UA114716C2 - Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів - Google Patents

Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів Download PDF

Info

Publication number
UA114716C2
UA114716C2 UAA201401402A UAA201401402A UA114716C2 UA 114716 C2 UA114716 C2 UA 114716C2 UA A201401402 A UAA201401402 A UA A201401402A UA A201401402 A UAA201401402 A UA A201401402A UA 114716 C2 UA114716 C2 UA 114716C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
soybean
sequence
specified
plant
transgene
Prior art date
Application number
UAA201401402A
Other languages
English (en)
Inventor
Томас Гофман
Дон Марі Паркгерст
Нін Чжоу
Даякар Пареді
Юньсін Корі Цюй
Нейтан Бард
Сандра Ґрейс Толедо
Ґреґорі Елан Бредфіш
Брюс Гелд
Вайтхілінгам Секар
Ян ВАН
Лорен КЛАРК
Шон Майкл РАССЕЛЛ
Келі Ен Сміт
Тері Р. Райт
Original Assignee
Дау Аґросаєнсиз Елелсі
ЕмЕс ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дау Аґросаєнсиз Елелсі, ЕмЕс ТЕКНОЛОДЖИЗ, ЕлЕлСі filed Critical Дау Аґросаєнсиз Елелсі
Publication of UA114716C2 publication Critical patent/UA114716C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11017—Taurine dioxygenase (1.14.11.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01183—Phosphinothricin acetyltransferase (2.3.1.183)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase

Abstract

Винахід стосується трансгенної рослини сої з генетичною подією pDAB8264.42.32.1 і включає експресійні кластери і трансгенні вставки, які містять множину ознак, що надають резистентність до таких гербіцидів, як: гліфосат, арилоксіалканоат і глюфозинат. У деяких варіантах винаходу послідовність трансгена може бути "зчеплена" з іншими ознаками, включаючи, наприклад, інший ген стійкості до гербіцидів і/або білки, що знищують комах.

Description

Перехресні посилання на споріднені заявки
У даній заявці, відповідно до ст. 35 Кодексу законів США, 5119(е), заявляється про пріоритет попередньої заявки Мо 61/507444, поданої 13 липня 2011 р., і заявки Мо 61/515634, поданої 5 серпня 2011 р. Ці заявки у всій своїй повноті і у всіх цілях вводяться у даний опис за допомогою посилання.
Попередній рівень техніки
Гліфосат (М-фосфонометилгліцин), гербіцид широкого спектра дії, інгібує /5- енолпірувілшикімат-З-фосфат-синтазу (ЕРБР5), тобто фермент шляху метаболізму шикімової кислоти, під дією якого у клітинах рослин продукуються незамінні ароматичні амінокислоти.
Інгібування ЕРБРЗ є ефективним способом порушення синтезу білків і, тим самим, знищення уражених клітин рослин. Оскільки гліфосат не має селективності відносно клітин рослин, він знищує як бур'яни, так і культурні рослини. Таким чином, він може бути використаний у сільськогосподарському виробництві тільки у тому випадку, якщо культурні рослини будуть піддані модифікації, яка надасть їм резистентність до гліфосату, що буде забезпечувати виживання потрібних рослин після їх обробки гліфосатом.
Для виділення мутантних ЕР5Р-синтаз, які є резистентними до гліфосату, була застосована технологія рекомбінантних ДНК. Такі резистентні до гліфосату мутантні ЕРЗР-синтази можуть бути введені у рослини і можуть надавати трансформованим рослинам резистентність до гліфосату. Так, наприклад, ген резистентності до гліфосату був виділений зі штаму СРА
Адгорасіегішт, як описано у патенті США Мо. 5633435. Ця робота і всі роботи, що цитуються там, вводяться у даний опис за допомогою посилання.
Інші гени стійкості до гліфосату були сконструйовані шляхом внесення мутацій. Такими генами є ген АгоА, виділений Сотаї і описаний у патентах США МоМо 5094945, 4769061 і 4535060. Був використаний мутант з однією мутацією, описаний у патенті США Мо 5310667 і отриманий шляхом заміни гліцинового залишку аланіновим залишком у положеннях амінокислот 80-120. Подвійні мутанти були описані у патентах США МоМо 6225114 і 5866775, де у ген ЕРБРЗ дикого типу, крім вказаної вище мутації, була введена друга мутація (заміна аланінового залишку треоніновим залишком у положеннях 170-210).
В інших роботах резистентна до гліфосату кукурудза була отримана шляхом введення
Зо модифікованого гена ЕРБРО кукурудзи, що несе мутації у положенні залишку 102 (заміну треоніну на ізолейцин) і залишку 106 (заміну проліну на серин) в амінокислотній послідовності, що кодується послідовністю, наявною у сСепВапкК під реєстр. Мо. Х63374. Див., патенти США
МоМо 6566587 і 6040497.
Прикладами генетичних подій, які надають резистентність до гліфосату у сої, є генетичні події сої 5Т5 40-3-2 (Раддейце еї аїЇ. 1995) і генетичні події сої МОМ89788 (патент США Мо 7608761).
За останні роки широке застосування технології вирощування резистентних до гліфосату сільськогосподарських культур і майже всюди застосування гліфосату привели до появи великої кількості резистентних до гліфосату бур'янів, які погано піддаються знищенню. У регіонах, в яких фермери стикаються з резистентними до гліфосату бур'янами або з бур'янами інших видів, які ще гірше піддаються знищенню, такий недостатній спектр гербіцидної дії гліфосату може бути компенсований шляхом резервуарного змішування або чергування застосування гліфосату з іншими гербіцидами, які будуть знищувати бур'яни, що не входять у спектр дії гербіцидів.
Гербіцид, 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4-ОЮ), може бути використаний у комбінації з гліросатом для боротьби з більш широким рядом широколистих або дводольних бур'янів, які можуть набувати стійкість або резистентність до гліфосату. 2,4-ЮО, що використовується як гербіцид вже протягом більше 60 років, забезпечує післясходове знищення однорічних, дворічних і багаторічних широколистих бур'янів широкого ряду. Що стосується кукурудзи, сої і бавовнику, то 2,4-О (при нормі введення 560-1120 г екв. кислоти/га (г е.к./га)) знищує головні бур'яни цих культур, включаючи: Атбговзіа апетівійоїїа, Атбговіа М йда, Хапіпішт вігитагіит,
Спепородійт аіІрит, Неїїапіпив аппишв, Іротоєа 5р., Абшіоп ІНеорнНгавзії, Сопуга Сападепвів і
Зеппа оріизітоЇа. 2,4-О0О0 забезпечує часткове знищення деяких широко поширених бур'янів, включаючи РоїЇудопит репзуїмапісит, Роїудопит регзісагіа, Сігвіцт агуепзе, Тагахасит оїісіпа|е і Атагапійизх 5р., включаючи Атагапійпиз гидів і Атагапіпих раїтеті.
Обмеження щодо подальшого застосування 2,4-0О полягає у тому, що її селективність до дводольних культур, таких, як соя або бавовник, є дуже низькою, а тому 2,4-0 звичайно не застосовують до чутливих дводольних культур (і навіть поблизу від цих культур). Крім того, застосування 2,4-Ю до пасовищних культур до деякої міри обмежене природою можливого пошкодження цих культур. 2,4-О у комбінації з гліфосатом була використана для забезпечення бо більш ретельного випалювання пасовищної трави перед посівом культур сої і бавовнику, які висаджуються на неорні землі; однак, через чутливість цих дводольних рослин до 2,4-О, таке випалювання може бути здійснене, головним чином, щонайменше за 14-30 днів до посіву (Адгійапсе, 2005).
Одним мікроорганізмом, який був широко досліджений на його здатність розкладати 2,4-О, є
Ваїбіопіа ешгорна, що містить ген НаА, який кодує фермент (ТА), що каталізує першу стадію шляху мінералізації. (Див. патенти США Мо 6153401 і ЗЕМВАМК Асс. Мо. М16730). ТА каталізує перетворення 2,4-0О-кислоти у дихлорфенол (ОСР) за допомогою діоксигеназної реакції, що залежить від а-кетоглутарату (Зте)каї єї аі., 2001). ОСР має більш низьку гербіцидну активність порівняно з 2,4-Ю0. НЯаА був використаний у трансгенних рослинах для надання резистентності до 2,4-О у дводольних рослин (наприклад, у бавовнику і тютюну), які, за своєю природою, є сприйнятливими до 2,4-О0 (Зігерег еї аї. (1989), Гуоп еї аї. (1989), Гуоп (1993) та у патенті США Мо. 5608147).
Ряд генів типу НА, які кодують білки, здатні розкладати 2,4-О, були виділені з відповідного середовища і депоновані у базі даних Сепрапк. Багато гомологів є аналогічними ТА (тобто мають 285 95-ну ідентичність амінокислот) і мають ферментативні властивості, аналогічні ферментативним властивостям ТА. Однак, існує ряд гомологів, які значно менш ідентичні ТаАд (25-50 95), але при цьому мають характерні залишки, асоційовані із залишками а-кетоглутарат-
Ее (П)-діоксигеназ. Отже, специфічність дивергентних білків ТЯА до субстрату поки не виявлялася.
Прикладом гена, що розщеплює 2,4-О, з низькою гомологією («35 95) до НаА є ген ааа-12, що походить від ОеїЇЙйіа асідомогап5 (ЗСПІеїпії» еї а. (2004) апа Ууезіепаог! еї аї. (2002)). Ген ааа- 12 кодує 5-енантіомер-специфічну а-кетоглутарат-залежну діоксигеназу, яка була використана у рослинах для надання їм стійкості до деяких феноксіауксинових гербіцидів, включаючи, але не обмежуючись ними, феноксіалканоатні гербіциди (наприклад, гербіциди на основі феноксіоцтової кислоти, такі, як 2,4-О і МСРА; і гербіциди на основі феноксибутанової кислоти, такі, як 2,4-ОВ і МСОСРВ) і гербіциди на основі піридилоксіалканової кислоти (наприклад, гербіциди на основі піридилоксіоцтової кислоти, такі, як триклопір і флуроксипір), а також кислотні, сольові або складноефірні форми активного(их) інгредієнта(ів) (див., наприклад, УМО 2007/053482).
Зо Глюфозинат-амоній ("люфозинат") являє собою несистемний і неселективний гербіцид, що належить до класу фосфінотрицинів. І -фосфінотрицин, тобто активний інгредієнт глюфозинату, використовується, головним чином, для післясходового знищення широколистих і трав'янистих бур'янів, а саме, за допомогою необоротного інгібування глутамін-синтази, тобто, ферменту, необхідного для детоксифікації аміаку у рослинах. Глюфозинатні гербіциди є комерційно доступними і наявні у продажу під торговими марками ІСМІТЕФ і ГІВЕКТУФ).
Фермент фосфінотрицин-М-ацетилтрансфераза (РАТ), виділена з грунтових бактерій зігеріотусев мігідоспготодепев5, каталізує перетворення І-фосфінотрицину в його неактивну форму за допомогою ацетилування. Оптимізована для рослини форма гена, що експресує РАТ, була використана у рослинах сої для надання їм стійкості до глюфозинатного гербіциду. Одним з таких прикладів рослин сої, резистентних до глюфозинату, є трансгенна соя генетичної події
А5547-127. Зовсім нещодавно застосування глюфозинатного гербіциду до рослин з ознаками стійкості до глюфозинату було запропоноване як неселективний метод ефективної боротьби з бур'янами, резистентними до АЇ 5 і гліфосату.
Експресія гетерологічних або чужорідних генів у рослинах залежить від того, чи вбудовується цей чужорідний ген у хромосому. Це може бути обумовлено, наприклад, хроматиновою структурою (наприклад, гетерохроматином) або безпосередньою близькістю елементів регуляції транскрипції (наприклад, енхансерів) до сайту інтеграції (Ууеї5іпод еї аї., Апп.
ВеУ. Сепеї 22:421-477, 1988). Той самий ген у тій самій трансгенній рослині (або в іншому організмі) може проявляти широку варіабельність у рівнях експресії у різних генетичних подіях.
Також можуть спостерігатися відмінності у просторових або часових профілях експресії. Так, наприклад, відмінності у відносних рівнях експресії трансгену у різних тканинах рослин можуть не відповідати профілям, очікуваним для даних елементів регуляції транскрипції, які є присутніми у введеній генній конструкції.
Таким чином, для ідентифікації генетичних подій у лінії, яка експресує введений ген, що представляє інтерес, часто створюють і скринують велике число мутацій доти, доки не буде досягнутий рівень експресії, який відповідає визначеним вимогам. Для комерційних цілей звичайно створюється від ста до тисячі різних модифікацій і ці модифікації скринують для виявлення однієї модифікації, яка буде надавати бажані рівні і профілі експресії трансгенів.
Генетична подія, яка надає потрібні рівні і/або профілі експресії трансгенів, може бути 60 використана для інтрогресії трансгену в інше генетичне середовище за допомогою статевого ауткросингу з використанням стандартних методів схрещування. У потомстві таких кросів зберігається характер експресії трансгену, властивий вихідному трансформанту. Така стратегія застосовується для забезпечення надійної експресії генів у ряду сортів, які добре адаптовані для їх культивування в умовах даної місцевості.
Короткий опис суті винаходу
Даний винахід стосується, зокрема, ефективних способів боротьби з виробленням резистентності у бур'янів, які забезпечують можливість ефективного застосування технології надання культурним рослинам стійкості до гербіцидів. Даний винахід також пропонує фермерам широкий вибір універсальних і адаптивних засобів боротьби з бур'янами.
Більш конкретно, даний винахід, зокрема, стосується генетичної події сої (сіІусіпе тах), позначеної ррАВ8264.42.32.1 ("РОАВ8264.42.32.1-генетична подія сої"), репрезентативне насіння якої і насіння її потомства депоноване в Американській колекції типових культур (АТОС) під реєстр. Мо. РТА-1 1993. Даний винахід включає рослини сої, які містять генетичну подію ррАВ8264.42.32.1 (і включає рослини сої, які містять трансгенну вставку між послідовностями
ЗЕО ІЮ МО 1 і БЕО ІЮ МО:2).
Трансгенна вставка, яка є присутньою у розглянутій генетично модифікованій рослині та у її депонованому насінні, включає три гени стійкості до гербіцидів: ааа-12, 2тпЕрзрз і раї. Ген аад- 12, що походить від ОеїЩіа асідомогап5, кодує білок арилоксіалканоат-діоксигеназу (ААО-12), яка надає стійкість, наприклад, до таких гербіцидів як 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота і піридилоксіацетат. Ген 2терзр5, модифікована послідовність ЕРБР5, виділена з кукурудзи, продукує білок, що надає стійкість до гербіцидів, таких, як гліфосат. Ген раї, виділений з грунтових бактерій Зігеріотусез мігідоспготодепев, надає стійкість до гербіциду глюфозинату.
В інших своїх аспектах даний винахід включає рослини потомства, соєві боби, насіння і/або частини рослин і насіння, що регенеруються, і потомство, яке містить генетичну подію ррАВ8264.42.32.1, а також отримані з них харчові або кормові продукти. Даний винахід також включає частини генетичної події РОАВ8264.42.32.1, якими є, але не обмежуються ними, пилок, овули, квітки, паростки, корені, листи, ядра вегетативних клітин, клітини пилка та інші клітини рослин, які містять генетичну подію ррАВ8264.42.32.1. Даний винахід також стосується рослин сої, які мають стійкість до множини гербіцидів, включаючи феноксіауксинові і/або
Зо арилоксіалканоатні гербіциди, гліфосат і/або глюфозинат. Такі рослини сої можуть також включати гени, що надають стійкість до різних інших неселективних і селективних гербіцидів, включаючи, але не обмежуючись ними, гербіциди дикамбу, імідазолінон і НРРО. Даний винахід також включає нові генетичні композиції, що містять генетичну подію ррАВ8264.42.32.1, і показники агрономічної продуктивності рослин сої, що містять генетичну подію ррАВ8264.42.32.1.
Даний винахід, зокрема, стосується схрещування рослин і рослин, стійких до гербіцидів.
Даний винахід включає нову генетичну подію у рослинах сої, що містить описаний тут полінуклеотид, вбудований у специфічний сайт геному клітини сої.
У деяких варіантах винаходу зазначений трансген/полінуклеотид може бути "зчеплений" з іншими ознаками, включаючи, наприклад, агрономічні ознаки і/або білки, що знищують комах.
Однак, даний винахід включає рослини, що мають одну описану тут генну модифікацію.
Додаткові ознаки можуть бути введені у геном рослини або у локус, такий, як генетична подія ррАВ8264.42.32.1, наприклад, за допомогою схрещування рослин, повторної трансформації трансгенної рослини, що містить генетичну подію ррАВ8264.42.32.1, або додавання нових ознак завдяки направленій інтеграції за допомогою гомологічної рекомбінації.
Інші варіанти здійснення винаходу включають вирізання частини трансгенної вставки і/або фланкуючих послідовностей генетичної події рОАВ8264.42.32.1, або всіх зазначених вставок іМабо послідовностей. Після вирізання, у специфічний хромосомний сайт генетичної події рорАВ8264.42.32.1 може бути введена інша і/або додаткова вставка. Таким чином, ця репрезентативна вставка може бути замінена репрезентативною вставкою генетично модифікованої рослини сої, що розглядається, або ця репрезентативна вставка може бути зчеплена з іншою(ими) вставкою(ами).
В одному зі своїх варіантів даний винахід охоплює хромосомний сайт-мішень сої, локалізований на хромосомі 15. У деяких варіантах винаходу цей сайт-мішень включає гетерологічну нуклеїнову кислоту. У деяких варіантах винаходу цей хромосомний сайт-мішень сої локалізований між фланкуючими послідовностями, представленими у ЗЕО ІЮО МО:1 і ЗЕО ІЮ
МО:2.
В одному зі своїх варіантів даний винахід охоплює спосіб обробки трансгенної рослини сої, де зазначений спосіб включає вбудовування гетерологічної нуклеїнової кислоти у визначене бо положення хромосоми 15. В іншому варіанті винаходу гетерологічну нуклеїнову кислоту вбудовують у хромосому 15, у положення, що знаходиться поблизу від різних описаних тут репрезентативних полінуклеотидних сегментів або між цими сегментами.
Крім того, даний винахід стосується аналізів на присутність генетичної події, що розглядається, у зразку (наприклад, у рослині сої). Ці аналізи базуються на визначенні послідовності ДНК рекомбінантної конструкції вбудованої у геном сої, і геномних послідовностей, що фланкують інсерційний сайт. Даний винахід також стосується наборів і умов проведення цих аналізів.
Таким чином, даний винахід стосується, зокрема, клонування і аналізу послідовностей ДНК цілої репрезентативної вставки і її граничних областей (у лініях трансгенної сої). Ці послідовності є унікальними. На основі цих послідовностей вставок і граничних областей (їі областей стику) можуть бути і були створені праймери, специфічні до такої генетичної події.
ПЛР-аналіз показав, що ці зазначені генетичні модифікації можуть бути ідентифіковані шляхом оцінки ПЛР-ампліконів, сконструйованих з використанням наборів праймерів, специфічних до такої модифікації. Таким чином, ці та інші споріднені методи можуть бути застосовані для унікальної ідентифікації ліній сої, що містять генетичну подію відповідно до винаходу.
Даний винахід також, зокрема, стосується ПЛР-аналізів ТАОМАМ, кінцевою метою яких є детектування генетичної події 8264.42.32.1. Деякі варіанти винаходу стосуються аналізів, що дозволяють визначити зиготність. Даний винахід також стосується, зокрема, застосування еталонного гена СМР 01-25-)19 (СепВапк: АК286292.1), використовуваного для визначення зиготності. Ці та інші споріднені методи можуть бути застосовані для унікальної ідентифікації зиготності генетичної події РОАВ8264.42.32.1 і виведених ліній сої, що містять дану генетичну подію.
Короткий опис графічного матеріалу
На фіг. 1 представлена карта плазміди ррАВ8264.
На фіг. 2 схематично представлена діаграма, що ілюструє визначення локалізації праймерів для підтвердження 5'- і 3-граничної послідовності генетичної події РОАВ8264.42.32.1 у сої.
На фіг. З схематично представлена діаграма, що ілюструє визначення локалізації праймерів для підтвердження нетрансформованої і геномної ДНК, де генетичною подією у сої є ррАВ8264.42.32.1.
Зо На фіг. 4 схематично представлена діаграма, що ілюструє визначення локалізації праймерів для проведення аналізу ТАОМАМ з метою детектування присутності генетичної події ррАВВ8264.42.32.1 у сої.
Короткий опис послідовностей
ЗБО ОО МО: 1 являє собою 5-фланкуючу граничну послідовність генетичної події рорАВ8264.42.32.1, що розглядається, у сої.
ЗБО ОО МО:2 являє собою 3-фланкуючу граничну послідовність генетичної події ррАВ8264.42.32.1, що розглядається, у сої.
ЗЕО ІЮ МО:З являє собою праймер 4232 М/Е1.
ЗЕО ІЮ МО:4 являє собою праймер 4232 М/ЕЗ.
ЗЕО ІЮ МО:5 являє собою праймер 4232 МУ/Е4.
ЗЕО ІЮ МО:6 являє собою праймер 4232 МУКІ1.
ЗЕО ІЮ МО:7 являє собою праймер 4232 МУК2.
ЗЕО ІЮ МО:8 являє собою праймер 4232 МУКЗ.
ЗЕО ІЮ МО:9 являє собою праймер 4232 М/В4.
ЗЕО ІЮ МО:10 являє собою праймер ЕЮО м1 СІ.
ЗЕО ІЮ МО:11 являє собою праймер РАТ 11.
ЗЕО ІЮ МО:12 являє собою праймер 4232 ЗЕ.
ЗЕО ІЮ МО:13 являє собою праймер 4232 З.
ЗЕО ІЮ МО:14 являє собою зонд 4232 ЗР.
ЗЕО ІЮ МО:15 являє собою праймер СМ5116БРЕ.
ЗЕО ІЮ МО:16 являє собою праймер СМ5116Е. 5ЕО ІЮ МО:17 являє собою зонд ЗМ5116Ргобре.
ЗЕО ІЮО МО:18 являє собою вставку Т-ланцюга рраАВ8264 і неповні геномні 5'- і 3і-фланкуючі послідовності.
ЗЕО ІЮ МО:19 являє собою 5'-геномну послідовність-вставку (включаючи область стику) для генетичної події РОАВ8264.42.32.1.
ЗБО ОО МОс20 являє собою послідовність 3'-вставки-стику для генетичної події ррАВ8264.42.32.1, що розглядається.
ЗЕО ІЮ МО:21 являє собою послідовність плазміди ррАВ8264. 60 Докладний опис винаходу
Описаний тут винахід включає нові генетичні події рослини сої (соєві боби), що містять кластер для експресії множини генів стійкості до гербіцидів, вбудованих у специфічний локус геному клітин сої. Зокрема, були вирощені нові лінії рослини сої, що містять генетичну подію рорАВ8264.42.32.1. Така трансгенна рослина має стійкість до множини гербіцидів, включаючи феноксіауксинові і/або арилоксіалканоатні гербіциди, гліфосат і/або глюфозинат. Стійкість до багатьох гербіцидів дозволяє фермерам вибрати оптимальну комбінацію гербіцидів для більш ефективної боротьби з окремими популяціями бур'янів.
Репрезентативною трансгенною вставкою, що містить генетичну подію рОАВ8264.42.32.1, є генетичні елементи, які експресують три різних гени стійкості до гербіцидів: (1) синтетичний ген аад-12; (2) модифікована послідовність ЕРБРО кукурудзи, що кодує білок, який, порівняно з поліпептидом ЕРБР5 дикого типу, містить мутації, а саме, мутацію у положенні амінокислоти 102 (заміну треоніну ізолейцином) та у положенні 106 (заміну проліну серином), що надає резистентність або стійкість до гербіциду гліфосату; і (3) ген раї, що надає стійкість або резистентність до гербіциду глюфозинату. Ген аад-12, що походить від ОеїЇЙйіа асідомогап5, кодує білок арилоксіалканоат-діоксигеназу (ААЮО-12), тобто, фермент, здатний дезактивувати гербіциди, що мають са-кетоглутаратну групу, включаючи феноксіалканоатні гербіциди (наприклад, гербіциди на основі феноксіоцтової кислоти, такі, як 2,4-О і МСРА; і гербіциди на основі феноксибутанової кислоти, такі, як 2,4-0О8 і МСРВ) і гербіциди на основі піридилоксіалканової кислоти (наприклад, гербіциди на основі піридилоксіоцтової кислоти, такі, як триклопір і флуроксипір), включаючи кислотні, сольові або складноефірні форми активного(их) інгредієнтаків).
