JP7039493B2 - 生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントｄｂｎ９００４の有無を検出するための核酸配列、それを含有するキット、およびその検出方法 - Google Patents

Description

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本発明は、除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法、特に、グリホサートおよびグルホシネートに対して耐性があるダイズ植物ＤＢＮ９００４、ならびに特定の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡ分子が生物学的試料に含有されているかどうかを検出する方法に関する。

Ｎ－ホスホノメチルグリシンは、グリホサートとしても知られており、系統的に、移行性、恒常性、広域スペクトル性、非選択性をもつ除草剤である。グリホサートは、合成において５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）の基質となるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の競合的阻害剤であり、ＰＥＰおよび３－ホスホシキミ酸の２つの基質が、ＥＰＳＰＳの触媒作用をうけて5－エノールピルビルシキミ酸－３－ホスホシキミ酸に転換されるのを阻害し、それによって芳香族アミノ酸の前駆体であるシキミ酸の合成経路を遮断し、タンパク質合成を妨害して植物およびバクテリアを死滅させる。

グリホサート耐性は改変されたＥＰＳＰＳを発現することによって達成される。改変されたＥＰＳＰＳはグリホサートに対して親和性が低いため、グリホサートがあっても、ＥＰＳＰＳはその触媒活性を保持しすなわちグリホサート耐性を獲得する。

ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）は世界の５主要作物の１つである。除草剤耐性、特にグリホサート除草剤に対する耐性はダイズ生産において重要な農業形質である。グリホサート除草剤に対するダイズの耐性は、ダイズイベントＧＴＳ４０－３－２、ダイズイベントＭＯＮ８９７８８などのダイズ植物中のグリホサート除草剤耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ、ＣＰ４）を発現させる遺伝子導入法によって獲得できる。

近年グリホサート耐性農法が広く採用され、グリホサートの使用が増加することにより、グリホサート抵抗性の雑草が広く発生するようになった。グリホサート抵抗性の雑草、またはより防除困難な雑草種に形質転換した雑草に耕作者が直面している地域では、駆除できなかった雑草を防除できる他の除草剤と混合しまたは交互に使用することによって、耕作者はグリホサートの欠点を補うことができる。

グルホシネートは、ホスフィノトリシン除草剤類において非系統的かつ非選択的な除草剤である。グルホシネートは、主に一年生または多年生の広葉雑草の出芽後防除に用いられ、Ｌ－ホスフィノトリシン（グルホシネートの活性成分）がグルタミン合成酵素（植物中のアンモニア解毒作用に必須の酵素）を不可逆的に阻害することを経て雑草を防除する。植物の根を枯死させるグリホサートとは違い、グルホシネートは葉を最初に枯死させて蒸散によって植物の木部中を移行することができ、その速効性はパラコートとグリホサートとの中間である。

Ｌ－ホスフィノトリシンは、ストレプトマイセスから単離されたホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）に触媒されるアセチル化を経て、不活性型へと変換される。ダイズにおいて、植物に最適化されたＰＡＴの型を発現する遺伝子を用いて、グルホシネート除草剤に対する耐性をダイズイベントＡ５５４７－１２７などのダイズに与えてきた。従って、グルホシネート耐性形質と組み合わせてグルホシネート除草剤を用いることは、グリホサート抵抗性雑草に効果的に対応するための非選択的手段として利用できる。

今後、遺伝子導入昆虫抵抗性ダイズの普及とその大規模栽植に伴い、生き残ったわずかな数の昆虫／害虫が、増殖して数世代後に抵抗性を作り出す可能性がある。非昆虫抵抗性遺伝子導入ダイズとしての遺伝子導入除草剤耐性ダイズを、遺伝子導入昆虫抵抗性ダイズとある割合で同時に栽植することで、昆虫／害虫の抵抗性の誘発を遅延させることができる。

植物における外来遺伝子の発現はそれらの染色体上の位置に影響されることが知られており、このことはクロマチン構造（例えばヘテロクロマチン）または転写制御エレメント（例えばエンハンサー）が組み込み部位に近接していることによる可能性がある。目的を達成するには、商品化され得るイベント（すなわち、導入された標的遺伝子が最適に発現され得るイベント）の同定が実行可能になる前の段階で、多くの場合、数多くのイベントをスクリーニングする必要がある。例えば、植物および他の生物体において、導入された遺伝子の発現量にはイベント間で大きな差がでる場合のあることが認められてきた。また、異なる植物組織の間で導入遺伝子の相対的発現に差があるなど、発現の空間的または時間的パターンにおいても差がでる場合のあることが認められており、このような差は、実際の発現パターンが、導入された遺伝子構築物中の転写制御エレメントに従い期待される発現パターンとは一致しない場合があるという事実により明らかである。従って、一般に、数百の異なるイベントを産生し、これらのイベントから、商品化を目的とした導入遺伝子の発現量および発現パターンによって単一のイベントを選び出す必要がある。期待された導入遺伝子発現量および発現パターンをもつイベントは、従来の育種法を用いた有性ヘテロタイプハイブリダイゼーションの手段により、他の遺伝的背景に導入遺伝子を導入するのに用いることができる。このハイブリダイゼーションの手法によって作製された子孫は、最初の形質転換体の導入遺伝子発現特性を保持している。この戦略パターンを応用することで、多くの変種で信頼性のある遺伝子発現を確実になし得、これらの変種を土地の生育条件にうまく適応させることができる。

有性ハイブリダイゼーションの子孫に標的遺伝子が含有されているかどうかを確定するために、特定のイベントの存在を検出できることは有益であろう。加えて、例えば、組換え作物由来の食品類の正式な承認および表示が、それらが市場に出される前に義務付けられることが予想され、特異的なイベントを検出する方法は関連規制に従う助けにもなるであろう。例えばポリヌクレオチドプローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションなどの、よく知られた任意のポリヌクレオチド検出方法よって導入遺伝子の存在の検出は可能である。これらの検出方法は一般に、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子などの一般的な遺伝エレメントに焦点を置いている。従って、挿入された遺伝子導入ＤＮＡに近接する染色体ＤＮＡ（「隣接ＤＮＡ」）の配列がわからない限り、このような上記の方法は異なるイベント、特に同じＤＮＡ構築物で産生されたイベントを区別できないであろう。それゆえに、挿入された導入遺伝子と隣接ＤＮＡの接合部位にまたがる１対のプライマー、特に、隣接配列を含有する第１のプライマーおよび挿入配列を含有する第２のプライマーが、現在のところ、ＰＣＲによって遺伝子導入特異的イベントを同定するために多くの場合用いられている。

本発明の目的は、除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法を提供することであり、その遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対してより良好な耐性を有し、その検出方法は、特異的な遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡ分子が生物学的試料に含有されているかどうかを正確にかつ迅速に同定できる。

上記の目的を達成するために、本発明は以下の核酸配列を有する核酸分子を提供し、その核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および／または配列番号４もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む。

好ましくは、核酸配列は、配列番号１もしくはその相補的配列、および／または配列番号２もしくはその相補的配列を含む。さらに、核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列、および／または配列番号４もしくはその相補的配列を含む。

またさらに、核酸配列は、配列番号５またはその相補的配列を含む。

配列番号１またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の５′末端に位置するヌクレオチド２２個の長さの配列であり、かつ配列番号１またはその相補的配列は、ダイズ挿入部位の隣接ゲノムＤＮＡ配列と挿入配列の５′末端のＤＮＡ配列とにまたがっている。従って、配列番号１またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４が存在することとして同定できる。配列番号２またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の３′末端に位置するヌクレオチド２２個の長さの配列であり、かつ配列番号２またはその相補的配列は、挿入配列の３′末端のＤＮＡ配列とダイズ挿入部位の隣接ゲノムＤＮＡ配列とにまたがっている。従って、配列番号２またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４が存在することとして同定できる。

本発明において、核酸配列は、配列番号３もしくはその相補的配列の中の遺伝子導入挿入配列の任意部分の、少なくとも１１個以上の連続したポリヌクレオチド（第１の核酸配列）、または配列番号３もしくはその相補的配列の中の５′隣接ダイズゲノムＤＮＡ領域の任意部分の、少なくとも１１個以上の連続したポリヌクレオチド（第２の核酸配列）であり得る。核酸配列はさらに、無傷の配列番号１を含む配列番号３に相同的または相補的な部分であり得る。第１の核酸配列および第２の核酸配列を一緒に用いる場合、ＤＮＡプライマー対としてのこれらの核酸配列を、増幅産物を作製するＤＮＡ増幅法で用いることができる。ＤＮＡプライマー対を用いたＤＮＡ増幅法で、作製された増幅産物が配列番号１を含む増幅産物である場合、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫の存在を診断できる。第１および第２の核酸配列は、ＤＮＡのみからなる必要はなく、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは他のヌクレオチドの組み合わせ、または１つ以上のポリメラーゼの鋳型としてではないそれらの類似体を含み得ることは、当業者には周知である。さらに本発明に記述のプローブまたはプライマーは、長さが少なくとも約１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、または２２個の連続したヌクレオチドであるべきであり、それは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５で示すヌクレオチドから選択することができる。プローブおよびプライマーは、配列番号３、配列番号４、および配列番号５で示すヌクレオチドから選択される場合、少なくとも約２１個から約５０個以上の長さを有する連続したヌクレオチドであってもよい。配列番号３またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の５′末端に位置するヌクレオチド１２０７個の長さの配列であり、かつ配列番号３またはその相補的配列は、７４０個のヌクレオチドのダイズ隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号３のヌクレオチド１～７４０）、ｐＤＢＮ４００３構築物のＤＮＡ配列中の７４個のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド７４１～８１４）、１９５個のヌクレオチドのｔ３５Ｓターミネーター配列（配列番号３のヌクレオチド８１５～１００９）、２１個のヌクレオチドのベクタースペーサー配列（配列番号３のヌクレオチド１０１０～１０３０）、および１７７個のヌクレオチドのホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼｃＰＡＴの５′末端ＤＮＡ配列（配列番号３のヌクレオチド１０３１～１２０７）（配列番号３のヌクレオチド８１５～１２０７）からなる。従って、配列番号３またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４が存在することとして同定できる。

核酸配列は、配列番号４もしくはその相補的配列の中の、遺伝子導入挿入配列の任意部分の少なくとも１１個以上の連続したポリヌクレオチド（第３の核酸配列）、または配列番号４もしくはその相補的配列の中の、３′隣接ダイズゲノムＤＮＡ領域の任意部分の少なくとも１１個以上の連続したポリヌクレオチド（第４の核酸配列）であり得る。核酸配列はさらに、無傷の配列番号２を含む配列番号４に相同的または相補的な部分であり得る。第３の核酸配列および第４の核酸配列を一緒に用いる場合、ＤＮＡプライマー対としてのこれらの核酸配列を、増幅産物を作製するＤＮＡ増幅法で用いることができる。ＤＮＡプライマー対を用いたＤＮＡ増幅法において、作製された増幅産物が配列番号２を含む増幅産物である場合、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫の存在を診断できる。配列番号４またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の３′末端に位置するヌクレオチド６３１個の長さの配列であり、かつ配列番号４またはその相補的配列は、２２６個のヌクレオチドのｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１プロモーター配列（配列番号４のヌクレオチド１～２２６）、ｐＤＢＮ４００３構築物のＤＮＡ配列中の６１個のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド２２７～２８７）、６個のヌクレオチドの接合する配列（配列番号４のヌクレオチド２８８～２９３）、および３３８個のヌクレオチドのダイズ隣接ゲノムＤＮＡ配列（配列番号４のヌクレオチド２９４～６３１）からなる。従って、配列番号４またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４が存在することとして同定できる。

配列番号５またはその相補的配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特性を示す長さ７０５９個のヌクレオチドの配列であり、そこに特異的に含有されるゲノムおよび遺伝エレメントを表１に示す。配列番号５またはその相補的配列を包含することは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４が存在することとして同定できる。

核酸配列またはそれらの相補的配列をＤＮＡ増幅法で用いて、アンプリコンを作製することができ、そのアンプリコンを検出することで、生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫の存在を診断する。核酸配列またはそれらの相補的配列をヌクレオチド検出法で用いて、生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫の存在を検出することができる。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法も提供する。その方法は、
核酸増幅反応において標的増幅産物を増幅するために、検出される試料を少なくとも２つのタイプのプライマーに接触させる工程と、
核酸増幅反応を行う工程と、
標的増幅産物の存在を検出する工程とを含み、
標的増幅産物は、配列番号３もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および／または配列番号４もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む。

