JP7443491B2 - ダイズ植物ｄｂｎ８００２を検出するための核酸配列およびそのための検出方法 - Google Patents

Description

CGMCC CGMCC 17299

本発明は、植物分子生物学の分野に関し、とりわけ農業生物工学研究における遺伝子導入作物育種の分野に関する。特に、本発明は、昆虫抵抗性およびグルホシネート除草剤耐性の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２、ならびに生物学的試料が特異的な遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を含有しているかどうかを検出するための核酸配列、およびその検出方法に関する。

ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）は、世界の５つの主要作物のうちの１つである。ダイズの農業形質および品質の向上のために生物工学がダイズに応用されてきた。除草剤耐性、特にグリホサート除草剤に対する耐性は、ダイズ生産において重要な農業形質である。例えばＧＴＳ４０－３－２、ＭＯＮ８９７８８などのダイズイベントが成功しており、それらは米国などの大規模なダイズ栽植地域において広く生育されている。別の重要な農業形質としては、昆虫抵抗性、とりわけ鱗翅目の昆虫に対する耐性がある。例えばＭＯＮ８７７０１などのダイズイベントが成功しており、それらはブラジルなどの大規模なダイズ栽植地域において広く生育されている。Ｖｉｐタンパク質が、Ｃｒｙタンパク質とは異なる作用機構を有しており、生長期間中の殺虫性タンパク質であり、Ｃｒｙタンパク質抵抗性昆虫を効果的に管理するための手段として使用され得るということは言及に値する。ダイズの鱗翅目抵抗性は、遺伝子導入法によるダイズ植物中の鱗翅目抵抗性遺伝子の発現によって付与され得る。その上、グルホシネート除草剤は、グリホサート除草剤とは異なる作用機構を有しており、非選択的接触型の除草剤であり、グリホサート抵抗性雑草を効果的に管理するための手段として使用され得る。ダイズのグルホシネート除草剤耐性は、遺伝子導入法によるダイズ植物中のグルホシネート除草剤耐性遺伝子（例えばＰＡＴ）の発現によって付与され得る。

ダイズ作物の形質転換に適切な機能的な異質遺伝子（Ｖｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子）を含有する発現ベクターを設計し、それに相当する商業的遺伝子導入ダイズイベントを得ることは非常に重要である。現在まで、ダイズ植物において昆虫を防除するためのＶｉｐタンパク質を応用した成功例はまだ得られていない一方、ダイズ生産において重要な農業形質としての除草剤耐性はほぼ不可欠なものである。従って、商業的に適切で良好なダイズ形質転換イベントには、Ｖｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子が、ダイズにおいて適当な量で発現し、ダイズイベントの収量および他の生理的指標に影響を与えることなく、それらに相当する機能を提供し得るように、ダイズ植物中のＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子のためのベクター設計、２つの発現カセットの間の相互作用、昆虫抵抗性の有効性、除草剤耐性の有効性、ならびに収量および他の植物生理的指標への影響などの因子について、包括的な検討が必要とされる。

植物における外来遺伝子の発現は、おそらく、クロマチンの構造（例えばヘテロクロマチン）、または転写制御エレメント（例えばエンハンサー）の組込み部位への接近のために、染色体上の外来遺伝子の位置によって影響を受けることが知られている。このため、多くの場合、商品化され得るイベント（すなわち導入された標的遺伝子が最適に発現されるイベント）を特定するために、数多くのイベントをスクリーニングする必要がある。例えば、植物および他の生物体において、導入された遺伝子の発現レベルに関してイベント間で大きな差があり得ること、また、発現の空間的または時間的パターンに関する差、例えば様々な植物組織における導入遺伝子の相対的発現の差もあり得ることが認められており、これらの差は、実際の発現パターンと、導入された遺伝子構築物中の転写制御エレメントに基づいて期待される発現パターンとの間に起こり得る相違に反映される。このため、商業用途に期待される導入遺伝子発現のレベルおよびパターンを有する単一イベントのために、通常、数百から数千の異なるイベントを作製し、これらのイベントをスクリーニングする必要がある。期待通りの導入遺伝子の発現のレベルまたはパターンを有するイベントは、従来の育種法を用いた有性異系交配によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するのに有用である。このような交配によって生殖された子孫は、最初の形質転換体の導入遺伝子発現特性を保持している。この手段は、局所的な生育条件によく適合した複数の変種において、信頼性のある遺伝子発現を確実にするために用いられる。

有性交配種の子孫が標的遺伝子を含有しているかどうかを決定するために、特定のイベントの存在を検出できることは有利であろう。また、特定のイベントを検出するための方法は、組換え作物植物に由来する食品類についての市販前の承認および表示を求める規制などの関連規制に準拠するために有益であろう。ポリヌクレオチドプローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなどのポリヌクレオチドを検出するための任意の周知の方法によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子など、よく用いられる遺伝エレメントに焦点を置いている。その結果、このような方法は、挿入された遺伝子導入ＤＮＡに近接した染色体ＤＮＡ（「隣接ＤＮＡ」）の配列がわからない限り、異なるイベント、特に同じＤＮＡ構築物を用いることによって作製された異なるイベントを識別するには有用ではない可能性がある。そのため、ＰＣＲによって特定の遺伝子導入イベントを特定するためには、挿入された導入遺伝子と隣接ＤＮＡとの間の接合部にまたがる１対のプライマー、特に、挿入配列に含まれる第１のプライマーおよび挿入配列に含まれる第２のプライマーが通常用いられる。

本発明の目的は、ダイズ植物ＤＢＮ８００２を検出するための核酸配列およびその検出方法を提供することである。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、良好な昆虫抵抗性ならびに良好なグルホシネート除草剤耐性を有する。当該検出方法は、生物学的試料が、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡ分子を含有しているかどうかを正確かつ迅速に特定することができる。

上記の目的を達成するために、本発明は核酸配列を提供し、その核酸配列は、配列番号３またはその相補的配列の１～６４２番目の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および配列番号３もしくはその相補的配列の６４３～１５２４番目の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、ならびに／または配列番号４もしくはその相補的配列の１～３４７番目の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および配列番号４もしくはその相補的配列の３４８～６５６番目の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む。

好ましくは、当該核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列の１～６４２番目の２２～２５個の連続したヌクレオチド、および配列番号３もしくはその相補的配列の６４３～１５２４番目の２２～２５個の連続したヌクレオチド、ならびに／または、配列番号４もしくはその相補的配列の１～３４７番目の２２～２５個の連続したヌクレオチド、および配列番号４もしくはその相補的配列の３４８～６５６番目の２２～２５個の連続したヌクレオチドを含む。

好ましくは、当該核酸配列は、配列番号１もしくはその相補的配列、および／または配列番号２もしくはその相補的配列を含む。

前記配列番号１またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の５’末端の挿入接合部周辺に位置する２２個のヌクレオチドの配列である。前記配列番号１またはその相補的配列は、ダイズ挿入部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列と挿入配列の５’末端のＤＮＡ配列とにまたがる。従って、配列番号１またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在として特定され得る。前記配列番号２またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の３’末端の挿入接合部周辺に位置する２２個のヌクレオチドの配列である。前記配列番号２またはその相補的配列は、挿入配列の３’末端のＤＮＡ配列とダイズ挿入部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列とにまたがる。従って、配列番号２またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在として特定され得る。

好ましくは、当該核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列、および／または配列番号４もしくはその相補的配列を含む。

本発明の核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列の中のＴ－ＤＮＡ挿入配列の任意の部分における少なくとも１１個もしくはより多くの連続したポリヌクレオチド（第１の核酸配列）、または配列番号３もしくはその相補的配列の中の５’隣接ダイズゲノムＤＮＡ領域の任意の部分における少なくとも１１個もしくはより多くの連続したポリヌクレオチド（第２の核酸配列）の配列とすることができる。さらに、当該核酸配列は、配列番号１全体を含む配列番号３の一部分に対して相同的または相補的な配列とすることができる。第１の核酸配列および第２の核酸配列が一緒に用いられる場合、これらの核酸配列は、増幅産物を作製するＤＮＡ増幅法においてＤＮＡプライマー対として働き得る。ＤＮＡ増幅法で前記ＤＮＡプライマー対を用いることによって作製された増幅産物に配列番号１が含まれれば、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫が存在すると診断することができる。配列番号３またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２におけるＴ－ＤＮＡ挿入配列の５’末端の挿入接合部周辺に位置する１５２４個のヌクレオチドの配列である。配列番号３またはその相補的配列は、ダイズゲノム５’隣接配列からの６４２個のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド１～６４２）、ｐＤＢＮ４００６構築物ＤＮＡ配列からの３８４個のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド６４３～１０２６）、およびｐｒＡｔＡｃｔ２転写起点配列からの４９８個のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド１０２７～１５２４）からなる。従って、配列番号３またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在として特定され得る。

当該核酸配列は、配列番号４もしくはその相補的配列の中のＴ－ＤＮＡ挿入配列の任意の部分における少なくとも１１個もしくはより多くの連続したポリヌクレオチド（第３の核酸配列）、または配列番号４もしくはその相補的配列の中の３’隣接ダイズゲノムＤＮＡ領域の任意の部分における少なくとも１１個もしくはより多くの連続したポリヌクレオチド（第４の核酸配列）の配列とすることができる。さらに、当該核酸配列は、配列番号２全体を含む配列番号４の一部分に対して相同的または相補的な配列とすることができる。第３の核酸配列および第４の核酸配列が一緒に用いられる場合、これらの核酸配列は、増幅産物を作製するＤＮＡ増幅法においてＤＮＡプライマー対として働き得る。ＤＮＡ増幅法で前記ＤＮＡプライマー対を用いることによって作製された増幅産物に配列番号２が含まれれば、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫が存在すると診断することができる。配列番号４またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２におけるＴ－ＤＮＡ挿入配列の３’末端の挿入接合部周辺に位置する６５６個のヌクレオチドの配列である。配列番号４またはその相補的配列は、ｔ３５Ｓ転写ターミネーターのＤＮＡ配列からの１４５個のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド１～１４５）、ｐＤＢＮ４００６構築物ＤＮＡ配列からの２０２個のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド１４６～３４７）、およびダイズゲノム３’隣接配列からの３０９個のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド３４８～６５６）からなる。従って、配列番号４またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在として特定され得る。

さらに、当該核酸配列は、配列番号５またはその相補的配列を含む。

前記配列番号５またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を特徴づける７３４４個のヌクレオチドの配列である。配列番号５に含有される特異的なゲノムおよび遺伝エレメントを表１に示す。配列番号５またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在として特定され得る。

当業者には周知のように、第１、第２、第３、および第４の核酸配列は、ＤＮＡのみからなる必要はなく、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、または、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および１つもしくは複数のポリメラーゼの鋳型として働かない他のヌクレオチドもしくはそれらの類似体の組み合わせを含んでもよい。また、本発明のプローブまたはプライマーは、長さが少なくとも約１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、または２２個の連続したヌクレオチドであるべきであり、それは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に定めるヌクレオチドから選択されてもよい。当該プローブおよびプライマーは、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に定めるヌクレオチドから選択される場合、長さが少なくとも約２１個から約５０個またはより多くの連続したヌクレオチドであってもよい。

当該核酸配列またはそれらの相補的配列をＤＮＡ増幅法で用いてアンプリコンを作製し、そのアンプリコンを用いて生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫の存在を検出することができる。当該核酸配列またはそれらの相補的配列をヌクレオチド検出法で用いて、生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫の存在を検出することができる。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡに相当する存在を検出するための方法も提供し、その方法は、
－核酸増幅反応において標的増幅産物を増幅するための少なくとも２つのプライマーに、検出される試料を接触させる工程と、
－前記核酸増幅反応を行う工程と、
－前記標的増幅産物の存在を検出する工程と、を含み、
前記標的増幅産物は当該核酸配列を含む。

好ましくは、前記標的増幅産物は、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列を含む。

特に、前記プライマーは第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、第１のプライマーは配列番号１、配列番号８、および配列番号１０から選択され、第２のプライマーは配列番号２、配列番号９、および配列番号１１から選択される。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法も提供し、その方法は、
－検出される試料をプローブに接触させる工程であって、そのプローブは当該核酸配列を含む工程と、
－ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記検出される試料を前記プローブとハイブリダイズさせる工程と、
－前記検出される試料の前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程と、を含む。

前記ストリンジェントな条件は、６５℃で６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム）および０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の溶液中でのハイブリダイゼーション、それに続く２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳの溶液、ならびに１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳの溶液における膜洗浄（それぞれで１回）であってもよい。

好ましくは、当該プローブは、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列を含む。

任意選択で、当該プローブの少なくとも１つは、少なくとも１つのフルオロフォアで標識化される。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法も提供し、その方法は、
－検出される試料をマーカー核酸分子に接触させる工程であって、そのマーカー核酸分子は当該核酸配列を含む工程と、
－ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記検出される試料を前記マーカー核酸分子とハイブリダイズさせる工程と、
－前記検出される試料の前記マーカー核酸分子とのハイブリダイゼーションを検出し、さらに、マーカー支援育種解析を行って、昆虫抵抗性および／または除草剤耐性が前記マーカー核酸分子に遺伝的に関連しているかどうかを決定するために工程と、を含む。

好ましくは、前記マーカー核酸分子は、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、および／または配列番号６～１１もしくはその相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡ検出キットも提供し、そのＤＮＡ分子は、当該核酸配列を含み、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして働くことができる。