Даний винахід також стосується аналізів на присутність генетичної події, що розглядається, у зразку. Аспекти даного винаходу включають способи конструювання і/або продукування будь- яких описаних або пропонованих тут діагностичних молекул нуклеїнової кислоти, а зокрема, молекул, які повністю або частково складаються з фланкуючих послідовностей, що розглядаються.
Даний винахід, зокрема, стосується схрещування рослин і рослин, стійких до гербіцидів. У деяких варіантах винаходу зазначена полінуклеотидна послідовність може бути "зчеплена" з іншими ознаками (такими як, іншій(ії) ген(и) стійкості до гербіцидів і/або ген(и), що кодує(ють)
Ко) білки, які знищують комах, або, наприклад, білки, які інгібують послідовності РНК). Однак, даний винахід також включає рослини, що мають одну описану тут генетичну подію.
Більш конкретно, даний винахід стосується, зокрема, генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1, ліній рослин, що містять зазначений трансген, і методів клонування і аналізу ДНК-послідовності цієї трансгенної вставки і/або її граничних областей. Лінії рослин відповідно до винаходу можуть бути детектовані з використанням описаних і пропонованих тут послідовностей.
У деяких варіантах винаходу пропонований або описаний тут полінуклеотидний сегмент (такий, як БЕО ІЮО МО:1, 5ЕО ІЮО МО:2 і/або вставка між ними, як зазначено, наприклад, на фіг. 2) може бути вирізаний, а потім знову введений з додатковою(ими) полінуклеотидною(ими) послідовністю(остями).
У деяких своїх варіантах даний винахід стосується клітинних ліній сої, стійких до гербіцидів, і їх ідентифікації. Даний винахід, зокрема, стосується детектування наявності розглянутої генетичної події для того, щоб визначити, чи містить потомство, отримане шляхом статевого схрещування, генетичну подію, що представляє інтерес. Крім того, даний винахід включає спосіб детектування даної модифікації яка буде відповідати вимогам, які ставляться
Регуляторними органами для одержання дозволу на надходження цього продукту на первинний ринок з вказівкою на етикетці даного харчового продукту, наприклад, що цей продукт був отриманий з рекомбінантних культур. Присутність генетичної події, що розглядається, може бути детектована будь-яким добре відомим методом детектування нуклеїнових кислот, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або ДНК-гібридизація з використанням нуклеїновокислотних зондів. Аналіз, проведений за допомогою ПЛР, специфічної до генетичної події, описаний нижче. (Інший приклад можна знайти у публікації УміпаеєїЇ5 еї аї. (Мед. Рас.
Гапароцймлиу, Опім. Сепі 64/5р0:459462, 1999)). Деякі з цих прикладів стосуються використання серії праймерів, що охоплюють послідовність стику, розташовану між вставкою і фланкуючою
ДНК.
У даній заявці описана репрезентативна генетична подія сої ррАВ8264.42.32.1, її відбір і характеризація на стабільність і експресію у цілій рослині і на молекулярні рівні від покоління до покоління. Обидві фланкуючі послідовності генетичної події ррА8264.42.32.1 були секвеновані і представлені тут як ЗЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮО МО:2. Були розроблені аналізи, специфічні для такої модифікації. Було також проведене картування геному сої (хромосоми 15 сої). Може бути бо здійснена інтрогресія генетичної події ррАВ8264.42.32.1 в елітні сорти, яким була надана стійкість до таких гербіцидів як феноксіауксин, гліфосат і глюфозинат, в інбредних і гібридних лініях сої.
Ген ЕРБР5, що розглядається, кодує мутантну 5-енолпірувіл-3-фосфошикімову кислоту- синтазу (ЕРБРБ). Ген ЕРБР5 дикого типу був вперше виділений з кукурудзи 7еа таув, і його послідовність була депонована у СепВапкК під реєстр. Мо Хб63374. Див. також патент США Мо. 6566587 (а зокрема, описану там послідовність зХЕО ІЮ МО:3).
Для досягнення високого рівня експресії гетерологічних генів у рослинах може виявитися переважним реконструювати зазначені гени так, щоб вони більш ефективно експресувалися у клітинах рослин. Модифікація нуклеотидної послідовності ЕРБРБ5 у рослині дикого типу може надавати таку резистентність при її експресії у клітинах рослин. Як описано у патенті "587, у поліпептиді ЕРБР5, модифікація із заміною треоніну ізолейцином у положенні залишку 102 і модифікація із заміною проліну серином у положенні 106 білка, порівняно з поліпептидом дикого типу, призводить до утворення поліпептиду ЕРБРЗ з подвійною мутацією (2пЕРЗРБ), використовуваного у вставці, що розглядається. При його експресії у клітинах рослин, він надає стійкість до гліфосату. Ген ЕРБР5, що розглядається, позначений також тут "ген 2терзре5" або рММО, може бути альтернативно оптимізований для підвищення рівня експресії у дводольних рослинах, а також в однодольних рослинах, а зокрема, у рослинах сої. Зустрічальність кодонів може бути вибрана виходячи з переважної зустрічаності кодону сім'ядолі, тобто, білок може бути реконструйований так, щоб він кодувався кодонами, які частіше зустрічаються в однодольних і дводольних рослин. Для підвищення ефективності транскрипції/трансляції 2гтерзрзв-кодуючої послідовності і для полегшення проведення стадій модифікацій ДНК можуть бути видалені небажані послідовності і надлишкові рестрикційні сайти. Оптимізований по сім'ядолі варіант гена, що розглядається, однодольних рослин також докладно описаний у попередній заявці США (реєстр.Мо 61/419703), поданій З грудня 2010 р. під заголовком "ОРТІМІЛЕО ЕХРАЕББІОМ ОБ СІМРНОБЗАТЕ ВЕБІЗТАМСЕ ЕМСОБІМОа МОСІЕБЇ!С АСІЮ
МОЇ ЕСИОГЕ5 ІМ РІ АМТ СЕТ 5".
Як було описано раніше, введення та інтеграція трансгену у геном рослини являють собою спонтанні події внесення деяких генетичних подій (а тому термін "модифікація" ("емепі") стосується вставки, яка експресується у рослині, що трансформується). Тобто, при здійсненні
Зо багатьох методів трансформації, таких, як трансформація агробактерією (Адгобасіегішт), метод "вистрілювання генів" ії М/НІЗКЕК5, не можна точно прогнозувати, в яку ділянку геному буде вбудовуватися трансген. Таким чином, ідентифікація фланкуючої геномної ДНК рослини по обидва боки вставки може відігравати важливу роль для ідентифікації рослини, що має дану інсерційну модифікацію. Так, наприклад, можуть бути сконструйовані ПЛР-праймери, що генерують ПЛР-амплікон в області стику між вставкою і геномом хазяїна. Цей ПЛР-амплікон може бути використаний для ідентифікації унікальної інсерційної модифікації або інсерційної модифікації іншого типу.
У процесі введення вставки у геном клітин рослин нерідко виникають деякі делеції або інші альтерації у вставці і/або у фланкуючих її геномних послідовностях. Таким чином, релевантний сегмент описаної тут плазмідної послідовності може містити деякі незначні модифікації. Це справедливо також і для описаних тут фланкуючих послідовностей. Таким чином, рослина, що містить полінуклеотид, який має визначений ступінь ідентичності з фланкуючими послідовностями і/або з послідовностями вставки, що розглядаються, входить в обсяг даного винаходу. Полінуклеотидна послідовність може вважатися ідентичною послідовності відповідно до винаходу, якщо вона щонайменше на 65 95, більш переважно, щонайменше на 70 95, більш переважно, щонайменше на 7595, більш переважно, щонайменше на 8095, а найбільш переважно, щонайменше на 85 9о 86 95, 87 Фо, 88 о, 89 У, 90 Уо, 91 95, 92 Фо, 93 Уо, 94 Чо, 95 9о, 9696, 9795, 9895, 9995 ідентична представленій або описаній тут послідовності. Для визначення таких рослин і полінуклеотидних послідовностей відповідно до винаходу може бути також проведена гібридизація у визначених умовах, описаних у даній заявці. Послідовність, що містить фланкуючі послідовності і повнорозмірну послідовність вставки, може бути підтверджена шляхом порівняння з послідовністю депонованого насіння.
Термін "генетичні події" ("емепі") означає початково випадкові події трансформації, причому, за час розробки даного винаходу, щонайменше 2500 насінин лінії сої, яка містить зазначені генетичні модифікації, були депоновані в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801
Опімегейу Вошцемага, Мапавзавз, МА, 20110 ї є загальнодоступними, без яких-небудь обмежень (але відповідно до патентного права). Цей депозит був зареєстрований в АТСС під депозитарним номером Мо. РТА-11993. 100 упаковок (25 насінин на упаковку) насіння Сіусіпе тах (насіння сої Сіусіпе тах І.: ррдавВ8264.42.32.1) було депоновано 11 липня 2011 р. Цей бо депозит був проаналізований 26 липня 2011 р. і на даний час це насіння було життєздатним.
Зазначений депозит поклали на зберігання відповідно до Будапештського договору про депонування насіння з метою проведення патентної процедури. Даний депозит буде зберігатися, без обмежень до його доступу, у депозитарії АТСС, що є загальнодоступним депозитарієм, протягом 30 років, або протягом п'яти років після останнього запиту, або протягом терміну дії патенту, яким би довгим він не був, і цей депозит буде замінений, якщо він втратить свою життєздатність протягом цього періоду часу.
Депоноване насіння є частиною даного винаходу. Цілюом очевидно, що з цього насіння можуть бути вирощені рослини сої, і такі рослини є частиною даного винаходу. Даний винахід також стосується послідовностей ДНК, які містяться у цих рослинах сої, що можуть бути використані для детектування цих рослин і їх потомства. Методи детектування і набори відповідно до винаходу можуть бути застосовані для ідентифікації будь-якого одного, двох або навіть всіх трьох цих трансформантів, в залежності від кінцевої мети проведення даного тесту.
Описані тут визначення і приклади наводяться для кращого розуміння даного винаходу і як керівництво з його практичного здійснення. Якщо це не обговорено особливо, то використовувані тут терміни мають свої загальноприйняті значення, зрозумілі середньому фахівцю у даній галузі. У даному описі використовується номенклатура основ ДНК відповідно до ст. 37 Зводу законів США (СЕК) 5 1.822.
Використовуваний тут термін "потомство" означає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, що містить генетичну подію ррАВ8264.42.32.1. "Трансгенну рослину з генетичною подією" ("емепі"; одержують шляхом трансформації клітин рослин гетерологічною ДНК, тобто, конструкцією нуклеїнової кислоти, що включає трансген, що представляє інтерес; регенерації популяції рослин, отриманих після вбудовування трансгену у геном рослини; і відбору конкретної рослини, яка відрізняється тим, що вона має інсерцію у конкретному положенні геному. Термін "трансгенна рослина з генетичною подією" (емепі") означає вихідний трансформант і потомство трансформанта, що включають гетерологічну ДНК. Термін "трансгенна рослина з генетичною подією" ("емепі") також означає рослину потомства, продукованого за допомогою статевого ауткросингу трансформанта і рослини іншого сорту, що включає геномну/трансгенну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентним батьком, вбудована трансгенна ДНК і фланкуюча геномна ДНК
Зо (геномна/трансгенна ДНК), що походить від трансформованого батька, є присутньою у потомстві цього кросу на тій самій хромосомній ділянці. Термін "трансген" ("емепі") також означає ДНК вихідного трансформанта і його потомства, що містять вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, розташовану безпосередньо близько від вбудованої ДНК, яка, як передбачається, повинна передаватися потомству, що одержує цю вбудовану ДНК, включаючи трансген, що представляє інтерес, у результаті статевого схрещування однієї батьківської лінії, яка містить вбудовану ДНК (наприклад, вихідного трансформанта і його потомства, що продукується після самозапилення), і батьківської лінії, яка не містить вбудовану
ДНК. "Послідовність стику" охоплює положення, в якому ДНК, вбудована у геном, приєднана до
ДНК геному нативної рослини сої, що фланкує положення інсерції, і ідентифікації або детектування однієї або іншої послідовності стику у рослинному генетичному матеріалі будуть достатніми для виявлення такого трансгену. Даний винахід включає послідовності ДНК, що охоплюють інсерції в описаних тут трансформантах сої і фланкуючі ДНК аналогічної довжини.
Конкретні приклади таких діагностичних послідовностей описані у даній заявці, однак, у даному винаході можуть бути використані й інші діагностичні послідовності, що перекриваються з послідовностями стику зазначених інсерцій або з послідовностями стику інсерцій і геномної послідовності.
Даний винахід, зокрема, стосується ідентифікації подій трансформації з використанням таких фланкуючих послідовностей, послідовностей стику і послідовностей вставки. Даний винахід включає використання споріднених ПЛР-праймерів і ампліконів. Відповідно до даного винаходу, для детектування або ідентифікації комерційно доступних сортів або ліній трансгенної сої, виведених із запатентованих ліній трансгенної сої, можуть бути застосовані методи ПЛР-аналізу з використанням ампліконів, що охоплюють вбудовану ДНК і її граничні області.
Бінарна плазміда ррАВ8264 (5ЕО ІЮ МО:21) включає генетичні елементи, представлені на фіг.1. Наведені нижче генетичні елементи (не включаючи граничні послідовності Т-ланцюга) містяться в області Т-ланцюга ррАВ8264. У таблиці 1 нумерація залишків генетичних елементів відповідає нумерації залишків описаної тут послідовності БЕО ІЮ МО:21.
Таблиця 1
Нумерація залишків генетичних елементів, що містяться у бінарній плазміді рорАВВ264 (5ЕО І МО:21)
АВ7 МАВУЗ (Область 137 п.н.- | Ппотрзоп апа Муаїй, (1997) Ріапі. Мої. Віо!., 34: 687-692.; приєднання до матриці 1302 п.н.. | МО9727207 . . 1303 п.н. -
Гістон Н4А7 48 З"ОТА 1342 п.н.- (нетрансльована що Снароцшівє евї аї, (1987) Ріапі. Мої. Віо!.,: 179-191 2002 п.н. область)
Інтронна послідовність 2003 п.н.- | немає й д 2025 п.н. 2ТЕРБРБ МІ 2026 п.н.- | Патент США Мо. 6566587 3363 п.н.
ОТтТРс (оптимізований 3364 п.н. - біт Патент США Мо. 5510471
Інтронна послідовність 3736 п.н.- | немає й д 3748 п.н. 3749 п.н. - . о 9 пн-- Снацрег ог аі., (1992) /. Мої Віоі., 225: 569-574
Промотор гістону НААУ ) 4215 п.Н.- ) Снароще іа. (1987) Ріапі Мої. Вісі. 8: 179-191 48 5169 п.н.
Інтронна послідовність 5170 п.н.- |немає й д 5261 п.н.
Промотор АШРБІ 10 5ово пн. - (промотор 10 убіхітину що Саїв, єї аї., (1990) 9. Віої. Спет., 265: 12486-12493 ; ; 6583 п.н.
Агарідорзів Іпаіапа . . 6584 п.н. - 6592 п.н. - аад-12 мі 7473 ПН. МО 2007/053482
Інтронна послідовність, тата пн. - що містить стоп-кодони у Немає й 7575 п.н. всіх 6 рамках зчитування
АшОВЕ23 З ТА (Адгорасієтійт 757впн-
Ттвеїасієп5, відкрита щі Патент США Мо. 5428147 8032 п.н. рамка зчитування, 23 тА
Інтронна послідовність 8033 п.н.- | немає й д 8146 п.н.
Промотор СУМУ віт пн - (Промотор вірусу 8663 п Н Мегдадиег еї аї, (1996) Ріапі. Мої. Віо!., 31: 1129-1139 мозаїки ліани касави Що
Інтронна послідовність 8664 пон. - | Немає
Р д 8670 п.н. 8671 п.н. - о 9222 пн. Муопіебеп еї аї, (1988) Сепе 70: 25-37
Інтронна послідовність, 9223 пн. - що містить стоп-кодони у Немає й 9324 п.н. всіх 6 рамках зчитування
АшШОВЕ1 3-ОТА (Адгорасієтійт 9325 п.н. - ! о Й
Іштеїасієпв, відкрита 10028 пн. Ниапо еї аї, (1990) 9. Васіегіої!. 172:1814-1822 рамка зчитування 1 СТА
Послідовності БЕО ІЮ МО:19 і 20, відповідно, являють собою 5'- і 3і-фланкуючі послідовності, що присутні разом з 5'- і 3і-частинами послідовності вставки, як більш докладно описано нижче, і таким чином, включають 5'- і 3'-послідовності "стику" або "транзиції" вставки і геномної ДНК.
Що стосується послідовності ЗЕО ІЮ МО:19, то залишки 1-1246 являють собою геномну 5'- фланкуючу послідовність, а залишки 1247-1550 являють собою залишки 5'-кінця вставки. Що стосується послідовності ЗЕО ІЮ МО:20, то залишки 1-176 являють собою залишки 3'-кінця вставки, а залишки 177-680 являють собою геномну 3'-фланкуючу послідовність. Таким чином, послідовності стику або транзиції в області 5'-кінця вставки знаходяться у положеннях залишків 1246-1247 послідовності ЗЕО ІЮ МО:19. Аналогічним чином, послідовності стику або транзиції в області 3'--кінця вставки знаходяться у положеннях залишків 176-177 послідовності 560 ІЮ
МО:20. Полінуклеотидами відповідно до винаходу є полінуклеотиди, що містять, наприклад, 5, 10, 20, 50, 100, 150 або 200 основ, а можливо і більше, і будь-які включення між ними з будь- якої сторони послідовності стику. Таким чином, праймер, що охоплює послідовність стику, може містити, наприклад, 5-10 основ, які повинні гібридизуватися з фланкуючою послідовністю, і 5-10 основ, які повинні гібридизуватися з послідовністю вставки. Зонди та амплікони можуть бути сконструйовані аналогічним чином, хоча, звичайно, вони довше праймерів.
Послідовності, що розглядаються (включаючи фланкуючі послідовності), є унікальними. На основі цих послідовностей-вставок і граничних послідовностей були отримані трансген- специфічні праймери. ПЛР-аналіз показав, що ці лінії рослини сої можуть бути ідентифіковані за різними генотипами сої шляхом аналізу ПЛР-ампліконів, отриманих з використанням цих наборів трансген-специфічних праймерів. Таким чином, ці та інші споріднені процедури можуть бути застосовані для ідентифікації унікальності зазначених ліній рослини сої. Ідентифіковані тут послідовності є унікальними.
Способи детектування відповідно до винаходу є особливо цінними, якщо їх застосовувати у комбінації зі схрещуванням рослин для того, щоб визначити, яке потомство містить даний трансген, після чого батьківська рослина, що містить трансген, що представляє інтерес, може бути схрещена з лінією іншої рослини для надання потомству однієї або більше додаткових ознак, що представляють інтерес. Ці методи із застосуванням ПЛР-аналізів є переважними для реалізації програм зі схрещування рослин сої, а також з контролю якості, зокрема, товарного
Зо насінного матеріалу трансгенної сої. У наш час існують і використовуються набори для ПЛР- детектування цих ліній трансгенної сої. Це дозволяє також прискорити реєстрацію продукту і його надходження на реалізацію.
Крім того, для ідентифікації конкретної геномної локалізації кожної вставки можуть бути використані фланкуючі/геномні послідовності сої. Ця інформація може бути використана для одержання молекулярних маркерних систем, специфічних для кожного трансгену. Такі системи можуть бути використані для розробки прискореної стратегії схрещування і одержання даних зі зчеплення.
Крім того, інформація про фланкуючу послідовність може бути використана для дослідження і характеризації процесів інтеграції трансгенів, властивостей сайта геномної інтеграції, відбору трансформантів, стабільності трансгенів і їх фланкуючих послідовностей, і експресії генів (особливо процесів, що стосуються сайленсингу генів, профілю метилування трансгенів, ефектів положень і потенційних елементів, асоційованих з експресією, таких, як
МАН (області приєднання до матриції і т. п.).
Виходячи з усього зазначеного вище, цілком очевидно, що даний винахід включає насіння, депоноване як насіння з генетичною подією 11 липня 2011 р. і доступне під депозитарним Мо
АТОСС РТА-11993. Даний винахід також включає стійку до гербіцидів рослину сої, вирощену з насіння, депонованого в АТСС під зазначеним реєстраційним номером і у зазначену дату. Крім того, даний винахід включає частини зазначеної рослини, такі, як листя, зразки тканини, насіння, отримане від зазначеної рослини, пилок, борошно (соєве борошно) та інші частини (де зазначені частини містять трансгенну вставку, фланковану послідовностями ЗЕО ІЮ МО-1 і 5ЕО
ІЮО МО:2). Даний винахід також включає не-тотипотентні клітини, що походять від будь-яких рослин, що розглядаються (включаючи клітини частин зазначених рослин, перерахованих вище).
Крім того, даний винахід включає потомство рослин і/або потомство рослин, вирощених з депонованого насіння, а переважно, насіння рослини сої, резистентного до гербіцидів, де зазначена рослина має геном, що містить описану тут геномну ДНК дикого типу/послідовність "стику" ДНК-вставки, що детектується. Використовуваний тут термін "соя" означає рослину
СіІусіпе тах і включає всі її сорти, які можуть бути виведені шляхом схрещування однієї рослини сої з іншою рослиною сої.
Даний винахід також включає способи одержання кросів з використанням рослини відповідно до винаходу як щонайменше одного батька. Так, наприклад, даний винахід включає
Е:-гібрид рослини, який включає як одного або двох батьків будь-які описані тут рослини. Даний винахід також стосується насіння, продукованого такими Е--гібридами відповідно до винаходу.
Даний винахід включає спосіб продукування насіння Е:-гібриду шляхом схрещування описаної тут рослини з іншою рослиною (наприклад, інбредним батьком) і збору отриманого гібридного насіння. Даний винахід включає описану тут рослину, яка є або жіночою батьківською рослиною, або чоловічою батьківською рослиною. Характеризація отриманих рослин може бути проведена більш ефективно після ретельного дослідження рослин-батьків.
Стійка до гербіцидів рослина сої відповідно до винаходу може бути виведена шляхом першого статевого схрещування першої батьківської рослини сої, вирощеної з насіння будь-якої із зазначених тут ліній, і другої батьківської рослини сої, з одержанням множини рослин- нащадків першої генерації; а потім відбору потомства першої генерації, яке є резистентним до гербіциду (або яке має щонайменше один з трансгенів відповідно до винаходу); самозапилення потомства першої генерації з продукуванням множини рослин-нащадків другої генерації; а потім відбору потомства другої генерації, яке є резистентним до гербіциду (або яке має щонайменше один з трансгенів відповідно до винаходу). Ці стадії можуть також включати зворотне схрещування рослини-нащадка першої генерації або рослини-нащадка другої генерації з другою батьківською рослиною сої або з третьою батьківською рослиною сої. Потім може бути засіяна культура сої, що містить насіння сої відповідно до винаходу або її потомства.
Слід також зазначити, що дві різних трансгенних рослини можуть бути також схрещені з одержанням потомства, що містить два доданих екзогенних гени, які незалежно сегрегуються.
Після самозапилення відповідного потомства можуть бути отримані рослини, що є гомозиготними по обох доданих екзогенних генах. Зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенною рослиною також розглядається як вегетативне розмноження. Інші методи схрещування, звичайно застосовувані для надання різних ознак і вирощування різних культур, відомі фахівцям. Схрещування при беккросуванні було використане для простого спадкування добре успадковуваної ознаки шляхом перенесення генів у потрібні гомозиготні сорти або інбредну лінію, яка є рекурентним батьком. Джерело переданої
Зо ознаки називають батьком-донором. Як і очікувалося, отримана рослина має ознаки рекурентного батька (наприклад, сорту), і ця бажана ознака передається від батька-донора.
Після першого схрещування відбирають рослини, які мають фенотип батька-донора, і ці рослини повторно схрещують (піддають зворотному схрещуванню) з рекурентним батьком. Як і очікувалося, отримана рослина має ознаки рекурентного батька (наприклад, сорту), і ця бажана ознака передається від батька-донора.
Молекули ДНК відповідно до винаходу можуть бути використані як молекулярні маркери у методі схрещування із застосуванням маркерів (МАВ). Молекули ДНК відповідно до винаходу можуть бути використані у методах із застосуванням маркерів (таких, як АРІ Р-, ВЕЇ Р-, ВАРБ-,
ЗМР- ії 55Е-маркери), які дозволяють ідентифікувати агрономічно цінні і генетично зчеплені ознаки, відомі фахівцям. Ознака резистентності до гербіцидів може бути простежена у потомства кросу, отриманого шляхом схрещування з рослиною сої відповідно до винаходу (або з їх потомством і будь-яким іншим сортом або іншим різновидом рослини сої) із застосуванням
МАВ-методів. Маркерами для зазначених ознак є молекули ДНК, і МАВ-методи, добре відомі фахівцям, можуть бути застосовані для простежування ознаки(ознак) резистентності до гербіцидів у рослин сої, де щонайменше одна лінія рослини сої відповідно до винаходу або її потомства є батьком або предком. Способи відповідно до винаходу можуть бути застосовані для ідентифікації рослини сої будь-якого сорту, що має трансген, що розглядається.