さらに、標的増幅産物は、配列番号１もしくはその相補的配列の中の１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチド、および／または配列番号２もしくはその相補的配列の中の１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチドを含む。

またさらに、標的増幅産物は、配列番号１またはその相補的配列、配列番号２またはその相補的配列、配列番号６またはその相補的配列、および配列番号７またはその相補的配列から選択される少なくとも１つを含む。

前記の技術的解決法において、プライマーの少なくとも１つは、核酸配列もしくはその断片、またはそれに相補的な配列を含む。

具体的には、プライマーは第１プライマーおよび第２プライマーを含み、第１プライマーは配列番号８および配列番号１０から選択され、第２プライマーは配列番号９および配列番号１１から選択される。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法も提供し、その方法は、
検出される試料をプローブと接触させる工程であって、プローブは配列番号３もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および／または配列番号４もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む工程と、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、検出される試料をプローブとハイブリダイズする工程と、
検出される試料とプローブとの間のハイブリダイゼーション状態を検出する工程とを含む。

ストリンジェントな条件は、６５℃で６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム）および０．５％のＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）の溶液中でハイブリダイゼーションを行い、次に２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、および１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳそれぞれで膜を1回洗うことでよい。

さらにプローブは、配列番号１もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチド、および／または配列番号２もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチドを含む。

またさらにプローブは、配列番号１またはその相補的配列、配列番号２またはその相補的配列、配列番号６またはその相補的配列、および配列番号７またはその相補的配列から選択される少なくとも１つを含む。

任意で、プローブの少なくとも１つは、少なくとも１つのフルオロフォアで標識化される。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法も提供し、その方法は、
検出される試料をマーカー核酸分子と接触させる工程であって、マーカー核酸分子は配列番号３もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および／または配列番号４もしくはその相補的配列の中の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含む工程と、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、検出される試料をマーカー核酸分子とハイブリダイズする工程と、
検出される試料のマーカー核酸分子とのハイブリダイゼーション状態を検出し、さらに、グリホサート耐性および／またはグルホシネート耐性とマーカー核酸分子との間の遺伝的現象における遺伝子連鎖をマーカー支援育種解析により確定する工程とを含む。

さらにマーカー核酸分子は、配列番号１もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチド、および／または配列番号２もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチドを含む。

またさらにマーカー核酸分子は、配列番号１またはその相補的配列、配列番号２またはその相補的配列、配列番号６またはその相補的配列、および配列番号７またはその相補的配列から選択される少なくとも１つを含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまたＤＮＡ検出キットも提供し、それは少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、そのＤＮＡ分子は、配列番号３の相同配列もしくはその相補的配列の少なくとも１１個の連続したヌクレオチド、および／または配列番号４の相同配列もしくはその相補的配列の少なくとも１１個の連続したヌクレオチドを含み、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫に特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして利用され得る。

さらに、ＤＮＡ分子は、配列番号１もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチド、および／または配列番号２もしくはその相補的配列の中の、１～１１番目もしくは１２～２２番目の連続したヌクレオチドを含む。

またさらに、ＤＮＡ分子は、配列番号１の相同配列またはその相補的配列、配列番号２の相同配列またはその相補的配列、配列番号６の相同配列またはその相補的配列、および配列番号７の相同配列またはその相補的配列から選択される少なくとも１つを含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、植物の細胞または部分も提供し、それは、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列、グルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、および特異的な領域の核酸配列を含む。特異的な領域の核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つを含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の作製方法も提供し、その方法は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列の少なくとも１つの核酸配列から選択される特異的な領域の核酸配列を、ダイズ植物のゲノムに導入する工程を含む。

具体的には、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の作製方法は、
グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性がある遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の第１の親ダイズ植物を、グリホサート耐性および／またはグルホシネート耐性がない第２の親ダイズ植物に有性的にハイブリダイズして、数多くの子孫植物を作製する工程と、
子孫植物をグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤で処理する工程と、
グリホサートおよび／またはグルホシネートに対して耐性がある子孫植物を選択する工程とを含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の栽培方法も提供し、その方法は、
少なくとも１つのダイズ種子を栽植する工程であって、そのダイズ種子のゲノムは、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、ならびに特異的な領域の核酸配列を含む工程と、
ダイズ種子をダイズ植物に育てる工程と、
有効量のグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤をダイズ植物に噴霧し、特異的な領域の核酸配列をもたない他の植物に比べて植物損傷が少ない植物を収穫する工程とを含み、
特異的な領域の核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示す配列の少なくとも１つの核酸配列から選択される。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、除草剤が引き起こす損傷から植物を保護するための方法も提供し、その方法は、有効量のグリホサートおよび／またはグルホシネートを含有する除草剤を、少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を栽植する畑に散布する工程を含み、その遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、その遺伝子導入ダイズ植物はグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対する耐性を有する。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、畑の雑草の防除方法も提供し、その方法は、有効量のグリホサートおよび／またはグルホシネートを含有する除草剤を、少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を栽植する畑に散布する工程を含み、その遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、その遺伝子導入ダイズ植物はグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対する耐性を有する。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、グリホサート耐性植物用の畑におけるグリホサート抵抗性雑草の防除方法も提供し、その方法は、有効量のグルホシネートを含有する除草剤を、少なくとも１つのグリホサート耐性遺伝子導入ダイズ植物を栽植する畑に散布する工程を含み、そのグリホサート耐性遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、そのグリホサート遺伝子導入ダイズ植物は同時にグルホシネート除草剤に対しても耐性を有する。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、昆虫の抵抗性を遅延させるための方法も提供し、その方法は、昆虫抵抗性ダイズ植物を栽植する畑において、グリホサートおよび／またはグルホシネート耐性を有する少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を育てる工程を含み、グリホサートおよび／またはグルホシネート耐性を有するその遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む。

上記の目的を達成するために、本発明はまた、配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチドを含む農産物または商品も提供し、その農産物または商品は、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、ダイズフレーク、ダイズ粉、ダイズタンパク質あるいはその濃縮物、ダイズ油、ダイズタンパク質繊維、豆乳凝固物、または豆腐である。

本発明における除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４の検出のための核酸配列およびその検出方法において、以下の定義および方法は本発明をより明確に定めることができ、かつ当業者が本発明を実施するための指針となり得、特に明記しない限り、これらの用語は通常の当業者による従来の用い方に従って理解されるものである。

用語「ダイズ」はグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）を言い、ダイズと交配できる全ての植物種を含み、野生のダイズ種を包含する。

用語「含む」または「包含する」は、「包含するが、限定されない」ことを言う。

用語「植物」は、植物全体、植物細胞、植物器官、植物プロトプラスト、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、根端、葯などの植物の部分または植物における無傷植物細胞を包含する。本発明の範囲内にある遺伝子導入植物の部分は、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚および花、茎、果実、葉および根を包含するがこれらに限定されるものではなく、上記の植物の部分は、本発明のＤＮＡ分子であらかじめ形質転換した遺伝子導入植物に由来し、従って少なくとも部分的に遺伝子導入細胞またはそれらの子孫で構成されると理解されるべきである。

用語「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を言い、コード配列前の制御配列（５′非コード配列）およびコード配列後の制御配列（３′非コード配列）を包含する。用語「天然の遺伝子」は、その独自の制御配列を有することが必然的に認められる遺伝子を言う。用語「キメラ遺伝子」は、天然の遺伝子ではない任意の遺伝子を言い、非自然発生の制御配列およびコード配列を含有する。用語「内在遺伝子」は、生物体のゲノム中の天然の位置にある天然の遺伝子を言う。用語「外来遺伝子」は、生物体のゲノム中に現在は存在しているが本来は存在しない異質遺伝子であり、また遺伝子導入のステップを経て受容体細胞に導入された遺伝子を言う。外来遺伝子は、天然の遺伝子、または非天然の生物体に挿入されたキメラ遺伝子を含んでもよい。用語「導入遺伝子」は、形質転換の手順を経てゲノムに導入された遺伝子である。組換えＤＮＡが植物ゲノムに挿入された部位は、「挿入部位」または「標的部位」と称されてもよい。

用語「隣接ＤＮＡ」は、例えば植物生物体の中にもともとあるゲノム、または形質転換イベントに関わる断片など、形質転換の過程を経て導入された外来（異種）ＤＮＡを含んでもよい。従って隣接ＤＮＡは、天然ＤＮＡと外来ＤＮＡとの組み合わせを包含できる。本発明において、「隣接領域」または「隣接配列」または「ゲノム境界領域」または「ゲノム境界配列」は、少なくとも３、５、１０、１１、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、１０００、１５００、２０００、２５００、もしくは５０００の塩基対の配列、またはより長い配列を言い、最初に外因的に挿入されたＤＮＡ分子のすぐ上流または下流に位置し、最初に外因的に挿入されたＤＮＡ分子に近接している。隣接領域が下流に位置する場合、隣接領域はまた、「左境界隣接部」または「３′隣接部」または「３′ゲノム境界領域」または「ゲノム３′境界配列」などと称されてもよい。隣接領域が上流に位置する場合、隣接領域はまた、「右境界隣接部」または「５′隣接部」または「５′ゲノム境界領域」または「ゲノム５′境界配列」などと称されてもよい。

外来ＤＮＡのランダムな組込みを起こす形質転換の処置を行うことにより、結果的に、それぞれの形質転換体が異なる隣接領域を特異的に含有することになる。組換えＤＮＡが従来のハイブリダイゼーションによって植物に導入される場合、その隣接領域は普通変化しない。形質転換体はまた、異質性挿入断片ＤＮＡとゲノムＤＮＡのセグメントとの間、またはゲノムＤＮＡの２つのセグメントの間、または異質性ＤＮＡの２つのセグメントの間に特有な接合を含有する。「接合」とは、２つの特異的なＤＮＡ断片が連結する点である。例えば、接合は挿入断片ＤＮＡが隣接ＤＮＡに連結される位置にある。接合点はまた、形質転換された生物体にも存在しており、改変された天然の生物体において認められる形で２つのＤＮＡ断片が互いに連結されている。「接合ＤＮＡ」または「接合領域」は接合点を含有するＤＮＡを言う。

本発明は、ＤＢＮ９００４と呼ばれる遺伝子導入ダイズイベントおよびその子孫を提供し、その遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の植物および種子およびそれらの植物細胞または再生可能な部分を含むダイズ植物ＤＢＮ９００４である。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の植物の部分は、細胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、葉、さや、および、ダイズ粕、粉、油などのダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の製品、具体的には、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂ダイズフレーク、脱脂ダイズ粉焼成物、豆乳凝固物、豆腐、ダイズタンパク質濃縮物、単離ダイズタンパク質、植物タンパク質加水分解物、組織化ダイズタンパク質およびダイズタンパク質繊維を包含するが、これらに限定されない。

本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４はＤＮＡ構築物を含み、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、ＤＮＡ構築物が植物細胞で発現された時に、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対する耐性を得る。ＤＮＡ構築物は２つのタンデム発現カセットを含み、第１の発現カセットは、植物での発現に適切なプロモーターおよび適切なポリアデニル化シグナル配列を含み、そのプロモーターは５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコード化する遺伝子に作用可能に連結でき、そのＥＰＳＰＳはグリホサート除草剤に対して耐性がある。第２の発現カセットは、植物での発現に適切なプロモーターおよび適切なポリアデニル化シグナル配列を含み、そのプロモーターはホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコード化する遺伝子に作用可能に連結でき、ＰＡＴタンパク質の核酸配列はグルホシネート除草剤に対して耐性がある。さらに、プロモーターは植物から単離した適切なプロモーターであってもよく、構成的、誘導的および／または組織特異的なプロモーターを包含し、その適切なプロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｔｓｆ１プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス・ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）プロモーター、ケストルム属黄化葉巻ウイルスプロモーター、パタチンプロモーター、リブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）プロモーター、グルタチオンＳ－転移酵素（ＧＳＴ）プロモーター、Ｅ９プロモーター、ＧＯＳプロモーター、ａｌｃＡ／ａｌｃＲプロモーター、アグロバクテリウム・リゾゲネスＲｏｌＤプロモーター、およびシロイヌナズナＳｕｃ２プロモーターを包含するが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル配列は、植物において機能する適切なポリアデニル化シグナル配列であってもよく、その適切なポリアデニル化シグナル配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス・ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓターミネーター由来およびエンドウマメのリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ・オキシラーゼＥ９ターミネーター由来のポリアデニル化シグナル配列、プロテアーゼ阻害剤ＩＩ（ＰＩＮＩＩ）遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列、ならびにαチューブリン遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列を包含するが、これらに限定されない。