好ましくは、前記ＤＮＡ分子は、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、昆虫抵抗性Ｖｉｐ３Ａａタンパク質をコード化する核酸配列、グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、および特異的領域の核酸配列を含む植物の細胞も提供し、その特異的領域の核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、および／または配列番号７に定める配列を含む。

好ましくは、前記植物の細胞は、昆虫抵抗性Ｖｉｐ３Ａａタンパク質をコード化する核酸配列、グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、および特異的領域の核酸配列を含み、その特異的領域の核酸配列は、配列番号３および／または配列番号４に定める配列を含む。

好ましくは、前記植物の細胞は、配列番号１、配列番号５の１０３２～６４４４番目の核酸配列、および配列番号２を連続して含むか、または配列番号５に定める配列を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、昆虫の害からダイズ植物を保護するための方法も提供し、その方法は、標的昆虫の餌の中に少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物の細胞を供給する工程を含む。前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞は、そのゲノム中に配列番号１および／または配列番号２に定める配列を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞の摂取は、標的昆虫がさらにその遺伝子導入ダイズ植物を餌にすることを阻害する。

好ましくは、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞は、そのゲノム中に配列番号３および／または配列番号４に定める配列を含む。

好ましくは、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号５の１０３２～６４４４番目の核酸配列、および配列番号２を連続して含むか、または配列番号５を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、ダイズ植物を栽植する圃場において除草剤または雑草防除が引き起こす損傷からダイズ植物を保護するための方法も提供する。その方法は、少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を栽植した前記圃場に有効量のグルホシネート除草剤を使用する工程を含む。その遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に配列番号１および／または配列番号２に定める配列を含み、その遺伝子導入ダイズ植物はグルホシネート除草剤耐性を有する。

好ましくは、前記遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に配列番号３および／または配列番号４に定める配列を含む。

好ましくは、前記遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号５の１０３２～６４４４番目の核酸配列、および配列番号２を連続して含むか、または配列番号５に定める配列を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性のダイズ植物を育種するための方法も提供し、その方法は、
－少なくとも１つのダイズ種子を栽植する工程であって、前記ダイズ種子は、そのゲノム中に、昆虫抵抗性Ｖｉｐ３Ａａタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート除草剤耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、ならびに特異的領域の核酸配列を含むか、または前記ダイズ種子は、そのゲノム中に配列番号５に定める核酸配列を含む、工程と、
－前記ダイズ種子をダイズ植物に生育する工程と、
－前記ダイズ植物を標的昆虫で害し、および／または前記ダイズ植物に有効量のグルホシネート除草剤を散布し、次に特異的領域の核酸配列を含まない他の植物に比べて植物損傷が低減した植物を収穫する工程と、を含み、
前記特異的領域の核酸配列は、配列番号１および／または配列番号２に定める配列であり、好ましくは、前記特異的領域の核酸配列は、配列番号３および／または配列番号４に定める配列である。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性のダイズ植物を作製するための方法も提供し、その方法は、
－第１のダイズ植物のゲノム中に含まれる昆虫抵抗性Ｖｉｐ３Ａａタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート除草剤耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列ならびに特異的領域の核酸配列、または第１のダイズ植物のゲノム中に含まれる配列番号５に定める核酸配列を、第２のダイズ植物に導入することによって、複数の子孫植物を作製する工程と、
－前記特異的領域の核酸配列を含む前記子孫植物を選択する工程であって、その子孫植物も昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性を有する工程と、を含み、
前記特異的領域の核酸配列は、配列番号１および／または配列番号２に定める配列であり、好ましくは、前記特異的領域の核酸配列は、配列番号３および／または配列番号４に定める配列である。

好ましくは、前記方法は、
－遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を、昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性形質を欠いているダイズ植物に有性的に交配することによって、複数の子孫植物を作製する工程と、
－前記特異的領域の核酸配列を含む前記子孫植物を選択する工程と、
－その子孫植物を標的昆虫で害し、および／またはグルホシネートでその子孫植物を処理する工程と、
－昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性を有する前記子孫植物を選択する工程と、を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する農産物または商品も提供し、その農産物または商品は、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、ダイズフレーク、ダイズ粉、ダイズタンパク質もしくはその濃縮物、ダイズ油、ダイズタンパク質繊維、豆乳凝固物、または豆腐である。

本発明に係るダイズ植物を検出するための核酸配列およびその検出方法において、本発明をより明確に定義し、本発明の実施にあたり当業者の指針となるように、以下の定義および方法を提供する。特に明記しない限り、各用語は、当業者による従来の用い方に従って理解されるべきである。

用語「ダイズ」は、グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）を言い、そのダイズと交配することができる全ての植物変種を含み、野生のダイズ種を包含する。

用語「含む」または「含有する」は、「包含するが、限定されない」ことを意味する。

用語「植物」は、植物全体、植物細胞、植物器官、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および植物または植物の部分における無処置である植物細胞を包含し、植物の部分は、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、根端、または葯であり得る。本発明の範囲内で、遺伝子導入植物の部分は、以下に限定されるものではないが、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、花、茎、果実、葉、および根を包含すると理解されるべきである。上述の植物の部分は、本発明のＤＮＡ分子であらかじめ形質転換した遺伝子導入植物またはその子孫に由来し、従って少なくとも部分的に遺伝子導入細胞からなる。

用語「遺伝子」は、特異的なタンパク質を発現する核酸断片を言い、コード配列の前の制御配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の制御配列（３’非コード配列）を包含する。「天然の遺伝子」は、その独自の制御配列を有する自然界で認められる遺伝子を言う。「キメラ遺伝子」は、天然の遺伝子ではない任意の遺伝子を言い、自然界で認められない制御配列およびコード配列を含む。「内在遺伝子」は、天然の遺伝子であり、生物体のゲノムにおけるその自然の位置にあるものを言う。「外来遺伝子」は、異質遺伝子であり、自然にはそれを含有しない生物体のゲノム中に現在は存在しているものであり、また、遺伝子導入の手法を経て受容体細胞に導入された遺伝子も言う。外来遺伝子は、非天然の生物体に挿入された天然の遺伝子またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換の手法によってゲノムに導入された遺伝子である。「挿入部位」または「標的部位」は、組換えＤＮＡが挿入された植物ゲノムにおける部位を言う。

「隣接ＤＮＡ」は、植物などの生物体に自然に存在するゲノム、または、形質転換の手法を経て導入された外来（異種）ＤＮＡ、例えば形質転換イベントに関わる断片を含み得る。従って、隣接ＤＮＡは、天然ＤＮＡと外来ＤＮＡとの組み合わせを包含してもよい。本明細書では、「隣接領域」、「隣接配列」、「隣接ゲノム配列」、または「隣接ゲノムＤＮＡ」とも呼ばれる用語「隣接ＤＮＡ」は、少なくとも３、５、１０、１１、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、１０００、１５００、２０００、２５００、もしくは５０００塩基対またはより多くの塩基対の配列を言い、最初に挿入された外来ＤＮＡ分子のすぐ上流または下流のいずれかに位置し、その外来ＤＮＡ分子に近接している。この隣接領域が下流に位置する場合、この隣接領域はまた、「３’隣接部」または「左境界隣接部」などと称されてもよい。この隣接領域が上流に位置する場合、この隣接領域はまた、「５’隣接部」または「右境界隣接部」などと称されてもよい。

外来ＤＮＡの無作為な組込みをもたらす形質転換の手法により、結果的に、各形質転換体がそれぞれの形質転換体に特異的な異なる隣接領域を含有することになる。組換えＤＮＡが伝統的な交配によって植物に導入される場合、その隣接領域は一般に変えられることはない。形質転換体はまた、異種挿入断片ＤＮＡとゲノムＤＮＡ断片との間、もしくは２つのゲノムＤＮＡ断片の間、または２つの異種ＤＮＡ断片の間に特有な接合部も含有することになる。「接合部」は、２つの特異的なＤＮＡ断片が連結する点である。例えば、接合部は、挿入断片ＤＮＡが隣接ＤＮＡに連結される位置にある。接合点はまた、天然の生物体で認められる様式から改変された様式で２つのＤＮＡ断片が互いに連結されている、形質転換された生物体にもある。「接合部領域」または「接合部配列」は、接合点を含むＤＮＡを言う。

本発明は、ＤＢＮ８００２と呼ばれる遺伝子導入ダイズイベントおよびその子孫を提供する。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、ダイズ植物ＤＢＮ８００２とも称され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の植物および種子を、その植物の細胞または再生可能な部分と共に包含し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の植物の部分は、以下に限定されるものではないが、細胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、葉、さや、ならびに、ダイズの粕、粉、および油などのダイズ植物ＤＢＮ８００２に由来する製品、具体的には、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂ダイズフレーク、脱脂ダイズ粉焼成物、豆乳凝固物、豆腐、ダイズタンパク質濃縮物、単離ダイズタンパク質、植物タンパク質加水分解物、組織化ダイズタンパク質、およびダイズタンパク質繊維を包含する。

本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、植物細胞において発現された場合に、昆虫に対する抵抗性およびグルホシネート除草剤に対する耐性を遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に与えるＤＮＡ構築物を含有する。ＤＮＡ構築物は直列に配置された２つの発現カセットを含む。第１の発現カセットは、植物における発現に適切なプロモーターおよび適切なポリアデニル化シグナル配列を含み、そのプロモーターは、鱗翅目の昆虫に対して主に抵抗性があるＶｉｐ３Ａａタンパク質の核酸配列に作用可能に連結される。第２の発現カセットは、植物における発現に適切なプロモーターおよび適切なポリアデニル化シグナル配列を含み、そのプロモーターは、ホスフィノトリシンＮーアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコード化する遺伝子に作用可能に連結され、ＰＡＴタンパク質の核酸配列はグルホシネート除草剤に対して耐性がある。さらに、プロモーターは、植物から単離した適切なプロモーターであってもよく、構成的、誘導的、および／または組織特異的なプロモーターを包含する。その適切なプロモーターは、以下に限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス・ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）プロモーター、ケストルム属黄化葉巻ウイルスプロモーター、パタチンプロモーター、リブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）プロモーター、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プロモーター、Ｅ９プロモーター、ＧＯＳプロモーター、ａｌｃＡ／ａｌｃＲプロモーター、アグロバクテリウム・リゾゲネスＲｏｌＤプロモーター、およびシロイヌナズナＳｕｃ２プロモーターを包含する。ポリアデニル化シグナル配列は、植物において機能する適切なポリアデニル化シグナル配列であってもよい。適切なポリアデニル化シグナル配列は、以下に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーターに由来するポリアデニル化シグナル配列、プロテアーゼ阻害剤ＩＩ（ＰＩＮ ＩＩ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、およびαチューブリン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列を包含する。

加えて、発現カセットは、他の遺伝エレメントをさらに含んでもよく、以下に限定されるものではないが、エンハンサーおよびシグナルペプチド／輸送ペプチドを包含する。エンハンサーは、遺伝子発現レベルを高めるものであり、以下に限定されるものではないが、タバコエッチウィルス（ＴＥＶ）翻訳活性化因子、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー、およびＦＭＶ３５Ｓエンハンサーを包含する。シグナルペプチド／輸送ペプチドは、細胞外のスペースへ、または特異的な細胞内の小器官もしくは区画の中へ輸送のために、Ｖｉｐ３Ａａタンパク質および／またはＰＡＴタンパク質に作用し得る。例えば、葉緑体輸送ペプチドをコード化する配列が葉緑体を標的とするために用いられ、または、「ＫＤＥＬ」保持配列が小胞体を標的とするために用いられる。

前記ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、略称Ｂｔ）から単離されてもよく、形質転換した細胞における転写物の安定性および有効性が向上するように、ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子のヌクレオチド配列をコドンの最適化または他の方法によって変えることができる。

用語「鱗翅目」は、ガとチョウの両方を包含する用語であり、農業および林業における害虫の最大の目である。鱗翅目は、例えば、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｙｐｓｉｌｏｎ（Ｒｏｔｔｅｍｂｅｒｇ））、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（Ｈｕｂｎｅｒ））、プロデニア・リトュラ（Ｐｒｏｄｅｎｉａ ｌｉｔｕｒａ）、コウスイロヨトウ（Ａｔｈｅｔｉｓ ｌｅｐｉｇｏｎｅ）、およびモモノゴマダラノメイガ（Ｃｏｎｏｇｅｔｈｅｓ ｐｕｎｃｔｉｆｅｒａｌｉｓ）を包含する。

ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＰＡＴ）遺伝子は、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）株から単離した酵素であり得、グルホシネート除草剤耐性を植物に与えるように、アセチル化によるＬ－ホスフィノトリシンのその不活性型への変換を触媒する。ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ：ＰＴＣ、２－アミノ－４－メチルホスフィニル酪酸）はグルタミン合成酵素の阻害剤である。ＰＴＣは、抗生物質、２－アミノ－４－メチルホスフィニル－アラニル－アラニンの構造単位である。このトリペプチド（ＰＴＴ）は、グラム陽性およびグラム陰性の細菌および真菌である灰色かび病菌に対して活性である。ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子はまた、選択マーカー遺伝子として利用されてもよい。