Способи відповідно до винаходу включають спосіб одержання стійкої до гербіцидів рослини сої, де зазначений спосіб включає інтрогресію генетичної події РОАВ8264.42.32.1 у рослину сої даного сорту. Більш конкретно, способи відповідно до винаходу можуть включати схрещування двох рослин відповідно до винаходу або однієї рослини відповідно до винаходу з будь-якою іншою рослиною. Переважні способи також включають відбір потомства зазначеного кросу шляхом аналізу зазначеного потомства на генетичну подію, яка детектується відповідно до даного винаходу. Так, наприклад, даний винахід може бути застосований для простежування генетичної події, що розглядається, у всіх циклах схрещування з рослинами, що мають інші бажані ознаки, такі, як агрономічні показники, протестовані у даному винаході у різних прикладах. Рослини, що містять розглянутий трансген і мають потрібну ознаку, можуть бути детектовані, ідентифіковані, відібрані і відразу використані, наприклад, в інших раундах схрещування. Трансген/ознака, що розглядається, може бути також об'єднаний(а) з бо ознакою(ами) резистентності до комах і/або з іншими ознаками стійкості до гербіцидів за допомогою схрещування і моніторингу такого трансгену/ознаки відповідно до даного винаходу.
Одним з варіантів останнього аспекту є рослина, що містить трансген, що розглядається, і ген, що кодує резистентність до гербіциду дикамби.
Таким чином, даний винахід може бути об'єднаний, наприклад, з додатковими ознаками, що кодують резистентність до гліфосату (наприклад, резистентність до рослинної або бактеріальної гліфосатоксидази (Б5ОХ)) і гліфосатацетилтрансферази (САТ); додатковими ознаками, що кодують резистентність до глюфозинату (наприклад, резистентність до біалафосу (раг)); ознаками, що надають резистентність до гербіциду, який інгібує ацетолактат-синтазу (АЇ 5) (наприклад, до імідазолінонів |гаких, як імазетапірі|, до сульфонілсечовин, сульфоаніліду триазолпіримідину, до піримідинілтіобензоатів і до інших хімічних речовин |С5гі, З!ИГА і т.п.|); ознаками резистентності до бромоксинілу (наприклад, Вхп); ознаками резистентності до гербіциду дикамби (див., наприклад, заявку на патент США 2003/0135879); ознаками резистентності до інгібіторів ферменту НРРО (4-гідроксифеніл-піруват-діоксигенази); ознаками резистентності до інгібіторів фітоендезатурази (РОБ); ознаками резистентності до гербіцидів, що інгібують фотосистему ІЇ (наприклад, р5БА); ознаками резистентності до гербіцидів, що інгібують фотосистему І; ознаками резистентності до гербіцидів, що інгібують протопорфіриногеноксидазу ІХ (РРО) (наприклад, РРО-1), і ознаками резистентності до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, СУР7БЄВ1І). Одна або більше таких ознак можуть бути об'єднані відповідно до даного винаходу з метою ефективного знищення, уповільнення і/або попередження поширення заносних бур'янів і/або надання резистентності до гербіцидів багатьох класів.
Для фахівця у даній галузі очевидно, що ген аай-12, використовуваний у даному винаході, також надає резистентність до сполук, що перетворюються у феноксіацетатауксинові гербіциди (наприклад, 2,4-ЮВ, МСОРВ і т.п.). Молекула масляної кислоти, присутня у гербіциді 2,4-О8В, перетворюється за допомогою В-окиснення у фітотоксичну 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту.
Аналогічним чином, МСРВ перетворюється за допомогою В-окиснення у фітотоксичну МСРА.
Гербіциди на основі бутанової кислоти самі по собі не є гербіцидними, але, за допомогою рД- окиснення у чутливих до них рослинах, вони можуть перетворюватися у відповідну кислоту з продукуванням гербіциду у формі оцтової кислоти, що є фітотоксичною. Гербіциди на основі бутанової кислоти не здійснюють шкідливого впливу на рослини, не здатні до швидкого Д- окиснення. Однак, рослини, що здатні до швидкого р-окиснення і можуть перетворювати гербіцид на основі бутанової кислоти у форму оцтової кислоти, згодом можуть бути захищені
ААр-12.
Методи застосування гербіцидів добре відомі фахівцям. Такі методи застосування можуть включати приготування резервуарної суміші з більш ніж одного гербіциду. Переважними гербіцидами, придатними для використання у даному винаході, є комбінації гербіцидів гліфосату, глюфозинату і феноксіауксину (таких, як 2,4-Ю0; 24-08; МСРА; МСРВ). Іншими переважними комбінаціями є суміші "гліфосат плюс 2,4-0" або "глюфозинат плюс 2,4-0".
Гербіциди цих трьох типів можуть бути використані у переважних комбінаціях, які, як очевидно, є найбільш переважними для здійснення даного винаходу. Один або більше з гербіцидів, що розглядаються, можуть бути внесені на поля/посівні площі перед їх засівом насінням відповідно до винаходу. Таке внесення може бути здійснене, наприклад, за 14 днів до посіву насіння відповідно до винаходу. Один або більше з гербіцидів, що розглядаються, можуть бути також внесені після посіву насіння, але до появи сходів. Один або більше з гербіцидів, що розглядаються, можуть бути також внесені у грунт (для знищення бур'янів) або нанесені на верхівку бур'янів і/або на верхівку трансгенних рослин відповідно до винаходу. Розглянуті три гербіциди можуть бути застосовані по черзі або вони можуть бути використані у комбінації, наприклад, для знищення або попередження росту бур'янів, які можуть бути стійкими до одного гербіциду, але не до іншого. Як очевидно фахівцям, у різних способах відповідно до винаходу, гербіциди розглянутих трьох типів можуть бути внесені у різний час.
Крім того, розглянутий трансген може бути зчеплений з однією або більше додатковими ознаками стійкості до гербіцидів, з однією або більше додатковими вихідними ознаками (наприклад, з резистентністю до комах, резистентністю до зараження грибами або стійкістю до стресів і т.п.) або з продуктивними ознаками (наприклад, з підвищеною врожайністю, з підвищеною маслянистістю, поліпшеною якістю волокна і т.п.), де ознаки обох типів є трансгенними і нетрансгенними. Таким чином, даний винахід може бути застосований для вирощування сільськогосподарських культур з повним набором поліпшених агрономічних ознак, таких, як якість культури, її пристосовуваність і економічний показник "витрати - ефективність боротьби з будь-якими шкідниками сільськогосподарських культур".
Методи інтеграції полінуклеотидної послідовності у специфічний сайт хромосоми рослинної клітини за допомогою гомологічної рекомбінації описані у літературі. Так, наприклад, сайт- специфічна інтеграція, описана у публікації патентної заявки Мо. 2009/0111188 АТ, включає використання рекомбіназ або інтеграз, які опосередковують введення донорної полінуклеотидної послідовності у хромосому мішені. Крім того, у міжнародній патентній заявці
Мо. МО 2008/021207 описана гомологічна рекомбінація, опосередковувана білками "цинкові пальці" і здійснювана для інтеграції однієї або більше донорних полінуклеотидних послідовностей у специфічні положення геному. Рекомбінази, такі, як РІ Р/ЕКТ, описані у патенті
США Мо. 6720475, або СЕЕЛ/Л ОХ, описані у патенті США Мо 5658772, можуть бути використані для інтеграції полінуклеотидної послідовності у специфічний сайт хромосоми. | нарешті, використання мегануклеаз для вбудовування донорних полінуклеотидів у специфічний сайт хромосоми було описане у публікації Рисніа еї аІ., РМАЗ ОА 93 (1996) рр. 5055-5060.
Фахівцям по суті відомі і ними застосовуються інші різні методи сайт-специфічної інтеграції у клітини рослин (Кипаг еї аї., Тгепавз іп Ріапі Зеї 6(4) (2001) рр. 155-159). Крім того, системи сайт- специфічної рекомбінації що були ідентифіковані у деяких прокаріотичних і нижчих еукаріотичних організмів, можуть бути використані й у рослинах. Прикладами таких систем є, але не обмежуються ними, система рекомбіназ К/К5 плазміди рокі! дріжджів гудозасспаготусез гоихії (Агакі еї аї. (1985) 9. Мої. Віої. 182: 191-203), і система біп/діх фагу Ми (Маєзег апа КаніІтапп (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 230: 170-176).
У деяких варіантах винаходу можуть виявитися бажаними інтеграція або зчеплення з новим(и) трансгеном(ами) безпосередньо близько від існуючої трансгенної вставки. Трансгенна вставка може розглядатися як переважний геномний локус, який був вибраний виходячи з унікальних ознак, таких, як єдиний інсерційний сайт, нормальна менделевська сегрегація і стабільна експресія, і переважна комбінація властивостей, включаючи стійкість до гербіциду і агрономічну продуктивність в окремо взятому й у різних інших географічних регіонах. Нові інтегровані трансгени повинні сприяти збереженню експресійних властивостей трансгенів у вже існуючих трансформантах. Крім того, оскільки вже були ідентифіковані геномні фланкуючі послідовності і положення нового інтегрованого трансгену, необхідно розробити аналізи для детектування і підтвердження нового інтегрованого трансгену. | нарешті, інтеграція нового трансгену у специфічне положення хромосоми, яке зчеплене з існуючим трансгеном, буде полегшувати інтрогресію трансгенів в інший генетичний фон за допомогою статевого ауткросингу із застосуванням стандартних методів схрещування.
У деяких варіантах винаходу може виявитися бажаним вирізання полінуклеотидних послідовностей з трансгенної вставки. Наприклад, вирізання трансгену, описане у попередній заявці на патент США Мо. 61/297628, здійснюють з використанням нуклеаз "цинкові пальці" для видалення полінуклеотидної послідовності, що складається з генного експресійного кластера, з інтегрованої у хромосому трансгенної вставки. Полінуклеотидною послідовністю, що видаляється, може бути селективний маркер. Після вирізання і видалення полінуклеотидної послідовності, модифікована трансгенна вставка може бути знову вбудована шляхом інсерції полінуклеотидної послідовності. Вирізання полінуклеотидної послідовності і подальше повторне вбудовування модифікованої трансгенної вставки надає певні переваги, такі, як можливість повторного використання селективного маркера або попередження непередбачених замін у транскриптомі рослини, які можуть відбуватися у результаті експресії специфічних генів.
У даному винаході описаний специфічний сайт на хромосомі 15 у геномі сої, який є особливо придатним для вбудовування в нього гетерологічних нуклеїнових кислот. У даному винаході описані 5'і-фланкуюча послідовність і 3'і'-фланкуюча послідовність, які можуть бути також використані для ідентифікації і/або визначення локалізації сайта інсерції/приєднання на хромосомі 15. Таким чином, даний винахід стосується способів введення гетерологічних нуклеїнових кислот, що представляють інтерес, у попередньо визначений сайт-мішень або в область, розташовану поблизу від цього сайта-мішені. Даний винахід також охоплює насіння сої іабо рослину сої, що містять будь-яку гетерологічну нуклеотидну послідовність, вбудовану в описаний тут сайт-мішень або у звичайне оточення цього сайта. Одним із засобів досягнення такої націленої інтеграції є вирізання і/або введення іншої вставки замість описаного тут раї- експресуючого кластера. Говорячи в цілому, у даному винаході може бути застосований будь- який метод, яким є, наприклад, але не обмежується ним, направлена гомологічна рекомбінація.
Використовуваний тут термін "зчеплення" трансгену або ознаки означає об'єднання бажаних ознак в одній трансгенній лінії. Селекціонери здійснюють зчеплення трансгенних ознак за допомогою схрещування батьків, кожний з яких має одну з потрібних ознак, а потім ідентифікують потомство, яке має обидві ці потрібні ознаки. Іншим способом зчеплення генів є бо перенесення двох або більше генів в ядро клітини-рослини під час трансформації. Іншим способом зчеплення генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим геном, що представляє інтерес. Так, наприклад, зчеплення генів може бути застосоване для об'єднання двох або більше різних ознак, включаючи, наприклад, дві або більше різні ознаки, наприклад, резистентність до комах і резистентність до хвороб, а також дві або більше ознаки резистентності до гербіцидів, і/або ознаку(и) резистентності до комах і ознаку(и) резистентності до гербіцидів. Крім використання гена, що представляє інтерес, при "зчепленні генів", крім гена, що представляє інтерес, можна також використовувати селективний маркер.
Використовуваний тут термін "гомологічна рекомбінація" означає реакцію між будь-якою парою нуклеотидних послідовностей, що мають відповідні сайти, які містять аналогічні нуклеотидні послідовності, за допомогою яких дві нуклеотидних послідовності можуть взаємодіяти (піддаватися рекомбінації) з утворенням нової послідовності рекомбінантної ДНК.
Сайти кожної з аналогічних нуклеотидних послідовностей називаються тут "гомологічними послідовностями". Говорячи в цілому, частота гомологічної рекомбінації зростає у міру збільшення довжини гомологічної послідовності. Таким чином, якщо гомологічна рекомбінація спостерігається між двома нуклеотидними послідовностями, що мають менший ступінь ідентичності, то частота (або ефективність) рекомбінації знижується у міру збільшення дивергентності цих двох послідовностей. Рекомбінація може бути здійснена з використанням однієї гомологічної послідовності на кожного донора і молекулу-мішень, у результаті чого може бути отриманий продукт рекомбінації "простого кросинговеру". Альтернативно, дві гомологічні послідовності можуть знаходитися на кожній з нуклеотидних послідовностей мішені і донора.
Рекомбінація між двома гомологічними послідовностями на донорі і двома гомологічними послідовностями на мішені призводить до одержання продукту рекомбінації "подвійного кросинговеру". Якщо гомологічні послідовності на донорній молекулі фланкують послідовність, що піддається модифікації (наприклад, послідовність, що представляє інтерес), то рекомбінація за допомогою подвійного кросинговеру з молекулою-мішенню буде призводити до утворення продукту рекомбінації в якому послідовність, що представляє інтерес, буде заміняти послідовність ДНК, яка спочатку знаходилася між гомологічними послідовностями на молекулі- мішені. Обмін послідовностями ДНК між мішенню і донором, що відбувається у результаті події рекомбінації з подвійним кросинговером, називається "заміною послідовностей".
Зо Розглянута трансгенна рослина здатна до трансгенної експресії трьох різних білків, які мають стійкість до гербіцидів, що призводить до розвитку стійкості до комбінацій гербіцидів, які можуть знищувати майже всі широколисті і трав'янисті бур'яни. Ці експресійний кластер/трансгенна вставка, що мають ознаку стійкості до багатьох гербіцидів, можуть бути зчеплені, наприклад, з іншими ознаками стійкості до гербіцидів (наприклад, резистентності до гліфосату, резистентності до глюфозинату, резистентності до імідазолінону, резистентності до дикамби, резистентності до НРРО, резистентності до бромоксинілу і т.п.), Її з ознаками резистентності до комах (такими як СтуїЕ, СтуіАб, СтутАс, СтуЗ4/45, Сту!Ве, СтуїЇСа, Сту!ба,
СтуїЕа, Стуї Ра, інсектицидні білки вегетативної системи ("МІР5"), включаючи МІРЗА і т.п.). Крім того, білки стійкості до гербіцидів, які є присутніми в експресійному кластері/трансгенній вставці відповідно до винаходу, можуть служити як один або більше селективних маркерів 510, що полегшують відбір первинних трансформантів рослин, генетично сконструйованих з використанням другого гена або групи генів.
Ці комбінації ознак були покладені в основу розробки нових способів боротьби з бур'янами різних видів (і т.п.-), що було продиктовано набуттям цими бур'янами резистентності до гербіцидів або їх природною стійкістю до цих гербіцидів (наприклад, до гліфосату). Таким чином, нові способи боротьби з бур'янами, здійснювані з використанням генетичної події рорАВ8264.42.32.1, входять в обсяг даного винаходу.
Надання культурам трансгенних ознак, що розглядаються, взятих як у комбінації, так і окремо, дозволяє здійснювати боротьбу з іншими культурами-самосівами, стійкими до гербіцидів, де зазначені культури не містять генів, що надають стійкість до фенокси-гербицидів, піридилокси-гербицидів, гліфосатних і/або глюфозинатних гербіцидів.
Переважні рослини або насіння відповідно до винаходу містять у своєму геномі ідентифіковані тут послідовності-вставки разом щонайменше з 20-500 або більше суміжними фланкуючими нуклеотидами, які знаходяться на обох сторонах вставки, як описано у даній заявці Якщо це не обговорено особливо, то термін "фланкуючі послідовності" означає послідовності, ідентифіковані у БЕО ІЮ МО і БЕО ІО МО:2. І у цьому випадку трансгенами, що розглядаються, є гетерологічні ДНК, вбудовані між фланкуючими геномними послідовностями, що розглядаються, розташованими безпосередньо близько від вбудованої ДНК. Як і очікувалося, усі ці фланкуючі послідовності або їх частини можуть передаватися потомству, яке буде мати вбудовану ДНК завдяки статевому схрещуванню з батьківською лінією, яка включає зазначений трансген.
Даний винахід включає тканинні культури клітин, що регенеруються, рослини відповідно до винаходу. Даний винахід також включає рослину, яка регенерується із зазначеної тканинної культури, а зокрема, рослину, що має здатність експресувати всі морфологічні і фізіологічні ознаки репрезентативного сорту. Переважні рослини відповідно до винаходу мають усі фізіологічні і морфологічні ознаки рослини, вирощеної з депонованого насіння. Даний винахід також включає потомство такого насіння і насіння, що має якісні ознаки, які представляють інтерес.
Модифікації (такі, як мутація, а також трансфекція і схрещування) рослин або їх насіння або частин, дозволяють виводити сорти, які можуть бути названі "по суті, виведеними" сортами.
Міжнародна Організація з захисту нових сортів рослин (ШРОМ) представила наведене нижче керівництво, що дозволяє визначити, чи є даний сорт по суті виведеним із захищеного сорту:
ІАЇ Цей сорт, за припущенням, повинен бути, по суті виведеним з іншого сорту ("батьківського сорту"), якщо: () він переважно виведений з батьківського сорту або з сорту, який сам переважно виведений з батьківського сорту, але при цьому зберігає основні властивості, характерні для генотипу або комбінації генотипів батьківського сорту; (ії) він явно відрізняється від батьківського сорту; і (ії) за винятком відмінностей, які є результатом дериватизації, він відповідає батьківському сорту за основними ознаками, характерними для генотипу або комбінації генотипів батьківського сорту.
Документ ОРОМ, підготований Відомством США, був прийнятий на Шостій конференції за участю Міжнародних організацій, що проходила у Женеві 30 жовтня 1992 р.
Використовуваний тут термін "лінія" означає групу рослин, які мають незначні відмінності між собою щонайменше за однією ознакою або взагалі не мають родових відмінностей. Такі лінії можуть бути створені у результаті самозапилення і схрещування декількох поколінь, або вегетативного розмноження з одного батька із застосуванням методів культивування тканин або клітин.
Зо Використовувані тут терміни "сорт" і "різновид" є синонімами і означають лінію, використовувану у промисловому виробництві.
Терміни "стабільність" або "стабільний", якщо вони стосуються даного компонента, означають, що даний компонент зберігається від покоління до покоління, а переважно, щонайменше по трьох поколіннях, в основному, на тому самому рівні, наприклад, переважно, 15 95, більш переважно, «10 95, а найбільш переважно, 5 95. Стабільність може залежати від температури, регіону, стресу і часу посіву. Наступні покоління, вирощені у польових умовах, повинні продукувати цей компонент на аналогічному рівні.
Термін "комерційна цінність" рослини означає, що дана рослина має хорошу схожість і високу фертильність, що дозволяє фермерам вирощувати цю культуру на фермах зі стандартним сільськогосподарським обладнанням, а олія з описаними тут компонентами може бути екстрагована з насіння на стандартному обладнанні для помелу та екстракції. Дана культура вважається комерційно цінною, якщо її врожайність, що визначається за масою насіння, вміст олії і загальна кількість олії, отримана на один акр, складає у межах 15 95 від середньої врожайності якого-небудь іншого порівнянного комерційного сорту сої, який не має яких-небудь інших цінних ознак, характерних для даного регіону.
Термін "агрономічно елітний" стосується лінії, яка має бажані агрономічні властивості, такі, як висока врожайність, зрілість, резистентність до хвороб і т.п., а також стійкість до гербіцидів, що надаються трансформанту(ам), що розглядається(ються). Агрономічні ознаки, взяті окремо або у будь-якій комбінації, як описано нижче у прикладах для рослини, що містить трансген відповідно до винаходу, входять в обсяг даного винаходу. Будь-які і всі описані агрономічні ознаки і контрольні точки можуть бути використані для ідентифікації таких рослин або у вигляді оцінного бала, або будь-якої граничної точки або обох граничних точок інтервалу значень, використовуваних для визначення властивостей таких рослин.
Як буде очевидно з даного опису, переважні варіанти наборів для детектування можуть, наприклад, включати зонди і/або праймери, зв'язані з "послідовностями стику" або "послідовностями транзиції" і/або такі, що містять "послідовності стику" або "послідовності транзиції" (де геномна фланкуюча послідовність сої приєднана до послідовності вставки). Так, наприклад, ці набори включають полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, сконструйовані для ідентифікації однієї або обох послідовностей стику (де вставка приєднана бо до фланкуючої послідовності), як показано у таблиці 1. Однією зі стандартних конструкцій є конструкція, яка має один праймер, що гібридизується у фланкуючій області, і один праймер, що гібридизується у вставці. Такі праймери звичайно мають довжину щонайменше 15 залишків.
При такому розташуванні, праймери можуть бути використані для генерування/ампліфікації амплікону, що детектується, який вказує на присутність трансгену відповідно до винаходу. Ці праймери можуть бути використані для генерування амплікону, що охоплює (і включає) послідовність стику, зазначену вище.
Праймер(и), "що приєднується(ються)" до фланкуючої послідовності, звичайно не гібридизуєтся(ються) в області, що знаходиться за межами приблизно 200 основ або за межами області стику. Таким чином, типові фланкуючі праймери повинні бути сконструйовані так, щоб вони містили щонайменше 15 залишків будь-якого ланцюга у межах 200 основ у фланкуючих послідовностях від початку вставки. Тобто, праймери, що містять послідовність відповідного розміру, що складається із залишків (або гібридизується з ними) в області, що складає у межах від 100 до 200-500 основ або т.п., і починається від будь-якої з послідовностей стику або обох послідовностей стику, ідентифікованих вище, також входять в обсяг даного винаходу.
Аналогічним чином, праймери вставки можуть бути сконструйовані у будь-якій ділянці вставки, однак, залишки на цій вставці (включаючи комплемент), яка знаходиться в області, що складає у межах від 100 до 200-500 або т.п. основ, і починається від послідовності(ей) стику, ідентифікованої(их) вище, можуть бути використані, наприклад, для конструювання кожного праймера без винятку.
Для фахівця у даній галузі також очевидно, що праймери і зонди можуть бути сконструйовані для гібридизації, у стандартних умовах гібридизації і/або ПЛР-умовах, з сегментами представлених тут послідовностей (або їх комплементів), де зазначений праймер або зонд не є повністю комплементарним репрезентативній послідовності. Тобто, у даному випадку може бути допустима певна міра невідповідності. Що стосується праймера, що складається приблизно з 20 нуклеотидів, то, звичайно, наприклад, один, два або т.п. нуклеотидів необов'язково будуть зв'язуватися з протилежним ланцюгом, якщо помилково спарена основа знаходиться всередині або на кінці праймера, протилежного амплікону. Різні придатні умови гібридизації наводяться нижче. Як зонди можуть бути також використані синтетичні нуклеотидні аналоги. Можуть бути також використані пептид-вмісні нуклеїновокислотні зонди (РМА), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо зазначити, що такі зонди і праймери (які здатні ідентифікувати і диференціювати унікальні ознаки) можуть бути використані у діагностичних аналізах на присутність трансгену відповідно до винаходу.
Слід зазначити, що при ПЛР-ампліфікації можуть виникати помилки, які можуть давати, наприклад, незначні помилки при секвенуванні. Тобто, якщо це не обговорено особливо, описані тут послідовності були визначені шляхом конструювання довгих ампліконів, які походять від геномних ДНК сої, з подальшим клонуванням і секвенуванням цих ампліконів. Тому не дивно, що у послідовностях, отриманих і визначених таким способом, можуть бути виявлені незначні відмінності і деякі невідповідності, якщо взяти до уваги необхідність проведення множини раундів ампліфікації для одержання амплікону, достатнього для секвенування геномних ДНК. Слід зазначити і взяти до уваги, що будь-які уточнення, необхідні для виправлення помилок або невідповідностей такого типу, що звичайно виникають при секвенуванні, входять в обсяг даного винаходу.