加えて、発現カセットは、エンハンサーおよびシグナルペプチド／輸送ペプチドを包含するがこれらに限定されない他の遺伝エレメントを包含してもよい。エンハンサーは遺伝子の発現レベルを高めることができ、かつエンハンサーは、タバコエッチウィルス（ＴＥＶ）翻訳活性化因子、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー、およびＦＭＶ３５Ｓエンハンサーを包含するが、これらに限定されない。シグナルペプチド／輸送ペプチドは、ＥＰＳＰＳタンパク質および／またはＰＡＴタンパク質が、細胞外または細胞内の特異的な小器官または区画に輸送されるようにすることができ、例えば、葉緑体輸送ペプチドをコード化する配列を用いて葉緑体を標的とし、またはＫＤＥＬ保持配列を用いて小胞体を標的とする。

５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣＰ４株から単離されてもよく、ＥＰＳＰＳをコード化するポリヌクレオチドは、形質転換した細胞における転写物の安定性および有効性を向上させるという目的達成のため、コドンの最適化によりまたは他のやり方を経て、変えられてもよい。５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）遺伝子は、選択可能なマーカー遺伝子として用いられてもよい。

「グリホサート」は、Ｎ－ホスホノメチルグリシンおよびその塩を言う。「グリホサート除草剤」で処理するとは、グリホサート含有の任意の除草剤製剤を用いて処理を行うことを言う。生物学的に有効な投与量を実現するために、ある種のグリホサート製剤の使用割合を選ぶことは、通常の農業技術者の技能を超えるものではないであろう。除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の植物原料を包含する畑をグリホサート含有の任意の除草剤製剤を用いて処理することで、その畑の雑草の生育が防除され、かつ除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の植物原料の生育または収量は影響を受けないと予想される。

ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）から単離したホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子は、アセチル化によるＬ－ホスフィノトリシンの不活性型への変換を触媒し、植物にグルホシネート除草剤耐性を与える。ホスフィノトリシン（ＰＴＣ、２－アミノ－４－メチルホスホノ酪酸）はグルタミン合成酵素の阻害剤である。ＰＴＣは、抗生物質である２－アミノ－４－メチルホスホノ－アラニル－アラニンの構造単位であり、このトリペプチド（ＰＴＴ）は、グラム陽性およびグラム陰性の細菌および真菌である灰色かび病菌に対して活性を有する。ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子はまた選択可能なマーカー遺伝子として利用されてもよい。

「グルホシネート」（ホスフィノトリシンとしても知られる）は、アンモニウム２－（アミノ）－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホニル］酪酸を言う。「グルホシネート除草剤」で処理するとは、グルホシネート含有の任意の除草剤製剤を用いて処理を行うことを言う。生物学的に有効な投与量を実現するために、ある種のグルホシネート製剤の使用割合を選ぶことは、通常の農業技術者の技能を超えるものではないであろう。除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の植物原料を包含する畑をグルホシネート含有の任意の除草剤製剤を用いて処理することで、その畑の雑草の生育が防除され、かつ除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の植物原料の生育または収量は影響を受けないと予想される。

ＤＮＡ構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、遺伝子銃形質転換、および花粉管経路形質転換を包含するがこれらに限定されない形質転換法を用いて植物に導入される。

アグロバクテリウム媒介形質転換法は、植物形質転換の一般的な方法である。植物に導入される外来ＤＮＡは、ベクターの左境界共通配列と右境界共通配列との間、すなわちＴ－ＤＮＡ領域でクローン化される。アグロバクテリウム細胞は、ベクターについて形質転換され、次いで植物組織への感染に用いられ、外来ＤＮＡを含むベクターのＴ－ＤＮＡ領域は植物ゲノムに挿入される。

遺伝子銃形質転換法は、外来ＤＮＡを含有する担体を用いて外来ＤＮＡを植物細胞に打ち込む方法である（粒子媒介バイオ投射形質転換）。

花粉管経路形質転換法は、植物の受粉によって形成される天然の花粉管経路（花粉管誘導組織とも呼ばれる）を用い、珠心経路を経由して胚嚢に外来ＤＮＡを運び込む方法である。

形質転換の後、遺伝子導入植物は形質転換した植物組織から再生されるはずであり、外来ＤＮＡを持つ子孫は適当なマーカーを用いて選択される。

ＤＮＡ構築物は互いに連結されたＤＮＡ分子の組み合わせであり、その組み合わせは１つ以上の発現カセットを提供する。ＤＮＡ構築物は、好ましくは、細菌の細胞内で自己複製できて異なる制限酵素部位を含有するプラスミドであり、そこに含有される制限酵素部位は、機能遺伝子エレメント、すなわち、プロモーター、イントロン、リーダー配列、コード配列、３′ターミネーター領域、および他の配列を提供するＤＮＡ分子を導入するために用いられる。ＤＮＡ構築物に含有される発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写を提供するのに必要な遺伝子エレメントを含み、かつ発現カセットは、原核細胞または真核細胞において発現するように設計されてもよい。本発明の発現カセットは植物細胞において最も好ましく発現するように設計される。

遺伝子導入「イベント」は、異種ＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換する工程、すなわち、標的遺伝子を含有する核酸発現カセットを遺伝子導入法により植物ゲノムに挿入することによって植物群を産生すること、その植物群を再生すること、および挿入した特異的なゲノム部位の特性を有する特異的な植物を選択することを含む工程によって獲得される。用語「イベント」は、異種ＤＮＡの最初の形質転換体およびこの形質転換体の子孫を含む。用語「イベント」はまた、異種ＤＮＡを含有する他種の個体と形質転換体とを有性的にハイブリダイズすることによって獲得した子孫も包含し、戻し交配の親で戻し交配を繰り返した後でも、形質転換体の親からの挿入ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡは、ハイブリッド子孫においても同じ染色体の位置に存在する。用語「イベント」はまた、最初の形質転換体からのＤＮＡ配列を言い、そのＤＮＡ配列は、挿入ＤＮＡ、および挿入ＤＮＡに最も近接した隣接ゲノム配列を含み、かつそのＤＮＡ配列は、挿入ＤＮＡを含む親系統（例えば、最初の形質転換体および自己増殖により産生したその子孫）を、挿入ＤＮＡを持たない親系統に有性的にハイブリダイズすることによって産生する子孫に伝えられると期待され、その子孫は標的遺伝子を含有する挿入ＤＮＡを受け取る。

本発明における「組換え体」は、一般に自然では認められないため人工的に手を加えることによって作製されたＤＮＡおよび／またはタンパク質および／または生物体の形態を言う。このように人工的に手を加えることによって、組換えＤＮＡ分子および／または組換え植物を作製することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、化学合成された核酸セグメントまたは遺伝子工学操作技術によって単離された核酸セグメントなど、他のケースにおいて単離された２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって獲得される。核酸操作を行う技術については周知である。

用語「導入遺伝子」は、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物の部分または植物を含み、その遺伝子型は異種核酸の存在によって異なると予想され、導入遺伝子は、初めにそのように変えられた遺伝子導入体、および、有性ハイブリダイゼーションまたは無性生殖によって最初の遺伝子導入体から得られる子孫個体を含む。本発明において、用語「導入遺伝子」は、従来の植物育種法または自然発生現象によって起こるゲノム（染色体または染色体外のゲノム）の変化は含まず、自然発生現象とは、例えば、無作為抽出の他家受精、非組換えウィルスの感染、非組換え細菌性の形質転換、非組換え体の転移または突然変異である。

本発明において「異種」とは、自然の中の第１の分子であって、第２の分子と組み合わさることが一般に認められない第１の分子を言う。例えば、分子は第１の種に起源をもち、第２の種のゲノムに挿入されてもよい。従って、この分子は、宿主に対して異種であり、宿主細胞のゲノムに人工的に導入される。

グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対して耐性がある遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の栽培は、以下のステップにより達成される。最初は、第１の親ダイズ植物を第２の親ダイズ植物と有性的にハイブリダイズして植物の多様な雑種第１代を作製するステップであり、その第１の親ダイズ植物は、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対する耐性を有する本発明の発現カセットで形質転換することによって獲得した遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４およびその子孫から栽培されたダイズ植物からなり、その第２の親ダイズ植物は、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対する耐性を欠いている。次は、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤の散布に対して耐性がある子孫植物を選択し、それによってグリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物を栽培するステップである。これらのステップはさらに、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤の散布に対して耐性を有する子孫植物を、第２の親ダイズ植物または第３の親ダイズ植物と戻し交配するステップ、次に、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤の散布によって、または形質に関わる分子マーカー（遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４における挿入配列の５′末端および３′末端で同定される接合部位を含むＤＮＡ分子など）の同定によって子孫を選択するステップ、それによってグリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物を作製するステップを含んでもよい。

また、２つの異なる遺伝子導入植物をハイブリダイズして、独立して別々に付加された２つの外来遺伝子を含有する子孫を作製してもよいと理解されるべきである。付加された２つの外来遺伝子についてホモ接合体である子孫植物は、適当な子孫の自己増殖から獲得することができる。上述の親植物の戻し交配および非遺伝子導入植物との異系交配も推定でき、無性生殖についても同じある。

Ｂｔ遺伝子導入ダイズは、例えば鱗翅目の昆虫／害虫を死滅させることができるが、一方で、少数の生き残った昆虫／害虫は、増殖の数世代後に、Ｂｔタンパク質抵抗性がある抵抗性の昆虫／害虫を作り出す可能性もある。昆虫／害虫の抵抗性の問題に対処するために、米国環境保護庁は遺伝子導入作物の使用について指針を提供しており、すなわち、シェルターダイズ（非昆虫抵抗性遺伝子導入ダイズでもよい（非害虫抵抗性遺伝子導入ダイズであり得る（例えば、除草剤耐性遺伝子導入ダイズまたは非標的害虫抵抗性遺伝子導入ダイズまたは非遺伝子導入ダイズ））をある割合で用意することが要求されている。対応する遺伝子導入昆虫抵抗性ダイズで大半の昆虫／害虫が死滅する場合でも、一部の昆虫／害虫はそのシェルターダイズで死滅せず、このことで抵抗性をもたない昆虫／害虫群の数が確実に優位になる。そのため、少数の抵抗性の昆虫／害虫が生き残ったとしても、その抵抗性の昆虫／害虫が、数で優位にある非抵抗性の昆虫／害虫と交配した後には、抵抗性遺伝子はかなり希薄になる。

用語「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはそのレポーター分子、例えば放射性同位元素、リガンド、化学発光剤または酵素などに結合する単離された核酸分子である。このようなプローブは標的核酸鎖に対して相補的である。本発明において、プローブは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のゲノムからのＤＮＡ鎖に対して相補的であり、それは、そのゲノムＤＮＡが遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４もしくはその種子に由来するか、または遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の植物もしくは種子もしくは抽出物に由来するかには関係がない。本発明のプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するポリアミドおよび他のプローブ材料も包含し、標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために用いることができる。

用語「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションおよびアニーリングにより相補的な標的ＤＮＡ鎖に結合する単離された核酸分子であり、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成し、次に、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の作用の下、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法による標的核酸配列の増幅における応用に関わる。

プローブおよびプライマーの長さは、一般に１１個以上のポリヌクレオチド、好ましくは１８個以上のポリヌクレオチド、さらに好ましくは２４個以上のポリヌクレオチド、最も好ましくは３０個以上のポリヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーは、具体的には、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の下で標的配列とハイブリダイズする。標的ＤＮＡ配列と異なり、かつ標的ＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーション能力を保持しているプローブは従来の方法で設計できるが、本発明のプローブおよびプライマーは、標的核酸の連続した核酸に対して完全なＤＮＡ配列の同一性を有していることが好ましい。

隣接ゲノムＤＮＡのプライマーおよびプローブ、ならびに本発明に基づく挿入断片配列は、従来の方法によって、例えば遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の植物原料から相当するＤＮＡを単離し、ＤＮＡ分子の核酸配列を確定する方法によって確定できる。ＤＮＡ分子はダイズゲノムの遺伝子導入挿入断片配列および隣接配列を含み、ＤＮＡ分子の断片はプライマーまたはプローブとして用いることができる。