「グルホシネート」（ホスフィノトリシンとしても知られる）は、アンモニウム－２－アミノ－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスフィニル］酪酸を言う。「グルホシネート除草剤」での処理とは、グルホシネートを含有する任意の除草剤製剤での処理を言う。グルホシネート製剤の使用割合を選択し、生物学的に有効な量を実現することは、通常の農業技術者の技能の範囲内である。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの植物原料を含有する圃場を、グルホシネートを含有する任意の除草剤製剤で処理することで、圃場における雑草の生育を防除することになり、かつその処理は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する植物原料の生育または収量に影響しないことになる。

ＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、弾道形質転換（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、および花粉管経路形質転換を包含するがこれらに限定されない形質転換法を経て、植物に導入される。

アグロバクテリウム媒介形質転換は、植物の形質転換のために通常用いられる方法である。植物に導入される外来ＤＮＡは、左境界共通配列と右境界共通配列との間、すなわちＴ－ＤＮＡ領域でベクターにクローン化される。ベクターはアグロバクテリウム細胞に形質転換され、続いてその細胞を用いて植物組織に感染させる。外来ＤＮＡを含むベクターの中のＴ－ＤＮＡ領域が植物ゲノムに挿入される。

弾道形質転換では、外来ＤＮＡを含むベクターが植物細胞に打ち込まれる（粒子媒介遺伝子銃形質転換）。

花粉管経路形質転換は、植物の受粉の後に形成される自然の花粉管（花粉管の伝達組織としても知られる）を用い、珠心経路を経て胚嚢に外来ＤＮＡを運び込むための方法である。

形質転換の後、形質転換した植物組織から遺伝子導入植物を再生し、外来ＤＮＡを有する子孫を適切なマーカーを用いて選択する必要がある。

ＤＮＡ構築物は、１つまたは複数の発現カセットを提供する共に連結されたＤＮＡ分子の集まりである。ＤＮＡ構築物は、好ましくは、細菌の細胞内で自己複製できかつ様々な制限酵素部位を含有するプラスミドであり、その様々な制限酵素部位は、機能性遺伝エレメント、すなわち、プロモーター、イントロン、リーダー配列、コード配列、３’ターミネーター領域、および他の配列を提供するＤＮＡ分子を導入するのに有用な部位である。ＤＮＡ構築物に含有される発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写に必要な遺伝エレメントを含み、原核細胞または真核細胞において発現するように設計することができる。最も好ましくは、本発明の発現カセットは、植物細胞において発現するように設計される。

遺伝子導入「イベント」は、異種ＤＮＡ構築物での植物細胞の形質転換により作製され、その形質転換には、植物群を生成するために、少なくとも１つの標的遺伝子を含む核酸発現カセットを、遺伝子導入法により植物のゲノムに挿入するステップ、植物群を再生するステップ、および特定のゲノム位置への挿入物の特性を有する特定の植物を選択するステップが包含される。用語「イベント」は、異種ＤＮＡを包含する最初の形質転換体およびその子孫を言う。用語「イベント」はまた、異種ＤＮＡを包含する他の変種の個体に最初の形質転換体を有性的に交配することによって作製された子孫も言う。戻し交配の親で戻し交配を繰り返した後でも、最初の形質転換体の親からの挿入ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡは、交配子孫においてもなお同じ染色体の位置に存在する。用語「イベント」はまた、挿入ＤＮＡと挿入ＤＮＡにすぐ近接する隣接ゲノム配列とを含む最初の形質転換体からのＤＮＡ配列を言い、挿入ＤＮＡを包含する親系統（例えば、最初の形質転換体および自己増殖から生じたその子孫）を、挿入ＤＮＡを含有しない親系統に有性的に交配することによって作製され標的遺伝子を包含する挿入ＤＮＡを受け取る子孫に、そのＤＮＡ配列は伝えられると期待されるであろう。

本明細書で用いられる「組換え」は、普通は自然界で認められないと考えられるため人の介入によって作られたＤＮＡおよび／もしくはタンパク質ならびに／または生物体の形態を言う。このような人の介入で組換えＤＮＡ分子および／または組換え植物が作製され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、例えば化学合成により、または遺伝子工学技術を用いて単離核酸セグメントを操作することにより、２つの異なる分離した配列セグメントを、人為的に組み合わせることによって得られる。核酸を操作する技術は当技術分野において周知である。

用語「導入遺伝子」は、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物の部分、または植物を包含し、その遺伝子型は異種核酸の存在によって変えられている。「導入遺伝子」は、そのように初めに変えられた上記の遺伝子導入生物体、ならびに有性交配または無性繁殖によって最初の遺伝子導入生物体から作製された個々の子孫を包含する。本明細書で用いられる用語「導入遺伝子」は、従来の植物育種法、または無作為な他家受精、非組換えウィルスの感染、非組換え細菌の形質転換、非組換え体の転位、もしくは突然変異などの自然発生イベントによる（染色体または染色体外の）ゲノムの変化は包含しない。

本明細書で用いられる「異種」とは、第１の分子であって、自然界において第２の分子との組み合わせが普通認められない第１の分子を言う。例えば、分子が第１の種に由来し、第２の種のゲノムに挿入される場合がある。従って、その分子は宿主に対して異種であり、その宿主の細胞のゲノムに人工的に導入されることになる。

鱗翅目昆虫抵抗性およびグルホシネート除草剤耐性を有する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、以下のステップにより育種することができる。すなわち、そのステップは、最初に、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２およびその子孫から培養したダイズ植物からなる第１の親ダイズ植物を、鱗翅目昆虫抵抗性およびグルホシネート除草剤耐性を欠いている第２の親ダイズ植物に有性的に交配することにより、複数の第１の子孫植物を作製するステップであって、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２およびその子孫は、鱗翅目昆虫に対する抵抗性およびグルホシネート除草剤に対する耐性がある本発明の発現カセットを用いた形質転換から得たものであるステップと、次に、鱗翅目昆虫の害に対する抵抗性および／またはグルホシネート除草剤に対する耐性がある子孫植物を選択することにより、鱗翅目昆虫の害に対する抵抗性およびグルホシネート除草剤に対する耐性があるダイズ植物を育種するステップとである。これらのステップは、さらに、鱗翅目昆虫抵抗性および／またはグルホシネート耐性の子孫植物を、第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物に戻し交配し、次に、鱗翅目昆虫の害、グルホシネート除草剤の使用、または形質に関わる分子マーカー（例えば、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の５’末端および３’末端から特定される接合部を含むＤＮＡ分子）の特定により子孫をスクリーニングすることによって、鱗翅目昆虫抵抗性およびグルホシネート除草剤耐性のダイズ植物を作製するステップを包含することができる。

また、２つの異なる遺伝子導入植物を交配して、別々に付加された独立した２つの外来遺伝子を含有する子孫を作製することもできると理解されるべきである。適当な子孫の自己増殖で、付加された各外来遺伝子の両方についてホモ接合性である子孫植物を作製することができる。前述の親植物との戻し交配および非遺伝子導入植物との異系交配も考えられ、栄養繁殖についても同様である。

用語「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、または酵素に付けられた、単離された核酸分子を意味する。このようなプローブは、標的核酸の鎖に対して、本発明においては遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２ゲノムのゲノムからのＤＮＡ鎖に対して相補的であり、そのゲノムＤＮＡが遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２または種子からなのか、それとも遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する植物もしくは種子またはそれらの抽出物からなのかに関わらない。本発明のプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミドおよび他のプローブ物質も包含し、標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができる。

用語「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールしてプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次にポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の作用の下で標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する単離された核酸分子の断片である。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法による標的核酸配列の増幅におけるその使用に関わる。

プローブおよびプライマーは、長さが、一般に１１個以上のポリヌクレオチド、好ましくは１８個以上のポリヌクレオチド、さらに好ましくは２４個以上のポリヌクレオチド、最も好ましくは３０個以上のポリヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を保持し標的ＤＮＡ配列とは異なるプローブを、従来の方法で設計してもよいが、本発明のプローブおよびプライマーは、標的配列中の連続した核酸と、完全なＤＮＡ配列の同一性を有することが好ましい。

本発明の隣接ゲノムＤＮＡおよび挿入配列に基づくプライマーおよびプローブは、従来の方法によって、例えば、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する植物原料から相当するＤＮＡ分子を単離し、ＤＮＡ分子の核酸配列を決定することによって決定できる。ＤＮＡ分子は遺伝子導入挿入配列およびダイズゲノム隣接配列を含み、そのＤＮＡ分子の断片をプライマーまたはプローブとして用いてもよい。

本発明の核酸のプローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を用いて、試料における遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からのＤＮＡの存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある一定の環境下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本明細書では、２つの核酸分子が逆平行の２本鎖核酸構造を形成することが可能であれば、これら２つの分子は互いに特異的にハイブリダイズすることが可能である。核酸分子と他方の核酸分子が完全な相補性を示せば、その核酸分子はその他方の核酸分子の「相補体」と言われる。本明細書では、核酸分子の全てのヌクレオチドが他方の核酸分子の相当するヌクレオチドに相補的であれば、これら２つの核酸分子は「完全な相補性」を示すと言われる。２つの核酸分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールし結合することができる十分な安定性で、互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「最小限に相補的」であると言われる。同様に、２つの核酸分子が、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニールし結合することができる十分な安定性で、互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「相補性」を持つと言われる。完全な相補性からの逸脱は、このような逸脱が２つの分子の２本鎖構造の形成を完全に妨げない限りは許容される。プライマーまたはプローブとして働くために、核酸分子は、使用する特定の溶媒および塩濃度下で、安定的な２本鎖構造を形成することができる十分な相補性を配列中に有しさえすればよい。

本明細書では、実質的に相同である配列は、別の適合する核酸分子の相補鎖と高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進するストリンジェントである適当な条件は当業者には既知であり、例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）を用いた約４５℃での処理、それに続く２．０×ＳＳＣを用いた５０℃での洗浄である。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、低ストリンジェンシー条件における５０℃での約２．０×ＳＳＣから、高ストリンジェンシー条件における５０℃での約０．２×ＳＳＣまでとすることができる。また、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件における室温（約２２℃）から高ストリンジェンシー条件における約６５℃まで上げることができる。温度と塩濃度の両方を変えてもよく、または、それらのうちの一方を一定に保ちながら他方の可変条件を変化させてもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、中ストリンジェンシー条件下で、例えば、約２．０×ＳＳＣおよび約６５℃で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片の、１つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズする。さらに好ましくは、本発明の核酸分子は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片の１つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズする。本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、および配列番号７、もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片を含む。本発明の好ましい別のマーカー核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、および配列番号７、もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片と、８０％から１００％、または９０％から１００％の配列同一性を有する。配列番号１、配列番号２、配列番号６、および配列番号７を植物育種法でマーカーとして用いて、遺伝子交配の子孫を特定してもよい。プローブの標的ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションは、以下に限定されるものではないが蛍光タグ、放射性タグ、抗体系タグ、および化学発光タグを包含する当業者に周知の任意の方法によって、検出することができる。

特定の増幅プライマーを用いる標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲ）に関して、「ストリンジェントな条件」は、ＤＮＡ熱増幅反応においてプライマーが標的核酸配列とのみハイブリダイズすることを可能にする条件であり、プライマーは、標的核酸配列（またはその相補的配列）に相当する野生型配列を有するがゆえに標的核酸配列に結合して、好ましくは特有な増幅産物、すなわちアンプリコンを作製することが可能である。

用語「（標的配列）に特異的に結合する」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブまたはプライマーが標的配列を含む試料中の標的配列とのみハイブリダイズすることを表す。

本明細書では、「アンプリコン」は、鋳型核酸の一部分として用いられる標的核酸配列の核酸増幅産物を言う。例えば、本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を有性的に交配することによってダイズ植物が作製されるかどうか、または圃場から採取されたダイズ試料が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を含むかどうか、もしくはダイズ抽出物（ミール、粉、または油など）が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を含むかどうかを決定するために、ダイズ植物の組織試料または抽出物から抽出されたＤＮＡを、プライマー対を用いた核酸増幅法に供して、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡの存在に特徴的なアンプリコンを作製してもよい。プライマー対は、挿入された外来ＤＮＡの挿入部位に近接する植物ゲノムの中の隣接配列に由来する第１のプライマー、および挿入された外来ＤＮＡに由来する第２のプライマーを包含する。アンプリコンは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的な長さおよび配列を有する。アンプリコンは、長さが、プライマー対に１個のヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さの合計、または、好ましくはプライマー対に約５０個のヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さの合計、または、さらに好ましくはプライマー対に約２５０個のヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さの合計、または、最も好ましくはプライマー対に約４５０個以上のヌクレオチド塩基対を組み合わせた長さの合計に等しくてもよい。

あるいは、プライマー対は、挿入されたヌクレオチド配列全体を包含するアンプリコンを作製するように、挿入ＤＮＡの両側の隣接ゲノム配列に由来することができる。植物ゲノム配列に由来するプライマー対の１つは、挿入ＤＮＡ配列から離れて位置してもよく、その距離は、１個のヌクレオチド塩基対から約２万個のヌクレオチド塩基対までの範囲とすることができる。本明細書では、用語「アンプリコン」は、具体的にはＤＮＡ熱増幅反応において形成されるプライマーダイマーを除外する。