Слід також зазначити, що деякі геномні послідовності нерідко є делетованими, наприклад, при вбудовуванні послідовності у процесі створення трансгену. Таким чином, між розглянутими фланкуючими послідовностями і геномними послідовностями, наявними, наприклад, у базі даних СЕМВАМК, можуть спостерігатися деякі відмінності.
Компоненти "вставки" представлені на фігурах і більш докладно обговорюються нижче у прикладах. Полінуклеотидні послідовності ДНК цих компонентів або їх фрагменти можуть бути використані як ДНК-праймери або зонди у способах відповідно до винаходу.
У деяких варіантах винаходу зазначені композиції і способи застосовуються для детектування присутності трансгенної/геномної області вставки у рослинах сої та у її насінні і т.п. Даний винахід стосується послідовностей ДНК, що містять описану тут трансгенну/геномну послідовність стику в області вставки; сегменти, що містять ідентифіковану тут послідовність стику, і комплементи будь-яких зазначених репрезентативних послідовностей і будь-яких їх сегментів. Послідовність стику області вставки охоплює послідовність стику, розташовану між гетерологічною ДНК, вбудованою у геном, і ДНК, що є присутньою у клітинах рослини сої і фланкує інсерційний сайт. Такі послідовності дозволяють діагностувати даний трансген.
На основі цих послідовностей вставки і граничних послідовностей можуть бути сконструйовані праймери, специфічні для даного трансгену. ПЛР-аналіз показав, що лінії бо рослини сої відповідно до винаходу можуть бути ідентифіковані на різні генотипи сої шляхом проведення аналізу ПЛР-ампліконів, отриманих з використанням наборів цих праймерів, специфічних для даного трансгену. Ці та інші споріднені методи можуть бути застосовані для ідентифікації унікальних властивостей цих ліній рослини сої. Таким чином, ПЛР-амплікони, що походять від зазначених пар праймерів, є унікальними і можуть бути використані для ідентифікації зазначених ліній рослини сої.
У деяких варіантах винаходу послідовності ДНК, що містять суміжний фрагмент нового трансгену/геномної області вставки, також є аспектом даного винаходу. Даний винахід включає послідовності ДНК, що містять полінуклеотидну послідовність трансгенної вставки достатньої довжини, що походить від однієї або більше вказаних вище рослин сої, і/або послідовності, що можуть служити як праймерні послідовності для продукування продукту-амплікону, використовуваного для ідентифікації однієї або більше цих рослин сої.
Споріднені варіанти винаходу стосуються послідовностей ДНК, що містять щонайменше 2, 3,4,5,6, 7, 8,9, 10,11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжних нуклеотидів трансгенної частини ідентифікованої тут послідовності ДНК або її комплементу, і фланкуючу послідовність ДНК сої аналогічної довжини (таку як ЗЕО ІЮ МО:1 і 5ЕО ІО МО2 і їх сегменти), що походить від зазначених послідовностей або їх комплементів. Такі послідовності можуть бути використані як ДНК-праймери у методах ампліфікації ДНК. Амплікони, продуковані з використанням цих праймерів, дозволяють ідентифікувати будь-які описані тут генетично модифіковані рослини сої. Тому даний винахід також включає амплікони, продуковані з використанням таких ДНК-праймерів і гомологічних праймерів.
Даний винахід також включає способи детектування присутності ДНК у зразку, що відповідає описаному тут трансгену сої. Такі способи можуть включати: (а) контактування зразка, що містить ДНК, з набором праймерів, які, при їх використанні у реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з ДНК, що походить щонайменше від одного з цих трансгенів сої, продукують амплікон, що дозволяє ідентифікувати зазначений(і) трансген(и); (Б) здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням амплікону, і (с) детектування амплікону.
Інші способи детектування відповідно до винаходу включають спосіб детектування присутності ДНК у зразку, що відповідає зазначеному трансгену, де зазначений спосіб включає: (а) контактування зразка, що містить ДНК, із зондом, який гібридизується у жорстких умовах гібридизації з ДНК, що походить щонайменше від одного із зазначених трансгенів сої, і який не гібридизується у жорстких умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини сої (яка не містить
ДНК-вставку, що представляє інтерес, ); (5) гібридизацію зразка і зонда у жорстких умовах; і (с) детектування гібридизації зонда з ДНК.
В інших своїх варіантах даний винахід включає способи одержання рослини сої, що містить генетичну подію рорАВ8264.42.32.1, де зазначений спосіб включає стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської лінії сої (яка містить експресійні кластери відповідно до винаходу, що надають рослинам зазначеної лінії ознаку резистентності до гербіцидів) з другою батьківською лінією сої (не має такої ознаки стійкості до гербіцидів) з одержанням множини потомства рослини; і (Б) відбір потомства рослини з використанням молекулярних маркерів. Такі способи можуть включати, але необов'язково, додаткову стадію зворотного схрещування потомства рослини з другою батьківською лінією сої з одержанням чистосортної рослини сої, яка має зазначену ознаку стійкості до гербіцидів.
Відповідно до іншого свого аспекту, даний винахід стосується способів визначення зиготності потомства кросів із зазначеним трансгеном. Такі способи можуть включати контактування зразка, що містить ДНК сої, з набором праймерів відповідно до винаходу.
Зазначені праймери, при їх використанні у реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною
ДНК, що походить щонайменше від однієї із зазначених трансгенних рослин сої, продукують перший амплікон, що дозволяє ідентифікувати щонайменше один із зазначених трансгенів сої.
Такі способи також включають здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з продукуванням першого амплікону; детектування першого амплікону і контактування зразка, що містить ДНК сої, із зазначеним набором праймерів (зазначений набір праймерів, якщо він використовується у реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК рослин сої, продукує другий амплікон, що містить нативну геномну ДНК сої, гомологічну геномній області сої); і здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з продукуванням другого амплікону.
Зазначені способи також включають детектування другого амплікону і порівняння першого і другого ампліконів у зразку, де присутність обох ампліконів вказує на те, що даний зразок є гетерозиготним по трансгенній вставці.
Набори для детектування ДНК можуть бути розроблені із застосуванням описаних тут композицій і методів, добре відомих фахівцям у галузі детектування ДНК. Ці набори є бо придатними для ідентифікації ДНК-вставки, що розглядається, у зразку рослини сої і можуть бути застосовані у методах схрещування рослин сої, що містять цю ДНК. Зазначені набори містять послідовності ДНК, які є гомологічними або комплементарними ампліконам, наприклад, описаним у даній заявці, або послідовності ДНК, які є гомологічними або комплементарними
ДНК, що міститься у трансгенних генетичних елементах розглянутих трансформантів. Ці послідовності ДНК можуть бути використані у реакціях ампліфікації ДНК або як зонди у методі гібридизації ДНК. Зазначені набори можуть також містити реагенти і матеріали, необхідні для здійснення методу детектування. "Зонд" являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана стандартна мітка, що детектується, або репортерна молекула (наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент). Такий зонд комплементарний ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені, а у випадку даного винаходу, ланцюгу геномної ДНК, що походить від одного із зазначених трансформантів сої, незалежно від того, походять вони від рослини сої або зразка, що включає ДНК трансформанта. Зондами відповідно до винаходу є не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також і поліаміди й інші матеріали, що специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і можуть бути використані для детектування присутності цієї послідовності ДНК-мішені. Термін "виділений" полінуклеотид означає, що даний полінуклеотид знаходиться не в тому стані, в якому він звичайно присутній у природі, а функціонально приєднаний, наприклад, до гетерологічного промотору. Аналогічним чином, термін "очищений" білок означає білок, що не знаходиться у своєму природному стані. "Праймери" являють собою виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які були піддані відпалу з комплементарним ланцюгом ДНК-мішені за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду "праймер - ланцюг ДНК-мішені" і з подальшим подовженням ланцюга ДНК- мішені під дією полімерази, наприклад, ДНК-полімерази. Пари праймерів відповідно до винаходу можуть бути використані для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або із застосуванням інших стандартних методів ампліфікації нуклеїнових кислот.
Зонди і праймери звичайно мають довжину в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, АТ, 42, 43, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
Зо 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189,190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 216, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, А11, 412, 413, А14, 415, 416, 417, А18, 419, 420, 421, 422, А23, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, А73, 474, 475, 476, 477,478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 полінуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню за допомогою гібридизації в умовах високої жорсткості. Переважно, зонди і праймери відповідно до винаходу мають послідовності, повністю ідентичні послідовності-мішені, і зонди, які відрізняються від послідовності-мішені і зберігають здатність гіобридизуватися з послідовностями-мішенями, можуть бути сконструйовані стандартними методами.
Методи одержання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, у керівництві
Моїесшіаг Сіопіпд: А ІГарогаїюгу Мапаиаї, 2па ед., мої. 1-3, єд. затьгоок еї аї., Соїд Зргіпуд Нагрог
І арогагогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, М.У., 1989. Пари ПЛР-праймерів можуть бути отримані з відомої послідовності, наприклад, з використанням комп'ютерних програм, розроблених для цієї мети.
Праймери і зонди, отримані на основі описаних тут фланкуючих послідовностей ДНК і послідовностей вставки, можуть бути використані для підтвердження (і якщо це необхідно, для корекції) описаних послідовностей стандартними методами, наприклад, шляхом повторного клонування і секвенування таких послідовностей.
Нуклеїновокислотні зонди і опраймери відповідно до винаходу гсгібридизуються з послідовністю ДНК мішені у жорстких умовах. Для детектування присутності ДНК трансгенної вставки у зразку може бути застосований стандартний метод гібридизації нуклеїнових кислот або метод ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнової кислоти або їх фрагменти здатні специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнової кислоти у визначених умовах. Вважається, що дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо ці дві молекули утворюють антипаралельну структуру двохланцюжкової нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти "комплементарна" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо ці молекули мають повну комплементарність. Вважається, що молекули є "повністю комплементарними", якщо кожний нуклеотид однієї з цих молекул комплементарний нуклеотиду іншої молекули. Дві молекули вважаються "мінімально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною, але при цьому зберігати стабільність, достатню для їх гібридизації одна з одною щонайменше у стандартних умовах "низької жорсткості". Аналогічним чином, вважається що молекули є "комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною, але при цьому зберігати стабільність, достатню для їх гібридизації одна з одною щонайменше у стандартних умовах "високої жорсткості".
Стандартні умови жорсткості описані у керівництві Затрьгоок еї аї., 1989. Тому, відхилення від повної комплементарності припустиме, якщо таке відхилення не буде призводити до абсолютної нездатності молекул утворювати двохланцюжкову структуру. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти могла служити як праймер або зонд, необхідно тільки, щоб вона була у достатній мірі комплементарна послідовності, здатній утворювати стабільну двохланцюжкову структуру у присутності конкретного розчинника та у присутності солі у визначеній концентрації.
Зо Використовуваний тут термін "по суті, гомологічна послідовність" означає послідовність нуклеїнової кислоти, що специфічно гібридизується з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, з яким вона гібридизується в умовах "високої жорсткості". Термін "жорсткі умови" функціонально визначені з погляду гібридизації нуклеїновокислотного зонда з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто, з конкретною послідовністю, що представляє інтерес, нуклеїнової кислоти), проведеної відповідно до процедури специфічної гібридизації, обговорюваної у керівництві Затьгоок еї аї., 1989, аї 9.52-9.55. Див. також, затюогоок еї аї., 1989 аї 9.47-9.52 апа 9.56-9.58. Відповідно до цього, нуклеотидні послідовності відповідно до винаходу можуть бути використані відповідно до їх здатності селективно утворювати дуплексні молекули з комплементарними фрагментами ДНК.
В залежності від мети застосування, умови гібридизації можуть варіювати для досягнення різних ступенів селективності зонда відносно послідовності-мішені. У тих випадках, коли потрібна висока селективність, звичайно використовуються відносно жорсткі умови утворення гібридів, наприклад, у випадку проведення аналізу ТАОМАМ у кінцевій точці і ПЛР у реальному часі, слід використовувати МОуСі» у концентрації від 1,5 мМ і приблизно до 4,0 мМ при температурі приблизно 60-752С, при цьому, для підвищення жорсткості, час утримання може варіювати, як описано у даній заявці. В інших методах гібридизацію звичайно проводять з використанням відносно низьких концентрацій солі і/або при високій температурі, наприклад, в іншому випадку концентрація МаСі може складати приблизно від 0,02М до 0,15М Масі, а температура може складати приблизно від 50 "С до 70 "С. Жорсткі умови, наприклад, можуть включати щонайменше 2-разове промивання гібридизаційного фільтра промивальним буфером високої жорсткості (0,2х552, 0,1 95 ДСН, 65 С). Відповідні умови жорсткості, що стимулюють гібридизацію ДНК, наприклад, обробка 6,0х хлоридом натрію/цитратом натрію (5552) приблизно при 45 "С, з подальшим промиванням 2,0х5552 при 50 "С, відомі фахівцям у даній галузі. Так, наприклад, концентрація солі у стадії промивання може бути вибрана з концентрацій солі, звичайно використовуваних в умовах низької жорсткості, а саме, приблизно 2,0х5552 при 50 "С, і концентрацій солі, звичайно використовуваних в умовах високої жорсткості, а саме, приблизно 0,2х55С02 при 50 "С. Крім того, температура у стадії промивання, яка в умовах низької жорсткості складає приблизно 22 "С, тобто кімнатна температура, може бути підвищена до температури гібридизації в умовах високої жорсткості, тобто приблизно до 65 "С. Температура і концентрація бо солі можуть варіювати або один з цих параметрів може залишатися постійним, а інший може змінюватися. При таких селективних умовах можуть спостерігатися незначні невідповідності, якщо вони взагалі є, між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню. Детектування послідовностей ДНК за допомогою гібридизації добре відоме фахівцям і репрезентативні методи аналізів за допомогою гібридизації описані у патентах США МоМо 4965188 і 5176995.
В особливо переважному варіанті винаходу нуклеїнова кислота відповідно до винаходу може специфічно гібридизуватися з одним або більше проілюстрованими або описаними тут праймерами (або ампліконами, або іншими послідовностями), включаючи комплементи і їх фрагменти, в умовах високої жорсткості. В одному з аспектів даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу має послідовність нуклеїнової кислоти, представлену тут в одній з репрезентативних послідовностей, або її комплементи і/або фрагменти.
В іншому аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу має послідовність, яка на 80-10095 або 90-10095 ідентична зазначеним послідовностям нуклеїнової кислоти. В іншому аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти відповідно до винаходу має послідовність, що на 95-100 95 ідентична зазначеній послідовності нуклеїнової кислоти. Такі послідовності можуть бути використані як маркери у методах схрещування рослин для ідентифікації потомства генетичних кросів.
Гібридизація зонда з молекулою ДНК-мішені може бути детектована будь-якими методами, відомими фахівцям, і такими методами можуть бути, але не обмежуються ними, методи, здійснювані з використанням флуоресцентних міток, радіоактивних міток, міток на основі антитіл і хемілюмінесцентних міток.
Що стосується ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені (наприклад, за допомогою ПЛР), що проводиться з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, термін "жорсткі умови" означає умови, що дозволяють парі праймерів гібридизуватися тільки з послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, з якою може зв'язуватися праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), і переважно, продукувати унікальний продукт ампліфікації, тобто, амплікон.
Термін "специфічний до (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизуються у жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню у зразку, що містить таку послідовність-мішень.
Використовувані тут терміни "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означають продукт ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, яка є частиною нуклеїновокислотної матриці. Так, наприклад, для того, щоб визначити, чи може рослина сої, отримана у результаті статевого схрещування, містити трансгенну геномну ДНК рослини сої відповідно до винаходу,
ДНК, екстрагована зі зразка тканини рослини сої, може бути піддана ампліфікації нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, що включає праймер, що походить від фланкуючої послідовності, яка присутня у геномі рослини і знаходиться поблизу від інсерційного сайта вбудованої гетерологічної ДНК, і другий праймер, що походить від вбудованої гетерологічної
ДНК, у результаті чого може бути отриманий амплікон, що може бути використаний для детектування присутності трансгенної ДНК. Амплікон має довжину і послідовність, які також є придатними для детектування такого трансгену. Довжина амплікону може варіювати у межах від загальної довжини пар праймерів плюс одна пара нуклеотидних основ, і/або загальної довжини пар праймерів плюс приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, зЗ2г3, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, (510) 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382,
383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, А15, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, АЗ0, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, А75, А76, А77, 478, 479, А80, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар нуклеотидних основ (ж будь-які з перерахованих вище збільшень). Альтернативно, пара праймерів може походити від фланкуючої послідовності, розташованої на обох сторонах вбудованої ДНК, у результаті чого може продукуватися амплікон, що включає повнорозмірну нуклеотидну послідовність вставки. Один з членів пари праймерів, що походить від геномної послідовності рослини, може знаходитися на визначеній відстані від вбудованої послідовності ДНК. Така відстань може включати інтервал від однієї пари нуклеотидних основ і приблизно до двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. У використовуване тут поняття терміну "амплікон", зокрема, не входять димери праймерів, які можуть утворюватися у реакції термоампліфікації ДНК.
Ампліфікація нуклеїнової кислоти може бути здійснена будь-яким з різних методів ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомих фахівцям, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Фахівцям відомі різні методи ампліфікації і ці методи описані, іпіег аа, у патенті США Мо. 4683195 та у патенті США Мо 4683202. Методи ПЛР-ампліфікації були розроблені для ампліфікації геномної ДНК довжиною до 22 т.п.н. Ці методи, а також інші методи ампліфікації
ДНК, відомі фахівцям, можуть бути застосовані для практичного здійснення даного винаходу.
Послідовність гетерологічної трансгенної ДНК-вставки або фланкуюча геномна послідовність трансформанта сої, що розглядається, можуть бути підтверджені (і скориговані, якщо це необхідно) шляхом ампліфікації таких послідовностей, що походять від зазначеного трансформанта, з використанням праймерів, які походять від описаних тут послідовностей, з подальшим проведенням стандартного секвенування ПЛР-амплікону або клонованої ДНК.
Амплікон, отриманий такими методами, може бути детектований різними способами.
Найбільш добре відомим методом детектування ДНК-ампліконів є електрофорез в агарозному гелі і забарвлювання етидійбромідом. Іншим таким методом є генетичний елементний аналіз,
Зо де сконструйований ДНК-олігонуклеотид перекривається із суміжною фланкуючою послідовністю геномної ДНК і з вбудованою послідовністю ДНК. Цей олігонуклеотид іммобілізують на ямках мікротитраційного ямкового планшета. Після ПЛР області, що представляє інтерес (яка проводиться з використанням одного праймера у вбудованій послідовності і одного опраймера у суміжній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий ПЛР-продукт може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і може служити як матриця для проведення реакції подовження на одну основу з використанням
ДНК-полімераз і мічених ЗаМТР, специфічних до передбачуваної наступної основи. Зчитування може бути здійснене за допомогою флуоресцентного або ЕГІЗА-аналізу. Сигнал вказує на присутність вставки/фланкуючої послідовності, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу.
Іншим методом є метод піросеквенування, описаний Умпде (Іппом. Рпапта. Тесп. 00: 18-24, 2000). У цьому методі сконструйований олігонуклеотид перекривається з суміжною геномною
ДНК ії з послідовністю стику ДНК-вставки. Олігонуклеотид піддають гібридизації з одноланцюжковим ПЛР-продуктом області, що представляє інтерес (яка проводиться з використанням одного праймера у вбудованій послідовності і одного праймера у фланкуючій геномній послідовності), та інкубують у присутності ДНК-полімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'-фосфосульфату і люциферину. Потім окремо додають ОМТР, і таке додавання призводить до продукування світлового сигналу, що детектується. Світловий сигнал вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ.
Іншим методом, який може бути застосований для детектування амплікону відповідно до винаходу, є поляризація флуоресценції. У цьому методі конструюють олігонуклеотид, що перекривається з геномною фланкуючою послідовністю і з послідовністю стику ДНК-вставки.
Олігонуклеотид піддають гібридизації з одноланцюжковим ПЛР-продуктом області, що представляє інтерес (яка проводиться з використанням одного праймера у вбудованій ДНК і одного праймера у фланкуючій геномній послідовності ДНК), та інкубують у присутності ДНК- полімерази і флуоресцентно міченого ЗаАМТР. Подовження на одну основу призводить до включення ЯамМТР. Таке включення може бути визначене за зміною поляризації на флуориметрі.
Зміна поляризації вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності, що бо свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу.
ТАОМАМ (РЕ Арріїей Віозувзіет5, Еовієг Сйу, Саїйї.) являє собою метод детектування присутності ДНК і кількісної оцінки послідовності ДНК. Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, що перекривається з геномною фланкуючою послідовністю і з послідовністю стику ДНК-вставки. Зонд ЕКЕТ і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій послідовності ДНК і один у фланкуючій геномній послідовності) піддають реакції циклізації у присутності термостабільної полімерази і аМТР. У процесі специфічної ампліфікації, ДНК- полімераза Тад гідролізується, у результаті чого з молекули, що гасить, на зонді ЕКЕТ вивільняється флуоресцентна молекула. Флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності/трансгенної послідовності-вставки, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації і гібридизації.
Для детектування послідовності можуть бути застосовані описані методи молекулярних маяків. Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, що перекривається з фланкуючою геномною послідовністю і з послідовністю стику ДНК-вставки. Унікальність структури зонда ЕКЕТ полягає у тому, що цей зонд має вторинну структуру, яка підтримує флуоресцентну молекулу і молекулу, що гасить, безпосередньо близько одна від одної. Зонд
ЕКЕТ і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій послідовності ДНК і один у фланкуючій геномній послідовності) піддають реакції циклізації у присутності термостабільної полімерази і амМмтТР. Після успішної ПЛР-ампліфікації, гібридизація зонда ЕКЕТ з послідовністю-мішенню призводить до видалення вторинної структури зонда і до просторового розділення флуоресцентної молекули і молекули, що гасить. У результаті виникає флуоресцентний сигнал.
Флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої геномної послідовності/трансгенної послідовності-вставки, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації і гібридизації.
Приймаючи до уваги той факт, що визначена локалізація у геномі сої є особливо придатною для інсерції, можна сказати, що даний винахід також включає насіння сої і/або рослину сої, що містять щонайменше одну не-аай12/рау2г-терврбе-кодуючу послідовність, що знаходиться у цьому положенні геному або майже поряд з цим положенням. Одним з варіантів є заміна описаної тут вставки на іншу вставку. Говорячи загалом, у даному винаході може бути, наприклад, здійснена направлена гомологічна рекомбінація. Технологія такого типу розглядається, наприклад, у МО 03/080809 А2 і у відповідній опублікованій заявці на патент
Зо США (0.5. 2003/0232410). Таким чином, даний винахід включає рослини і клітини рослин, що містять гетерологічну вставку (введену замість множини копій репрезентативних вставок або у комбінації з цими копіями), фланковану повнорозмірними фланкуючими послідовностями, представленими тут як 5ЕБЕО І МО:1 і 5ЕБЕО ІО МО:2, або розпізнаваною частиною цих послідовностей. Із застосуванням такого(их) способу(ів) може(можуть) бути також вбудована(ї) додаткова копія (або додаткові копії) репрезентативної вставки або будь-яких її компонентів.
Всі цитовані тут патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації у всій своїй повноті вводяться у даний опис за допомогою посилання у тій галузі, що конкретно відповідає опису даного винаходу.
Подані нижче приклади наводяться для ілюстрації методів практичного здійснення винаходу і опису деяких переважних варіантів винаходу. Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження даного винаходу. При цьому, для фахівця у даній галузі очевидно, що методи, описані у наведених нижче прикладах, являють собою конкретно застосовувані підходи, представлені для ілюстрації переважних варіантів практичного здійснення винаходу. Однак, фахівцю у даній галузі, виходячи з опису винаходу, буде очевидно, що у ці конкретні варіанти здійснення винаходу може бути внесена множина змін, які дозволяють одержати такий самий або аналогічний результат і не виходять за межі суті і обсягу винаходу. Якщо це не обговорено особливо, то всі відсотки подані за масою, а всі співвідношення розчинників у суміші подані за об'ємом, якщо це не зазначено конкретно.