本発明の核酸のプローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。従来からある任意の、核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来のＤＮＡの存在を同定するために用いることができる。核酸分子またはその断片は、ある種の環境下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズできる。本発明で用いるように、もし２つの核酸分子が逆平行の２本鎖核酸構造を形成できれば、これら２つの核酸分子は互いに特異的にハイブリダイズできると考えられる。もし２つの核酸分子が完全な相補性を示せば、その２つのうちの１つの核酸分子は他方の核酸分子の「相補体」と言われる。本発明で用いるように、核酸分子の各ヌクレオチドが、別の核酸分子の相当するヌクレオチドに相補的である場合、これら２つの核酸分子は「完全な相補性」を示すと言われる。もし２つの核酸分子が、少なくとも従来の「低いストリンジェンシー」な条件下でアニールして互いに結合することが可能な十分な安定性で互いにハイブリダイズできれば、これら２つの核酸分子は「最小限で相補的」と言われる。同様に、もし２つの核酸分子が、従来の「高いストリンジェンシー」な条件下でアニールして互いに結合することが可能な十分な安定性で互いにハイブリダイズできれば、これら２つの核酸分子は「相補的」と言われる。完全な相補性からのずれは、このずれが、２つの分子が２本鎖構造を形成するのを完全に妨げるわけでない限りは、許容され得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして作用できるために確保することは、使用する特定の溶媒および塩濃度で、安定的な２本鎖構造を形成できるのに十分な相補性を、その分子が配列中に有するということだけである。

本発明で用いるように、実質的に相同である配列は核酸分子のセグメントであり、その核酸分子は、適合する核酸分子の他のセグメントの相補的鎖と高いストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズできる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、例えば約４５℃の条件下で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で処理し、次いで５０℃の条件下で２．０×ＳＳＣで洗浄することであり、これらの条件は当業者には周知である。例えば洗浄ステップにおける塩濃度は、低いストリンジェンシー条件下の５０℃での約２．０×ＳＳＣから、高いストリンジェンシー条件下の５０℃での約０．２×ＳＳＣまでの間から選択されてもよい。加えて、洗浄ステップにおける温度条件は、低いストリンジェンシー条件下の環境温度約２２℃から、高いストリンジェンシー条件下の約６５℃まで上げられてもよい。温度条件および塩濃度のどちらも変えることができ、またはそれらのうち1つは変えないでもう一方の可変性の条件を変えることもできる。好ましくは、本発明の核酸分子は、中程度のストリンジェンシー条件下、例えば約２．０×ＳＳＣおよび約６５℃で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７もしくはそれらの相補的配列または上記の配列の任意の断片の、１つ以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズしてもよい。さらに好ましくは、本発明の核酸分子は、高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７もしくはそれらの相補的配列または上記の配列の任意の断片の、１つ以上の核酸分子と特異的にハイブリダイズしてもよい。本発明において、好ましいマーカー核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片を有する。本発明の好ましい他のマーカー核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７もしくはそれらの相補的配列、または上記の配列の任意の断片に対して８０％から１００％または９０％から１００％の配列同一性を有する。配列番号１、配列番号２、配列番号６および配列番号７は、遺伝子ハイブリダイゼーションの子孫を同定するために、植物育種法においてマーカーとして用いることができる。プローブの標的ＤＮＡ分子とのハイブリダイゼーションは、蛍光標識、放射性標識、抗体様標識、および化学発光標識を包含する、当業者に周知の任意の方法によって検出できるが、その方法はこれらに限定されない。

特異的な増幅プライマーを用いる標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲによる増幅）に関して、「ストリンジェントな条件」は、標的核酸配列に相当する野生型配列（またはその相補的配列）のプライマーが標的核酸配列に結合でき、ＤＮＡ熱増幅反応においてプライマーが標的核酸配列とハイブリダイズすることをただ可能にする条件を言い、「ストリンジェントな条件」は、好ましくは特有な増幅産物、すなわちアンプリコンの作製を可能にする。

用語「（標的配列）への特異的な結合」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、標的配列を含有する試料中で、プローブまたはプライマーが標的配列のみとハイブリダイゼーションすることを言う。

本発明で用いるように、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、鋳型核酸の一部分である標的核酸配列の核酸増幅産物を言う。例えば、本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の有性ハイブリダイゼーションによってダイズ植物が作製されるどうか、もしくは畑から採取されたダイズ試料が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４を含有しているかどうか、または脱脂ダイズ、ダイズ粉、ダイズ油などのダイズ抽出物が遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４を含有しているかどうかを確定するために、ダイズ植物の組織試料またはその抽出物から抽出されたＤＮＡは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在に特徴的なアンプリコンを、プライマー対を用いた核酸増幅法によって産生できる。プライマー対は、植物ゲノムにおける挿入された外来ＤＮＡの挿入部位に近接した隣接配列由来の第１プライマー、および挿入された外来ＤＮＡ由来の第２プライマーを含む。アンプリコンは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４に特徴的な長さおよび配列を有する。アンプリコンの長さの範囲は、プライマー対プラス１個のヌクレオチド塩基対の結合長さ、好ましくはプライマー対プラス約５０個のヌクレオチド塩基対の結合長さ、さらに好ましくはプライマー対プラス約２５０個のヌクレオチド塩基対の結合長さ、最も好ましくはプライマー対プラス約４５０個以上のヌクレオチド塩基対の結合長さであってもよい。

任意で、プライマー対は、挿入されたヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンを作製するために、挿入されたＤＮＡの両側にある隣接ゲノム配列由来であってもよい。植物ゲノム配列由来のプライマー対の１つは、挿入されたＤＮＡ配列から離れた位置にあってもよく、その距離は、１個のヌクレオチド塩基対から約２００００個のヌクレオチド塩基対までの範囲であってもよい。用語「アンプリコン」を使用する場合、具体的にはＤＮＡ熱増幅反応において形成されるプライマーダイマーを除外する。

核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する当技術分野で既知の任意の核酸増幅法によって達成できる。様々な核酸増幅法が当業者にはよく知られてきた。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂまでのゲノムＤＮＡおよび４２ｋｂまでのバクテリオファージＤＮＡを増幅するまでに発展した。当技術分野のこれらの方法および他のＤＮＡ増幅法を本発明で用いることができる。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のゲノムは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の、挿入された外来ＤＮＡ配列および隣接ＤＮＡ配列と、用意されたプライマー配列を用いて、増幅することができ、ＰＣＲアンプリコンまたはクローン化されたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定は増幅後に行うことができる。

ＤＮＡ増幅法に基づいたＤＮＡ検出キットは、適当な反応条件で標的ＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、特徴的なアンプリコンを増幅するＤＮＡプライマー分子を含有する。検出キットは、特徴的なアンプリコンを検出するための、アガロースゲルに基づいた検出方法、または当技術分野で既知のいくつかの方法を提供できる。配列番号３または配列番号４のダイズゲノム領域の任意の一部に相同的または相補的であり、かつ配列番号５の導入遺伝子挿入領域の任意の一部に相同的または相補的である、ＤＮＡプライマーを含むキットを本発明は提供する。特に配列番号８および配列番号９は、ＤＮＡ増幅法における有用なプライマー対として認識され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の５′導入遺伝子／ゲノム領域の一部に相同的な特徴的アンプリコンを増幅し、そのアンプリコンは配列番号１を含む。ＤＮＡプライマーとして用いられる他のＤＮＡ分子は配列番号５から選択されてもよい。

これらの方法によって作製されたアンプリコンは、種々の技術によって検出できる。これらの方法の１つが遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）で、ここでは挿入されたＤＮＡ配列と近接した隣接ゲノムＤＮＡ配列とにまたがるＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖が設計される。オリゴヌクレオチド鎖はマイクロウェルプレートのマイクロウェルに固定化され、標的領域をＰＣＲ増幅（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのプライマーを使用）した後、その１本鎖のＰＣＲ産物は、固定化されたオリゴヌクレオチド鎖とハイブリダイズでき、ＤＮＡポリメラーゼと、次に反応が見込まれる塩基のために特異的に標識化したｄｄＮＴＰとを用いる単一塩基伸長反応の鋳型として利用することができる。検出結果は蛍光法またはＥＬＩＳＡのような方法によって得られる。シグナルは挿入／隣接配列が存在することを表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長反応が成功したことを意味する。

他の方法は、パイロシークエンシング技術である。この方法では、挿入されたＤＮＡ配列と近接したゲノムＤＮＡの接合部位にまたがるオリゴヌクレオチド鎖を設計する。オリゴヌクレオチド鎖を、標的領域の１本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのプライマーを使用）とハイブリダイズし、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン－５′－ホスホ硫酸、およびルシフェリンとともにインキュベートする。ｄＮＴＰをそれぞれ付加し、産生した光シグナルを測定する。光シグナルは、挿入／隣接配列が存在することを表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長反応または複数塩基伸長反応が成功したことを意味する。

Ｃｈｅｎらが述べている蛍光偏光現象（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. １９９９年、第９巻：ｐ.４９２－４９８）もまた、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を使用するには、挿入されたＤＮＡ配列と近接したゲノムＤＮＡの接合部位にまたがるオリゴヌクレオチド鎖を設計する必要がある。オリゴヌクレオチド鎖を、標的領域の１本鎖ＰＣＲ産物（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのプライマーを使用）とハイブリダイズし、次に、ＤＮＡポリメラーゼ、および蛍光標識したｄｄＮＴＰとともにインキュベートする。単一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰが挿入される。このような挿入の偏光の変化は蛍光光度計を用いて測定できる。偏光の変化は、挿入／隣接配列が存在することを表し、これは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長反応が成功したことを意味する。

Ｔａｑｍａｎは、ＤＮＡ配列の存在を検出し、かつ定量分析する方法として述べられており、また製造業者から提供される説明書に詳細に述べられている。ここで以下に簡単に説明すると、挿入されたＤＮＡ配列と近接したゲノム隣接接合部位にまたがるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。循環反応は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰが存在する中で、ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのプライマーを使用）を用いて行われる。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、ＦＲＥＴプローブの蛍光部分と消光部分とが分離し、蛍光部分が遊離する。蛍光シグナルの産生は、挿入／隣接配列が存在することを表し、これは、増幅およびハイブリダイゼーションが成功したことを意味する。

除草剤耐性遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の植物原料を検出する適切な技術はまた、ハイブリダイゼーション原理に基づく、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含してもよい。特に、適切な技術は、プローブおよび試料をインキュベートする工程、非結合プローブを除去するために洗浄する工程、およびプローブがハイブリダイズされたかどうかを検出する工程を包含する。上述の検出方法はプローブに付けたマーカーのタイプに依存し、例えば、放射標識したプローブは、Ｘ線フィルムを露光および現像することにより検出可能であり、または、酵素標識プローブは、基質の変換を経て色が変化することにより検出可能である。

Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９６年、第１４巻：ｐ．３０３－３０８）は、配列の検出に分子マーカーの利用を導入した。以下に簡単に説明すると、挿入されたＤＮＡ配列と近接したゲノム隣接接合部位にまたがるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブに特有の構造は結果的に２次構造になり、それは蛍光部分および消光部分を近距離内で保持する。循環反応は、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰが存在する中で、ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入配列および近接した隣接ゲノム配列それぞれのプライマーを使用）を用いて行われる。ＰＣＲ増幅に成功した後、ＦＲＥＴプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションがプローブの２次構造を失わせ、蛍光部分および消光部分は空間的に離れて蛍光シグナルを生成する。蛍光シグナルの産生は挿入／隣接配列が存在することを表し、これは、増幅およびハイブリダイゼーションが成功したことを意味する。

マイクロフルイディクスなどの他に記述の方法は、ＤＮＡ試料の単離および増幅のための方法および装置を提供する。発光染料は、特異的なＤＮＡ分子を検出し確定するために用いられる。ＤＮＡ分子を検出する電子センサー、または特異的なＤＮＡ分子が結合するため特異的なＤＮＡ分子が検出され得るナノビーズを含むナノチューブ装置は、本発明のＤＮＡ分子の検出に有用である。