核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する当技術分野で既知の様々な核酸増幅法のいずれかによって達成することができる。様々な核酸増幅法が当業者に既知である。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂまでのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するまでに発展している。これらの方法および当技術分野で既知の他のＤＮＡ増幅法を本発明で用いることができる。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの挿入された外来ＤＮＡ配列および隣接ＤＮＡ配列は、用意したプライマー配列を用いて遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のゲノム上で増幅することができる。増幅後、ＰＣＲアンプリコンまたはクローン化されたＤＮＡを、標準的な配列決定法によって配列決定する。

ＤＮＡ増幅法に基づいたＤＮＡ検出キットは、適当な反応条件下で標的ＤＮＡと特異的にハイブリダイズし特徴的なアンプリコンを増幅するプライマーとして用いられるＤＮＡ分子を含有する。そのキットにより、アガロースゲルに基づいた検出方法、または特徴的なアンプリコンを検出するための当技術分野で既知の多くの方法が提供され得る。本発明によって提供されるのは、配列番号３または配列番号４の中のダイズゲノムの任意の一部に相同的または相補的であり、かつ配列番号５の中の遺伝子導入挿入領域の任意の一部に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーを含有するキットである。ＤＮＡ増幅法において有用であると具体的に特定されるプライマー対は配列番号８および配列番号９を含み、それらは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の５’導入遺伝子／ゲノム領域の一部に相同的な特徴的アンプリコンを増幅し、そのアンプリコンは配列番号１を含む。ＤＮＡプライマーとして有用な他のＤＮＡ分子を配列番号５から選択することができる。

これらの方法によって作製されたアンプリコンは複数の技術によって検出され得る。そのような方法の１つが遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）であり、その解析においては、挿入ＤＮＡ配列と、近接した隣接ゲノムＤＮＡ配列とにまたがるＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖が設計される。オリゴヌクレオチド鎖はマイクロウェルプレートのウェル内に固定化される。標的領域をＰＣＲ増幅（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのための２つのプライマーを用いた）した後、１本鎖のＰＣＲ産物を、固定化したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、次に反応が見込まれる塩基のために特異的に標識化したｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼとを用いる単一塩基伸長反応の鋳型として利用することができる。その結果は、蛍光法またはＥＬＩＳＡに基づいた方法によって得ることができる。シグナルが挿入／隣接ゲノム配列の存在を表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長が成功したことを示している。

別の方法はパイロシークエンシング技術である。この方法では、挿入ＤＮＡ配列と近接ゲノムＤＮＡ接合部分とにまたがるオリゴヌクレオチド鎖を設計する。オリゴヌクレオチド鎖を標的領域からの１本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのための２つのプライマーを用いた）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン－５’－ホスホ硫酸、およびルシフェリンと共にインキュベートする。各ｄＮＴＰを別々に付加し、産生した光シグナルを測定する。光シグナルが挿入／隣接配列の存在を表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一または複数塩基の伸長が成功したことを示している。

Ｃｈｅｎらが述べている蛍光偏光現象（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９９年、第９巻：４９２～４９８頁）もまた、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いるには、挿入ＤＮＡ配列と近接ゲノムＤＮＡ接合部分とにまたがるオリゴヌクレオチド鎖を設計する必要がある。そのオリゴヌクレオチド鎖を標的領域からの１本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのための２つのプライマーを用いた）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したｄｄＮＴＰと共にインキュベートする。単一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰが組み込まれる。このような組み込みは、蛍光光度計を用いて偏光の変化として測定することができる。偏光の変化が挿入／隣接配列の存在を表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長が成功したことを示している。

Ｔａｑｍａｎは、ＤＮＡ配列の存在を検出しかつ定量的に解析する方法として述べられており、製造業者から提供される説明書に詳しく記載されている。ここでは以下に簡単に説明する。挿入ＤＮＡ配列と近接ゲノム隣接接合部分とにまたがるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのための２つのプライマーを用いた）を、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で反応サイクルに供する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブの蛍光部分と消光部分との間で切断が起こり、蛍光部分が遊離する。蛍光シグナルの生成が挿入／隣接配列の存在を表し、これは、増幅およびハイブリダイゼーションが成功したことを示している。

ハイブリダイゼーションの原理に基づいて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの植物原料を検出するための適切な技術はまた、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションも含む。特に、適切な技術は、プローブを試料と共にインキュベートし、それらを洗浄して非結合プローブを除去し、プローブがハイブリダイズされたかどうかを検出することを含む。その検出方法はプローブに付けた標識の型に依り、例えば、放射活性で標識したプローブは、Ｘ線フィルムの露光および現像により検出することができ、または、酵素で標識したプローブは、基質を変換して色変化をもたらすことによって検出され得る。

配列の検出における分子マーカーの使用については、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９６年、第１４巻：３０３～３０８頁）によって述べられており、以下に簡単に述べる。挿入ＤＮＡ配列と近接ゲノム隣接接合部分とにまたがるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブは、その特有な構造により、蛍光部分および消光部分を極めて接近した状態で保持する二次構造を含有する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入配列および隣接ゲノム配列それぞれのための２つのプライマーを用いた）を、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で反応サイクルに供する。ＰＣＲ増幅に成功した後、ＦＲＥＴプローブの標的配列とのハイブリダイゼーションによりプローブは二次構造を失い、その結果、蛍光部分および消光部分は空間的に離れ、蛍光シグナルが生成される。蛍光シグナルの生成が挿入／隣接配列の存在を表し、これは、増幅およびハイブリダイゼーションが成功したことを示している。

マイクロフルイディクスなど、他の述べられている方法により、ＤＮＡ試料の単離および増幅のための方法および装置が提供される。光学染料は、特異的なＤＮＡ分子を検出し決定するために用いられる。ナノチューブ装置は、本発明のＤＮＡ分子を検出するのに有用であり、ＤＮＡ分子を検出するための電子センサー、または特異的なＤＮＡ分子と結合してそのＤＮＡ分子を検出可能にするためのナノビーズを含む。

ＤＮＡ検出キットは、本明細書に記載の構成物、およびＤＮＡ検出の分野において述べられまたは既知の方法を用いて発展させることができる。当該キットは、試料が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡを含有しているかどうかを特定するのに有用であり、当該キットを使用して遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡを含有するダイズ植物を育種することができる。当該キットは、配列番号１、２、３、４、または５の少なくとも一部に相同的または相補的なＤＮＡのプライマーまたはプローブを含有してもよく、またはＤＮＡの遺伝子導入の遺伝エレメントに含有されるＤＮＡに相同的または相補的な他のＤＮＡのプライマーまたはプローブを含有してもよく、これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応で用いることができ、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法でプローブとして用いることができる。ダイズゲノムに含有され、図１および表１に示された遺伝子導入挿入配列およびダイズゲノム接合部分のＤＮＡ構造は以下を含む。すなわち、そのＤＮＡ構造は、遺伝子導入挿入配列の５’末端に近接したダイズＤＢＮ８００２隣接ゲノム領域、アグロバクテリウムの右境界領域（ＲＢ）からの挿入配列の一部、シロイヌナズナＡＣＴＩＮ２プロモーター（ｐｒＡｔＡｃｔ２）からなる第１の発現カセットであって、バチルス・チューリンゲンシスの昆虫抵抗性ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子に作用可能に連結し、さらにノパリン合成酵素ターミネーター（ｔＮｏｓ）に作用可能に連結した第１の発現カセット、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ｐｒ３５Ｓ）からなる第２の発現カセットであって、ストレプトマイセスのグルホシネート耐性ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃＰＡＴ）に作用可能に連結し、さらにカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）に作用可能に連結した第２の発現カセット、アグロバクテリウムの左境界領域（ＬＢ）からの挿入配列の一部、および遺伝子導入挿入配列（配列番号５）の３’末端のダイズ植物ＤＢＮ８００２隣接ゲノム領域を含む。ＤＮＡ増幅法において、プライマーとして有用なＤＮＡ分子は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における導入遺伝子挿入配列に由来する任意の部分、または遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における隣接ダイズゲノムのＤＮＡ配列に由来する任意の部分とすることができる。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、他の遺伝子導入ダイズ変種、例えば除草剤（グリホサート、ジカンバなど）耐性遺伝子導入ダイズ変種または他の昆虫抵抗性遺伝子を保有する遺伝子導入ダイズ変種と組み合わせて用いることができる。これらの異なる遺伝子導入イベントを様々に組み合わせることによって、それらの組み合わせを用いて本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２と一緒に育種する場合に、様々な昆虫に抵抗性がありかつ様々な除草剤に耐性がある改良ハイブリッド遺伝子導入ダイズ変種を提供することができる。これらの変種は、非遺伝子導入変種および単一形質の遺伝子導入変種に比べて、収量が増加するなどのより良好な性能を示す。

本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、鱗翅目害虫が引き起こす摂取損傷に対して抵抗性があり、かつグルホシネートを含有する農業用除草剤の植物毒性に対して耐性がある。二重形質のダイズ植物は、鱗翅目害虫（トビイロスズメ（Ｃｌａｎｉｓ ｂｉｌｉｎｅａｔａ）など）が引き起こす摂取損傷に対する抵抗性を提供するバチルス・チューリンゲンシスのＶｉｐ３Ａａタンパク質を発現し、かつグルホシネート耐性を植物に与えるストレプトマイセスのグルホシネート抵抗性ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質を発現する。二重形質のダイズは以下の利点を有する。すなわち、二重形質のダイズは、１）トビイロスズメおよびプロデニア・リトュラがダイズ栽植地域における主な害虫である場合に、鱗翅目害虫（トビイロスズメ、プロデニア・リトュラなど）による経済的損失を回避し、２）グルホシネートを含有する農業用除草剤の使用により雑草の広域スペクトル防除のための能力をダイズに与え、および３）ダイズ生産量が低減しないという利点を有する。また、昆虫抵抗性およびグルホシネート耐性の形質をコード化する各導入遺伝子は、同じＤＮＡセグメント上で連結され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２ゲノムの単一座位にある。これにより、育種効率が向上し、かつ繁殖群およびその子孫において、分子マーカーを用いることによって遺伝子導入挿入断片を追跡することが可能である。一方、本発明の検出方法において、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、配列番号６もしくはその相補的配列、または配列番号７もしくはその相補的配列を、ＤＮＡのプライマーまたはプローブとして用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫に特徴的な増幅産物を作製し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの植物原料の存在を迅速、正確かつ安定的に特定することができる。

配列の簡単な説明
配列番号１ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の５’末端の挿入接合部周辺に位置する長さが２２個のヌクレオチドの配列であって、ヌクレオチド１～１１およびヌクレオチド１２～２２がダイズゲノムの挿入部位の両側にそれぞれ位置する配列
配列番号２ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の３’末端の挿入接合部周辺に位置する長さが２２個のヌクレオチドの配列であって、ヌクレオチド１～１１およびヌクレオチド１２～２２がダイズゲノムの挿入部位の両側にそれぞれ位置する配列
配列番号３ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の５’末端の挿入接合部周辺に位置する１５２４個のヌクレオチドの配列
配列番号４ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における挿入配列の３’末端の挿入接合部周辺に位置する６５６個のヌクレオチドの配列
配列番号５ Ｔ－ＤＮＡの全配列、５’末端および３’末端の各ダイズゲノム隣接配列
配列番号６ 配列番号３の中に位置し、ｐＤＢＮ４００６構築物のＤＮＡ配列とｐｒＡｔＡｃｔ２転写起点配列とにまたがる配列
配列番号７ 配列番号４の中に位置し、ｔ３５Ｓ転写ターミネーター配列とｐＤＢＮ４００６構築物のＤＮＡ配列とにまたがる配列
配列番号８ 配列番号３を増幅するための第１のプライマー
配列番号９ 配列番号３を増幅するための第２のプライマー
配列番号１０ 配列番号４を増幅するための第１のプライマー
配列番号１１ 配列番号４を増幅するための第２のプライマー
配列番号１２ ５’隣接ゲノム配列からのプライマー
配列番号１３ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１２と対であるプライマー
配列番号１４ ３’隣接ゲノム配列からであり、配列番号１２と対で用いて、導入遺伝子がホモ接合性なのかそれともヘテロ接合性なのかを検出し得るプライマー
配列番号１５ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１４と対であるプライマー
配列番号１６ ＴａｑｍａｎにおいてｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子を検出するための第１のプライマー
配列番号１７ ＴａｑｍａｎにおいてｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子を検出するための第２のプライマー
配列番号１８ ＴａｑｍａｎにおいてｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子を検出するためのプローブ
配列番号１９ ＴａｑｍａｎにおいてＰＡＴ遺伝子を検出するための第１のプライマー
配列番号２０ ＴａｑｍａｎにおいてＰＡＴ遺伝子を検出するための第２のプライマー
配列番号２１ ＴａｑｍａｎにおいてＰＡＴ遺伝子を検出するためのプローブ
配列番号２２ ダイズ内在遺伝子レクチンのための第１のプライマー
配列番号２３ ダイズ内在遺伝子レクチンのための第２のプライマー
配列番号２４ サザンブロットアッセイにおけるｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子のためのプローブ
配列番号２５ サザンブロットアッセイにおけるＰＡＴ遺伝子のためのプローブ
配列番号２６ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１３と同方向を有するプライマー
配列番号２７ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１３と逆方向を有し、隣接配列を得るために用いられるプライマー
配列番号２８ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１３と逆方向を有し、隣接配列を得るために用いられるプライマー
配列番号２９ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１５と同方向を有するプライマー
配列番号３０ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１５と逆方向を有し、隣接配列を得るために用いられるプライマー
配列番号３１ Ｔ－ＤＮＡからであり、配列番号１５と逆方向を有し、隣接配列を得るために用いられるプライマー
本発明の技術的解決法について、さらに、添付の図面および実施例を参照して以下に詳細に述べる。