Якщо це не обговорено особливо, то наведені нижче скорочення означають: п.н. пара основ що градуси Цельсія днк дезоксирибонуклеїнова кислота ріс дигоксигенін
ЕОТА етилендіамінтетраоцтова кислота т.п.н. тисяча пар основ
МКГ мікрограми мкл мікролітри мл мілілітри
М молярна маса
ОІР зонд, що перекривається
ПЛР полімеразна ланцюгова реакція
РТ транскрипційна одиниця рослини ден додецилсульфат натрію
ЗОР стандартна робоча процедура зо буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0
ТВЕ буферний розчин, що містить суміш основи трису, борної кислоти і ЕОТА, рН 8,3 в вольти
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Трансформація і відбір рослин сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1, ЩО містять 2"1ЛПЕРЗРЗ і ААО-12
Трансгенну сою (Сіусіпе тах), що містить генетичну подію ррАВ8264.42.32.1, одержували за допомогою Адгорасіегійшт-опосередковуваної трансформації експлантатів у стовщеннях у сім'ядолі сої. Для ініціації трансформації використовували інактивований штам ЕНАТО1
Адгорасіегішт (Ноой еї аїЇ., 1993), що несе бінарний вектор ррАВ8264 (фіг.1), що містить селективний маркер, раї мб, і гени, що представляють інтерес, аад-12 Мі і 2тЕРБЗРБ м, в області Т-ланцюга ДНК.
Адгорасіегійт-опосередковувану трансформацію здійснювали модифікованим методом, описаним 7епо еї аї. (2004). Коротко, насіння сої (сорту Мамегіск) пророщували на базальному середовищі, а потім виділяли стовщення сім'ядолі і ці стовщення інфікували агробактерією. У середовища для стимуляції утворення, подовження і укорінення паростків додавали цефотаксим, тиментин і ванкоміцин з метою видалення агробактерій. Для інгібування росту нетрансформованих паростків використовували глюфозинат. Відібрані паростки переносили у середовище для укорінення для ініціації утворення коренів, а потім переносили у грунтову суміш для акліматизації паростків.
Верхівкові листи відібраних паростків забарвлювали глюфозинатом для скринінгу на передбачувані трансформанти. Скриновані паростки переносили у теплицю, залишали для акліматизації а потім листи забарвлювали глюфозинатом для повторного підтвердження стійкості до гербіцидів і детектування присутності передбачуваних трансформантів. Потім брали зразки скринованих рослин і проводили їх молекулярний аналіз для підтвердження присутності селективного маркерного гена і/або гена, що представляє інтерес. Рослини То залишали у теплиці для самозапилення і одержували насіння Ті.
Цей трансформант, тобто сою з генетичною подією рОрАВ8264.42.32.1, одержували з незалежно трансформованого ізоляту. Рослини Ті піддавали зворотному схрещуванню та інтрогресії в елітні сорти у наступних поколіннях. Даний трансформант відбирали виходячи з його унікальних властивостей, таких, як єдиний інсерційний сайт, нормальна менделевська
Зо сегрегація, стабільна експресія і чудова комбінація властивостей, включаючи стійкість до гербіцидів і агрономічні показники. У наведених нижче прикладах представлені дані, що були використані для характеризації трансформанта сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1..
Приклад 2: Характеризація експресії білка у генетичній події сої з модифікацією ррАВ8264.42.32.1
Були охарактеризовані біохімічні властивості рекомбінантних білків ААО-12, 2пЕРБ5РЗ і
РАТ, що експресуються у генетичній події сої з модифікацією ррАВ8264.42.32.1. Кількісний твердофазовий імуноферментний аналіз (ЕГІ5А) являє собою відомий біохімічний аналіз, що може бути здійснений з метою характеризації біохімічних властивостей білків і підтвердження експресії цих білків у зазначених трансформантах сої.
Приклад 2.1: Експресія білка РАТ у тканинах рослини
Рівні білка РАТ визначали у генетичній події сої РОАВ8264.42.32.1. Розчинний білок РАТ, екстрагований з тканини листя сої, аналізували за допомогою кількісного твердофазового імуноферментного аналізу (ЕГІЗА).
Зразки тканини сої виділяли з рослин, що тестуються, і готували для аналізу на експресію.
Білок РАТ екстрагували з тканин рослин сої з використанням забуференого фосфатом фізіологічного розчину, що містить детергент твін-20 (РВ5Т), що включає 1 95 полівінілпіролідон (ПВП). Тканину рослини центрифугували, а потім збирали водний супернатант, розводили відповідним буфером, якщо це необхідно, і аналізували з використанням набору для "сендвіч"-
ЕГІЗА РАТ. Цей набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками (Епмігоіодіх, Ропапа, МЕ). Даний аналіз підтвердив експресію білка РАТ.
Аналіз з детектування здійснювали для оцінки стабільності експресії, а також вертикального спадкування (між поколіннями) і горизонтального спадкування (між лініями всередині покоління) генетичної події РОАВ8264.42.32.1 у рослинах сої. Покоління трансформантів сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1 від Тз до Т5 мали стабільну експресію, і така експресія спостерігалася у всіх лініях.
Приклад 2.2: Експресія білків ААЮ-12 і 2пЕРЗРЗ у тканинах рослини
Рівні білків ААО-12 і 2"тЕРЗРЗ визначали у генетичній події сої РОАВ8264.42.32.1. Розчинні білки, екстраговані з тканини листя сої, аналізували за допомогою кількісного твердофазового імуноферментного аналізу (ЕГІЗА).
Зразки тканини сої виділяли з рослин, що тестуються, і готували для аналізу на експресію.
Білки ААО-12 і 2тЕРБРБ5 екстрагували з тканин рослин сої з використанням забуференого фосфатом фізіологічного розчину, що містить детергент твін-20 (РВ5Т), що включає 1 95 альбумін бичачої сироватки (ВЗА). Тканину рослини центрифугували, а потім збирали водний супернатант, розводили відповідним буфером, якщо це необхідно, і аналізували з використанням набору для "сендвіч"'-ЕІБА ААО-12 і (СА21, відповідно. Цей набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками (ААО-12: номер за каталогом 20-0161, Веасоп Апаїуїйїса! Зувзіет»5, Іпс., засо, Маіпе; 2тЕРБРО: кат. 7020100, зігагедіє Оіадповійс5, Мемжагк, ОЕ). Покоління трансформантів сої з генетичною подією рорАВВ8264.42.32.1 від Та до Тє мали стабільну експресію ААО-12 і 2птЕРЗРБ, і така експресія спостерігалася у всіх лініях.
Приклад 2.3: Дослідження з ефективності експресії
Польові дослідження на рівні експресії генетичної події сої рОАВ8264.42.32.1 здійснювали на рослинах у фазі росту М3. Дослідження з визначення рівнів експресії проводили на всіх ділянках, оброблених гербіцидами шляхом розпилення, а також на необроблених ділянках. Ці експерименти здійснювали відповідно до описаних раніше протоколів. Рівні експресії були аналогічні для всіх ділянок, тобто, для необроблених ділянок і ділянок, оброблених різними комбінаціями гербіцидів (таблиця 2). На жодній стадії дослідження якого-небудь значимого пошкодження рослин не спостерігалося.
Таблиця 2
Обробка гербіцидами і концентрації гербіцидів, використовуваних у дослідженнях з визначення рівнів експресії білків 77111716 |Гліфосатя2,4-О, кожнийпо224бгекла.д//-:/ /( г
Приклад 3: Клонування і характеризація послідовності ДНК у вставці та у фланкуючих граничних областях трансформантів сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32 1
Зо Для характеризації і опису геномного інсерційного сайта визначали послідовність граничних областей фланкуючої геномної Т-ДНК трансформанта сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1. Була підтверджена геномна послідовність трансформанта сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1, що включає 1246 п.н. 5'і-фланкуючої граничної послідовності (ЗЕО ІЮ
МО:1) і 504 п.н. 3і-фланкуючої граничної послідовності (ЗЕО ІЮ МО:2). ПЛР-ампліфікація граничних послідовностей трансформанта сої з генетичною подією ррАаВвВв8264.42.32.1 підтвердила, що граничні області походять від вихідної рослини сої, а області стику являють собою унікальні послідовності трансформанта сої з генетичною подією ррАВ8264.42.32.1.
Області стику можуть бути використані для трансген-специфічної ідентифікації генетичної події сої рРОАВ8264.42.32.1. Крім того, інсерційний сайт Т-ланцюга був охарактеризований шляхом ампліфікації геномного фрагмента, що відповідає області ідентифікованих фланкуючих граничних послідовностей, які походять від геному нетрансформованої сої дикого типу.
Порівняння ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої з рослиною, що має геномну послідовність дикого типу, виявило делецію оригінального локусу приблизно у 38 п.н. В цілому, характеризація вставки і граничної послідовності рОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої показала, що у геномі сої присутня інтактна копія Т-ланцюга.
Таблиця З
Список праймерів і їх послідовностей, використовуваних для підтвердження геномної ДНК ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої праймера п.н.
Підтвердження 5'-
ЗЕО ІЮ 4292 25 САТТТСТОСАТСАТТТ граничної геномної ДНК,
МО:З АТОАССАЦОа використовуваної разом з праймером ЕО мі С1
Підтвердження 5'-
ЗЕО ІЮ 4292-МЕЗ 25 ТОТАААТаСТТСАСА граничної геномної ДНК,
МО:4 АСАТадаИатсСА використовуваної разом з праймером ЕО мі С
Підтвердження 5'-
ЗЕО ІЮ 4292-МІЕА 25 АТаТАААТаСсСТтТТСАС граничної геномної ДНК,
МО:5 ААСАТОСАСТО використовуваної разом з праймером ЕО мі С1
Підтвердження 3'-
ЗЕО ІЮ 4292-МІВі 26 ТТСТАСАИСТАССА граничної геномної ДНК,
МО:6 СААСАДСАССТ використовуваної разом з праймером РАТ 11
Підтвердження 3'-
ЗЕО ІЮ 4292-МІВо 28 СаТАТСТОаАТАСТАА граничної геномної ДНК,
МО:7 ССАатТТСаААТТО використовуваної разом з праймером РАТ 11
Підтвердження 3'-
ЗЕО ІЮ 4292-МІВЗ 25 ААДСАСАТАСОАдИаСОИ граничної геномної ДНК,
МО:8 тпсастАТТ використовуваної разом з праймером РАТ 11
Підтвердження 3'-
ЗЕО ІЮ 4292-МІВА 26 ААДАСАСТАСТАССАС граничної геномної ДНК,
МО:9 АААССААДИТат використовуваної разом з праймером РАТ 11
Підтвердження 5'- граничної геномної ДНК, мен ЕО мі С1 26 ла використовуваної разом з
І праймером 4232-М/Е1, 4232-МЕЗ або 4232-МЕ4
Підтвердження 3'- граничної геномної ДНК,
ЗЕО ІЮ МО: РАТ 11 24 АСАСАС,ССАСАДАСА використовуваної разом з 11 - ССАСАДОДаИ праймером 4232-М/ВІ1, 4232-82, 4232-М ВЗ або 4232-М НА
Таблиця 4
Умови проведення стандартної ПЛР-ампліфікації граничних областей і трансген-специфічних послідовностей у ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої
Й Подов- Кінцеве
Послідов- Набір ПЛР- дента Ленату Відпал ження подов- ність-мішень | праймерів | суміш (еС/хв в («С/сек) ("С/сек.) | ("С/хв.: ження
І І сек. об/хв.
Б5-гранична |4232-М/Е1/ЕО 98/10 63/30 68/4:00 а | ма | о 5/3 Шо
Б5-гранична |4232-М/ЕЗ/ЕО 98/10 63/30 68/4:00
ВВ сні СІЙ в Шо
Б5-гранична |4232-МРА/ЕО 98/10 63/30 68/4:00
ВВ сна СІЙ в Шо 3-гранична 4232- 98/10 63/30 68/4:00
М/ВТ/РАТ. 11 щш- 5/3 Шо 3-гранична 4232- 98/10 63/30 68/4:00
МУ/В2/РАТ. 11 щш- 5/3 Шо 3-гранична 4232- 98/10 63/30 68/4:00
М/ВЗ/РАТ. 11 щш- З Тло 3-гранична 4232- 98/10 63/30 68/4:00
М/ВАРАТ. 11 й ЗІЗ Шо
По всьому 4232- 98/10 63/30 68/4:00 локусу М/Е1/4232- 95/3 32 72/10 вставки МВ цикли
По всьому 4232- 98/10 63/30 68/4:00 локусу М/Е1/4232- 95/3 32 цикли 72/10 вставки Маг ц
Таблиця 5
ПЛР-суміш для стандартної ПЛР-ампліфікації граничних областей і трансген-специфічних послідовностей у ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої
ПЛР-суміш А ПЛР-суміш В
Реагент 1 х реакційна суміш Реагент 1 х реакційна суміш (мкл) (мкл) ни пи ст: по ПО Ус ПО ПО СУК ПО
АссРгіте ріх ВирегМіх 10 х буфер ГА Тао 1111-1111 моСь(25 мм 77777.06 г Ф 1111-1111 амтеР2,5 мкм)
Праймер, 10 мкм Праймер, 10 мкм
Гідроліз ГДНК Гідроліз ГДНК 1111-1111 А Тад (Бодумкл)
Об'єм дози, що 29 Об'єм дози, що 20 вводиться вводиться
ПЛР-суміш С ПЛР-суміш Ю
Реагент 1 х реакційна суміш Реагент 1 х реакційна суміш (мкл) (мкл)
Продовження таблиці 5 о МоСеб5мм| | 77/75 7777171 МоСберб5мм| | 77/06 г щ о амтРІДЯММ| | 77/78 77777111 амтРІД5ММ| | 77/32 вводиться вводиться
Приклад 3.1: Підтвердження геномних послідовностей сої
Вирівнювання 5'- і 3-фланкуючих граничних областей з повнорозмірною геномною "шотган"- послідовністю хромосоми 15 Сіусіпе тах показало, що подія рОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої була вбудована у хромосому 15 геному сої. Для підтвердження інсерційного сайта для трансгену геному ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої здійснювали ПЛР з використанням різних пар праймерів (фіг.2, таблиця 3, таблиця 4 і таблиця 5). Геномну ДНК генетичної події сої рорАВ8264.42.32.1 та інші трансгенні або нетрансгенні лінії сої використовували як матрицю.
Таким чином, для того, щоб підтвердити, що 5'-граничні послідовності являють собою скориговані 2ІТЕР5Р5 м1-специфічні праймери, наприклад, були вибрані праймери ЕО мі С1і праймери, сконструйовані для клонованої 5'-кінцевої граничної послідовності і/або порівнюваної послідовності на хромосомі 15 геному сої, і позначені 4232-М/Е1, 4232-ММЕЗ і 4232-М/Е4, і ці праймери були використані з метою ампліфікації ДНК-сегмента, який охоплює ген 2пт1ЕРЗРБ м1 до 5-кінця граничної послідовності. Аналогічним чином, для підтвердження клонованої 3'- кінцевої граничної послідовності, раї-специфічний праймер, наприклад, РАТ 11, ії чотири праймери, сконструйовані для клонованої 3'-кінцевої граничної послідовності і/або порівнюваної послідовності на хромосомі 15 геному сої і позначені 4232-М/В1, 4232-82, 4232-МУКЗ і 4232-
МУКА, були використані з метою ампліфікації ДНК-сегментів, що охоплюють ген раї до 3'-кінцевої граничної послідовності. ДНК-фрагменти прогнозованого розміру були ампліфіковані тільки з геномної ДНК генетичної події сої рРОАВ8264.42.32.1. з використанням кожної пари праймерів, тобто, одного праймера, локалізованого на фланкуючій граничній області ррАВ8264.42.32.1- генетичної події сої і одного трансген-специфічного праймера, але не із зразків ДНК, що походять від інших трансгенних ліній сої або нетрансгенного контролю. Отримані результати показали, що клоновані 5- і 3-граничні послідовності являють собою фланкуючі граничні послідовності вставки Т-ланцюга для ррАВ8264.42.32.1-генетичної події СОЇ.
Для додаткового підтвердження присутності у геномі сої ДНК-вставки Т-ланцюга, геномну
ДНК, яка не містить вставки Т-ланцюга в рОАВ8264.42.32.1-генетичній події сої, піддавали ПЛР- ампліфікації по всіх граничних послідовностях рослини сої. Один праймер, сконструйований для
Зо 5'-кінцевої граничної послідовності, 4232-М/Е1, і два праймери, сконструйовані для 3'-кінцевої граничної послідовності, 4232-М/К1 і 4232-М/2К2, були використані з метою ампліфікації 5'- кінцевої граничної послідовності і 3'-кінцевої граничної послідовності ДНК-сегментів, в які був вбудований Т-ланцюг рОАВ8264. Як і очікувалося, ПЛР-ампліфікація, що проводиться з використанням пари праймерів 4232-М/Е1 і 4232-М/К1, дозволяла ампліфікувати приблизно 2,4 т.п.н. ДНК-фрагмента, що походить від геномної ДНК нетрансгенних контрольних рослин сої та інших трансгенних ліній сої, але не з ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої. Аналогічним чином,
ПЛР-реакції що проводяться з використанням пари праймерів 4232-ММЕ1 і 4232-МН2, продукували приблизно 2,5 т.п.н. ДНК-фрагмента, що походить від геномної ДНК нетрансгенних контрольних рослин сої та інших трансгенних ліній сої, але не з ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої. Вирівнювання ідентифікованих 5- і З3-граничних областей послідовності ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої з повнорозмірною геномною "шотган»-послідовністю хромосоми 15 Сіусіпе тах показало, що у локусі вихідного геному була присутня делеція у 38 п.н. (фіг.3). Отримані результати показали, що подія РОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої була вбудована у сайт хромосоми 15 геному сої.
Приклад 4: Характеризація ррАвВ8264.42.32.1-генетичної події сої за допомогою саузерн- блот-аналізу
Саузерн-блот-аналіз проводили з метою визначення профілю інтеграції в РОАВ8264.42.32.1- генетичній події сої. У результаті цих експериментів були отримані дані, що продемонстрували інтеграцію і цілісність трансгенів аад-12 мі і 2тЕРБРБ5 м! у геномі сої. ррдАвВ8264.42.32.1- генетична подія сої була охарактеризована як повнорізмірний трансформант, що утворений за допомогою простої інтеграції і містить одну копію РТ аай-12 м1 і 2птЕРЗРЗ м'1, яка походть від плазміди РОАВ8264.
Дані Саузерн-блот-аналізу дозволяють припустити, що повнорозмірний фрагмент Т-ланцюга був вбудований у геном генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1. Більш ретельний Саузерн-блот- аналіз був проведений з використанням зонда, специфічного до генів ааа-12 мі і 2птЕРБРБ м, які містяться в області інтеграції Т-ланцюга рОрАВ8264, і з використанням описаних тут рестриктуючих ферментів, що мають сайти розщеплення, локалізовані у плазміді, і продукують фрагменти, що гібридизуються, які знаходяться всередині плазміди, або фрагменти, що охоплюють область стику плазміди і геномної ДНК сої (граничні фрагменти). Молекулярні маси, отримані виходячи із Саузерн-гібридизації для комбінації рестриктуючих ферментів і зонда, були унікальними для даного трансформанта, що забезпечувало його точну ідентифікацію. Ці аналізи також показали, що даний плазмідний фрагмент був вбудований у геномну ДНК сої без реаранжування РТИи аад-12 мі і 2птЕРЗРЗБ м.
Приклад 4.1: Збір зразків листя сої і виділення геномної ДНК (гДНК)
Геномну ДНК екстрагували з тканини листя, зібраного від окремих рослин сої, що містять ррАВВ8264.42.32.1-генетичну подію сої. Крім того, ГДНК виділяли з нормальних рослин сої сорту
МамегіскК, які мають генетичний фон, що є репрезентативним для лінії даної рослини, де відсутні гени аад-12 м1 і 2птЕРБЗРБЗ м1. Окрему геномну ДНК екстрагували з ліофілізованої тканини листя відповідно до стандартного методу СТАВ (Затьгоок еї а)ї. (1989)). Після екстракції ДНК кількісно оцінювали на спектрофлуориметрі з використанням реагенту РІСО СВЕЕМ (Іпийгтодеп, Сапізбаай,
СА). Потім ДНК візуалізували на агарозному гелі для підтвердження концентрацій, отриманих в аналізі з використанням РІСО СКЕЕМ, і для якісної оцінки ДНК.
Приклад 4.2: Гідроліз і розділення ДНК
Для молекулярної характеризації ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої за допомогою
Саузерн-блот-аналізу, десять мікрограмів (10 мкг) геномної ДНК піддавали гідролізу. Геномну
ДНК, що походить від сої ррАВ8264.42.32.1 і від нетрансгенної лінії сої сорту Мамегіск, гідролізували шляхом додавання приблизно п'яти одиниць вибраного рестриктуючого ферменту на мкг ДНК і відповідного реакційного буфера до кожного зразка ДНК. Кожен зразок інкубували приблизно при 372С протягом ночі. Рестриктуючі ферменти Ніпаїй, МсоїЇ, Мей і Расі використовували окремо для кожного гідролізату (Мем Епдіапа Віоїабв, Ірху/ісп, МА). Крім того, позитивний за гібридизацією контрольний зразок одержували шляхом об'єднання плазмідної
ДНК, ррАВ8264, з геномною ДНК, що походить від нетрансгенної сої сорту МамегісК. "Коктейль" з плазмідної ДНК/геномної ДНК гідролізували із застосуванням тих самих методів і з використанням того самого рестриктуючого ферменту, які були вибрані для тест-зразків. Після інкубування гідролізатів протягом ночі додавали 25 мкл розчину ОШІК-РВЕСІР РГОБ5 (ЕддеВіозузіетв5, Сайпегериго, МО) і гідролізовані зразки ДНК осаджували ізопропанолом.
Осаджену ДНК оресуспендували у 15 мкл 1 х буфера для завантаження (0,01 95 бромфенолового синього, 10,0 мМ ЕОТА, 10,0 95 гліцерину, 1,0 мМ трису, рН 7,5). Зразки ДНК і маркери молекулярної маси піддавали електрофорезу в 0,85 95 агарозних гелях з 0,4 х буфера
ТАЕ при 35 вольт приблизно протягом 18-22 годин для розділення фрагментів. Гелі забарвлювали етидійбромідом і ДНК візуалізували шляхом опромінення ультрафіолетом (УФ).
Приклад 4.3: Перенесення за допомогою Саузерн-блот-аналізу і обробка мембрани
Саузерн-блот-аналіз проводили, в основному, як описано у публікації МетеїїпкК, еї аї. (1994).
Коротко, після електрофоретичного розділення і візуалізації ДНК-фрагментів, гелі піддавали депуринізації шляхом додавання 0,25М НСІ приблизно протягом 20 хвилин, а потім обробляли денатуруючим розчином (0,4М МаонН, 1,5М Масі) приблизно протягом 30 хвилин і нейтралізуючим розчином (1,5М масі, 0,5М трису, рН 7,5) протягом щонайменше 30 хвилин.
Перенесення за допомогою Саузерн-блот-аналізу проводили протягом ночі на найлонових мембранах з використанням капілярної системи, що містить 10х5502. Після перенесення, ДНК зв'язували з мембраною з використанням реагентів для перехресного зшивання при УФф- випромінюванні, а потім мембрану швидко промивали 2х550-розчином. Із застосуванням такого способу одержували Саузерн-блот-мембрани, готові для гібридизації.
Приклад 4.4: Мічення ДНК-зонда і гібридизація
ДНК-фрагменти, зв'язані з найлоновою мембраною, детектували з використанням міченого зонда. Зонди одержували шляхом ПЛР-включення нуклеотиду, міченого дигоксигеніном (ІС), бо ІрІа-11|-4ОТР, у ДНК-фрагмент, ампліфікований з плазміди ррАВ8264 з використанням праймерів, специфічних до генних елементів (таблиця 6). Генерування ДНК-зондів за допомогою ПЛР-синтезу здійснювали з використанням набору для синтезу ПЛР-зонда, міченого рІС (РКОВЕ 5УМТНЕЗ5ІЗ КІТ) (Коспе бОіадповійсв5, Іпаіапароїї5, ІМ) відповідно до процедур, рекомендованих виробниками.
Мічені зонди аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі для визначення їх якості і кількості. Потім потрібну кількість міченого зонда використовували для гібридизації з
ДНК-мішенню на найлонових мембранах з метою детектування специфічних фрагментів методами, в основному описаними для одержання розчину БІС ЕАБУ НУВ (Коспе Оіадповіїісв,
Іпаіапароїїє, ІМ). Коротко, блоти на найлоновій мембрані, що містять іммобілізовану ДНК, швидко промивали 2х55С і попередньо гібридизували з 20-25 мл попередньо нагрітого розчину рій ЕАБЗУ НУВ у посудинах для гібридизації приблизно при 45-55 С протягом приблизно 2 годин у печі для гібридизації. Потім розчин для попередньої гібридизації декантували і заміняли на «15 мл попередньо нагрітого розчину БІС ЕАБМУ НУВ, що містить потрібну кількість специфічних зондів, денатурованих шляхом кип'ятіння у водяній бані протягом приблизно п'яти хвилин. Потім проводили стадію гібридизації приблизно при 45-55 "С протягом ночі у печі для гібридизації.