ＤＮＡ検出キットは、本発明で述べる構成物、およびＤＮＡ検出の分野で述べられまたは知られている方法を用いて発展させることができる。キットは、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在の同定を容易にし、また遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡを含有するダイズ植物の栽培にも用いることができる。キットは、配列番号１、２、３、４、または５の少なくとも一部に相同的または相補的なＤＮＡプライマーまたはプローブを含有してもよく、またはＤＮＡの遺伝子導入遺伝エレメントに含有されるＤＮＡに相同的もしくは相補的な他のＤＮＡプライマーもしくはプローブを含有してもよく、これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応に用いることができ、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いることができる。ダイズゲノムに含有される、図１および表１に記述の遺伝子導入の挿入配列とダイズゲノムの接合部位のＤＮＡ構造は以下を含む。つまり、このＤＮＡ構造は、遺伝子導入の挿入配列の５′末端に位置するダイズ植物ＤＢＮ９００４の隣接ゲノム領域、アグロバクテリウムの左境界領域（ＬＢ）からの挿入配列の一部、エンハンサー領域のタンデムリピートを含有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ｐｒ３５Ｓ）からなる第１の発現カセットであって、ストレプトマイセスのグルホシネート耐性ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃＰＡＴ）に作用可能に連結し、次いでカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）に作用可能に連結する第１の発現カセット、ダイズＴｓｆ１遺伝子（伸長因子ＥＦ－１αをコード化する）プロモーター（ｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１）からなる第２の発現カセットであって、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドのコード配列（ｓｐＡｔＣＴＰ２）に作用可能に連結し、次にアグロバクテリウムＣＰ４株のグリホサート耐性５－エノール－ピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ｃＥＰＳＰＳ）に作用可能に連結し、次いでエンドウマメのリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ由来の３′非翻訳配列（ｔＰｓｅ９）に作用可能に連結する第２の発現カセット、アグロバクテリウムの右境界領域（ＲＢ）からの挿入配列の一部、および遺伝子導入の挿入配列（配列番号５）の３′末端に位置するダイズ植物ＤＢＮ９００４の隣接ゲノム領域を含む。ＤＮＡ増幅法において、プライマーとしてのＤＮＡ分子は、ダイズ植物ＤＢＮ９００４中の遺伝子導入の挿入配列由来の任意の一部であってもよく、または遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の隣接ダイズゲノムのＤＮＡ領域由来の任意の一部であってもよい。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、除草剤（例えば２，４－Ｄ、ジカンバなど）耐性をもつダイズなどの他の遺伝子導入ダイズ変種、または他の昆虫抵抗性遺伝子（例えばＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｂなど）を保有する遺伝子導入ダイズ変種と組み合わせることができる。これらの異なる遺伝子導入イベント全てについての様々な組み合わせは、本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４と一緒に育種され得、その結果、様々な害虫に抵抗性がありかつ様々な除草剤に耐性がある改良ハイブリッド遺伝子導入ダイズ変種を提供する。これらの変種は、非遺伝子導入変種および単一形質の遺伝子導入変種に比べて、収量が増加するなどの優良な特性を示す可能性がある。

本発明は、除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法を提供する。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、グリホサートおよび／またはグルホシネート含有の農耕地用除草剤の植物毒性効果に対して耐性がある。二重形質のダイズ植物は、アグロバクテリウム株ＣＰ４のグリホサート抵抗性５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）タンパク質を発現し、それによってグリホサートに対する耐性を与えられ、かつストレプトマイセスのグルホシネート抵抗性ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質を発現し、それによってグルホシネートに対する耐性を与えられる。二重形質のダイズは以下の利点を有する。１）二重形質のダイズは、グリホサート含有の農耕地用除草剤をダイズ作物に散布することによって、広域スペクトルの雑草防除能力を有する。２）グルホシネート耐性形質と組み合わせてグルホシネート除草剤を用いること（グリホサート除草剤と混合してまたは交互に）は、グリホサート抵抗性雑草を効果的に管理するための非選択的手段として利用できる。３）非昆虫抵抗性遺伝子導入ダイズとしての除草剤耐性遺伝子導入ダイズを、遺伝子導入昆虫抵抗性ダイズとある割合で同時に栽植することで、昆虫／害虫の抵抗性の誘発を遅延させることができる。４）ダイズの収量が減少しない。加えて、グリホサート耐性の形質をコード化する遺伝子とグルホシネート耐性をコード化する遺伝子とは、同じＤＮＡセグメント上で連結され、ゲノムのダイズＤＢＮ９００４ゲノムの単一座位に存在しており、このことは、育種効率を高め、かつ育種群およびその子孫において分子マーカーを用いて遺伝子導入の挿入断片を追跡することを可能にする。一方、配列番号１もしくはその相補的配列、配列番号２もしくはその相補的配列、配列番号６もしくはその相補的配列、または配列番号７もしくはその相補的配列を、本発明の検出方法においてＤＮＡのプライマーまたはプローブとして用いて、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫として診断される増幅産物を作製し、迅速に、正確に、かつ安定に遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の植物原料を同定できる。

配列の簡単な説明
配列番号１ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の５′末端のヌクレオチド２２個の長さの配列であって、１～１１番目のヌクレオチドおよび１２～２２番目のヌクレオチドはそれぞれダイズゲノム上の挿入部位の両側に位置する配列
配列番号２ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の３′末端のヌクレオチド２２個の長さの配列であって、１～１１番目のヌクレオチドおよび１２～２２番目のヌクレオチドはそれぞれダイズゲノム上の挿入部位の両側に位置する配列
配列番号３ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の５′末端のヌクレオチド１２０７個の長さの配列
配列番号４ 遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中の挿入接合部位近くの挿入配列の３′末端のヌクレオチド６３１個の長さの配列
配列番号５ Ｔ－ＤＮＡ配列全体、５′隣接ダイズゲノム配列および３′隣接ダイズゲノム配列
配列番号６ 配列番号３の中に位置し、ｐＤＢＮ４００３構築物ＤＮＡ配列中のヌクレオチド配列とｔ３５Ｓ転写終結配列とにまたがる配列
配列番号７ 配列番号４の中に位置し、ｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１プロモーター配列とｐＤＢＮ４００３構築物ＤＮＡ配列中のヌクレオチド配列とにまたがる配列
配列番号８ 配列番号３を増幅する第１プライマー
配列番号９ 配列番号３を増幅する第２プライマー
配列番号１０ 配列番号４を増幅する第１プライマー
配列番号１１ 配列番号４を増幅する第２プライマー
配列番号１２ ５′隣接ゲノム配列上のプライマー
配列番号１３ Ｔ－ＤＮＡ上に位置し、配列番号１２と対にされるプライマー
配列番号１４ 配列番号１２と対になって、導入遺伝子がホモ接合体なのかそれともヘテロ接合体なのかを検出する、３′隣接ゲノム配列上のプライマー
配列番号１５ Ｔ－ＤＮＡ上に位置し、配列番号１４と対になるプライマー
配列番号１６ ＥＰＳＰＳを検出するためのＴａｑｍａｎプライマー１
配列番号１７ ＥＰＳＰＳを検出するためのＴａｑｍａｎプライマー２
配列番号１８ ＥＰＳＰＳを検出するためのＴａｑｍａｎプローブ１
配列番号１９ ＰＡＴを検出するためのＴａｑｍａｎプライマー３
配列番号２０ ＰＡＴを検出するためのＴａｑｍａｎプライマー４
配列番号２１ ＰＡＴを検出するためのＴａｑｍａプローブ２
配列番号２２ ユビキチンのダイズ内在遺伝子の第１プライマー
配列番号２３ ユビキチンのダイズ内在遺伝子の第２プライマー
配列番号２４ サザンブロットハイブリダイゼーション検出におけるＥＰＳＰＳのプローブ
配列番号２５ サザンブロットハイブリダイゼーション検出におけるＰＡＴのプローブ
配列番号２６ 配列番号１３と同方向のＴ－ＤＮＡ上に位置するプライマー
配列番号２７ 配列番号１３と逆方向のＴ－ＤＮＡ上に位置し、隣接配列を獲得するために用いられるプライマー
配列番号２８ 配列番号１３と逆方向のＴ－ＤＮＡ上に位置し、隣接配列を獲得するために用いられるプライマー
配列番号２９ 配列番号１５と同方向のＴ－ＤＮＡ上に位置するプライマー
配列番号３０ 配列番号１５と逆方向のＴ－ＤＮＡ上に位置し、隣接配列を獲得するために用いられるプライマー
配列番号３１ 配列番号１５と逆方向のＴ－ＤＮＡ上に位置し、隣接配列を獲得するために用いられるプライマー
本発明の技術的解決法についてはさらに、下記の図面および実施例により詳細に述べる。

本発明に係る除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法に従って、遺伝子導入の挿入配列とダイズゲノムとの間の接合部位を構造的に図示したものである。 本発明に係る除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法に従って、組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００３を構造的に図示したものである。

本発明に係る除草剤耐性ダイズ植物ＤＢＮ９００４を検出するための核酸配列およびその検出方法の技術的解決法については、さらに、特定の実施形態により下記で説明する。

クローニングおよび形質転換
１．１．ベクタークローニング
組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００３を、標準的な遺伝子クローニング技術を用いて構築した（図２に示す）。ベクターｐＤＢＮ４００３は２つのタンデム遺伝子導入発現カセットを含有し、第１の発現カセットはダイズＴｓｆ１遺伝子（伸長因子ＥＦ－１αをコード化する）プロモーター（ｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１）からなり、それは、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドのコード配列（ｓｐＡｔＣＴＰ２）に作用可能に連結でき、次にアグロバクテリウムＣＰ４株のグリホサート耐性５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ｃＥＰＳＰＳ）に作用可能に連結し、エンドウマメのリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼ由来の３′非翻訳配列（ｔＰｓｅ９）に作用可能に連結する。また第２の発現カセットは、エンハンサー領域のタンデムリピートを含有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ｐｒ３５Ｓ）からなり、それは、ストレプトマイセスのグルホシネート耐性ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ｃＰＡＴ）に作用可能に連結でき、次いでカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓターミネーター（ｔ３５Ｓ）に作用可能に連結する。

液体窒素法によって、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ、シカゴ、米国；Ｃａｔ．Ｎｏ．１８３１３ー０１５）をベクターｐＤＢＮ４００３について形質転換し、形質転換した細胞を、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を選択マーカーとして用いてスクリーニングした。

１．２．植物形質転換
形質転換を従来のアグロバクテリウム感染法により行い、無菌培養したダイズの子葉節組織を実施例１．１に記述のアグロバクテリウムと共培養して、構築した組換え発現ベクターｐＤＢＮ４００３中のＴ－ＤＮＡをダイズの染色体に導入し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４を作製した。

アグロバクテリウム媒介のダイズ形質転換について簡単に述べると、成熟ダイズ種子を、ダイズ発芽培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、および８ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ５．６）において発芽させ、その種子を発芽培地に播種し、温度２５±１℃および光周期（明期／暗期）１６時間／８時間の条件下で培養した。発芽して４～６日後に、明るい緑色の子葉節が膨潤したダイズ無菌実生を得、子葉下の軸を子葉節の下３～４ｍｍで切り取り、子葉を縦に切り、頂芽、側芽および種子根を除去した。メスのナイフバックを用いて子葉節に傷をつけ、傷のついた子葉節組織をアグロバクテリウム懸濁液に接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、ＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列およびＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列を、傷のついた子葉節組織に導入することができる（ステップ１：感染ステップ）。このステップでは、好適に、子葉節組織を、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ_６６０＝０．５～０．８、感染培地（２．１５ｇ／ＬのＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、１０ｇ／Ｌのグルコース、４０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴン（ＡＳ）、４ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、および２ｍｇ／Ｌのゼアチン（ＺＴ）、ｐＨ５．３））に浸して感染を開始した。子葉節組織を、ある期間（３日間）アグロバクテリウムと共培養した（ステップ２：共培養ステップ）。好適に、感染ステップの後、子葉節組織を固形培地（４．３ｇ／ＬのＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、２０ｇ／Ｌのショ糖、１０ｇ／Ｌのグルコース、４ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２ｍｇ／Ｌのゼアチン、および８ｇ／Ｌの寒天、ｐＨ５．６）で培養した。この共培養の段階の後、任意で「回収」ステップを入れた。「回収」ステップにおいて、植物形質転換体の選択剤は添加されずに、回収培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３０ｇ／Ｌのショ糖、２ｍｇ／Ｌのゼアチン（ＺＴ）、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、１００ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、および１００ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸、ｐＨ５．６）の中に、アグロバクテリウムの生育を阻害することで知られている少なくとも１つの抗生物質（１５０～２５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン）があってもよい（ステップ３：回収ステップ）。好適に、子葉節から再生された組織ブロックを、固形培地において選択剤なしで抗生物質と培養し、アグロバクテリウムを除き、感染細胞の回収段階を準備した。その次に、子葉節から再生された組織ブロックを、選択剤（グリホサート）を含有する培地で培養し、生育している形質転換カルスを選択した（ステップ４：選択ステップ）。好適に、子葉節から再生された組織ブロックをスクリーニング固形培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３０ｇ／Ｌのショ糖、１ｍｇ／Ｌの６－ベンジルアデニン（６－ＢＡＰ）、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、１００ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、１００ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸、および１０ｍｇ／Ｌのグリホサートイソプロピルアミン塩、ｐＨ５．６）で選択剤と培養し、そして形質転換した細胞を継続的に生育させた。次に、形質転換した細胞から植物を再生した（ステップ５：再生ステップ）。好適に、選択剤を含有する培地で育てた、子葉節から再生した組織ブロックを固形培地（Ｂ５分化培地およびＢ５発根培地）で培養して植物を再生した。