本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列におよびその検出方法における遺伝子導入挿入配列とダイズゲノムとの間の接合部位の構造模式図およびダイズ植物ＤＢＮ８００２を検出するための核酸配列の相対位置の模式図（相対位置の模式図については、Ｗｍ８２．ａ２ ＲｅｆＧｅｎを参照されたい）である。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００６の構造模式図である。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、オオタバコガ（Ｈｕｂｎｅｒ）に対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のバイオアッセイ効果を示す。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ）に対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のバイオアッセイ効果を示す。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）に対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のバイオアッセイ効果を示す。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、トビイロスズメに対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のバイオアッセイ効果を示す。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、オオタバコガ（Ｈｕｂｎｅｒ）を投入した遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を示す。 シロイチモジヨトウが自然発生する条件下での、本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を示す。 ハスモンヨトウが自然発生する条件下での、本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を示す。 本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２の検出のための核酸配列およびその検出方法における、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のバイオアッセイ効果を示す。

本発明に係るダイズ植物ＤＢＮ８００２を検出するための核酸配列およびその検出方法の技術的解決法について、さらに、具体的な実施例を参照して以下に説明する。

クローニングおよび形質転換
１．１ ベクタークローニング
組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００６（図２に示す）を、標準的な遺伝子クローニング技術を用いて構築した。ベクターｐＤＢＮ４００６は、直列に配置された２つの遺伝子導入発現カセットを含む。２つの遺伝子導入発現カセットは、シロイヌナズナＡＣＴＩＮ２プロモーター（ｐｒＡｔＡｃｔ２）からなる第１の発現カセットであって、バチルス・チューリンゲンシス（ＣＮ１０３５０９８０８Ｂ）の昆虫抵抗性ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子に作用可能に連結され、さらに、ノパリン合成酵素ターミネーター（ｔＮｏｓ）に作用可能に連結された第１の発現カセット、およびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ｐｒ３５Ｓ）からなる第２の発現カセットであって、ストレプトマイセスのグルホシネート耐性ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃＰＡＴ）に作用可能に連結され、さらにカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ転写ターミネーター（ｔ３５Ｓ）に作用可能に連結された第２の発現カセットである。

液体窒素法によって、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、シカゴ、米国；Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３１３－０１５）をベクターｐＤＢＮ４００６で形質転換し、４－［ヒドロキシ（メチル）ホスフィニル］－ＤＬ－α－アミノ酪酸を、形質転換した細胞をスクリーニングするための選択マーカーとして用いた。

１．２ 植物形質転換
従来のアグロバクテリウム媒介形質転換法により形質転換を行った。その形質転換法は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を作製するために、無菌培養したダイズの子葉節組織を実施例１．１で述べたアグロバクテリウムと共培養して、組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００６中のＴ－ＤＮＡをダイズ染色体に転移させる工程を含む。

簡単に述べると、アグロバクテリウム媒介のダイズ形質転換は以下の工程を含む。すなわち、その工程は、ダイズ発芽培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、および８ｇ／Ｌの寒天；ｐＨ５．６）において成熟ダイズ種子を発芽させる工程、その種子を発芽培地に播種する工程、温度が２５±１℃かつ光周期（明期／暗期）が１６時間／８時間の条件下で培養する工程、発芽の４～６日後に、子葉節が膨潤した新鮮な緑色のダイズ無菌小植物を採取する工程、子葉節のおよそ３～４ｍｍ下で胚軸を切除する工程、子葉を縦方向に切り、頂芽、側芽、および種子根を除去する工程、および手術用ブレードの後ろ側で子葉節に傷をつけ、傷のついた子葉節組織をアグロバクテリウム懸濁液に接触させる工程である。上記形質転換において、アグロバクテリウムは、ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子のヌクレオチド配列およびＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列を、傷のついた子葉節組織に送達することができる（ステップ１：感染ステップ）。このステップでは、好適に、子葉節組織をアグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．５～０．８、感染培地（２．１５ｇ／ＬのＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、１０ｇ／Ｌのグルコース、４０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ：ＡＳ）、４ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＭＥＳ）、および２ｍｇ／Ｌのゼアチン（ｚｅａｔｉｎ：ＺＴ）；ｐＨ５．３）に浸して感染を開始した。子葉節組織をある期間（３日間）アグロバクテリウムと共培養した（ステップ２：共培養ステップ）。好適に、感染ステップの後、子葉節組織を固形培地（４．３ｇ／ＬのＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、１０ｇ／Ｌのグルコース、４ｇ／ＬのＭＥＳ、２ｍｇ／ＬのＺＴ、および８ｇ／Ｌの寒天を含有；ｐＨ５．６）で培養した。この共培養ステップの後に、任意選択の「回収」ステップがあってもよい。「回収」ステップでは、回収培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３０ｇ／Ｌのショ糖、２ｍｇ／ＬのＺＴ、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、１００ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、および１００ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸；ｐＨ５．６）は、アグロバクテリウムの増殖を阻害することで知られる少なくとも１つの抗生物質（１５０～２５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン）を含む一方、植物形質転換体のためのいかなる選択剤も含まない（ステップ３：回収ステップ）。好適に、子葉節から再生された組織ブロックを、抗生物質を含むが選択剤を含まない固形培地で培養してアグロバクテリウムを除き、感染細胞のための回収段階を用意した。続いて、子葉節から再生された組織ブロックを、選択剤（４－［（ヒドロキシ（メチル）ホスフィニル）］－ＤＬ－α－アミノ酪酸）を含有する培地で培養し、増殖している形質転換カルスを選択した（ステップ４：選択ステップ）。好適に、子葉節から再生された組織ブロックを、選択剤を含む固形の選択培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３０ｇ／Ｌのショ糖、１ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアデニン（６－ＢＡＰ）、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、１００ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、１００ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸、および１０ｍｇ／Ｌの４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィニル）－ＤＬ－α－アミノ酪酸；ｐＨ５．６）で培養し、結果的に、形質転換した細胞を継続的に増殖させた。そして、形質転換した細胞は植物に再生した（ステップ５：再生ステップ）。好適に、選択剤を含有する培地で増殖している子葉節から再生した組織ブロックを、固形培地（Ｂ５分化培地およびＢ５発根培地）で培養して植物を再生した。

スクリーニングから得た抵抗性組織をＢ５分化培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３０ｇ／Ｌのショ糖、１ｍｇ／ＬのＺＴ、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、５０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、５０ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸、１ｍｇ／Ｌのジベレリン、１ｍｇ／Ｌのオーキシン、および５ｍｇ／Ｌの４－（ヒドロキシ（メチル）ホスフィニル）－ＤＬ－α－アミノ酪酸；ｐＨ５．６）に移植し、分化のために２５℃で培養した。分化した小植物を、Ｂ５発根培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／ＬのＭＥＳ、３０ｇ／Ｌのショ糖、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、および１ｍｇ／Ｌのインドール－３－酪酸（ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：ＩＢＡ））に移植し、２５℃で培養した。小植物が高さ約１０ｃｍになったところでガラス温室に移動し、結実するまで培養した。温室において、１日につき、２６℃で１６時間、次に２０℃で８時間、植物を培養した。

１．３．遺伝子導入イベントの特定およびスクリーニング
総計２８８株の個別の遺伝子導入Ｔ０植物を作製した。最適な性能を有する遺伝子導入イベントを選別するために、上記の２８８株の個別の遺伝子導入Ｔ０単一植物を移植、栽培、および繁殖のために温室に移動して、遺伝子導入Ｔ１単一植物を産出した。

成熟ダイズ種子および選択剤としてのグルホシネートを用いたダイズの遺伝子形質転換プロセスでは、偽陽性の遺伝子導入イベントが生成される傾向があるため、Ｔ１世代にグルホシネートを散布して陽性の遺伝子導入イベントを特定し、総計１５４株の陽性の遺伝子導入単一植物を得た。ＴａｑＭａｎ（商標）解析により、上記の１５４株の遺伝子導入ダイズ植物について、単一複製のｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子が存在することおよびベクターの骨格配列が欠如していることを検出し、総計９０株の遺伝子導入単一植物を得た。遺伝子導入挿入部位の解析により、総計２４株の遺伝子導入単一植物をスクリーニングによって得た。それらの植物において、Ｔ－ＤＮＡの両側の配列はもとのままであり、そのＴ－ＤＮＡはダイズゲノムの重要な遺伝子に挿入されておらず、遺伝子の挿入によって結果的にいかなる大きな オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）も生じなかった。主要な標的昆虫（オオタバコガ（Ｈｕｂｎｅｒ）、プロデニア・リトュラ、シロイチモジヨトウなど）に対する抵抗性の評価および比較により、良好な昆虫抵抗性を有する総計２１株の遺伝子導入単一植物をスクリーニングによって得た。遺伝子形質転換および遺伝子挿入は、ダイズ植物の農業形質（実生の生長力、繁殖、時期、植物の高さ、または倒伏など）に影響する場合があり、上記の２１株の遺伝子導入Ｔ２世代単一植物を圃場に栽植して、異なる各段階（実生段階から全開花段階まで、初期の子実形成段階から成熟段階まで）で、その遺伝子導入Ｔ２単一植物の農業形質の性能を特定した。自己増殖および戻し交配育種の手段により、遺伝子導入ダイズ植物の農業形質、分子生態、標的昆虫に対する抵抗性、およびグルホシネート除草剤耐性が、異なる世代、異なる地理的環境、および／または異なる基礎環境物質の条件下で安定的に遺伝し得るかどうかをスクリーニングし、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を優れたイベントとして選択した。そのイベントは、導入遺伝子の単一複製物（実施例２を参照されたい）を有し、良好な昆虫抵抗性、グルホシネート除草剤耐性、および農業形質性能（実施例６および実施例７を参照されたい）を有する。

ＴａｑＭａｎによる遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の検出
植物ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、試料としての遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の葉（約１００ｍｇ）からゲノムＤＮＡを抽出し、ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子のコピー数を、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて蛍光定量ＰＣＲ法により検出した。一方、対照としての野生型ダイズ植物を、上記の方法による検出および解析に供した。実験を３反復で実施し、平均値を計算した。

具体的な方法は以下の通りである。

ステップ１：１００ｍｇの遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の葉を、液体窒素と共に乳鉢で磨砕してホモジネートにし、それぞれの試料を３反復で準備した。

ステップ２：上記の各試料のゲノムＤＮＡを、植物ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、詳細な方法についてはその製品説明書を参照されたい）を用いて抽出した。

ステップ３：上記の各試料のゲノムＤＮＡの濃度を、超微量分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。

ステップ４：上記の各試料のゲノムＤＮＡの濃度を、８０ｎｇ／μＬから１００ｎｇ／μＬまでの範囲で同じ濃度値に調整した。

ステップ５：各試料のコピー数を、Ｔａｑｍａｎプローブを用いた蛍光定量ＰＣＲ法により特定した。ここでは、コピー数が既知の特定済みの試料を標準として用い、野生型ダイズ植物からの試料を対照として用いた。それぞれの試料を３反復で試験し、平均値を計算した。蛍光定量ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。

以下のプライマーおよびプローブを、ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子の配列を検出するために用いる。

プライマー１：配列表の配列番号１６に定めるｃｇａａｔａｃａｇａａｃｃｃｔｇｔｃｇｇｃ
プライマー２：配列表の配列番号１７に定めるｃｇｔｇａｇｇａａｇｇｔｃｔｃａｇａａａｔｇａｃ
プローブ１：配列表の配列番号１８に定めるｃｇａｃｇａｔｇｇｃｇｔｇｔａｔａｔｇｃｃｔｃｔｔｇｇ
以下のプライマーおよびプローブを、ＰＡＴ遺伝子の配列を検出するために用いる。

プライマー３：配列表の配列番号１９に定めるｇａｇｇｇｔｇｔｔｇｔｇｇｃｔｇｇｔａｔｔｇ
プライマー４：配列表の配列番号２０に定めるｔｃｔｃａａｃｔｇｔｃｃａａｔｃｇｔａａｇｃｇ
プローブ２：配列表の配列番号２１に定めるｃｔｔａｃｇｃｔｇｇｇｃｃｃｔｇｇａａｇｇｃｔａｇ
ＰＣＲ反応系は以下を含む。

ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標） Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ） １０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物 １μＬ
ゲノムＤＮＡ ３μＬ
再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ） ６μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物は、濃度１ｍＭのそれぞれのプライマー４５μL、濃度１００μＭのプローブ５０μL、および１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）８６０μLを含み、アンバーチューブ内に４℃で貯蔵した。