Після закінчення гібридизації зонда, розчини БІС ЕАЗУ НУВ, що містять зонди, декантували в очищені пробірки і зберігали приблизно при -20 С. Ці зонди можуть бути повторно використані два рази відповідно до процедури, рекомендованої виробниками. Блоти на мембранах швидко обполіскували і два рази промивали в очищених пластикових контейнерах промивальним буфером в умовах низької жорсткості (2 х 55С, 0,1 96 ДСН) приблизно протягом п'яти хвилин при кімнатній температурі, а потім два рази промивали промивальним буфером в умовах високої жорсткості (0,1 х 55С, 0,1 95 ДСН), щоразу протягом 15 хвилин приблизно при 65"С. Блоти на мембранах швидко промивали 1 х малеїновокислотним буфером, взятим з набору промивальних і блокуючих буферів БІС (БІС УУА5Н АМО ВГОСК ВИОРРЕК ЗЕТ (Коспе
Ріадповійсв5, Іпаіапароїї5, ІМ)), приблизно протягом 5 хвилин. Потім здійснювали блокування в 1 х блокуючому буфері протягом 2 годин та інкубування з антитілом проти ОІС-АР (лужної фосфатази) (Коспе Оіадповііс5, Іпаіапароїї5, ІМ) в 1 х блокуючому буфері протягом мінімум 30 хвилин. Після 2-3 промивань 1 х промивальним буфером, специфічні ДНК-зонди залишалися
Зо зв'язаними з блотами на мембрані, а потім ОіІС-мічені ДНК-стандарти візуалізували з використанням хемілюмінесцентної системи детектування нуклеїнових кислот (СОР-5ТАВ
СНЕМІ ОМІМЕБСЕМТ МОСІ ЄС АСІЮ СЕТЕСТІОМ 5УЗТЕМ (Восне біадпозвіїйсв, Іпаіапароїв,
ІМ)) відповідно до рекомендацій виробників. Блоти експонували з хемілюмінесцентною плівкою один або декілька разів для детектування фрагментів, що гібридизуються, і для візуалізації стандартів молекулярних мас. Плівки проявляли у проявнику плівок АГ -РНВО 100 РІ О5 (Копіса
МіпоКа, О5ака, дарап) і зображення сканували. Число і розмір детектованих смуг були задокументовані для кожного зонда. ОБІсС-мічений маркер молекулярної маси ДНК ПІ (БІС МУУМ
І) ї ОІсС-мічений маркер молекулярної маси ДНК МІ! (БІ МУУМ МІ!) візуально проявлялися після детектування 0іІС, як описано у даній заявці, а тому вони були використані для визначення розміру фрагмента, що гібридизується, на Саузерн-блотах.
Таблиця 6
Локалізація і довжина зондів, використовуваних у Саузерн-блот-аналізі
Приклад 4.5: Результати Саузерн-блот-аналізу
Розміри передбачуваних фрагментів і фрагментів, що спостерігаються, а також конкретні гідролізати і зонд, де зазначені гідролізати і зонд були отримані на основі відомих рестрикційних сайтів ферментів РТ аад-12 мі і 2птЕРБЗРБ5 мі! представлені у таблиці 7. На основі цих гідролізатів і гібридизації були ідентифіковані два типи фрагментів: внутрішні фрагменти, в яких відомі сайти ферментів фланкують область зонда і повністю входять до складу інсерційної області РТ аад-12 м! і 2птЕРЗРЗ м; і граничні фрагменти, в яких один відомий сайт ферменту локалізований на одному кінці області зонда, а інший сайт, як і очікувалося, локалізований у геномі сої. Розміри граничних фрагментів варіюють в залежності від типу трансформанта, оскільки у більшості випадків сайти інтеграції ДНК-фрагментів є унікальними для кожного трансформанта. Граничні фрагменти являють собою засіб для визначення локалізації рестрикційних сайтів ферментів відносно інтегрованої ДНК і для оцінки числа ДНК-вставок.
Саузерн-блот-аналізи, що проводяться на багатьох поколіннях ррдАвВ8264.42.32.1-генетичної події сої, давали результати, які дозволяють припустити, що низькокопійні інтактні РТО ааа-12
МІ і 2птЕРБРЗБ м, що походять від плазміди рОАВ8264, були вбудовані у геном генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1.
Таблиця 7
Передбачувані і спостережувані фрагменти, що гібридизуються, у Саузерн-блот-аналізі . Передбачувані Спостережувані
ДНК-зонд Рестриктуючі Зразки розміри фрагмента розміри ферменти й фрагмента (п.н.) (п.но? рОАВВ264 4731 4700
Ніпа Ті Генетична подія сої оОАВВ264.42.32.1 75078 4100 рОАВВ264 7429 7400 ава-12 Мо оОАВВ264.42.32.1 73690 6700 рОАВВ264 4974 4900
Мі!
Генетична подія сої рОАВ8264.42.32.1 1974 7900 рОАвВВ264 9322 9300
Ніпа Ті Генетична подія сої оОАВВ264.42.32.1 73260 5300 рОАВВ264 5203 5200
Мсо | Генетична подія сої
ОПЕРЄРЄ оОАВВ264.42.32.1 73749 18000 рОАВВ264 11044 11000
Мі!
Генетична подія сої оОАВВ264.42.32.1 75199 7500 рОАВВ264 6768 6700
Р ас Генетична подія сої оОАВВ264.42.32.1 6768 6700 рОАВВ264 9322 9300
Ніпа ПІ - т
Генетична подія сої немає немає сресв роОАВ8264.42.32.1 й оОАВВ264 5203 5200
Месо І - т
Генетична подія сої немає немає роОАВ8264.42.32.1
Продовження таблиці 7
Передбачувані і спостережувані фрагменти, що гібридизуються, у Саузерн-блот-аналізі . Передбачувані Спостережувані
ДНК-зонд Рестриктуючі Зразки розміри фрагмента розміри ферменти й фрагмента (п.н.) (п.н32 отінер Мсо рОАВ8264.42.32.1
МА Ніпо рРОАВ8264.42.32.1 1. Розміри передбачуваних фрагментів отримані на основі карти плазміди ррАВ8264. 2. Розміри спостережуваних фрагментів були обчислені приблизно за даними, отриманими у цих аналізах, і за вказаними розмірами фрагментів маркера ІІ ї маркера МІ! молекулярної маси ОБІС-міченої ДНК.
Рестриктуючі ферменти Ніпапі ї Мсої зв'язуються з унікальними рестрикційними сайтами у плазміді РОАВ8264 і розщеплюють їх. Потім ці ферменти відбирали для характеризації вставки гена ааа-142 мі у ррАВ8264.42.32.1-генетичних подіях сої. Було прогнозовано, що граничні фрагменти розміром 24078 п.н. або »3690 п.н. гібридизуються з зондом після гідролізу ферментами Ніпаї!Ї або Мсої, відповідно (таблиця 7). Одиночні смуги гібридизації аай-12 мі розміром «4100 п.н. і «6700 п.н. спостерігалися у випадку використання ферментів Ніпапн або
Мсої, відповідно. Гібридизація зонда зі смугами такого розміру, за припущенням, вказує на присутність одного сайта інсерції гена аад-12 м1 у геномі рОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої.
Рестриктуючий фермент МеіЇ був вибраний для виділення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю аад-12 мі рослини (РТ; промотор/ген/термінатор) (таблиця 7).
Прогнозований -«-4900 п.н.-фрагмент спостерігався у випадку використання зонда після гідролізу ферментом М5іїЇ. Результати, отримані при ферментативному гідролізі зразків рОАВ8264.42.32 1 з подальшою гібридизацією зонда показали, що інтактна РТ аад-12 мі, що походить від плазміди РОАВ8264, була вбудована у геном ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої.
Рестриктуючі ферменти Ніпа!йї, Мсої ї М5іЇ зв'язуються з рестрикційними сайтами у плазміді рорАВ8264 і розщеплюють їх. Потім ці ферменти відбирали для характеризації вставки гена 2ТЕРБРБЗ м! у ррАВВ8264.42.32.1-генетичні події сої. Було прогнозовано, що граничні фрагменти розміром 24260 п.н., »3749 п.н. або »5199 п.н. гібридизуються із зондом після гідролізу ферментами Ніпаїй, Мсої і М5іїЇ, відповідно (таблиця 7). Одиночні смуги гібридизації 2ТЕРБРБЗ мі розміром -5300 п.н., 18000 пон. і -7500 п.н. спостерігалися у випадку використання ферментів Ніпап, Месої ї М5іїЇ, відповідно. Гібридизація зонда зі смугами такого розміру, за припущенням, вказує на присутність одного сайта інсерції гена 2"7ЕРЗРЗ м! у геномі рорАВВ8264.42.32.1-генетичних подій сої. Рестриктуючий фермент Расі був вибраний для виділення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю 2тЕРБЗРБ5 м! рослини (РТИи; промотор/ген/термінатор) (таблиця 7). Прогнозований «6700 п.н.-фрагмент спостерігався у випадку використання зонда після гідролізу ферментом Расі. Результати, отримані при ферментативному гідролізі зразків роАВ8264.42.32.1-генетичної події сої з подальшою гібридизацією зонда показали, що інтактна РТ 2тЕРБР5 мі, що походить від плазміди рорАВ8264, була вбудована у геном ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої.
Приклад 4.6: Відсутність послідовностей кістяка
Саузерн-блот-аналіз також проводили з метою підтвердження відсутності гена резистентності до спектиноміцину (з5зресі), елемента Огі Кер і білка ініціації реплікації ЧА (елемента ІПА) у ррАВ8264.42.32.1-генетичній події сої. Як і очікувалося, у зразках генетичної події сої ррАВ8264.42.32.1, якої-небудь специфічної гібридизації з геном резистентності до спектиноміцину, з елементом Огі Кер або з елементом ІпПА не спостерігалося у тому випадку, якщо у Саузерн-блот-аналіз були включені відповідні позитивний контроль (плазмідна ДНК рорАВ8264, додана до геномної ДНК МаметгісК) і негативний контроль (геномна ДНК МаметгіскК).
Зо
Після гідролізу ферментами Ніпаї! або Місої і гібридизації зі хгреск-специфічним зондом, одна очікувана смуга розміром 9300 п.н. або -5200 п.н. спостерігалася у зразку позитивного контролю (з ррАВ8264, доданою до геномної ДНК МамегісК), відповідно. ЗрескК-зонд не гібридизувався зі зразками негативного контролю і ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої.
Аналогічним чином, одна очікувана смуга розміром «7400 п.н. детектувалася у зразку позитивного контролю (з ррАВ8264, доданою до геномної ДНК Мамегіск), але була відсутня у зразках негативного контролю і ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої після Мео|-гідролізу і гібридизації з Огікер-специфічним зондом. Крім того, тільки одна очікувана смуга розміром -300 п.н. детектувалася у зразку позитивного контролю (з рОАВ8264, доданою до геномної
ДНК МаметгіскК), але була відсутня у зразках негативного контролю і ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої після НіпапПІ-гідролізу і гібридизації з «А-специфічним зондом. Ці дані вказують на відсутність гена резистентності до спектиноміцину, елемента Огі Кер і білка ініціації реплікації
ІТА у ррАВ8264.42.32.10-генетичній події сої.
Приклад 5: Дослідження для оцінки агрономічних показників і дослідження у польових умовах на врожайність і стійкість до гербіцидів
Було проведено декілька агрономічних досліджень для оцінки агрономічних показників генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1. Більшість досліджень у польових умовах проводили у різних географічних регіонах у Сполучених Штатах, де культивували сорт сої, що містить генетичну подію ррАВ8264.42.32.1. Було проведено три серії експериментів. У першій серії експериментів порівнювали агрономічну ефективність ррАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої, які були оброблені шляхом обприскування гербіцидами 2,4-Ю0 і гліфосатом, і агрономічну ефективність ррАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої, які не були оброблені гербіцидами. У другій серії експериментів порівнювали агрономічну ефективність рОАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої з агрономічною ефективністю контрольних рослин близької ізолінії Мамегіск. І нарешті, у третій серії експериментів тестували стійкість ррАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої до глюфозинату.
У першій серії експериментів порівнювали рорАВ8264.42.32.1-генетичні події сої, які обробляли шляхом обприскування сіллю диметіаміну 2,4-О у дозі 1120 г екв./га (УУеєдаг 64,
Митапт, Ви Кідде, 3 і гліфосатом у дозі 1120 г екв/га (ЮОигапдо, Юом/ Адгозсієепсев,
Ко) Іпаіапароїївз, ІМ), з рОАВ8264.42.32.1-генетичними подіями сої, які не обробляли гербіцидами.
Обробку гербіцидами проводили на фазах росту УЗ і К2. Дослідження у польових умовах, які складаються зі стадій обприскування і без обприскування, здійснювали на ділянках з довільним розташуванням протягом 2-річного незалежного культивування. Дослідження у польових умовах, проведені у 2010 році, складалися з повторних культивувань двадцяти п'яти культур у кожній ділянці, а дослідження у польових умовах, проведені у 2011 році, складалися з чотирьох культивувань двадцяти шести культур у кожній ділянці. В обох експериментах кожна ділянка складалася з двох рядів довжиною 12,5 футів, а всього було засіяно 30 дюймів з відстанню 2,5 футів між ділянками. Протягом всього сезону польові ділянки обробляли відповідно до звичайної агрономічної практики і зі знищенням бур'янів. Протягом всього сезону був оцінений ряд агрономічних показників. Дані для цих показників і стадій росту, якщо вони були отримані, представлені у таблиці 8.
Таблиця 8
Список агрономічних показників, визначених у дослідженнях у польових умовах, для порівняння ррАВВ8264.42.32.1-генетичної події сої з рослинами Мамегіск
Поява сходів: Величина густоти стояння рослин, розділена |Обчислено виходячи з густоти на число насінин, висаджених на ділянку в один метр, і стояння рослин на ранній стадії помножена на 100.
Потужність проростання: Потужність проростання складає 0 95, якщо на ділянці всі рослини гинули, і 100 95, якщо на М1-М3 ділянці всі рослини мали нормальний вигляд. рослин на ділянці.
Величина густоти стояння рослин на фазі росту Н2: Число рослин на репрезентативній 1-метровій ділянці ряду на фазі! Б2 росту НО.
Таблиця 8
Список агрономічних показників, визначених у дослідженнях у польових умовах, для порівняння ррАВВ8264.42.32.1-генетичної події сої з рослинами Мамегіск
Ед стен ійнннінинінінйй ХНН бальною оцінкою 0-100 95. рентний ІНН ураженій комахами.
Висота рослини: Середня висота рослин у сантиметрах на кожну ділянку, виміряна від поверхні грунту до верхівки після опадання листя.
Полягання рослин: Процент полягання на час збору врожаю, де 0 95 - без полягання, а 100 95 - всі рослини на ділянці полягали на землю.
ГЕН НЕ ог Кен ншміній -ЗНННННННННИ рослин, у яких стручки були сухими на вигдяд. (Опадання плодів: Процент стручків, які опали наземлю. / |В (ЗО ет ііі іній С НН до 13 9.
Коня тя насінин і реєстрували їх масу у грамах.
Колір насіння: Світло-коричневий колір насіння, що 1 - світло-коричневий колір оцінюється за бальною шкалою від 1 до 5. відсутній і далі до 5 - посилення коричневого кольору
Пошкодження на 1-й день після 1-го нанесення гербіцидів (У): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, хлороз і некроз через 6-24 години після хімічної обробки Шкала оцінок 0-100 9о (0 - немає рослин на стадії росту УЗ. Спостерігалися будь-які ознаки | пошкодження, 100 - всі рослини викривлення, які Є типовими для пошкоджень, викликаних |загинули) обробкою гербіцидом 2,4-0. Це проявляється закручуванням або висиханням листя і стебел.
Пошкодження на 7-й день після 1-го нанесення гербіцидів Шкала оцінок 0-100 95 (0 - немає (96): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, пошкоджень, 100 - всі рослини хлороз і некроз через 7 днів після хімічної обробки рослин загинули) на стадії росту МУЗ.
Пошкодження на 14-й день після 1-го нанесення гербіцидів Шкала оцінок 0-100 95 (0 - немає (96): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, пошкоджень, 100 - всі рослини хлороз і некроз через 14 днів після хімічної обробки рослин загинули) на стадії росту МУЗ.
Пошкодження на 1-й день після 2-го нанесення гербіцидів (У): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, хлороз і некроз через 6-24 години після хімічної обробки Шкала оцінок 0-100 9о (0 - немає рослин на стадії росту Н2. Спостерігалися будь-які ознаки | пошкоджень, 100 - всі рослини викривлення, які Є типовими для пошкоджень, викликаних |загинули) обробкою гербіцидом 2,4-0. Це проявляється закручування або висиханням листя і стебел.
Пошкодження на 7-й день після 2-го нанесення гербіцидів Шкала оцінок 0-100 95 (0 - немає (96): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, пошкоджень, 100 - всі рослини хлороз і некроз через 7 днів після хімічної обробки рослин загинули) на стадії росту НО.
Пошкодження на 14-й день після 2-го нанесення гербіцидів Шкала оцінок 0-100 95 (0 - немає (96): Загальна візуальна оцінка пошкодження культур, пошкоджень, 100 - всі рослини хлороз і некроз через 14 днів після хімічної обробки рослин загинули) на стадії росту НО.
Після закінчення вегетаційного періоду дані, отримані з усіх ділянок, об'єднували і проводили аналіз по всіх ділянках. Потім проводили аналіз даних і, виходячи з цього аналізу,
обчислювали величини для різних показників культур із застосуванням методу найменших квадратів як показано у таблиці 9. У випадку параметрів, для яких вимірювали значимий зазначений у таблиці ефект, а потім здійснювали розділення середніх із застосуванням 1- критерію Стьюдента з метою проведення порівняння між обробленими ррАВ8264.42.32.1- генетичними подіями сої і необробленими ррАВ8264.42.32.1-генетичними подіями сої. Ступінь ймовірності для визначення значимості складав р-0,05. ррдавВ8264.42.32.1-генетичні події сої проявляли стійкість до резервуарної суміші 2,4-О і гліфосату. На противагу цьому, жодна з рослин сорту Мамегіск, яка була оброблена резервуарною сумішшю 2,4-Ю0 і гліфосату, не проявляла стійкості до обробки гербіцидами.
Таблиця 9
Величини, визначені із застосуванням методу найменших квадратів за результатами аналізу для всіх ділянок з метою порівняння оброблених або необроблених рослин генетичних подій сої РОАВ8264.42.32.1 за 2010 і 2011 роки. Для кожної ознаки, величини, за якими не стоїть та сама буква, відрізняються за І-критерієм Стьюдента
Агрономічний показник або ознака обприскування
Несе Нм Я сінна НИНІ НУ НОСИ НІС ми 1,6 А нанесення гербіцидів (90
Немов НИНІ НОЗІ НОСИ НОСОВ нанесення гербіцидів (90 "
Метт айв НОСТІ НЕЗН НС СНИ МЕЗО мий А А нанесення гербіцидів (95) росту 2 пе | м | 11 в нанесення гербіцидів (95) " "
Мене; тіннівьНН НЕ ЗННІ НОЕЗНИ НСС НОСОВ ми 2,3 А нанесення гербіцидів (95)
Пошкодження на 14-й день після 2-го
Випадки розвиткухвороби(96)...-/:/ | /--/(079 | А | 34 | В / оМасат0б насінин) 77777771 |1111124 | А | 19 | в інтенсивністю кольору ррАВ8264.42.32.1-генетична подія сої проявляла високий рівень стійкості до резервуарної суміші гліфосату і 2,4-О на стадіях росту УЗ і К2 у вегетаційний період. Хоча спостерігалися невеликі пошкодження при початковій обробці рослин гербіцидами, однак, спочатку ці пошкодження не були значимими, а більш сильно проявлялися тільки через 14 днів після обробки. Всі оцінені ознаки, за винятком маси 100 насінин і випадків розвитку хвороби, були однаковими як для ррАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої, оброблених гербіцидами, так і для рорАВВ8264.42.32.1-генетичних подій сої, які не були оброблені гербіцидами. Нанесення 2,4-О і гліфосату на ррАВ8264.42.32.1-генетичних подіях сої у польових умовах не приводило до якої- небудь значимої зміни агрономічних показників або ознак, які могли б впливати на агрономічну продуктивність РОАВ8264.42.32.1-генетичної події СОЇ.
У другій серії експериментів порівнювали агрономічні показники для вибраних агрономічних властивостей ррдаВ8264.42.32.1-генетичних подій сої і контрольних рослин близької ізолінії
Мамегіск. Дослідження у польових умовах здійснювали на ділянках з довільним розташуванням протягом двох років незалежного культивування. Дослідження у польових умовах, проведені у 2010 році, складалися з двох культивувань двадцяти п'яти культур у кожній ділянці, а дослідження у польових умовах, проведені у 2011 році, складалися з чотирьох культивувань двадцяти шести культур у кожній ділянці. В обох експериментах кожна ділянка складалася з двох рядів довжиною 12,5 футів, а всього було засіяно 30 дюймів з відстанню 2,5 футів між ділянками. Протягом всього сезону польові ділянки обробляли відповідно до звичайної агрономічної практики і зі знищенням бур'янів. Протягом всього сезону був оцінений ряд агрономічних показників. Дані для цих показників і стадій росту, якщо вони були отримані, представлені у таблиці 8.
Після закінчення вегетаційного періоду, дані, отримані з усіх ділянок, об'єднували і проводили аналіз по всіх ділянках. Потім проводили аналіз даних і виходячи з цього аналізу обчислювали величини для різних показників культур із застосуванням методу найменших квадратів як показано у таблиці 10. У випадку параметрів, для яких вимірювали значимий зазначений у таблиці ефект, пізніше здійснювали розділення середніх із застосуванням 1- критерію Стьюдента для проведення порівняння між рослиною сорту МамегісК і ррАВ8264.42.32.1-генетичною подією сої. Ступінь ймовірності для визначення значимості складав р-0,05.
Таблиця 10
Величини, визначені із застосуванням методу найменших квадратів за результатами аналізу для всях ділянок, з метою порівняння ррАВ8264.42.32.1-генетичних подій сої і рослин сорту МаметіскК за 2010 і 2011 роки. Для кожної ознаки, величини, за якими не стоїть та сама буква, відрізняються за І-критерієм Стьюдента генетична подія сої хороша) нн 1 в (в в 1
Інтенсивністю кольору " "
Всі оцінені ознаки генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1 були аналогічні ознакам рослини сорту Мамегіск, за винятком кольору насінин. ррАВ8264.42.32.1-генетичні події сої мали колір насінин, оцінений як 1,8, а рослини сорту МамегіскК мали колір насінин, оцінений як 1,3. Така відмінність не є занадто істотною для фермерів і не впливає на продуктивність даної культури, а також не призводить до істотних змін агрономічних показників, які могли б негативно впливати на продуктивність даної культури. Отримані результати показали, що генетична подія сої ррАВ8264.42.32.1 може розвиватися не так, як рослина сорту Мамегіск з погляду деяких агрономічних показників, однак, такі відмінності є мінімальними і не виходять за межі звичайних
Зо показників соєвих культур при їх обробці на стандартних фермах.
Для проведення тесту на стійкість ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої до гербіциду глюфозинату, такий трансформант висівали на дослідні поля штату Індіани у вегетаційний період 2010 р. Рослину сорту МамегіскК, яка була вперше трансформована для продукування ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої, висівали у кожен розсадник і включали в експерименти як контроль. Цей трансформант рандомізували з іншими трансформантами, які були на одній і тій самій стадії розвитку, вибраній для проведення тесту, і цей тест проводили з чотирма повторами. Рослина сорту Мамегіск була включена як нетрансформований контроль.
Дослідження проводили за модифікованою дробно-ділянковою схемою з обробкою всіх ділянок повністю і субділянок з трансформантами. На одні рослини сої наносили глюфозинат у кількості 822 г е.к./га, а інші контрольні рослини не обробляли. Обробку проводили на фазах росту М5 і
К2. Стійкість до гербіцидів визначали шляхом аналізу рослин на ураження через 6 годин і 7 днів після обробки. Ураження рослин оцінювали візуально на хлороз, некроз листя і на загибель усієї рослини. ррАВ8264.42.32.1-генетична подія сої була у високій мірі стійкою до обробки глюфозинатними гербіцидами. На противагу цьому, жодна з рослин сорту Мамегіск не була стійкою до гербіцидів.