選別した抵抗性組織をＢ５分化培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３０ｇ／Ｌのショ糖、１ｍｇ／Ｌのゼアチン（ＺＴ）、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、５０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、５０ｍｇ／Ｌのアスパルギン酸、１ｍｇ／Ｌのジベレリン、１ｍｇ／Ｌのオーキシン、および１０ｍｇ／Ｌのグリホサートイソプロピルアミン塩、ｐＨ５．６）上に移し、分化のために２５℃で培養した。分化した実生は、Ｂ５発根培地（３．１ｇ／ＬのＢ５塩、Ｂ５ビタミン、１ｇ／Ｌの２－モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３０ｇ／Ｌのショ糖、８ｇ／Ｌの寒天、１５０ｍｇ／Ｌのセファロスポリン、および１ｍｇ／Ｌのインドール－３－酢酸（ＩＢＡ））上に移し、発根培地において２５℃で培養して高さ約１０ｃｍにし、結実するまで培養するためガラス温室に移した。温室で、植物を２６℃で１６時間培養し、次いで２０℃で毎日８時間培養した。

１．３．遺伝子導入イベントの同定およびスクリーニング
総計２８８の別個の遺伝子導入Ｔ_０植物を作製した。

再生した遺伝子導入ダイズ植物におけるＥＰＳＰＳ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子の存否をＴａｑＭａｎ（商標）解析によって調べ（実施例２を参照されたい）、グリホサートおよびグルホシネートの耐性株におけるコピー数の特性を示した。スクリーニングにより、単一コピー導入遺伝子での性能、良好なグリホサート除草剤耐性、グルホシネート除草剤耐性および農業形質に優れたものとして、イベントＤＢＮ９００４を選択した（実施例６を参照されたい）。

ＴａｑＭａｎによる遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の検出
遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４から約１００ｍｇの葉を試料として採取し、植物ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＥＰＳＰＳ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子のコピー数をＴａｑｍａｎプローブ蛍光定量的ＰＣＲ法により検出した。同時に、野生型ダイズ植物を対照として用い、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験に３回の繰り返しを設定し、平均した。

具体的な手順は以下の通りである。

ステップ１１．１００ｍｇの葉を遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４から採取し、液体窒素とともに乳鉢で磨砕してホモジネートにし、各試料について３回の繰り返しを設定した。

ステップ１２．上述の試料のゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて抽出した。特定の方法についてはその製品マニュアルを参考にできる。

ステップ１３．上述の試料のゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。

ステップ１４．上述の試料のゲノムＤＮＡの濃度を８０から１００ｎｇ／μＬまでの範囲の整合性のある濃度値に調整した。

ステップ１５． 試料のコピー数を、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量的ＰＣＲ法を用いて同定し、ここでは、コピー数が同定されておりかつ既知である試料を標準とし、野生型ダイズ植物の試料を対照とし、また各試料について３回の繰り返し実験を行い、平均をとった。蛍光定量的ＰＣＲのプライマーおよびプローブの配列は、それぞれ以下の通りである。

以下のプライマーおよびプローブを、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列を検出するために用いた。

プライマー１：配列表の配列番号１６で示す、ＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＧＴＴＧＡＧ
プライマー２：配列表の配列番号１７で示す、ＧＣＴＴＡＣＣＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧ
プローブ１：配列表の配列番号１８で示す、ＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＣ
以下のプライマーおよびプローブを、ＰＡＴ遺伝子配列を検出するために用いた。

プライマー３：配列表の配列番号１９で示す、ＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧ
プライマー４：配列表の配列番号２０で示す、ＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡＡＴＧＧ
プローブ２：配列表の配列番号２１で示す、ＣＡＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＴＧＴＧ
ＰＣＲ反応系：
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ）
１０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物 １μＬ
ゲノムＤＮＡ ３μＬ
水（ｄｄ Ｈ２Ｏ） ６μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物は、濃度１ｍＭの各プライマー４５μＬ、濃度１００μＭのプローブ５０μＬ、およびＬ１×ＴＥ緩衝液８６０μＬを含み、アンバーチューブ内に４℃で貯蔵した。

ＰＣＲ反応条件：
ステップ 温度 時間
２１ ９５℃ ５分間
２２ ９５℃ ３０秒間
２３ ６０℃ １分間
２４ ステップ２２に戻り、４０回繰り返した
ＳＤＳ ２．３ ｓｏｆｔｗａｒe（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータを解析し、単一コピー遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４を獲得した。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の検出
３．１．ゲノムＤＮＡの抽出
従来から用いられているＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウム臭化物）法に従ってＤＮＡの抽出を行った。つまり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４から若葉２ｇを採取し、液体窒素中で粉末に磨砕し、引き続いて、温度６５℃にあらかじめ加熱したＤＮＡ抽出ＣＴＡＢ緩衝液（２０ｇ／ＬのＣＴＡＢ、１．４Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮａＯＨでｐＨを８．０に調整）０．５ｍＬを添加し、よく混合し、次いで温度６５℃で９０分間抽出する工程と、フェノール０．５倍容量およびクロロホルム０．５倍容量を添加し、次に均一に混合するために反転させる工程と、１２０００ｒｐｍ（１分間あたりの回転数）で１０分間遠心分離する工程と、上清をピペットで取り、２倍容量の無水エタノールを添加し、遠心管を穏やかに振り、温度４℃で３０分間静置する工程と、回転速度１２０００ｒｐｍで１０分間再び遠心分離する工程と、ＤＮＡをチューブの底に集め、上清を捨て、質量濃度７０％のエタノール１ｍＬで沈殿物を洗浄する工程と、回転速度１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する工程と、減圧下で真空乾燥または超清浄実験台上で送風乾燥する工程と、ＤＮＡ沈殿物を適当な量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、温度条件－２０℃で貯蔵する工程とを行った。

３．２．隣接ＤＮＡ配列の解析
検査される試料の濃度を８０～１００ｎｇ／μＬの間とするために、上記の抽出したＤＮＡ試料の濃度を測定した。選択した制限酵素、ＰｓｉＩ、ＤｒａＩおよびＴａｑＩ（５′末端解析のため）ならびにＡｆｌＩＩ、ＴａｑＩおよびＰｓｉＩ（３′末端解析のため）それぞれでゲノムＤＮＡを消化した。ゲノムＤＮＡ２６．５μＬ、上記の選択した制限酵素０．５μＬおよび酵素消化緩衝液３μＬを各酵素消化系に添加して１時間消化した。酵素の消化が終了した後、無水エタノール７０μＬを酵素消化系に添加し、次に氷浴中に３０分間入れ、回転速度１２０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を捨て、送風乾燥し、その後、温度４℃で一晩かけて連結させるために、再蒸留水（ｄｄ Ｈ_２Ｏ）８．５μＬ、１０×Ｔ_４－ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、またその具体的な処方についてはＮＥＢウェブサイト、またはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｅｂ.ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓおよびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｅｂ.ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂ０２０２－ｔ４－ｄｎａ－ｌｉｇａｓｅ－ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｂｕｆｆｅｒを参考にできる）１μＬ、およびＴ_４－ＤＮＡリガーゼ０．５μＬを添加した。一連のネステッドプライマーでＰＣＲ増幅を行って、５′および３′の導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを単離した。具体的には、５′導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを単離するプライマーの組み合わせは、第１プライマーとして配列番号１３および配列番号２６、第２プライマーとして配列番号２７および配列番号２８、ならびに配列決定プライマーとして配列番号１３を含む。具体的には、３′導入遺伝子／ゲノムＤＮＡを単離するプライマーの組み合わせは、第１プライマーとして配列番号１５および配列番号２９、第２プライマーとして配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列決定プライマーとして配列番号１５を含み、ＰＣＲ反応条件は表３に示した。

獲得したアンプリコンを２．０％アガロースゲルで電気泳動にかけてＰＣＲ反応産物を分離し、その次にゲル回収キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ、Ｃａｔ.Ｎｏ.２８７０４、Ｑｉａｇｅn社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて標的断片をアガロースマトリックスから単離した。次に、精製したＰＣＲ産物を配列決定し（例えば、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）、解析した（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ配列解析ソフトウェア、ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）。

５′および３′の隣接配列および接触配列を、標準ＰＣＲ法を用いて同定した。５′の隣接配列および接触配列は、配列番号９、配列番号１３、または配列番号２６と組み合わせて配列番号８または配列番号１２を用いて同定できる。３′の隣接配列および接触配列は、配列番号１０、配列番号１５、または配列番号２９と組み合わせて、配列番号１１または配列番号１４を用いて同定できる。ＰＣＲ反応系および増幅条件を表２および表３に示した。隣接配列および接触配列を同定するために他のプライマー配列も用いることができるということは、当業者に認識されるであろう。

ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定により、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来のダイズ植物または種子を同定するために、プライマーおよびプローブとして使用可能な他のＤＮＡ分子の設計に用いることができるＤＮＡが提供される。

明らかになったのは、配列番号５の１～１２６８番目のヌクレオチドは、ダイズゲノム配列中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４挿入配列の右境界隣接部（５′隣接配列）であり、配列番号５の６０６８～７０５９番目のヌクレオチドは、ダイズゲノム配列中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４挿入配列の左境界隣接部（３′隣接配列）であると示されたことである。５′接合配列は配列番号１に載せ、３′接合配列は配列番号２に載せた。

３．３．ＰＣＲ接合アッセイ
接合配列は、比較的短いポリヌクレオチド分子であり、接合配列をポリ核酸アッセイで検出する場合に遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡに特徴的となる新規ＤＮＡ配列である。配列番号１および配列番号２の中の接合配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中にある遺伝子導入断片の挿入部位およびダイズゲノムＤＮＡの各端にある１１個のポリヌクレオチドである。より長い、またはより短いポリヌクレオチド接合配列は、配列番号３または配列番号４から選択されてもよい。接合配列（５′連結領域配列番号１、および３′連結領域配列番号２）は、ＤＮＡ検出方法におけるＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマー分子として有用である。接合配列である配列番号６および配列番号７もまた、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４における新規ＤＮＡ配列であり、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するためのＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマー分子として用いることもできる。配列番号６（配列番号３の７４１～８７２番目のヌクレオチド）は、ｐＤＢＮ４００３構築物ＤＮＡ配列とｔ３５Ｓターミネーター配列とにまたがり、配列番号７（配列番号４の１７０～２８７番目のヌクレオチド）は、ｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１プロモーター配列とｐＤＢＮ４００３構築物ＤＮＡ配列とにまたがる。

加えて、アンプリコンは、配列番号３または配列番号４からの少なくとも１つのプライマーを用いて産生され、ＰＣＲ法で用いられる場合のプライマーは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特徴的なアンプリコンを産生するために用いられる。

具体的には、ＰＣＲ産物は、遺伝子導入挿入配列の５′末端から産生され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の植物原料を含有するゲノム中のＴ－ＤＮＡ挿入配列の５′末端に隣接するゲノムＤＮＡの一部である。このＰＣＲ産物は配列番号３を含む。ＰＣＲ増幅を行うために、遺伝子導入挿入配列の５′末端に隣接するゲノムＤＮＡ配列とハイブリダイズするプライマー５（配列番号８）と、プライマー５と対になり、遺伝子導入ｔ３５Ｓ転写終結配列に位置するプライマー６（配列番号９）とを設計した。