ＰＣＲ反応条件は以下を含む。

ステップ 温度 時間
１ ９５℃ ５分
２ ９５℃ ３０秒
３ ６０℃ １分
４ ステップ２に戻り、４０回繰り返し
高速リアルタイム蛍光定量ＰＣＲシステムソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ ｖ２．３、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータを解析した。その結果、得られた遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は単一コピーであることが示された。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の挿入部位の解析
３．１ ゲノムＤＮＡの抽出
従来のＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物(ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)）法によりＤＮＡを抽出した。すなわち、２ｇの遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の若葉を液体窒素中で粉末に磨砕した後、６５℃にあらかじめ加熱した０．５ｍＬのＣＴＡＢのＤＮＡ抽出緩衝液（２０ｇ／ＬのＣＴＡＢ、１．４ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ（エデト酸）、ｐＨをＮａＯＨでｐＨ８．０に調整）を添加し、次にそれらをよく混合し、６５℃で９０分間抽出した。０．５容積のフェノールおよび０．５容積のクロロホルムを添加し、反転することによりに混合した。混合物を１２，０００ｒｐｍ（１分間あたりの回転数）で１０分間遠心した。上清をピペットで取り、２容積の無水エタノールを添加した。遠心管を穏やかに振り、次に４℃で３０分間静置した。ＤＮＡが遠心管の底に集まるように、遠心管を１２，０００ｒｐｍで１０分間再び遠心した。上清を捨て、沈渣を１ｍＬの７０％（質量濃度）エタノールで洗浄した。混合物を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。沈渣を、減圧下で乾燥または超清浄実験台上で送風乾燥した。得られたＤＮＡ沈渣を適当な量のＴＥ緩衝液に溶解し、－２０℃で貯蔵した。

３．２ 隣接ＤＮＡ配列の解析
上記の抽出ＤＮＡ試料の濃度を測定した。試験する試料の濃度は８０～１００ｎｇ／μＬである。制限酵素のＥｃｏＲ Ｉ（５’末端解析）およびＥｃｏＲ Ｖ（３’末端解析）それぞれを用いてゲノムＤＮＡを消化した。それぞれの酵素消化系に、２６．５μＬのゲノムＤＮＡ、０．５μＬの上記の制限酵素、および３μＬの酵素消化緩衝液（使用した全ての制限酵素は、その配合緩衝液またはＮＥＢ社からの一般的な緩衝液（現在ＮＥＢＣｕｔＳｍａｒｔとして知られている）有する酵素である）を添加し、１時間消化した。消化の後、酵素消化系に７０μＬの無水エタノールを添加し、氷浴中に３０分間保持し、１２，０００ｒｐｍで７分間遠心した。上清を捨てた後、沈渣を送風乾燥し、次に、８．５μＬの再蒸留水、１μＬの１０×Ｔ４－ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液、その具体的な配合については、ＮＥＢのウェブサイトにアクセスするか、または、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓもしくはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂ０２０２－ｔ４－ｄｎａ－ｌｉｇａｓｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｂｕｆｆｅｒを参照されたい）、および０．５μＬのＴ４－ＤＮＡリガーゼを添加し、次に４℃で一晩かけて連結させた。一連のネステッドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、５’末端ゲノムＤＮＡおよび３’末端ゲノムＤＮＡを単離した。具体的には、５’末端ゲノムＤＮＡを単離するためのプライマーの組み合わせは、第１のプライマーとして配列番号１３および配列番号２６、第２のプライマーとして配列番号２７および配列番号２８、ならびに配列決定プライマーとして配列番号１３を含む。３’末端ゲノムＤＮＡを単離するためのプライマーの組み合わせは、第１のプライマーとして配列番号１５および配列番号２９、第２のプライマーとして配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列決定プライマーとして配列番号１５を含む。ＰＣＲ反応条件を表３に示した。

上記のＰＣＲ増幅から生じた増幅産物を、質量分率が２．０％のアガロースゲルで電気泳動に供して、ＰＣＲ増幅産物を単離し、続いて、ゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、カタログ＃＿２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ株式会社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、アガロースマトリックスから標的断片を単離した。次に、精製したＰＣＲ増幅産物を配列決定し（例えばＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用）、解析した（例えばＤＮＡＳＴＡＲ配列解析ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ株式会社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて）。

５’および３’の隣接配列および接合部配列を標準的なＰＣＲの手法を用いて確認した。５’の隣接配列および接合部配列は、配列番号８または配列番号１２を、配列番号９、配列番号１３、または配列番号２６と組み合わせて用い、確認した。３’の隣接配列および接合部配列は、配列番号１１または配列番号１４を、配列番号１０、配列番号１５、または配列番号２９と組み合わせて用い、確認した。ＰＣＲ反応系および増幅条件を表２および表３に示した。隣接配列および接合部配列を確認するために他のプライマー配列も使用可能であることが、当業者には認識されよう。

ＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列決定により、他のＤＮＡ分子の設計に用いることが可能なＤＮＡが提供される。他のＤＮＡ分子は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来するダイズ植物または種子を特定するためのプライマーおよびプローブとして用いることが可能なＤＮＡ分子である。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の挿入配列は、配列番号５のヌクレオチド１～６４７に示されるダイズゲノム配列に右境界（５’隣接配列）で隣接し、配列番号５のヌクレオチド６６４７～７３４４に示されるダイズゲノム配列に左境界（３’隣接配列）で隣接することがわかった。５’接合部配列は配列番号１に定め、３’接合部配列は配列番号２に定めた。

３．３． 接合状態についてのＰＣＲアッセイ
接合部配列は比較的短いポリヌクレオチド分子であるが、それは、新規なＤＮＡ配列であり、ポリヌクレオチドの検出および解析において検出される場合には遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡに特徴的である。配列番号１および配列番号２の中の各接合部配列は、それぞれ、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２における遺伝子導入断片およびダイズゲノムＤＮＡの挿入部位の両側の１１個のポリヌクレオチドである。より長いまたはより短いポリヌクレオチド接合部配列を、配列番号３または配列番号４から選択することができる。接合部配列（５’接合部領域として用いられる配列番号１、および３’接合部領域として用いられる配列番号２）は、ＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマー分子としてＤＮＡを検出するための方法において有用であった。接合部配列である配列番号６および配列番号７もまた、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の新規ＤＮＡ配列であり、それらも、ＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマー分子として遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在を検出するために用いることが可能であった。配列番号６（配列番号３のヌクレオチド９１１～１１２９）は、ｐＤＢＮ４００６構築物においてＤＮＡ配列とｐｒＡｔＡｃｔ２転写起点配列とにまたがり、配列番号７（配列番号４のヌクレオチド１～２４３）は、ｐＤＢＮ４００６構築物においてｔ３５Ｓ転写終結配列とＤＮＡ配列とにまたがる。

さらに、配列番号３または配列番号４に由来する少なくとも１つのプライマーを用いてアンプリコンを生成し、前記プライマーは、ＰＣＲ法で用いた場合に、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンを生成した。

具体的には、ＰＣＲ増幅産物は、遺伝子導入挿入配列の５’末端から生成され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する植物原料のゲノムの中のＴ－ＤＮＡ挿入配列に隣接する５’末端のゲノムＤＮＡの一部を含んでいた。このＰＣＲ増幅産物は配列番号３を含む。ＰＣＲ増幅のために、遺伝子導入挿入配列に隣接する５’末端のゲノムＤＮＡ配列とハイブリダイズし得るプライマー５（配列番号８）と、プライマー５と対になっておりＴ－ＤＮＡ挿入配列のｐｒＡｔＡｃｔ２転写起点配列中に位置するプライマー６（配列番号９）とを設計した。

ＰＣＲ増幅産物は、遺伝子導入挿入配列の３’末端から生成され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する植物原料のゲノムの中のＴ－ＤＮＡ挿入配列に隣接する３’末端のゲノムＤＮＡの一部を含んでいた。このＰＣＲ産物は配列番号４を含む。ＰＣＲ増幅のために、Ｔ－ＤＮＡ挿入配列のｔ３５Ｓ転写終結配列中に位置するプライマー７（配列番号１０）と、プライマー７と対になっており遺伝子導入挿入配列に隣接する３’末端のゲノムＤＮＡ配列とハイブリダイズし得るプライマー８（配列番号１１）とを設計した。

表２および表３に記載のＤＮＡ増幅条件を上記の接合状態についてのＰＣＲアッセイで用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンを生成することが可能である。アンプリコンの検出は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔなどのサーモサイクラーを用いることによって、または当業者に既知の方法および装置によって行うことが可能である。

反応溶液を穏やかに混合し、サーモサイクラーにホットトップがない場合は、それぞれの反応溶液の上に１～２滴のミネラルオイルを添加した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒ－Ｂｉｏｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州）、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク、ドイツ）などのサーモサイクラーで、表３に示したサイクルパラメータを用いてＰＣＲ反応を行った。ＭＪ ＥｎｇｉｎｅまたはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔのサーモサイクラーは計算モードで運転するべきである。Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００のサーモサイクラーは、勾配速度を運転時に最大に設定するべきである。

実験は以下の結果を示す。プライマー５およびプライマー６（配列番号８および９）を遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、１５２４ｂｐ断片の増幅産物を生じるが、それらのプライマーを、非形質転換ダイズゲノムＤＮＡおよび非ＤＢＮ８００２ダイズゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、断片は増幅されなかった。プライマー７およびプライマー８（配列番号１０および１１）を遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、６５６ｂｐ断片の増幅産物を生じるが、それらのプライマーを、非形質転換ダイズゲノムＤＮＡおよび非ＤＢＮ８００２ダイズゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、断片は増幅されなかった。

接合状態についてのＰＣＲアッセイはまた、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する材料がホモ接合性かそれともヘテロ接合性かを特定することにも用いることが可能である。プライマー９（配列番号１２）、プライマー１０（配列番号１３）、およびプライマー１１（配列番号１４）を増幅反応で用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンを作製した。表４および表５に記載のＤＮＡ増幅条件を上記の接合状態についてのＰＣＲアッセイで用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンを作製することが可能である。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒ－Ｂｉｏｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ボストン、マサチューセッツ州）、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク、ドイツ）などのサーモサイクラーで、表５に示したサイクルパラメータを用いてＰＣＲ反応を行った。ＭＪ ＥｎｇｉｎｅまたはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔのサーモサイクラーは計算モードで運転するべきである。Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００のサーモサイクラーは、勾配速度を運転時に最大に設定するべきである。

増幅反応において、鋳型ＤＮＡを含む生物学的試料は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在に特徴的なＤＮＡを含有する。あるいは、増幅反応は、ダイズゲノムに由来するＤＮＡを含む生物学的試料から生成される２つの異なるＤＮＡアンプリコンを生じることになり、ダイズゲノムに由来するＤＮＡは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に存在する挿入ＤＮＡに相当する対立遺伝子についてヘテロ接合性である。これらの異なる２つのアンプリコンは、野生型ダイズゲノムの座位に由来する第１のアンプリコン（配列番号１２および配列番号１４）、ならびに遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡの存在に特徴的な第２のアンプリコン（配列番号１２および配列番号１３）に相当することになる。ヘテロ接合性ゲノムに関して述べた第２のアンプリコンに相当する単一アンプリコンを生成するのみであるダイズＤＮＡ試料は、その試料中に遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が存在すると診断することができ、その試料は、遺伝子導入ダイズ植物ＤＢＮ８００２に存在する挿入断片ＤＮＡに相当する対立遺伝子についてホモ接合性であるダイズ種子から産生された。

着目すべきは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のプライマー対を用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のゲノムＤＮＡに特徴的なアンプリコンを作製することである。これらのプライマー対は、以下に限定されるものではないが、プライマー５およびプライマー６（配列番号８および配列番号９）、ならびにプライマー７およびプライマー８（配列番号１０および配列番号１１）を包含し、ＤＮＡ増幅法で用いられる。また、内在ダイズ遺伝子の増幅のための対照プライマー１２および対照プライマー１３（配列番号２２および配列番号２３）が、反応条件の内部標準として包含される。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡ抽出試料の解析には、陽性対照として遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの組織ＤＮＡ抽出物、陰性対照として遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２ではないダイズ植物からのＤＮＡ抽出物、および鋳型ダイズＤＮＡ抽出物を含まない陰性対照が包含されるべきである。これらのプライマー対に加えて、配列番号３もしくはその相補的配列、または配列番号４もしくはその相補的配列からの任意のプライマー対を用いることができる。これらのプライマーは、ＤＮＡ増幅反応に用いた場合に配列番号１または配列番号２を含むアンプリコンをそれぞれ産生し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する組織に特徴的である。表２から表５に記載したＤＮＡ増幅条件は、適切なプライマー対を用いることによって、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンの作製に用いることができる。ＤＮＡ増幅法で遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に特徴的なアンプリコンを作製し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２または遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する産物を含有すると推定されるダイズ植物または種子のＤＮＡ抽出物を、増幅のための鋳型として用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在を決定することができる。

サザンブロットによる遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の検出
４．１ サザンブロットで用いるためのＤＮＡ抽出
乳鉢および乳棒を用い、およそ５ｇから１０ｇの植物組織を液体窒素中で磨砕した。４ｇから５ｇの磨砕した植物組織を、２０ｍＬのＣＴＡＢ溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１．４ＭのＮａＣｌ、０．２％ｖ／ｖのβ－メルカプトエタノール、２％ｗ／ｖのＣＴＡＢ）に再懸濁し、６５℃の温度で６０分間インキュベートした。インキュベーションの間、１０分ごとに反転することによって試料を均一に混合した。インキュベーションの後、等しい容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、抽出のために反転させることによって穏やかに混合し、次に４，０００ｒｐｍの回転速度で２０分間遠心した。水相を採取し、等しい容積のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で１度再抽出した。水相を再び採取し、等しい容積のイソプロパノールを添加した。その混合物を均一に混合し、－２０℃の温度で１時間静置してＤＮＡを沈殿させ、次に４，０００ｒｐｍの回転速度で５分間遠心してＤＮＡ沈渣を得、続いて１ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）に再懸濁した。存在し得る全てのＲＮＡを分解するために、４０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａと共に３７℃の温度で３０分間、ＤＮＡをインキュベートし、４，０００ｒｐｍの回転速度で５分間遠心し、次に、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２倍量の無水エタノールの存在下で、１２，０００ｒｐｍの回転速度で１０分間遠心してＤＮＡを沈殿させた。上清を捨てた後、１ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで沈渣を洗浄し、室温下で乾燥し、次に１ｍＬのＴＥ緩衝液にＤＮＡを再溶解した。