Приклад 6: Трансген-специфічний аналіз ТадМап
Трансген-специфічний аналіз ТАОМАМ був розроблений з метою детектування присутності у сої генетичної події РОАВ8264.42.32.1 і визначення статусу зиготності рослин у популяціях, отриманих шляхом схрещування. Генетична подія ррАВ8264.42.32.1 сої містить Т-ланцюг бінарного вектора ррАВ8264 (фіг4). Для специфічного детектування трансгену рорАВ8264.42.32.1 генетичної події сої, специфічні праймери і зонди ТАОМАМ були сконструйовані відповідно до послідовностей ДНК, локалізованих біля 5'-кінця (ЗЕО ІЮ МО:19) або 3'-кінця (ЗЕО ІЮ МО:20) послідовності "вставка-стик" даної рослини (фіг.4). Один трансген- специфічний аналіз для детектування трансгену ррАВ8264.42.32.1 генетичної події сої був розроблений так, щоб він дозволяв специфічно детектувати ДНК-фрагмент у 131 п.н., що охоплює інтегруючу 3'-послідовність стику, з використанням двох праймерів і мішень- специфічного зонда МОВ, що синтезований на синтезаторі Арріїей Віозує(етв (АВІ) і містить репортер ЕАМ біля свого 5'-кінця. Специфічність такого методу ТАОМАМ для детектування генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1 оцінювали для 11 різних трансформантів, що містять РТ 2ТЕРБЗРБ5 м! їі аад-12 мі, і для контрольного нетрансгенного сорту сої (Мамегіск), у вигляді дуплекса з ендогенним еталонним геном, що зустрічається у сої, ЗМР Г01-25-219 (КкКДНК сСіусіпе тах, СепВапк: АК286292.1).
Приклад 6.1: Виділення г ДНК
У цьому дослідженні тестували зразки геномної ДНК (гДНК), виділені з 11 різних трансформантів сої і з нетрансгенних сортів сої. Геномну ДНК екстрагували з використанням
Зо модифікованого набору для екстракції рослинної ДНК (Оіадеп МАСАТТКАСТ РІГ АМТ ОМА Кі) (Оіадеп, Маіепсіа, СА). Для екстракції ГДНК використовували диски свіжого листя сої, 8 дисків на зразок. Для проведення даного дослідження зразки розводили водою, що не містить ДНКази, до концентрації приблизно 10 нг/мкл.
Приклад 6.2: Аналіз ТадМанп і результати такого аналізу
Специфічні праймери і зонди ТАОМАМ були сконструйовані для проведення аналізу
ТАОМАМ, специфічного до генетичної події сої ррАВ8264.42.32.1. Ці реагенти можуть бути використані для детектування генетичної події сої рРОАВ8264.42.32.1 в умовах, перерахованих нижче. У таблиці 11 представлений список послідовностей праймерів і зондів, які були спеціально сконструйовані для детектування генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1.
Таблиця 11
ПЛР-праймери і зонди ТАОМАМ 77717111 назва//| Опис | ////////// Послідовність./-/-:(//./:/ К МЖ)ОО
ФЕОЮ Трансформант-
МО 12 4232 З'Є специфічний прямий | СИСААТатТтатТтАТТААдаттатстТАдас " праймер
ФЕОЮ Трансформант-
МО-1З 4232 З'В специфічний СсТоТАТСССТТТААТТасСсСАТастТАТ " зворотний праймер
Трансформант- специфічний зонд,
ЗеСИО 4232 УР що Б'ЄАМ/АТОССААТТАССААСААТ-МОВ
МО:14 використовується разом з 4232 З'КЕЇ 4232 ЗВ
Продовження таблиці 11 77111110 Назва! | Опис // | ////////// Послідовність/:|//|/Ж с
Мультиплексну ПЛР-ампліфікацію проводили у наведених нижче умовах: ПЛР-буфер 1 х
Коспе, 0,4 мкМ трансформант-специфічного прямого праймера, 0,4 мкМ трансформант- специфічного зворотного праймера, 0,4 мкМ праймера СМ5116БЕ, 0,4 мкМ праймера ОМ5116К, 0,2 мкМ трансформант-специфічного зонда, 0,2 мкМ зонда ЗМ5116, 0,1 95 ПВП, 6-20 нг гдНК у загальному обсязі реакційної суміші 10 мкл. Цю суміш ампліфікували у наведених нижче умовах: (і) 952С, 10 хвилин, (ії) 952С, 10 секунд, (ії) 602С, 40 секунд, (ім) повторення стадій (ії)-(іїї) за 40 циклів, (м) витримування при 402С. ПЛР у реальному часі здійснювали на обладнанні
КОСНЕ ГІСНТСУСІ ЕК 480. Аналіз даних проводили шляхом вимірювання точки перетинання (величини Ср), що визначається за допомогою програми ГІЗНТСМУСІ ЕК 480, яка являє собою число циклів ПЛР, де швидкість зміни флуоресценції досягає свого максимуму.
У методі ТАОМАМ для детектування трансгену ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої оцінювали 11 різних трансформантів, що містять РТО 2тЕРЗ5РЗ5 м! і аай-12 МІ, і нетрансгенний сорт сої у вигляді дуплекса з ендогенним еталонним геном, що зустрічається у сої, ЗМР 01-25- 19 (СепВапк: АК286292.1). Цей аналіз дозволяє специфічно детектувати генетичну подію сої рорАВ8264.42.32.1 і не дає або не збільшує які-небудь хибнопозитивні результати порівняно з контролем (тобто, 11 різних трансформантів, що містять РТ 2тЕРБРЗ м1 і ааа-12 МІ, і нетрансгенного сорту сої). Трансформант-специфічні праймери і зонди можуть бути використані для детектування генетичної події сої РОАВ8264.42.32.1, і ці умови і реагенти є придатними для проведення аналізів на зиготність.
Приклад 7: Передбачувана послідовність РОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої
Послідовність ЗЕО ІЮ МО:18 являє собою передбачувану послідовність трансгену ррАВ8264.42.32.1 генетичної події сої. Ця послідовність містить 5-геномну фланкуючу послідовність передбачувану вставку Т-ланцюга рраАВ8264 і 3-геномні фланкуючі послідовності. Що стосується послідовності ЗЕО ІЮ МО:18, то залишки 1-1246 являють собою залишки 5'-геномної фланкуючої послідовності; залишки 1247-11507 являють собою залишки вставки Т-ланцюга ррАВ8264, а залишки 11508-12011 являють собою 3'-геномну фланкуючу послідовність. Таким чином, послідовність стику або послідовність транзиції, розташовані біля
Б-кінця вставки, знаходяться у положеннях залишків 1246-1247 5ЕО ІО МО:18. Послідовність стику або послідовність транзиції, розташовані біля 3'-кінця вставки, знаходяться у положеннях залишків 11507-11508 5ЕО ІЮ МО:18.
Слід зазначити, що 5ЕО ІЮО МО:18 являє собою передбачувану репрезентативну послідовність трансгену ррАВ8264.42.32.1 генетичної події сої 1, і ця послідовність була отримана після порівняння шляхом вирівнювання послідовностей ЗЕО ІЮ МО:19, 5ЕО ІЮ МО:20 і Т-ланцюга ррАВ8264. Фактична послідовність вставки Т-ланцюга ррдАВ8264.42.32.1-генетичної події сої може трохи відрізнятися від послідовності 5600 ІЮ МО:18 (наприклад, у положеннях залишків 1247-11507). У процесі трансформації, тобто введення вставки Т-ланцюга у геном клітин рослин, нерідко виникають деякі делеції або інші альтерації у вставках. Крім того, при
ПЛР-ампліфікації можуть виникати помилки, що можуть призводити до незначних помилок при секвенуванні. Так, наприклад, описані тут фланкуючі послідовності були визначені шляхом продукування ампліконів з геномних ДНК сої з подальшим клонуванням і секвенуванням ампліконів. Тому не дивно, що у послідовностях, отриманих і визначених таким способом, можуть бути виявлені незначні відмінності і деякі невідповідності, якщо взяти до уваги необхідність проведення множини раундів ампліфікації для одержання амплікону, достатнього для секвенування геномних ДНК. Слід зазначити і взяти до уваги, що будь-які уточнення, необхідні для виправлення помилок або невідповідностей такого типу, які звичайно виникають при секвенуванні, входять в обсяг даного винаходу. Таким чином, релевантний сегмент описаної тут плазмідної послідовності може містити деякі незначні модифікації. Таким чином, рослина, яка містить полінуклеотид, що має визначений ступінь ідентичності послідовності вставки, що розглядається, входить в обсяг даного винаходу. Послідовність «ЕО ІЮ МО:18 або будь-який її сегмент можуть вважатися ідентичними представленій або описаній тут послідовності, якщо вони являють собою полінуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 90 Фо, 91 95, 92 Фо, 93 о, 94 Фо, 95 о, 96 95, 97 Фо, 98 95, 99 95 або більше ідентична представленій або описаній тут послідовності. Послідовність, що містить фланкуючі послідовності і послідовність вставки, може бути підтверджена шляхом порівняння з послідовністю депонованих насінин. Таким чином, деякі відмінності між послідовністю 5ЕБЕО ІЮО МО:18 і фактичною вставкою Т-ланцюга генетичної події сої рраАВвВ8264.42.32.1 можуть бути ідентифіковані і входять в обсяг даного винаходу.
Приклад 8: Використання інсерційного сайта ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої для направленої інтеграції
Відповідні агрономічні показники трансген-вмісної РОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої для декількох поколінь, вирощених у польових умовах, дозволяють припустити, що ці ідентифіковані області, які знаходяться поблизу від інсерційного сайта на хромосомі 15 ррАвВ8264.42.32.1- генетичної події сої, мають геномні ділянки, що досить добре підходять для направленої інтеграції інших трансгенів, які представляють інтерес. Така направлена інтеграція дозволяє вирішити проблеми, пов'язані з наявністю так званого "ефекту положення", і усунути ризик виникнення мутацій у геномі після інтеграції трансгену у хазяїна. Іншими перевагами такої направленої інтеграції є, але не обмежуються ними, зменшення великого числа подій трансформації, які повинні бути скриновані і протестовані до одержання трансгенної рослини, яка буде мати бажаний рівень експресії трансгену без яких-небудь відхилень, обумовлених випадковою інсерцією трансгену у локус геному хазяїна, що грає важливу роль. Крім того, така направлена інтеграція допускає зчеплення трансгенів, що буде призводити до більш ефективного схрещування елітних ліній рослини, які містять обидва гени.
Із застосуванням описаної тут технології, фахівець у даній галузі може самостійно вводити полінуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, у той самий інсерційний сайт, що є присутнім у ррАВ8264.42.32.1-генетичній події сої або у сайт, що знаходиться безпосередньо близько від інсерційного сайта ррдаВ8264.42.32.1-генетичної події сої. Один з таких методів описаний у Міжнародній патентній заявці Мо. УМО2008/021207, яка у всій своїй повноті
Зо вводиться у даний опис за допомогою посилання.
Коротко, геномна послідовність розміром до 20 т.п.н., що фланкує 5'-кінець інсерційного сайта, і геномна послідовність розміром до 20 т.п.н., що фланкує 3'-кінець інсерційного сайта
ЗЕО ІЮ МО:18, була використана для фланкування гена, що представляє інтерес, або генів, що представляють інтерес, які повинні бути вбудовані у геном ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої за допомогою гомологічної рекомбінації. Цей ген, що представляє інтерес, або гени, що представляють інтерес, можуть бути вбудовані точно в інсерційний сайт рр4АВ8264.42.32.1- генетичної події сої, або вони можуть бути вбудовані в яку-небудь іншу ділянку у межах області 20 т.п.н., що знаходиться поблизу від інсерційних сайтів рОАВ8264.42.32.1-генетичної події сої, що буде забезпечувати відповідний рівень експресії трансгену і не буде здійснювати якого- небудь негативного впливу на рослину. ДНК-вектори, які містять ген, що представляє інтерес, або гени, що представляють інтерес, і фланкуючі послідовності можуть бути вбудовані у клітини рослин будь-яким одним з декількох методів, відомих фахівцям, включаючи, але не обмежуючись ними, Адгобасіегішт-опосередковувану трансформацію. Інсерція донорного ДНК- вектора у сайт-мішень ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої може бути проведена більш ефективно із застосуванням одного або декількох методів, включаючи, але не обмежуючись ними, експресію або стимуляцію генів-підсилювачів рекомбінації або інгібування ендогенних генів-супресорів рекомбінації.
Крім того, відомо, що розщеплення двохланцюжкових специфічних послідовностей у геномі може бути проведене з метою підвищення частоти гомологічної рекомбінації, а тому інсерція в інсерційний сайт ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої або в його фланкуючі області може бути проведена більш ефективно завдяки експресії природних або сконструйованих послідовність- специфічних ендонуклеаз, що розщеплюють такі послідовності. Таким чином, із застосуванням описаної тут технології, будь-яка гетерологічна нуклеїнова кислота може бути вбудована у сайт- мішень, розташований між послідовностями 5ЕО ІЮ МО:1 ії 5ЕО ІЮ МО:2 або безпосередньо близько від них, а у деяких випадках, у послідовність зЗЕО ІЮ МО:18 або безпосередньо близько від неї.
Приклад 9: Вирізання експресійного кластера, що містить ген раї, з ррАвВ8264.42.32.1- генетичної події сої
Видалення експресійного кластера, що містить селективний маркерний ген, може виявитися бо переважним для направленого вбудовування у ррАВВ8264.42.32.1-генетичну подію сої.
Видалення селективного маркера раї з ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої дозволяє повторно використовувати селективний маркер раї для направленої інтеграції полінуклеїнових кислот у положення геному ррАВ8264.42.32.1-генетичної події сої у наступних поколіннях рослин сої.
Із застосуванням описаної тут технології, фахівець у даній галузі може самостійно вирізати полінуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, з ррдАВ8264.42.32.1-генетичної події СОЇ.
Один з таких методів описаний у патенті США, що зареєстрований під Мо 13/011666 і у всій своїй повноті вводиться у даний опис за допомогою посилання.
Коротко, були сконструйовані послідовність-специфічні ендонуклеази, такі, як нуклеази "цинкові пальці", які розпізнають такі послідовності ДНК, зв'язуються з ними і специфічно розщеплюють послідовності ДНК, що фланкують генний експресійний кластер. Нуклеази "цинкові пальці" доставляються у клітину рослини шляхом схрещування батьківської рослини, що містить трансгенні кластери, які експресують нуклеазу "цинкові пальці", з другою батьківською рослиною, що містить РОАВ8264.42.32.1-генетичну подію сої. Отримане потомство культивують до дозрівання насіння і аналізують на відсутність раЇї-експресуючого кластера за забарвлюванням листя гербіцидом, що містить глюфозинат. Потомство рослин, яке не є резистентним до гербіциду, підтверджують на молекулярному рівні і піддають самозапиленню.
Вирізання і видалення раї-експресуючого кластера підтверджують на молекулярному рівні у потомства, отриманого після самозапилення. Із застосуванням описаної тут технології, будь-яка гетерологічна нуклеїнова кислота може бути вирізана з хромосоми 15 сої у сайті-мішені, розташованому між послідовностями 5ЕО ІЮ МО:1 ії БЕО ІЮ МО:2, а переважно, у БЕО ІЮ МО:18.
і . по сЕРЕЛІМ ПОСНІДОВНОСТИЙ «її» Мам ддховсівноєа ТА
МБ теспроікеаеня, ШО наєтнай. Тс
БаєкайЕеЕ, Шов М, пси, Мі
Бахенан. Овувках паї. Жуахіле с.
Баесо,. МеБлат
Чекає», балейка її.
ВкЕВОЗКівсв. СЕеФфИКуУ й.
Неї4. Вкасе
Жакаж, Уаїієні1Тував хау. вла
Сівжжх. фам цейейі, ючи М.
Ящаїсв, Ке1іжи ХМ. кій. Тетхуй. «іййе ЛІНІЇ ТВАНСГЕННОЇ сої, ГЕНЕТЕЧНЯ ПОЦІЯ ВІ64.8.35.1, СІК ДО
ГБРЕТНИиЛІВ З ПАКЕІУВенеМи КЕЕАМИ КА ОЇ ОБЕІВІ Та їх
ДЕТЕКТУВАНЗЯ кізахорав-вОха «150» РИМІ, ай «15ії» і-ї «ІЗ» 17515, 34 «15їз Ваз 1 Ве «іай» лі е13е Жаселктнтєкнісв 3,5 «ії у «ії 1548 «Ж» ДУК «Щ1Яж ВітучМа послідовна «ЖЕ «МЛ» б'є рювзмнчна села» ай» зоцгслакюр ЕД глсантяйив сачсвавеска зогхачвака как ай авсотвІівх аїгасваєка сСабопшесеса Сслжесасасє дасавасвка зе 12 тхЕсхакске Кскаакатав севксасктас спсстактвсЕ сезсвавачет садатваваа ІН астнаквиси папгастлева авсомайаєтх зізчавссспазв васствоакай зсвсамасерь КІ акссоавешек СОКЕЖвЕсО Капацедцава леза шоєаю ствасвсатеє акчкакокче КІ кекеккеКе стстдецтнва гсасасвксс ссестазаса соїтсазаєся завести ХК сккскевееФє слзсатвктсв злектсвасц сего схвав чацлталсве КеКЕшКЕаКЕ зай зсксхзпчєт басстЕсаск здаесзскіоФя стсашвсссЕ свасадевст висанидвоє ча пиїесвіков звасзазкас зспсзесхава зЗсксйазавка закзатистх тисеастеив о тевазбідста Чеасазавев славч:сспаса авахсксоваса бкссзсаєта козсзавака БО візсаацксв Сасбдесвсх йралясчнаса аваесстаїсє всхтадесса свассавсає ве салпасавпяча слісідівав двавяйвасаєс агодсаваста садзаагссе пекеБевЕсЕ таз скоса со совозассвна саазазчавав сесасавнев Епадслотайв межа. тва зеасессвсва авсасееейеа ЄдестсСасає сакбсвуксаї ссовзасаввта ассесавкак що авсиазаєсі сага; аазавствка «саскатава йаззасисай але ав тезачазазу ча авекав СОЕБОТЕОЄСЕЕ Берекскаха сЯсзоЕїаяє Есе аде ча асазьвавса Єеклгасвой сКевіеассни аачсвчанов сваїсгдсаов явасссадчаа 1п35 зшисесеєсса сабасеееої бабнасаскї песовлпаває всасесткаг ствах 1по азайнсавазсї загсвсаєЄта каксебсаєс азсасзацчаа Збсдасісна авктдакааа 1142 зцдчакаваси сесасалеяї чернь Сбеесебав сСЕсСасрамжеме ажажкавекЕ 1203
Ессе втаь айпствчавчс сс всссса асрстостаєс сестад 1255 «дійж їх «ії М «21їйз ДЕК «13 Штучно послідзаністть еаиИ «ййїх 3'-грациачна сбдасть «ай
Басасатців СчаєссссоЯ артграссаве сссаававнес чЧрссатслпса актессазса, БИ ахассвасаєс Залессавіс вазссовіву ачазасцеспаст ссвайсвсес взпсегрксс їжи
Зочсслезсоч сасаскавеа зесасвотак кстсвпевівцс сатескоосК сепвскаова. 180 ссастссяавс сбахсатсеоя вастесавкса пехревонов васосаадеас спосаксодеа КВ с«азсвзаслас Фгчспазазса всссетакскач аакчеахпко саїбєсвачевя ссовавесчес зап сФесчекчуса КЕХасоеАяЄ сосок Ек акссом соєве сецечеве ау зи пеаватЕсот спазачесвака зпсавзсцалая вгйдчецвавс сетксокасє пегбедсеас яки кастаствек аствстаєтко сстсестсФфея сбадлисІе гедесасоса свовгссавада «В споастогстспевоцессазвацех пе кВ10х 3 «МТ В «їй МК «215з Штучний послідовність «де «ййІ3з порзбьер али МмКї «і З чассістопа ссвестаєЄєта ссачу 5 жів 4 «ЙІЇїх дО пвїйх ДЕК «йі3е Шбучна поспідавність «аж «ай» Праймеюр 4438-МЕЗ «Ох й тасвайсуєї бсасаасасв аобеа 25 «аймж 8 ка11х 25 «піде ДИ «Вії» Щтучиа послідовність «Пе «айва» Прамкаю 4835-нЕ5 «Ойм В. зіпсавенеаєс гісСсвсавйсат час: з5 «Ме «213» 55 «Фідх ДНК «ЖтЯ3» Штежчна послілаввість «8Яйх «гв3» праймар пили зай Б стбосвсвВес гзосасваєв апассе пе
Синіх КИЙ «ака я «ех1йе дик еЩі5»х Щтучна чослідеовмість ие «йЯї» Прзбкер ай -КпІ хцай» 7 спусасескуає девавесьа бодааєке КІ «Ж їх я «аБії» да «їй ДНК «ХіЯх о щеемчна йостідоевнуєть «ВЛ «йаЗ» Праймев ад» еМиЗ «АП» М авозтакаєт аапежестся ств 25 «ій. З скї1їз Ей «ід НЕ
А
«йіїз Штучна послідовність
ЖИ
«Яї» Пракмер 4238 КЕ «ей аввсвсквсо йесвеванес ваше ак «їй 10 «ів йк «їв ДНЕ «Її» Штучна лослідсвнкєть
Сея «йаУж пюепйеер ВО СІ -аоз 10
Феоаазааи чассовозоя зе зе «БО 1 «Ії і «вій ДНК «213 Щвучна послідевнасть чий «вий» Прафеяею ВЕТО хай» 13 свцчаиседе заасасолея вав ха «Біб» 12 «831 т «кій» ДНЕ «32» Щреучна поеслідевнікте «пз «йа3» Праймер ява Є «о 18 сасезвзкекЯк бакевачьсо ссравус я «вах 13 «Зі» кв «315» ДНК «вій» Шеучна песплуідсвність «Важ хайїх Праймор Зааш В «Я(ОЙх 33 екскабсез: ктавкевеце шестак хо кий» 34 «8112 36 «212 ДиЖ хи13» Штучна гпюеслідсвнійть «Де сиші пПюейМмев 4249 Ж, мічний ЕМ м МОВ
«4005 14 зЕпссааЕдесстаясваЄ 1 «ій 15 чиМіз 4 еа1їи» дик «13» Штучна лослідовність каш «ий» праймер мні Е «вобх 15 беазвтакосто сссасвопяа оче 24 «а» 15 «зії» ді «12 ДНЕ «ії» Штуєзна послідсвність «ех «ви3» Ддраннер сСИВ116 Кк «ож 15 вка дянта асабесава а 3 «ВО 17 в «ій ПЕК «віЗз Штучна пвослідсвність «ий «й» Зовд ПМБ1ї6, міченей БЕХ м ВОЗ «аж Кт сеаідчеасссцасвссвееваое 43 «Зійх Я «Ві 81 «ВІ5» НЕ «ВЗ Штучна послідовність «иа» «аа Вставка Телпонцюга ррАвВасЯя і незопені фланкуючі послідовності «айом їй васттасочакскечсЕссайсасвазовуасвзакааастасессатавсвевавевегав я пватгсскакактамхкасаяткакаснсасвкаєкаовсясяксвсвисевевав с котекЕе 12 кеІкскасскскстаакасасесксвскоВеЕ каско сскасвесвнв вас 190 втквакткссвасасксстаавоскатаєсскакчасеквазавсескскалакасяватоя 0 агсодаксксесескскескваазасезвавсвазсааасстчассатасакататссе 00
