对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植株的方法，其特征在于，包括：
将对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的转基因大豆事件DBN9008第一亲本大豆植株与缺少草甘膦和/或草铵膦耐受性的第二亲本大豆植株有性杂交，从而产生大量子代植株；
用草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂处理所述子代植株；和
选择耐受草甘膦和/或草铵膦除草剂的所述子代植株；
所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
16.一种培养对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂具有耐受性的大豆植物的方法，其特征在于，包括：
种植至少一粒大豆种子，所述大豆种子的基因组中包含特定区域的核酸序列，所述特定区域的核酸序列依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ IDNO:2，或者所述特定区域的核酸序列包含SEQ ID NO:5；
使所述大豆种子长成大豆植株；和
用有效剂量草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂喷洒所述大豆植株，收获与其他不具有特定区域的核酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
17.一种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草甘膦和/或草铵膦的除草剂施加到种植至少一种转基因大豆植物的大田中，所述转基因大豆植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQID NO:2，或者所述转基因大豆植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因大豆植物具有对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的耐受性。
18.一种控制田间杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草甘膦和/或草铵膦的除草剂施加到种植至少一种转基因大豆植物的大田中，所述转基因大豆植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因大豆植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因大豆植物具有对草甘膦除草剂和/或草铵膦除草剂的耐受性。
19.一种控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦抗性杂草的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦的除草剂施加到种植至少一种草甘膦耐受性的转基因大豆植物的大田中，所述草甘膦耐受性的转基因大豆植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述草甘膦耐受性的转基因大豆植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述草甘膦耐受性的转基因大豆植物同时具有对草铵膦除草剂的耐受性。
20.一种延缓昆虫抗性的方法，其特征在于，包括在种植抗虫大豆植物的大田中种植至少一种具有草甘膦和/或草铵膦耐受性的转基因大豆植物，所述具有草甘膦和/或草铵膦耐受性的转基因大豆植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第1100-5757位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述具有草甘膦和/或草铵膦耐受性的转基因大豆植物的基因组中包含SEQ ID NO:5。
21.一种产生自转基因大豆事件DBN9008的农产品或商品，其特征在于，所述农产品或商品为大豆片、大豆粉、大豆蛋白或其浓缩物、大豆油、大豆蛋白纤维、豆浆凝块；所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
22.根据权利要求21所述产生自转基因大豆事件DBN9004的农产品或商品，其特征在于，所述豆浆凝块为豆腐。
23.一种产生自转基因大豆事件DBN9008的农产品或商品，其特征在于，所述农产品或商品为卵磷脂、脂肪酸、甘油、固醇；所述转基因大豆事件DBN9008以种子的形式且以保藏编号CGMCC No.11449保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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