４．２ 制限酵素消化
上述の試料におけるゲノムＤＮＡの濃度を、超微量分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることによって測定した。

１００μＬの反応系において、５μｇのＤＮＡを毎回消化した。Ｔ－ＤＮＡにおけるｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子の各配列の一部をプローブとして用い、制限酵素Ｍｆｅ ＩおよびＮｃｏ ＩでゲノムＤＮＡをそれぞれ消化した。それぞれの酵素について消化産物を適当な温度で一晩インキュベートした。遠心減圧濃縮器（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中で試料を回転させて、容積を２０μLまで減じた。

４．３ ゲル電気泳動
ブロモフェノールブルーのローディングダイを実施例４．２からのそれぞれの試料に添加し、臭化エチジウムを含有する０．７％アガロースゲルにそれぞれの試料を載せ、ＴＡＥ電気泳動緩衝液（４０ｍＭのトリス酢酸、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）において単離のために電気泳動にかけた。ゲル電気泳動を２０Ｖの電圧で一晩運転した。

電気泳動の後、ゲルを０．２５ＭのＨＣｌで１０分間処理してＤＮＡを脱プリン化し、次に変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＮａＯＨ）および中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．２）それぞれで３０分間処理した。５×ＳＳＣ（３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）を磁製皿に注ぎ入れ、ガラスを覆い、次にウェットフィルターペーパーブリッジ、ゲル、正電荷ナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４１７２４０００１）、３枚のフィルターペーパー、ペーパータワー、および重量物を順次置いた。室温で一晩、膜転写した後、ナイロン膜を脱イオン水で２回すすぎ、紫外線クロスリンカー（ＵＶＰ、ＵＶクロスリンカー ＣＬ－１０００）によってＤＮＡを膜に固定化した。

４．４ ハイブリダイゼーション
プローブを準備するために適切なＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡプローブは、配列番号２４もしくは配列番号２５か、またはそれらの配列に部分的に相同的もしくは相補的であった。プローブのＤＩＧ標識、サザンブロット、膜洗浄、および他の操作を、ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１５８５６１４９１０）を用いて行った。具体的な方法については、それらの製品説明書を参照されたい。最終的に、Ｘ線フィルム（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６６９１６００１）を用いて、プローブが結合している位置を検出した。

それぞれのサザンブロットは以下の２つの対照試料を包含した。すなわち、それぞれのサザンブロットは、（１）陰性（非形質転換）分離個体からのＤＮＡであって、エレメント特異的なプローブにハイブリダイズ可能な任意の内在ダイズ配列を特定するために用いられたＤＮＡと、（２）陰性分離個体からのＤＮＡであって、Ｈｉｎｄ ＩＩＩに消化されたｐＤＢＮ４００６プラスミドがプローブの長さに基づいた単一コピー数に等価な量で導入され、ダイズゲノムにおいて遺伝子の単一コピーを検出する場合の実験の感度を示すために、陽性対照として用いられたＤＮＡとを包含した。

ハイブリダイゼーションのデータによってＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ解析を支持する裏づけとなる証拠が提供された。それはつまり、ダイズ植物ＤＢＮ８００２はｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子を単一コピーで含有するということである。ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子のためのプローブを用いることによって、Ｍｆｅ ＩおよびＮｃｏ Ｉの酵素消化は約５．５ｋｂおよび１１ｋｂの単一バンドをそれぞれ生成し、ＰＡＴ遺伝子のためのプローブを用いることによって、Ｍｆｅ ＩおよびＮｃｏ Ｉの酵素消化は約２．５ｋｂおよび１０ｋｂの単一バンドをそれぞれ生成する。このことは、ｍＶｉｐ３Ａａ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子は、ダイズ植物ＤＢＮ８００２に１つのコピーでそれぞれ存在していたことを表している。さらに、骨格プローブを用いると、ハイブリダイゼーションバンドは得られなかった。このことは、ベクターｐＤＢＮ４００６の骨格配列は、形質転換の間にダイズ植物ＤＢＮ８００２のゲノムに導入されなかったことを表している。

ＥＬＩＳＡによる遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２におけるタンパク質発現の検出
遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２におけるＶｉｐ３Ａａタンパク質およびＰＡＴタンパク質の発現範囲は、ＥＬＩＳＡによって検出することができる。

２ｍｇの遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の凍結乾燥した葉を秤量し、試料とした。液体窒素中でその葉を磨砕し、次に１ｍＬの抽出緩衝液（８ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．４２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、および５．５ｍｌ／ＬのＴｗｅｅｎ－２０；ｐＨ７．４）を添加した。その混合物を均一に混合し、４℃の温度で３０分間静置し、次に１２，０００ｒｐｍの回転速度で１０分間遠心した。上清をピペットで取り、上記の抽出緩衝液で適切な希釈度まで希釈した。８０μＬの希釈した上清をＥＬＩＳＡによる検出のために採取した。

葉の乾燥重量単位での試料中のタンパク質（Ｖｉｐ３Ａａタンパク質およびＰＡＴタンパク質）の量を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）検出キット（ＥＮＶＩＲＬＯＧＩＸ社、Ｖｉｐ３Ａａ ｋｉｔ（ＡＰ０８５）およびＰＡＴ ｋｉｔ（ＡＰ０１４））により測定し、解析した。具体的な方法についてはそれらの製品説明書を参照されたい。一方、野生型ダイズ植物の葉（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を対照試料として用いた。１株につき６反復で、上述の方法に従って検出および解析を実施した。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のタンパク質（Ｖｉｐ３Ａａタンパク質およびＰＡＴタンパク質）の含量の実験結果は、表６に示す通りであった。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物の葉におけるＶｉｐ３Ａａタンパク質の葉の乾燥重量単位での平均発現レベル（μｇ／ｇ）は、それぞれ１４．４９および０であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物の葉におけるＰＡＴタンパク質の葉の乾燥重量単位での平均発現レベル（μｇ／ｇ）は、それぞれ２２７．２９および０であった。

イベントの昆虫に対する抵抗性の検出
６．１ 中国でのダイズ植物ＤＢＮ８００２のバイオアッセイ
２種類の植物、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を、オオタバコガ（ＣＢＷ）、ハスモンヨトウ（ＴＣＷ）、シロイチモジヨトウ（ＢＡＷ）、およびトビイロスズメ（ＢＨＭ）を用いて、以下のバイオアッセイによって試験した。

２種類の植物、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）から、Ｖ３段階での上部２枚目の葉をそれぞれ準備した。それらを滅菌水ですすぎ、乾燥するまでガーゼで吸い取った。次に、葉脈を除去すると共に、ダイズの葉を約２．５ｃｍ×３ｃｍの形状に切り取った。１片から３片の葉（葉の数は昆虫の葉摂取量に基づいて決定した）を、円形の各プラスチック製ペトリ皿の底の蒸留水で湿らせたフィルターペーパー上に置いた。人工給餌によって孵化させたばかりの１０匹の幼虫をそれぞれの皿に置いた。次に、各ペトリ皿を蓋で覆い、温度２６～２８℃、相対湿度７０％～８０％、および光周期（明期／暗期）１６：８を包含する条件下で３日間保って、統計的結果を得た。３つの指標である幼虫の発達率、試験した昆虫の死滅率、および葉の損傷率を統計的に解析して、抵抗性形質の総点数（満点：３００点）を得た。抵抗性形質の総点数＝１００×死滅率＋［１００×死滅率＋９０×（孵化させたばかりの昆虫の数／投入幼虫の総計）＋６０×（陰性対照のための、孵化させたばかりの昆虫の数／投入幼虫の総計）＋１０×（陰性対照のための昆虫の数／投入幼虫の総計）］＋１００×（１－葉の損傷率）であり、投入幼虫の総計は、投入した幼虫の総数、すなわちそれぞれの皿における１０匹の幼虫を言い、幼虫の発達率は抵抗性形質の総点数の式によって反映され、葉の損傷率は葉の総面積における昆虫給餌面積の割合を言う。それぞれの昆虫について、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）からの５株の植物を、１株につき６反復で試験した。その結果を表７～表８および図３～図６にそれぞれ示した。

結果は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２はＮＧＭよりも著しく高い試験昆虫の死滅率および抵抗性形質の総点数を示し、このことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が、オオタバコガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、およびトビイロスズメに対して良好な抵抗性を有することを表している。

６．２ 中国での遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場試験
遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を圃場に栽植した。３反復での乱塊法を用いた。区域は、面積が３０ｍ２（５ｍ×６ｍ）、条間隔が６０ｃｍ、栽植間隔が１０ｃｍであった。植物を従来の方法で栽培および管理し、繁殖の全期間を通じて殺虫剤の散布を避けた。

（１）オオタバコガ
オオタバコガの自然発生が重大である地域で、ダイズを自然寄生に供するのみとした（自然な昆虫損傷の発生条件：最も深刻な損傷は６月から７月までに発生し、害虫の成長最適温度は２０℃から３０℃までの範囲である）。ダイズ植物がＶ３段階（３枚葉）まで生育した時に、オオタバコガの幼虫に食べられたＮＧＭの葉を調査するためにそれらのダイズ植物を追跡した。ＮＧＭの上部２枚目と３枚目の葉が食べ尽くされていない時に、オオタバコガのダイズ植物への損傷の面積率（損傷の面積率＝それぞれの単一植物における葉の損傷面積の合計／植物の葉の総面積×１００％）を一枚ずつ調査した。オオタバコガに対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の抵抗性の結果を表９に示す。

結果は、オオタバコガの自然発生の条件下では、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、ＮＧＭと比較してオオタバコガの損傷面積率が著しく低減したことを示し、よってこのことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２がオオタバコガに対して良好な抵抗性を有することを表している。オオタバコガの自然発生の条件下における遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を図７に示す。

（２）シロイチモジヨトウ
シロイチモジヨトウの自然発生が重大である地域で、ダイズを自然寄生に供するのみとした（自然な昆虫損傷の発生条件：最も深刻な損傷は６月から７月までに発生し、害虫の成長最適温度は２０℃から３０℃までの範囲である）。ダイズ植物がＶ３段階まで生育した時に、シロイチモジヨトウの幼虫に食べられたＮＧＭの葉を調査するためにそれらのダイズ植物を追跡した。ＮＧＭの上部２枚目と３枚目の葉が食べ尽くされていない時に、シロイチモジヨトウのダイズ植物への損傷の面積率（損傷の面積率＝それぞれの単一植物における葉の損傷面積の合計／植物の葉の総面積×１００％）を一枚ずつ調査した。シロイチモジヨトウに対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の抵抗性の結果を表１０に示す。

結果は、シロイチモジヨトウの自然発生の条件下では、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、ＮＧＭと比較してシロイチモジヨトウの損傷面積率が著しく低減したことを示し、よってこのことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２がシロイチモジヨトウに対して良好な抵抗性を有することを表している。シロイチモジヨトウの自然発生の条件下における遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を図８に示す。

（３）ハスモンヨトウ
ダイズ植物のＶ３段階で人工投入を２度実施した。それぞれの区域の中心領域の近くの１００株の植物を選択し、人工投入に供した。それぞれのダイズ植物の上部２枚目の葉に、人工給餌によって孵化させたばかりの約１０匹の幼虫を投入した。投入の３日後に、１回目の投入と同じ幼虫密度で２回目の投入を実施した。投入の５～２１日後に、幼虫に食べられた植物の葉の面積を１枚ずつ調査した。調査は、おおむね、投入の１４日後に実施した。ＮＧＭにおける葉の損傷面積率（損傷面積率＝それぞれの単一植物における葉の損傷面積の合計／植物の葉の総面積×１００％）が１５％に達すれば、有効であるとみなした。損傷面積率が１５％に達しなければ調査を適宜延期し得たが、２１日後に損傷面積率がなお１５％に達しなければ、この投入は無効とみなした。それぞれの区域におけるダイズ植物のＶ３段階の間のハスモンヨトウのダイズ葉への損傷面積率の平均値を計算した。ハスモンヨトウに対する遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の抵抗性の結果を表１１に示す。

結果は、人工投入の条件下では、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は損傷面積率がＮＧＭよりも著しく低いことを示し、よってこのことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２がハスモンヨトウに対して良好な抵抗性を有することを表している。ハスモンヨトウを投入した遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場効果を図９に示す。

６．３ アルゼンチンでのダイズ植物ＤＢＮ８００２のバイオアッセイ
２種類の植物、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を、クリソデイキス・インクルデンス（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ（ＳＢＬ））、ラチプルシア・ヌ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ（ＳＦＬ））、ヨトウガ（ＦＡＷ）、およびスポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ（ＢＬＡＷ））を用いて、以下のバイオアッセイによって試験した。