ＰＣＲ産物は、遺伝子導入挿入配列の３′末端から産生され、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の植物原料を含有するゲノム中のＴ－ＤＮＡ挿入配列の３′末端に隣接するゲノムＤＮＡの一部を含む。このＰＣＲ産物は配列番号４を含む。ＰＣＲ増幅を行うために、遺伝子導入挿入配列の３′末端に隣接するゲノムＤＮＡ配列とハイブリダイズするプライマー８（配列番号１１）と、プライマー８と対になり、ｐｒＧｍ１７ｇＴｓｆ１プロモーター配列の挿入断片の３′末端に位置するプライマー７（配列番号１０）とを設計した。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特徴的なアンプリコンを作製するために、表２および表３に記述のＤＮＡ増幅条件を上述のＰＣＲ接合に用いることができる。アンプリコンの検出は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００、もしくはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒなどを用いて、または当業者には既知の方法および装置によって行うことができる。

サーモサイクラーの断熱キャップがない場合は１～２滴のミネラルオイルを各反応溶液上に添加できることとし、材料を穏やかに混合した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホヤ、カリフォルニア州）、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒ－Ｂｉｏｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ボストン、マサチューセッツ州）、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ （Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ハンブルク、ドイツ）サーモサイクラーで、上記のサイクルパラメータ（表３）を用いてＰＣＲを行った。ＭＪ ＥｎｇｉｎｅまたはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーは計算モードで運転するべきである。Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラーを運転させる場合、温度勾配速度は最大値に設定するべきである。

実験結果は以下のことを示唆した。プライマー５およびプライマー６（配列番号８および配列番号９）を遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、１２０７ｂｐ断片の増幅産物が作製される。一方、それらのプライマーを、非形質転換ダイズゲノムＤＮＡおよび非ＤＢＮ９００４ダイズゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、断片は増幅されない。また、プライマー７およびプライマー８（配列番号１０および配列番号１１）を、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、６３１ｂｐ断片の増幅産物が作製される。一方、それらのプライマーを、非形質転換ダイズゲノムＤＮＡおよび非ＤＢＮ９００４ダイズゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応に用いた場合、断片は増幅されない。

ＰＣＲ接合アッセイはまた、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の材料がホモ接合体なのかそれともヘテロ接合体なのかを同定することにも用いることができる。プライマー９（配列番号１２）、プライマー１０（配列番号１３）およびプライマー１１（配列番号１４）を、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特徴的なアンプリコンを作製するための増幅反応に用いた。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特徴的なアンプリコンを作製するために、表４および表５に記述のＤＮＡ増幅条件を上述の接合アッセイに用いることができる。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホヤ、カリフォルニア州）、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒ－Ｂｉｏｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ボストン、マサチューセッツ州）、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ハンブルク、ドイツ）サーモサイクラーで、上記のサイクルパラメータ（表５）を用いてＰＣＲを行った。ＭＪ ＥｎｇｉｎｅまたはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーは計算モードで運転するべきである。Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ９７００サーモサイクラーを運転させる場合、温度勾配速度は最大値に設定するべきである。

増幅反応において、鋳型ＤＮＡを含有する生物学的試料は、その試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の存在を診断するためのＤＮＡを含有する。または増幅反応において、反応により、ダイズゲノム由来のＤＮＡを含有する生物学的試料から異なる２つのＤＮＡアンプリコンが作製され、そのダイズゲノム由来のＤＮＡは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４に存在する挿入ＤＮＡに相当する対立遺伝子に関してヘテロ接合性である。これらの異なる２つのアンプリコンは、野生型ダイズゲノム座位に由来する第１アンプリコン、および遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を診断する第２アンプリコンに相当する。ヘテロ接合性ゲノムに関して記述した第２アンプリコンの単一アンプリコンに相当するダイズＤＮＡ試料のみを作製することで、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の存在を診断かつ確定することができ、遺伝子導入ダイズ植物ＤＢＮ９００４に存在する挿入ＤＮＡに相当する対立遺伝子に関してホモ接合性であるダイズ種子によって、試料を作製する。

着目すべきは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のプライマー対を、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のゲノムＤＮＡに特徴的なアンプリコンを産生するために用いたことである。これらのプライマー対は、上述のＤＮＡ増幅法に用いるプライマー５およびプライマー６（配列番号８および配列番号９）、ならびにプライマー７およびプライマー８（配列番号１０および配列番号１１）を包含するが、これらに限定されない。加えて、ダイズ内在遺伝子の増幅に用いるプライマー１２およびプライマー１３（配列番号２２および配列番号２３）の１つの対照プライマー対を、反応条件の内部標準として包含した。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡ抽出試料の解析は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の組織ＤＮＡ抽出物の陽性対照、非遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来のＤＮＡ抽出物の陰性対照、および鋳型ダイズＤＮＡ抽出物を含まない陰性対照を包含するべきである。これらのプライマー対に加えて、配列番号３もしくは配列番号４、またはそれらの相補的配列からの任意のプライマー対も用いることができ、それらをＤＮＡ増幅反応に用いる場合、遺伝子導入イベントダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の組織に関して特徴的である配列番号１または配列番号２を含有するアンプリコンがそれぞれ作製される。表２～表５に記述のＤＮＡ増幅条件は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の特徴的なアンプリコンを適切なプライマー対で作製するために用いることができる。ＤＮＡ増幅法において検査する場合、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の存在を確定するための増幅の鋳型として用いることができるのは、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４に特徴的なアンプリコンが作製されるため遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４または遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４由来の産物を含んでいると推定される、ダイズ植物もしくは種子のＤＮＡを含有する抽出物である。

サザンブロットハイブリダイゼーションによる遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の検出
４．１．サザンブロットハイブリダイゼーションのためのＤＮＡ抽出
サザンブロット解析を、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６世代ホモ接合性形質転換イベントを用いて行った。乳鉢および乳棒を用い、植物組織を液体窒素中で磨砕した。磨砕した植物組織４～５ｇを、ＣＴＡＢ溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１．４Ｍ ＮａＣｌ、 ０．２％ｖ／ｖ β－メルカプトエタノール、２％ ｗ／ｖ ポリビニル－ピロリドン）２０ｍＬに再懸濁し、温度６５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの間、均一に混合するために１０分間ごとに試料を反転させた。インキュベーションの後、等しい容積のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、反転させて穏やかに混合し、次に回転速度４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。水相を収集し、等しい容積のイソプロパノールを添加した後、ＤＮＡが沈殿するように温度－２０℃で１時間静置し、次に回転速度４０００ｒｐｍで５分間遠心分離してＤＮＡ沈殿物を獲得し、次にその沈殿物をＴＥ緩衝液１ｍＬに再懸濁した。存在する全てのＲＮＡを分解するために、濃度３０ｍｇ／ｍＬのＲＮＡａｓｅ Ａ、５μＬとともに温度３７℃で３０分間ＤＮＡをインキュベートし、次に回転速度４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで回転速度１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、３Ｍの酢酸ナトリウム０．１容積および無水エタノール２容積の存在下でＤＮＡを沈殿させた。上清を捨てた後、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール１ｍＬで沈殿物を洗浄し、乾燥させ、次いでＴＥ緩衝液１ｍＬに再溶解した。上述試料のゲノムＤＮＡの濃度を、超顕微分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。

４．２．制限酵素で消化
毎回、反応系１００μＬ中でＤＮＡ５μｇを消化した。プローブとしてのＴ－ＤＮＡ上のＥＰＳＰＳおよびＰＡＴの部分配列とともに、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶそれぞれでゲノムＤＮＡを消化した。各酵素について消化産物を適当な温度で一晩インキュベートした。遠心減圧濃縮器（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試料を回転させ、容積を２０μＬまで減らした。

４．３．ゲル電気泳動
ブロモフェノールブルーローディングダイを実施例４．２からの各試料に添加し、各試料を臭化エチジウム含有の０．７％アガロースゲルに載せ、次にＴＡＥ電気泳動緩衝液（４０ｍＭ トリス酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で電気泳動によって分離し、ゲル電気泳動を２０ボルトで一晩運転した。

ゲルを、変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）および中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）でそれぞれ３０分間処理した。５×ＳＳＣを磁製皿に注ぎ入れ、ガラスを覆い、次いでウェットフィルターペーパーブリッジ、ゲル、正電荷ナイロンフィルム（Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ.Ｎｏ.１１４１７２４０００１）、３層フィルターペーパー、ペーパータワー、および重量物を順次置いた。室温で一晩トランスブロッティングした後、ナイロン膜を２×ＳＳＣで１０秒間すすぎ、ＤＮＡをＵＶ架橋結合によって膜上に固定化した。

４．４．ハイブリダイゼーション
プローブを準備するために適当なＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡプローブは、配列番号２４および配列番号２５であり、または前述の配列に相同的もしくは相補的である。プローブのＤＩＧ標識、サザンブロットハイブリダイゼーション、シグナル検出、および他の操作は、ＤＮＡ高効率ジゴキシン標識および検出キットＩＩ（ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅr Ｋｉｔ ＩＩ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社、Ｃａｔ.Ｎｏ.１５８５６１４９１０）を用いて行った。具体的な方法についてはそれらの製品仕様書を参考にすることができる。

各サザンは以下の２つの対照試料を含有する。（１）陰性（非形質転換）分離個体からのＤＮＡであり、エレメント特異的なプローブにハイブリダイズできる任意の内在ダイズ配列の同定に用いられる。（２）プローブ長さに基づいた１つのコピー数に等価なＨｉｎｄ ＩＩＩ－消化ｐＤＢＮ４００３プラスミドであり、ハイブリダイゼーションの陽性対照として用いられ、かつ実験の感度を説明するために用いられる。

ハイブリダイゼーションのデータによって、ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ解析を支持する証拠が提供され、すなわち、ダイズ植物ＤＢＮ９００４はＥＰＳＰＳ遺伝子およびＰＡＴ遺伝子の単一コピーを含有することが裏付けられた。ＥＰＳＰＳプローブを用いて、ＥｃｏＲ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖの消化によって、約１１ｋｂおよび１３ｋｂの単一バンドがそれぞれ産生され、一方ＰＡＴプローブを用いて、ＥｃｏＲ ＩおよびＥｃｏＲ Ｖの消化によって、約８ｋｂおよび３．２ｋｂの単一バンドがそれぞれ産生された。このことが意味したのは、ＥＰＳＰＳおよびＰＡＴの各コピーがダイズ形質転換イベントＤＢＮ９００４中に存在することである。

ＥＬＩＳＡによる遺伝子導入ダイズイベントの指定タンパク質の検出
遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４中のＥＰＳＰＳタンパク質およびＰＡＴタンパク質の発現範囲は、ＥＬＩＳＡによって検出できる。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の新鮮な葉２ｍｇを試料として採取し、液体窒素中で磨砕し、続いて、抽出物緩衝液（ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２７ｇ／Ｌ、 Ｎａ_２ＨＰＯ_４ １．４２ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／Ｌ、およびＴｗｅｅｎ－２０ ５．５ｍｌ/Ｌ、ｐＨ７．４）１ｍＬを添加し、次に回転速度４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、抽出物緩衝液で上清を４０倍に希釈し、希釈した上清をＥＬＩＳＡ検出用に８０μｌ採取した。

試料中のタンパク質（ＥＰＳＰＳタンパク質およびＰＡＴタンパク質）量の、新鮮な葉の重量に対する比率を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）キット（ＥＮＶＩＲＬＯＧＩＸ社、ＥＰＳＰＳキットおよびＰＡＴキット）により測定し、解析した。具体的な方法については、それらの製品仕様書を参考にすることができる。同時に、野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）の葉を対照として用い、上述の方法に従って検出および解析を行い、各植物について６回の繰り返しを設定した。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のタンパク質（ＥＰＳＰＳタンパク質およびＰＡＴタンパク質）の含量についての実験結果は、表６に示す通りである。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４および野生型ダイズ植物の新鮮な葉における、新鮮な葉の重量に対するＥＰＳＰＳタンパク質の平均発現量の比率（μｇ／ｇ）を、それぞれ、２３０．９および０と確定し、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４および野生型ダイズ植物の新鮮な葉における、新鮮な葉の重量に対するＰＡＴタンパク質の平均発現量の比率（μｇ／ｇ）を、それぞれ、２００．１および０と確定した。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の除草剤耐性の検出
この実験では、ラウンドアップ除草剤（４１％グリホサートイソプロピルアンモニウム塩水性薬剤）およびバスタ除草剤（活性成分は１８％グルホシネート）を噴霧に用いた。乱塊法を３反復で用いた。プロットの面積は１８ｍ^２（５ｍ×３．６ｍ）であり、条間隔は６０ｃｍであり、栽植距離は８ｃｍであり、従来の栽培法および管理法を用い、プロット間に１ｍの広い分離区域がある。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４に以下の３つのタイプの処理を行った。１）除草剤を噴霧せずに雑草を人工的に防除した。２）ラウンドアップ除草剤を１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａ（ａ.ｅ.／ｈａは「１ヘクタールあたりの活性成分の酸等量」を言う）の投与量でＶ３葉段階の間に噴霧し、次にラウンドアップ除草剤をＲ２段階（満開段階）の間に同じ投与量で再び噴霧した。３）バスタ除草剤を８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａ（ａ.ｉ.／ｈａは「１ヘクタールあたりの活性成分」を言う）の投与量でＶ３葉段階の間に噴霧し、次にバスタ除草剤をＶ６段階の間に同じ投与量で再び噴霧した。４）バスタ除草剤を８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａの投与量でＶ３葉段階の間に噴霧し、次にラウンドアップ除草剤を１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａの投与量でＲ２段階の間に噴霧した。野生型ダイズ植物（非遺伝子導入、ＮＧＭ）で並列防除実験を行った。なお、グリホサート除草剤の異なる含量および投与量の形式の、グリホサート酸等量の形式への変換、およびグルホシネート溶液の異なる濃度の、上述の活性成分グルホシネート等量への変換を以下の結論に適用した。