２種類の植物、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）から、Ｖ３段階での上部２枚目の葉をそれぞれ準備した。それらを滅菌水ですすぎ、乾燥するまでガーゼで吸い取った。次に、葉脈を除去すると共に、ダイズの葉を直径が約１ｃｍの円形に切断した。１片から３片の円形の葉（葉の数は昆虫の葉摂取量に基づいて決定した）を、各バイオアッセイプレートの各ウェル内の蒸留水で湿らせたフィルターペーパー上に置いた（図１０に示す）。孵化させたばかりの１匹の幼虫をそれぞれのウェル内に置いた。次に、各プレートを蓋で覆い、温度２６～２８℃、相対湿度７０％～８０％、および光周期（明期／暗期）１６：８を包含する条件下で５日間保って、統計的結果を得た。試験した昆虫の死滅率および葉の損傷率（葉の損傷率は、葉の総面積における昆虫に食べられた葉の面積の割合を言う）を統計的に解析した。それぞれの昆虫について、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）から、生育力が同等の６株の植物を、１株につき３２個のバイオアッセイウェルで試験した。結果を表１２および図１０（ヨトウガ）に示す。

結果は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は上述の昆虫種の試験昆虫についてＮＧＭよりも著しく高い死滅率を示し、このことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が、クリソデイキス・インクルデンス（ＳＢＬ）、ラチプルシア・ヌ（ＳＦＬ）、ヨトウガ（ＦＡＷ）、およびスポドプテラ・コスミオイデス（ＢＬＡＷ）（南米でダイズにみられる典型的な害虫類）に対して良好な抵抗性を有することを表している。

６．４ アルゼンチンでの遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の圃場試験
２種類の植物、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を圃場に栽植し、クリソデイキス・インクルデンス（ＳＢＬ）、ラチプルシア・ヌ（ＳＦＬ）、アンティカルシア・ゲムマタリス(Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ（ＶＢＣ）)、ヨトウガ（ＦＡＷ）を用い、以下の方法に従って圃場でのｉｎ ｖｉｖｏバイオアッセイを実施した。

大きなバイオアッセイケージ（スクリーンメッシュ型）を圃場に準備した。それぞれのバイオアッセイケージは１匹の昆虫のみの試験に用いた。個々のバイオアッセイケージは互いに通じる状態で配置せず、圃場で人工的に栽植したトウモロコシおよび自然に生育している雑草によって、さらに物理的に独立させた。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２および野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）を、１つ１つのバイオアッセイケージに無作為に栽植した。１つの植物の型につき３つの複製株を栽植し、それぞれの複製株を１つの作条（作条長さ：３ｍ、１つの作条あたり３０株、条間隔：５０ｃｍ）に栽植した。それらの植物を従来の方法で栽培および管理し、繁殖の全期間を通じて殺虫剤の散布を避けた。植物がＶ５段階（５枚葉）あたりまで生育した時に、適切な数の上述の種の成虫をケージの中に放った。１０日後、葉の損傷率（葉の総面積における昆虫に食べられた葉の面積の割合を言う）を調査した。結果を表１３に示す。

結果は、人工投入の条件下では、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２はＮＧＭよりも低い葉の損傷率を示し、このことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が、クリソデイキス・インクルデンス（ＳＢＬ）、ラチプルシア・ヌ（ＳＦＬ）、アンティカルシア・ゲムマタリス（ＶＢＣ）、およびヨトウガ（ＦＡＷ）（南米でダイズにみられる典型的な害虫類）に対して良好な抵抗性を有することを表している。

イベントの除草剤耐性の検出
バスタ除草剤（活性成分が１８％グルホシネート水溶液）を実験で散布使用するために選択した。３反復での乱塊法を用いた。区域は、面積が１５ｍ２（５ｍ×３ｍ）、条間隔が６０ｃｍ、かつ栽植間隔が２５ｃｍであった。植物を従来の方法で栽培および管理し、各区域間に１メートルの距離を設定した。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を以下の２つの処理に供した。すなわち、（１）散布使用ではなく、処理（２）の間、除草剤を散布する時に等しい容積の清浄水を散布し、（２）Ｖ２～Ｖ３の葉の段階（２枚葉または３枚葉）で、バスタ除草剤を８００ｇ ａ．ｉ．／ｈａ（ａ．ｉ．／ｈａは「１ヘクタールあたりの活性成分」を意味する）の使用量で散布使用した。なお、グルホシネート除草剤（バスタなど）は接触型除草剤であり、その除草剤を圃場で不適切に扱うと、例えば過剰な除草剤溶液が局所的に蓄積し、植物毒性症状が発生しかねず、このことは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が耐性を損なったことを意味するのではなく、様々な濃度および配合のグルホシネート除草剤も、上記と等量の活性成分グルホシネートに転換すれば、以下の結論に当てはまることに留意するべきである。

植物毒性症状の調査を使用後１週間および２週間でそれぞれ実施し、区域の収量を収穫時に決定した。植物毒性症状の評点を表１４に示す。形質転換イベントの除草剤耐性を、指標として除草剤の損傷率を用いることによって算定した。特に、除草剤の損傷率（％）＝Σ（同じ損傷レベルの植物の数×レベル数）／（植物の総数×最も高いレベル）であり、除草剤の損傷率は、グルホシネート処理の２週間後の植物毒性調査の結果によって算出したグルホシネートの損傷率を言い、除草剤に対するダイズの耐性レベルを、除草剤（グルホシネート）の損傷率に基づいて算定した。それぞれの区域のダイズ収量を、それぞれの区域の中央における３つの作条のダイズ子実の総収量（重量による）を秤量することによって得た。異なる処理間の収量の差を収量の百分率として評価した。収量の百分率（％）＝散布使用有りでの収量／散布使用無しでの収量。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の除草剤耐性およびダイズ収量の結果を表１５に示す。

結果は、グルホシネート除草剤による損傷率に関しては、グルホシネート除草剤（８００ｇ ａ．ｉ．／ｈａ）で処理した遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の損傷率は０である。従って、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、良好なグルホシネート除草剤耐性を有する。

収量の点では、散布使用がない処理と８００ｇ ａ．ｉ．／ｈａのグルホシネートの散布使用がある処理との間で、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の収量において有意な差はない。従って、このことはさらに、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２が良好なグルホシネート除草剤耐性を有し、かつその収量が損なわれないことを示している。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２から農産物または商品を製造することができる。農産物または商品において十分な発現量が検出されれば、それらの農産物または商品は、その農産物または商品の中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２からの材料の存在に特徴的であり得るヌクレオチド配列を含有していると推定される。農産物または商品は、以下に限定されるものではないが、ダイズの粕、粉および油、具体的にはレシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂ダイズフレーク、脱脂ダイズ粉焼成物、豆乳凝固物、豆腐、ダイズタンパク質濃縮物、単離ダイズタンパク質、植物タンパク質加水分解物、組織化ダイズタンパク質、ダイズタンパク質繊維、ならびに食物として動物による消費を意図した他の任意の食物などを包含する。プローブまたはプライマー対に基づいた核酸の検出方法および／またはキットを発展させて、配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列などの、生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来するヌクレオチド配列を検出することができ、プローブ配列またはプライマー配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２の存在を診断するために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に示す各配列、またはそれらの各部分から選択される。

結論として、本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、鱗翅目昆虫に対する良好な抵抗性を有しかつ収量を損なうことなくグルホシネート除草剤に対する高い耐性を有し、本発明の検出方法は、生物学的試料が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２のＤＮＡ分子を含有しているかどうかを正確かつ迅速に特定することができる。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当する種子は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：Ｎｏ．３，Ｎｏ．１ Ｐｒｅｃｉｎｃｔ， Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ、郵便番号１００１０１）に、ブタペスト条約に基づき、２０１９年２月１９日に保管され、その分類および名称はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、保存状態は生育可能、受入番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９である。その保管物は保管場所に３０年間保管される。

最後に、上記の実施例は、本発明を限定するよりもむしろ本発明の技術的解決法を説明するために用いられているにすぎないことに留意するべきである。本発明を好ましい実施例に照らして詳細に述べているが、当業者は、本発明の技術的解決法の趣旨と範囲から逸脱することなく、本発明の技術的解決法は変更または等価に置換することが可能であると理解するべきである。

Claims (19)

1. 核酸分子であって、前記核酸分子の核酸配列は、配列番号１もしくはその相補的配列、および／または配列番号２もしくはその相補的配列を含み、前記核酸分子は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９で、種子の形で保管されている、核酸分子。
2. 前記核酸分子の核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列、および／または配列番号４もしくはその相補的配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記核酸分子の核酸配列が配列番号５またはその相補的配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子。
4. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法であって、
   －核酸増幅反応において標的増幅産物を増幅するための少なくとも２つのプライマーに、検出される試料を接触させる工程と、
   －前記核酸増幅反応を行う工程と、
   －前記標的増幅産物の存在を検出する工程と、を含み、
   前記標的増幅産物は請求項１から３のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、方法。
5. 前記標的増幅産物は、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記プライマーが第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、前記第１のプライマーは配列番号１であり、前記第２のプライマーは配列番号２の相補的配列であり、または、前記第１のプライマーは配列番号８であり、前記第２のプライマーは配列番号９であり、または、前記第１のプライマーは配列番号１０であり、前記第２のプライマーは配列番号１１であることを特徴とする、請求項４に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法。
7. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法であって、
   －検出される試料をプローブに接触させる工程であって、前記プローブは請求項１または２に記載の核酸分子を含む、工程と、
   －前記検出される試料および前記プローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
   －前記検出される試料の前記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程と、を含むことを特徴とする、方法。
8. 前記プローブは、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 少なくとも１つのプローブが少なくとも１つのフルオロフォアで標識されることを特徴とする、請求項７に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法。
10. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に相当するＤＮＡの存在を検出するための方法であって、
    －検出される試料をマーカー核酸分子に接触させる工程であって、前記マーカー核酸分子は請求項１または２に記載の核酸分子を含む、工程と、
    －前記検出される試料および前記マーカー核酸分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
    －前記検出される試料の前記マーカー核酸分子とのハイブリダイゼーションを検出し、さらに、昆虫抵抗性および／または除草剤耐性が前記マーカー核酸分子に遺伝的に関連しているかどうかを決定するように解析を行う工程と、を含むことを特徴とする、方法。
11. 前記マーカー核酸分子は、配列番号６～１１またはその相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、前記ＤＮＡ分子は請求項１または２に記載の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２またはその子孫に特異的なＤＮＡのプライマーまたはプローブとして働くことができることを特徴とする、ＤＮＡ検出キット。
13. 前記ＤＮＡ分子は、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項１２に記載のＤＮＡ検出キット。
14. 昆虫の害からダイズ植物を保護するための方法であって、標的昆虫の餌の中に少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物の細胞を供給する工程を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞は、そのゲノム中に、配列番号５に定める配列を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９で、種子の形で保管されており、前記遺伝子導入ダイズ植物の細胞の摂取は、前記標的昆虫がさらに前記遺伝子導入ダイズ植物を餌にすることを阻害することを特徴とする、方法。
15. ダイズ植物を栽植する圃場において除草剤または雑草防除が引き起こす損傷からダイズ植物を保護するための方法であって、少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を栽植した前記圃場に有効量のグルホシネート除草剤を使用する工程を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号５に定める配列を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９で、種子の形で保管されており、前記遺伝子導入ダイズ植物はグルホシネート除草剤耐性を有することを特徴とする、方法。
16. 昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性のダイズ植物を育種するための方法であって、
    －少なくとも１つのダイズ種子を栽植する工程であって、前記ダイズ種子は、そのゲノム中に、配列番号５に定める核酸配列を含み、前記ダイズ種子は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９で、種子の形で保管されている工程と、
    －前記ダイズ種子をダイズ植物に生育する工程と、
    －前記ダイズ植物を標的昆虫で害し、および／または前記ダイズ植物に有効量のグルホシネート除草剤を散布し、次に、配列番号５を含まない他の植物に比べて植物損傷が低減した植物を収穫する工程と、を含むことを特徴とする、方法。
17. 昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性のダイズ植物を作製するための方法であって、
    －第１のダイズ植物のゲノム中の配列番号５に定める核酸配列を第２のダイズ植物に導入することによって複数の子孫植物を作製する工程であって、前記第１のダイズ植物は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７２９９で、種子の形で保管されている工程と、
    －前記子孫植物を選択する工程であって、前記子孫植物はそのゲノム中に配列番号５を含み、前記子孫植物も昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性を有する工程と、を含むことを特徴とする方法。
18. 前記方法は、
    －遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２を、昆虫抵抗性および／またはグルホシネート耐性を欠いているダイズ植物に有性的に交配することによって、複数の子孫植物を作製する工程と、
    －配列番号５を含む前記子孫植物を選択する工程と、
    －前記子孫植物を標的昆虫で害し、および／またはグルホシネートで前記子孫植物を処理する工程と、
    －昆虫抵抗性および／またはグルホシネート除草剤耐性を有する前記子孫植物を選択する工程と、を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ８００２に由来する農産物または商品であって、前記農産物または商品は、配列番号１もしくはその相補的配列、および／または配列番号２もしくはその相補的配列を有する核酸分子を含み、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、ダイズフレーク、ダイズ粉、ダイズタンパク質もしくはその濃縮物、ダイズ油、ダイズタンパク質繊維、豆乳凝固物、または豆腐であることを特徴とする、農産物または商品。