植物毒性の症状を投与後１週間および２週間で調査し、プロット内のダイズの収量を収穫時に測定した。植物毒性の症状の類別を表７に示した。形質転換したイベントの除草剤耐性を評価する指標として除草剤損傷割合を用いた。具体的には、除草剤損傷割合（％）＝Σ（同レベルの損傷を受けた植物の数×レベル数）／（植物の総数×最高レベル）であり、ここで、除草剤損傷割合はグリホサート損傷割合およびグルホシネート損傷割合を包含し、グリホサートまたはグルホシネートで処理後２週間の植物毒性の調査結果に基づいて除草剤損傷割合を確定した。各プロット内のダイズの収量は、各プロットの中央３つの作条で秤量したダイズ豆の総収量（重量）である。異なる処理間の収量の差を収量百分率の形式で測定し、ここで、収量百分率（％）＝噴霧ありの収量／噴霧なしの収量である。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の除草剤耐性およびダイズの収量の結果は、表８に示した通りである。

結果は、除草剤（グリホサートおよびグルホシネート）損傷割合について以下のことを示した。１）遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の損傷割合はグリホサート除草剤（１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａ）処理下では実質的に０であった。２）遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の損傷割合は、グルホシネート除草剤（８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａ）処理下でも実質的に０であった。３）遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の損傷割合は、グルホシネート除草剤（８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａ）およびグリホサート除草剤（１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａ）の処理下でも実質的に０であった。従って、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は良好な除草剤（グリホサートおよびグルホシネート）耐性を有する。

収量について、結果は以下のことを示した。遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の収量は、グリホサート除草剤（１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａ）、グルホシネート除草剤（８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａ）、およびグルホシネート除草剤（８００ｇ ａ.ｉ.／ｈａ）＋グリホサート除草剤（１６８０ｇ ａ.ｅ.／ｈａ）の３つの噴霧処理下で、噴霧なしの処理と比較してわずかに増加し、そのため、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は良好な除草剤（グリホサートおよびグルホシネート）耐性を有することをさらに意味する。

例えば、農産物または商品は遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４から作製できる。もし農産物または商品において十分な発現量が検出されれば、その農産物または商品は、その農産物または商品中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４材料の存在を診断できるヌクレオチド配列を含有していると推定される。食品または商品は、ダイズ粕、粉および油、具体的には、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、食用油、脱脂ダイズフレーク、脱脂ダイズ粉焼成物、豆乳凝固物、豆腐、ダイズタンパク質濃縮物、単離ダイズタンパク質、植物タンパク質加水分解物、組織化ダイズタンパク質、ダイズタンパク質繊維などの、ダイズ植物ＤＢＮ９００４由来の製品を包含するが、これらに限定されない。プローブ対またはプライマー対に基づいた核酸検出の方法および／またはキットは、例えば生物学的試料中の配列番号１または配列番号２に示す遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のヌクレオチド配列を検出するために発展させることができ、プローブ配列またはプライマー配列は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４の存在を診断するために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に示す配列もしくはそれらの断片、またはそれらの相補的配列から選択される。

結論として、本発明の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤に対してより良好な耐性を有し、かつ収量に対して影響を与えず、また検出方法は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡ分子が生物学的試料に含有されているかどうかを正確にかつ迅速に同定できる。

遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４に相当する種子は、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏ.３、Ｎｏ.１ Ｃｏｕｒｔｙａｒｄ、Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、北京、郵便番号：１００１０１）に、分類および命名をダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、受入番号をＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１として、２０１５年１１月２７日に保存された。その収集物は保管場所に３０年間保管される。

最後に、上記の実施形態は、単に、本発明の技術的解決法を限定するよりむしろ説明するために用いられていることを明言するべきであり、本発明は好ましい実施形態に関して詳細に述べられたが、当業者は、本発明の技術的解決法の趣旨と範囲から逸脱することなく、本発明の技術的解決法に変更または均等物置換が行われてもよいと理解するべきである。

Claims (21)

1. 核酸分子であって、前記核酸分子の核酸配列は、配列番号１、または配列番号１の相補的配列、または配列番号２、または配列番号２の相補的配列、または配列番号１と配列番号２の両方、または配列番号１の相補的配列と配列番号２の相補的配列の両方を含み、
   前記核酸分子の核酸配列が配列番号１と配列番号２の両方を含む場合、配列番号１は配列番号２から離れており、
   前記核酸分子の核酸配列が配列番号１の相補的配列と配列番号２の相補的配列の両方を含む場合、配列番号１の相補的配列は配列番号２の相補的配列から離れている、核酸分子。
2. 前記核酸配列は、配列番号３、または配列番号３の相補的配列、または配列番号４、または配列番号４の相補的配列、または配列番号３と配列番号４の両方、または配列番号３の相補的配列と配列番号４の相補的配列の両方を含み、
   前記核酸分子の核酸配列が配列番号３と配列番号４の両方を含む場合、配列番号３は配列番号４から離れており、
   前記核酸分子の核酸配列が配列番号３の相補的配列と配列番号４の相補的配列の両方を含む場合、配列番号３の相補的配列は配列番号４の相補的配列から離れている、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記核酸配列が配列番号５またはその相補的配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
4. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は、
   核酸増幅反応において標的増幅産物を増幅するために、検出される試料を少なくとも２つのタイプのプライマーに接触させる工程と、
   核酸増幅反応を行う工程と、
   前記標的増幅産物の存在を検出する工程とを含み、
   前記標的増幅産物は、請求項１から３のいずれかに記載の核酸分子を含み、
   前記遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１で、種子の形で寄託されている、方法。
5. 前記標的増幅産物は、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列を含む、請求項４に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法。
6. 前記プライマーが、配列番号８に示す配列を有する第１プライマー、および配列番号９に示す配列を有する第２プライマーを含む、または、前記プライマーが、配列番号１０に示す配列を有する第１プライマー、および配列番号１１に示す配列を有する第２プライマーを含む、請求項４に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法。
7. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は、
   検出される試料をプローブと接触させる工程であって、前記プローブは、請求項１に記載の核酸分子を含む工程と、
   ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記検出される試料を前記プローブとハイブリダイズする工程と、
   前記検出される試料と前記プローブとの間のハイブリダイゼーション状態を検出する工程とを含み、
   前記遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１で、種子の形で寄託されている、方法。
8. 前記プローブは、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項７に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法。
9. 前記プローブの少なくとも１つが少なくとも１つのフルオロフォアで標識されている、請求項７に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法。
10. 試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は、
    前記検出される試料をマーカー核酸分子と接触させる工程であって、前記マーカー核酸分子は、請求項１に記載の核酸分子を含む工程と、
    ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記検出される試料を前記マーカー核酸分子とハイブリダイズする工程と、
    前記検出される試料の前記マーカー核酸分子とのハイブリダイゼーション状態を検出し、さらに、グリホサート耐性および／またはグルホシネート耐性と前記マーカー核酸分子との間の遺伝的現象における遺伝子連鎖をマーカー支援育種解析により確定する工程とを含み、
    前記遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１で、種子の形で寄託されている、方法。
11. 前記マーカー核酸分子は、配列番号６もしくはその相補的配列、および／または配列番号７もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項１０に記載の、試料中の遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４のＤＮＡの存在を検出するための方法。
12. 少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、
    前記ＤＮＡ分子は、請求項１に記載の核酸分子を含み、前記ＤＮＡ分子は、遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４またはその子孫に特異的なＤＮＡプライマーの１つまたはプローブとして利用され得、
    前記遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１で、種子の形で寄託されている、ＤＮＡ検出キット。
13. 前記ＤＮＡ分子は、配列番号６の相同配列もしくはその相補的配列、および／または配列番号７の相同配列もしくはその相補的配列をさらに含む、請求項１２に記載のＤＮＡ検出キット。
14. グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列、グルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、および特異的な領域の核酸配列を含み、前記特異的な領域の核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つを含む、植物の細胞または部分。
15. グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の作製方法であって、前記方法は、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、ならびに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６および配列番号７に示す配列の少なくとも１つの核酸配列から選択される特異的な領域の核酸配列を、前記ダイズ植物のゲノムに導入する工程、または配列番号５に示す核酸配列を前記ダイズ植物のゲノムに導入する工程を含む、方法。
16. 前記ダイズ植物のゲノムに導入する工程は、
    グリホサートおよび／またはグルホシネート耐性がないダイズ植物に遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４を有性的にハイブリダイズして、数多くの子孫植物を作製し、前記特異的な領域の核酸配列を有する前記子孫植物を選択する工程と、
    前記子孫植物をグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤で処理する工程と、
    グリホサートおよび／またはグルホシネートに対して耐性がある前記子孫植物を選択する工程とを含み、
    前記遺伝子導入ダイズイベントＤＢＮ９００４は、受入番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１１７１で、種子の形で寄託されている、請求項１５に記載の、グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の作製方法。
17. グリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤に対して耐性があるダイズ植物の栽培方法であって、前記方法は、
    少なくとも１つのダイズ種子を栽植する工程であって、前記ダイズ種子のゲノムは、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳタンパク質をコード化する核酸配列および／またはグルホシネート耐性ＰＡＴタンパク質をコード化する核酸配列、ならびに特異的な領域の核酸配列を含み、または、前記ダイズ種子のゲノムは、配列番号５に示す核酸配列を含む工程と、
    前記ダイズ種子をダイズ植物に育てる工程と、
    有効量のグリホサート除草剤および／またはグルホシネート除草剤を前記ダイズ植物に噴霧し、前記特異的な領域の核酸配列をもたない他の植物に比べて植物損傷が少ない前記植物を収穫する工程とを含み、
    前記特異的な領域の核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号７に示す配列の少なくとも１つの核酸配列から選択される、方法。
18. 畑において除草剤および／または雑草防除が引き起こす損傷から植物を保護するための方法であって、前記方法は、有効量のグリホサートおよび／またはグルホシネートを含有する除草剤を、少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を栽植する畑に散布する工程を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、前記遺伝子導入ダイズ植物は前記グリホサート除草剤および／または前記グルホシネート除草剤に対する耐性を有する、方法。
19. 有効量のグルホシネートを含有する除草剤を、少なくとも１つのグリホサート耐性遺伝子導入ダイズ植物を栽植する畑に散布する工程を含み、前記グリホサート耐性遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含み、前記グリホサート耐性遺伝子導入ダイズ植物は同時に前記グルホシネート除草剤に対しても耐性を有する、請求項１８に記載の、畑において除草剤および／または雑草防除が引き起こす損傷から植物を保護するための方法。
20. 昆虫抵抗性を遅延させるための方法であって、前記方法は、昆虫抵抗性ダイズ植物を栽植する畑において、グリホサートおよび／またはグルホシネート耐性を有する少なくとも１つの遺伝子導入ダイズ植物を育てる工程を含み、前記グリホサートおよび／またはグルホシネート耐性を有する遺伝子導入ダイズ植物は、そのゲノム中に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示す配列から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、方法。
21. 配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチドを含む農産物または商品であって、前記農産物または商品は、レシチン、脂肪酸、グリセロール、ステロール、ダイズフレーク、ダイズ粉、ダイズタンパク質あるいはその濃縮物、ダイズ油、ダイズタンパク質繊維、豆乳凝固物、または豆腐である、農産物または商品。

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