КЕБжВЕсСЕвЕСсСКОко ск ваассакакаксесевекзавсисессанавснааакеЕкадаа, зо ккеЕконЕсосвачатасстсавксвесааостевесек сала СНИ асетеЕваесчетскневксЕДКсвачатавехауксовевесескавслокассассвавассв «я тЕЕцеастовваєцавснескацевссовасаєсссазавспвасаасесьв сссавоовосв ве ксеаккначассасавасведссаасванасксасавссодтастатсвказаов ГИ агасаацткасасвасаєссвсавачачинаацатскаксве кава вв сазасавазчатасссЗоавнаввнавнсассвацевоатгиави ЕЕ тай
Бесосзеасоковсладесзасналтааавссствсачосродасацоваванаоваа ве) чавескссвевавсвідовазсвссесасаасвосзлісавоустваваєсва вояк ВА вацизазасспаваказаввазазокакацлачвапавовзазисч вставав че кзресааоацочсскстанЕксскессКЕсЕті са аЕсс ре вастустстісано зей зЕйакавагсарЕракасататавнсавасачааачівоваласавкацасавазс каса Кт захісагаківсвкнсвЕсеЕвсвеватавттссстадавасасавтеетасксетасвокх їпва зававчваассзасекактикакссскаосннсазсаеаачесавевоваве еАгстев 1141 зесцасовасаскеаказавкавевакЕкЕкекесвсакАвЕгенвасвавалакавске Ко кекс савстацдавч систе освувасисвирасвсьседассавосадснсса є кн сасассванаціїкночессвасвснтсеванассвовваосссссвант кована сау ізий чесвавкесеасвескацссвкасвакаитасесиссоваксстааюсва саван КН чесосовхкгавазнксссвастакассвочкссавв ікла кчо ва ку е вемавсм ї5514 чексоувассвадссававсвсаавкакатацекевкакакнваедюсеккавивсевивЕ 1508 акасавасссксксспаназахакссмасалнакахскдедасисіскссслостіткавкес їв пиксавасасолванрчсісов оса тлавсавс авг сгастассастее ів «кЕвссвацкаксвасесзазасосвесвасскес ас ссатакрса кавова їв секаесавнакссткакакассреветсавассстивакоавас кс есдасая са ак ВНІ свазсацвасакаксакакссвоцраїсасас часті всвкасвіварсастваві ке іно чеастзасскезаззасчсвсвісааспазаватстасиісвазсцлассовааатагзіваата ЗВ текс басклатававкссссскакавствакассківакачасеасосЕскнкава дже о лазатжсквасксксасквасвсвевізекевескЕаесваза кс лес ват вай зазсвасжкссасстлесававснавазвссвнчивавкнковавассосоисавваксова Ой ссзасесваасєсвесвсавеснакепвех сс сдакававасеЗавесавот ох ва кеакекосасссссаваксасзаказехкказсвзікссавазсаскаксзазе аа ка ій
Хсаакатссехссаваксквссвазаксваксзацссівевесасі аванс ка га вечевчасісввсселсовізакакскавккасесеакссівававкна саке ана
Екзасваскоєсассвисчавонаск насосна иЕлсвисна сазана єваси кл зассасазачьчасесваастсоавагагасовацавасвватасксккаваайваві вс запа савіцассгточаасаваавчвавусоаесвеветеЕсЕвосЕскедавсаадевк шосе жаби звсвасчасачсссесостесосате вас аснсопоккесв сала ско тази асскаскзстсссвасквессвесвувазнавачедостасса ско ас свссвася яна засокоссссцнассанаксковачевсвстачасоцасєза вав украв ссвдва ся ад ласесткЗекссцерстаекекЕс:соя г воВоЕ се тасоассавасвавчавокое Зо збрсавсзассвалассссовачессоєсабсавасгосссвасеаааокетевесне ав
Каре сссодсессасассвостисквккасассковвсеваавссяа кв Усе каве зяхй заасзваєтоасссве ее соезкнкссвсзссаа совок ссде сс заяй човеасебкдессаєсукссосоасосавасхсосопода св ве павсодосове ее ие зтвсксасска сова сидсвивзквавскксдаа скоса са а кс ва БО кетеакаксявсвсЕовсЕсасасаскавасконассвакскосвосавнкекавкиє ійпкй заваЕсЕвевасазсенесковінавикозанокезакьсеакскАКА ЕК сенсодавак ли сстсбавносвсдеасачнаннссавскасасаскасаалваснсс сс сачнееасевя, 350 асоєссввасссвасвспависаднансесзовсцсисзаароуваваасосечазавсвосв зай алосссаксосочезсссвскваскствозоасі гав кс З аксораавакачесасоснескисеодасосасствзадогсссвакаведасоцаваьс КУ стспесвевазеоксаанчаецанавссаксассассссвзепа сс санок За теессцосвесч скоса тстссочедевсвакозеЗсвквиссодес сок екв з4на ацасчевсссаоєсткосікайекосотссасссавсовкссвсесексковоЕЕає за54а керссвподевосслевеіссссов киска все виб оесицЕсвевчснесевссмоеаовкчквевкоа сади савссцесиоовоав в ай себсесаваталессессоєд текла сект вс кс вОюа УМ сккЕспстспевесвссігевслтансксадевавсттсдеасспссстпсдавекоденоє ВТНо спесвсзаєстіссасазссасансссстесвавассдсацеассацесаваовавсвоє ЗВ закохався свосксвасвеваодеваескстацачевесесдкаксвЕстевноскся БЕ чЕсзясвса сич есе ше ев се ме вве ККЯ сазессосвасесевссесовсослссоват сова савссовсосвавовесесаВвоси ЗК пеасабссєсавовосезанолачсвассаосвосаводевсвсвавснековсквскса є ОА чевсєсазасвлескоаксесдссвссалосвоассссссласкссаксвсасвасяца 1 счдосазосасессвацовавснансвасвссспсзсовачсосчекевамсєаса ши пиаштссесавкоеуксвстссессакесе касет ссвесаадсводвадь ка У кесасовлусвнсвокавсвсськесассавстассосвксвсза коса саке зага певачадскотасстсскесквасвсссусеассовснвассісосассвсаассвасави ЗО кислесивисЕсешевасткосспувессвценжавнс нак ксвацесее чад падцсвізчтачкотасвсссковс екс засвассвассвсозеечссссвецев аа6а с«васчечсесчадевсевавс се сосцавансчвсвілсвоссосоЧевисекивсокх. зо шпееззастассьссірововорссосвнсвсонессссксодедесмесвс ев вий тскЕссЯСссЯЕКоЧСскоВоВксВссаВ сосен сца сома дао чЧасечкчвасткавстесестсасаасопносоастчсоуксоассовсопадасстксовеях тай жи зчачсесасивсвистосотсеодсвечасавсавесодвае косе евиою ка Сян поссспатссастасстосвкасактспавскосскосассу сс асаааеваааное чо
Ччисадесиссккувсвисоваа сосен асскавцдесдве паса зав саклЕсадестозссдосис ос сспосиваводеспеласедвораденвсвсссавас дз скасрічассіцснсасЕсдвагазовавскоаасапесвассопоавекессвк ка єюсче во пазсгадакскспваввавскостазсвстукаасиссассасксвавасостансссвое АБО девссяскасствассанвакаканссавзазчуатсвавасковсесоававессьяоюти Іва теза всвсочекадвасавкдасаивЕсасксасавасааастоцессатасвсавсквея вах засада меси сова тре ме ств вк єдвст все авикиа зва сапу лісасесвлсвлаєстсазезовссавосси как сессвгааю ода 5345 ззавтсотавасьсьвесавто свв се сце вставних зава азаззіїнаксаваадасстазасссставсставссвзсвсасазассвквоссьякіст ща садссглесднсстесспазаєссласазоасссеааксссставассссвовкваанссятое Звай кеагадавсвазаатвасвохсзазазсвовсс озон ванавіченавасккк вина вка зачсавстачассусасвесканассивасоо вай кчжатасвосоабссваиасаиасававксасосабвавсосзеставсевееккавко 57 зссосгсгбаствиассвоссоазе оса всацесвсразовассцьксеЕ Ж) кБасатосодсоссесавасбацпозіварсвадесцесвазатсспезасьсяцалеяся БУК звастдшенссассносвосеяскосанав есе ока екв ас снисх ЗЕ кЕйсваціхтапавсоцаавайцчаепакваовсва дак капасова кет со зччи їеваслпсвтІакоцвуастелевивасвавстасвассвтатостевдтакеніу нет ки стен псасковсвскцасассосаасакасватечасаскоссттетккспвосвсивататив БОБИ севзаксхвеваватековснтаксвссвасюкаксвах со вав ссавсяик «320 закгтксескековсванскакацаессавсвадвасесасехсвасалахваєвтканскаке віва
Касзсавнацвечекгзазвагсвеветадлсеавайасваєтассавассочсвассесасаввей УА савасацацзсасасзасакерспаачесвовааававкссочц сова кгсвассв 5106 каву оссесасьідсвосасалеастатсстасьстсцевзаєсвкстсяусаксивавх зай спкадстсаськссаподсавсестдкчквіссароссьсвастсасасссексекесдасве 48 чевссовасацоессосчсевс сосен сао сасавцкскстасазацаноє чаяй вопчссесосапьдастцасксдававасі і нрресасстеанвксвассваксвлааех вав ссЕШЕссазвассиковасеі стече акчавее вас есвувасесяовиа хаепа взстсеетЕстксасаспесевсекакскайазазкекекеЗсасассаксствсрсневх 256 часах свававнесавиве сах сасроунасідавсяедецецссввеьаяпаКо Що зафссссазабазасвессві совка івдавсі вав аасаводваковвассваці ас тн авссаєскеаксксЕвЕбавсставенаси че ксассзаєс ка вівса весь Ву чссавахсаатвассакасавазвасасекааханивскаалааво сватати ака зап вреуксясааєарцесасасолсвавчавас касок ссссааоавзоссвсков ака аа задсессасекдсаскадвевентспевнававинасквавадсаванцвавсяваоюссв за5е взавскескасвазасасзавататестксазкосяеактотасссвесзактсазвкавскиє ав свабкекслесЕссакоечтакаксхзавазасаваассзквассквааваяасаканах 7140 сесмесеаЕсековавассосвасацксяча ска сЧаедассвксидава сс тя кеозасовсксацівасезасзнесковааньошисаксосотевсвевоац ес ТВі сзесвасісавашсасвадьасоккссоселсскаала в каже ока те ТАЖ евстксосотосавасвзастесгавсасасусиснавЕвкаксаскасстактаерксво тая сессстзостстстооссвосстаеистссссосоекІКсКсосспстосткстасазавс за затасссайвяастссскссссасавсссаовкексазксксксваєвассківанаасскх зара скстсавесекессстассчсвссазодевазсскскакоуксссусаскстсесвавнве Зо ккесаскктекокксочктедвс сера сокасасвекескскавоссвавекекеЕа чтаа акстеацасесавтасдас сн косе ваза тавтьсвоснпавх зяб зацасскеасаваекассивсесчасеоавесвавовавеновао послав се 74 сЕтепвкктскзаккЕсевЕссвовеснасцЕсвакк Ессен сваввЕ тала чеосовссаассовчаиросскаскавсвововессссвксвсовнассвсІсксова тЕвб зарсеасвосевсоа т чссесести чесно сов свассвецессвсасег тя часшесссуше осо ссесмссноцсва сосок свое зе покора тла БАС КЖ є Кк сор кА АБО чада сстахасаскчекессневесенаук сива сноку 8106 спстсадсатьсесевщевсачсвосасдпаса кове са коговосаанса бас 160 казсасвссовсссавсскасакчссатосасоцсксааттапссдіасЕсацеасвавав УК чЕсуксоспоасаецет ост осачавсскосі скоса соте соводасвює вищо сссзаксазевсазессосасксскцЕкевссавачесвестспесастсссьсвеевах ній есе кесарева свассвасвкавч вк аксони ке вай часасесастусаевсісессстсвовссясеовксзалвоасосасссесвчассечуааоние віБо звесесЕсзассопесоассакчессвкиссакесскачеак ес асопсацнсккаае стає Бай єдшибессгсоавоччесаскаесосшскі сс сиссосапаті освоює сасюсвва яв кошсстестосаваа чес свасспсЯскопетевасечвосепацесе яка касчаксссвачессссесвецедакосеачсассссеаассстсссведссевзиаавсе Ос сазедкчекиусексесчоккісаа акаде ссдксассанеса а авїо акегетвствако тає аа свескесвсваасосааеес пси есдграе но кгайкатспаватесвгссадваакасвнаасае ска косасиес соски ев г.
ЧАН кседскатсвкалваваснасдаваиавас сват ассісаввсасевевопаст пса час казшрасоссівавсевистчеетоцесаствсвсаексвекакозесовеаачаксяооя кап зсзсодавтасксттацінсгаксузсвасткасктеваакееае два свакоя жо стасавкаузассдатзаваєсвзасасвваоасваа ся ватссвиукаєа ета аттов Іо ссслваковскчавакчиклачкаацаксаснавае Кс асасуаосава кис Іо саоссесавнеразсеукзаааоесосвлаасоцевсма секс дес аск ЕЕ чІсЕСЕСтсцокЧееексссвавса дова сослацуссодисодюпесссоумеюе я сЕЕЕсЕсстасазасьоще чес сссевсаасвавь кави ссодачс ее баває 36 чеопссчастсавІтвацасечнсссссвссвсвсссвдавичкавссвоссснетассев 3420 паксзадзааксосаасекокаєсупсаналнаствисазтсастатосавцексаводсевтая АВ псацвисвасвіопссспсасвівспесвассі асп саввзаєссазвватчівсадаєася КО двасескаивсстесачвасасицвав вата києва салат аокх по «кий внедвассе кава ваше чання а сага азаваау жає жксеядеЕслакеве вва сао каса са снасв Кока во се вас кавер сева ЕКО закавсесегпаслвавапазтсссптесопеветастватсскесвсатактвкессасия Іо сквковкікчсссЕвоавеЕессквкакавчсвассва чем кексаввссова, ЖАЄ авазавтстласякаансовкокосекочавосаесковчаасасвассоввадава ск УЗН чеЕзацскссттазавсеосавасстосечаваччазасева пана скачасос ев Но чсеавсклвівкачесвечакекакоасаксаскавсса скасована сю каса її ааеткЕтапассадасссасвоасассасвачассваа со засесазвсвоцседева МНІВо
Ззагецасасссеечессссосооа часа одваскескасосе 15146 шешесскооаанчассадсчасосскасозс т осасиче трава яскокекаєчечеса зпо50о сатаєевтсввазчкооссстадаатссасакснкасвсасассеасскаадессвоя ва споосесосввччесеквапоочнесо свв оиссКкссанасдвосес ЕК 10336 зичстосетолаадссксоацсасасасадсссссоекасакечсоосоеансвосисвевай їзІ8а сна насвчсаков свое сс ково евадсвссо сов 20445 зиазссаче каска касссачаксьзачч асом скснссаекгне МО тис тасадстводакссевівдввассадесоссвас час очнаксетосовкаи ЕйЗаб зазсадесчессазаксочестнсзакавстескказечсся свое наксобавсх ї5Е20 скасована четссячезинсаваа ко саквгвасасацесасосваветаво ї0да севзавочтуаац сис аіодссевесвчсе секр асавненсьесвЧкскава ес МЕТА адчисльсадсосчакслаалсванвавспесссвасісінасваресакчеевваксиснвиеий ІВЯй зодататізазакакаввексвісаствататсваксачічевк кохав касах тавЕб
ЕЕкссвакчкссевакічкодескаеякавк сосках асан зав ккеккскавсссличяксавасавквкакеасквевьаксекклечаск оче сосяєсава їпоцо зЗсазкесаане носа соче сосен сессаскЕсасвакоебасасоцсасесся, 1104й везла св кис нансзсчеснась пава сваксаваоессткв їй звсзвазеатвоасстанвкакссаксоаслважеа тес саван окосту 13180 авазасвівваєекаксвакосавасс как сацинатаєттсвзатвасссвк свое ке застпасасакіхссатадаславадасспачечссататовсдовствакдевкадени ізо седрастЕскацісасстаксаповаксоокстаавсссзаваствоепеакевеавех їі снсаєсйсваксвосісвкезакосекоаослекааскоксак кад КАК осажу 1400 асдсзоскодвазіслсевасквквоав у вксазасоваснксаскссвневсавка ї1450 азайстісєсрсавслеастахтлаайстакскавуснесакесоакткасвсакцкакств віщий пссескоцвеквкаїсакеуткававзас ці оссявсеассааскнссавсвакассваюанивие 150 псгавствоадссовскавовавлевасстсвакоасеасссоци ве восск ас Ко оюму Віа задо сса єс сисасакоссве в роспскескасоводассцеевес свою, іти сассбславтрсоассцІ опе цасдавасессвауцассвеві копала ссвасцвосве їїтей
Засспсесазссетаксвтивсодпдесвсавчсацссаналсстасотасле кова 1830 аговалсодевеЕ Еко са ссоєвве соска есваве сода, хів целазазвлсавссапанатазслввасчсссснкавсусвтсаствснвскассвескасе їх асастепуссескочсзавассовсссксасеасоцевсвсвесааввансцаскстсксоса ТОМ всассваваее їж «Май» 19 «вай СО кій» ДН «тій тУЧчЧнНа послідовність «ВХ кий» 8'-трванична сбдасжь їі вставка Зепзниюга «па ай» Т-витавиа Теланцюта «йййх 11. . 1550) «ОЇ пессвсочов сесцскоєсве сасазоцшасе сазізавкта зсксадваєа басБеБеста КО засставатс ассавсавеса свспувесвів стацасатає звеватезев аеебесьеке їй
ЕБЕКкассес Котвасвбат секс сассасКЕсье севсасжеєє сваазседада ЗВ аствассЕтс засабкцєва зактакжеск арт бала авкскопсяна асасадакс ай зіссдасвЕтс ЕБЕбЕсЕБКО савасеенв додааксває стзчассвеЯ віссвсопеаЕ зай
ЕЖЕЕКТСВЕЕ состаосеват гбеасаВЕаВкоВ стєттаваса ссссСаааваса азакеказай ЗЕ кстЕсакссов вадасасксв вестссвасз стЕстттавс двозкавсвЕ БЕК ях вежтказчек квискскакт аздасветеає сксатетажЕ бвакеосвсс збсаачаєса СЕН їтктасаскев закозагвасх зогакставо асксвавзаса авсвааетеке сесвлєдеаса, 540 ксааксвата зсдаевавео овакхссазсв заатоковев ктссосасЕй єсасавовна УКВ авсвсвачкта Касазсессс асзаалавкаи пече гате акеЕкаисзакца гапствзсве Ба спзасвавоа Себе вадедзесатє вадезавцак зЗапозакеку кекс ссх ше ксЕдкеако аа схваеверзеаєх спсвовсдЄк сеадаснобгаз задля ЗБ азвассксаса захкасзсаяа рБУусьссвсва саксозевса зсбзасасозв аксебокає вай звачазазакс сявасававу азавасєтата светацваве завшсчкає лейзааавов зпй казка зеЗзаскеав ЕЖеКОКсКО ЩеКЕКЕКака безе сов квас БО дгазслнавакв весабасатв казквакая зачати свастаоала авагсткаєсяа. 1030 зессакакеа кахасавеЕ кКатазбвкх коессзцваве асаскевває БесЕвкеасе ЗОВ завачаваєсс йабсасвкха сзвесскезес аосвоанаєав збевасссвйВ асесавсвев Зі ацевасзазта кЕхакавйаак закавсксЕт тЕКааевевВа ска авсва давабав БЕ ї520
КЕКЕКЕКЕНЕ мескдаєвтє сит аксксва якЕжЕЕЕК сесбцассво бсзцеабсає ізви косщаесвава ЗЕсасшосеа закачаексова вастееннх скоЗеааеье восесглсвт 1325 чЧесезааксея спртвацеєсев касазквкесв сбезмосвоае сегагосоче сгопісагоо 130 зссоєдасев азавістсяа срасакстсоя всесваксева сскедевесЯ адсвалзвсяа їібал весссдйвсса дассвавасе гвайраврата ясЕвесСвсвс асабчусесве ваФфаєстЕеЕ Ра всацавьсБЕб сібізавала саебссацава расссдедво бессрреуюа 1550 «ке З -аіїз БО «п12ж ДЕК «и1йт Штучна поаспідевність «виг «ай3» З'е"рРранимна область 5 ветавка 5-мпанцюа «й «ЖЕ Вставка Келавцюга «ад» (ЇР..4175І «еаййх га чЧсасатацастасасавсасгарсксвіксасцдекссоравсязаксасеактадасянксс в
Каксакацалтеосасксваваксяпссвассесваасава скоса жастос 128 аствсасккаававнсскссцсяакосах кві кава сте вассоспаве кава ї8о сеезсабсовсососккоассваскаастесквадала осо сасдєсвастаскаем акти ші савсачовесесвавестанасснасвавнаазоисчнацвассивасасо есе ЗО саке чн ачсоасоесвисьсасассссвве ЕСЕ сстаєсвсцесе ЗО бесазссассвесссознавсссяасеучисопссаасваассосвадасссоса в очаса ай дагпастдсодастевдсвасуєсвссвавасосувусусассавлсадесвалаєтасяс БИ ї-юшщкасксасчазтталестккооккокасессовацсвосацавослеєтЕстадоцкає ча асксаццазжецазавчсвасчачаааказсуаансвссксукаккивесвевастах БИЙ ассвствассасаєссечасккссасчсавзсаакавск осока сасасасвсозааасоо аби сексЕсчовессвгае 5цИ «ШІ» ЖІ «ЕЗіх Паб «ійх ДНЕ «ха» Шжучна плоліловність «Вуж «иЗх Лразміда рравазб «Ай хі зибседсарс вісасаєсаа сачсівдосс суватачік: давасялвва адессоасває во тКсапесстас зпоссаваєс сосксссадс спізасватає Каєсссассов вісставассе 1 чЕчсчаісає чадсесоасцвак Казавакскс авакстакасех чдзссватсу ашеЕсссдсве 150 чайна завсссдавс сазвзаєсайай Бабайзвсатзв свв ає ахтасавеесе 40 кссвоаасоЕе красечавкк стстсканав авкзвЕстаов звасаствочсо ассескскох З) сесзсввтат Єксускаваж абссввукаєсе ссавкЕКЕкає свасвссава База їв кКаседксаст кЕсестаєсав тТЕшебастза автшеесав БерекокУусе срсссакахх чай шпасатссчесяв авсосассва авЕссссаєз сашеЕБибео зеасбсшаня бепласвкся «йо е-равсксвав чсКавасвся зсасвссакє десуоесеає савврецчавєе сттасалса 4 вккастаайс сЕсаствасЕ тбсвавиедо вепісааснця заазосавіє звавсдасева. ГІ авізазсзва Багпсасцзси; таслазаозва аббсоісскак зазайбеве Байда ве касчсската валянки аскосвасва вовевсвсвЕ сЕаєскаєсв взвавескдає Ка авацінатак каааакскеавсв сксасссаве авайвазаваав ссппзазнато севавовеа тво плсазавсоя азссаваїтсса аассаавтаса сісоюшевсве сссвакскта взсасаавосо Ба аассазвссся поссдеввИс весесевзатс акавсаєсеск класввЕсса йспакакваєх о завссазеве сщЕсватаес сбсозаакжЕ сусваавсов зЕсеадеска газаастуєа ако акеровастк авайсесвсєс сдасеасвеєя Зсавсвсчтв есесаескеця геставаадав іпла асвсоєсавя сзорвасває сбсооасіазз задавши са добвспасіє зсаздсаване КЯ ЕЕ) сваваюисав казассекнв аесезакоєва зобссзвавта саседзавеза свзазвсзоиме 1145 кавдаванья сесавеве кесансагватне севавдтеасе КЗКЕКеКСНЕ Кокс зансоя щи чевЕСсСЮССИКе КайечайсОУч савекоєсь ккченсасва сВкЕавчсК сосееуеа їй саваавЕКЕК Зайстаскак мездоавевкс сЗксксаваак зебечосвсс века ах 11378 сссасесоса сорлзасстьсос сезксававо ксозесесее базаустаєс вправах ітяо асезвцевтвЕ ацавшесткоя скстеасіска дек сдфеасаксвс срастаєсво 154 зсвактеакее ссвессевна аствазесес ссавоевсво сассвайчеся ссснассава КО соиіассоо Бо везЯ бтігагватсяа ссфісасьціє асасстсаас свевассцує ха стакакетва ахазазчнах: дес аЕс бавесовеак ссцзсассвас зчЗосдасовсцЕ їЕЖИО зссенсзЕке сащсвсєскт Четсвксаїс Кесспечосая аосксссоечу асакавоває 8 свссскекс КтакссксвЕ ссакечЕова аксвпоавнак забез кксЯя «зве аея Ма ксазазЗссн забкесвеще сеежксхок асквяачасас завасєкпавЯ саеББкетеви ІБап севстсзаке совеаакека заесгжтвеЕ Ччаїазезсва еастсрзавто часебкаваєе ча ксавседева сс що вассевсвева адсзквастья сасасвасва Чавес е хх
Чевавекдєсе даздесссаа сспайсасва ккмзкагваасс сайесзокія бипкузиедеє ІчЯ0 сомлуваааса савасдетца ссозсччаїс сяскачкоеє апвескеаве Кесесдасова ке вабостусаче асаесчалоє зчкосвміва спатескесоя зецоасесає пос вец Я) пак сосає асокодкрово змепосесава всачаватеє зксассвакеє Кекс сесеке зі чкасєсакся весасечвев собосвасво сксеоЗсзчє чощакчасде засачессе вав с-ссЕксскоя ведете ссвосЕачЕ Каосюссяко сопрщассчєсав свв ЗАНО чес ссекик аскскссаза авФфосвосятс сссчЧасєуасх чсещпасесве сопсазачад 2340
Фееаассаса чеватачксв Козова с аечсвесвсоя вЕсагбчектча саксавкече 4 ст ерроесеьЯк сіссісссва вксодсрссси сЗзаспоапесга дтавсазбея состадцоесве 2460 ччЕссвкзка ассесспесе ссевссвісЕе свусаєокев чевавсктса свссвсесе ЗВО савзасьсчаса зсдссасаве сстссасаце сасавісеї ссачзсваксщ садсвссате «58 сазнлевасаєя збере стсе вовсассасс сссласаграц псасЕскевя дечасвкея. ІСТ їбсСріданссо сескїваєаю взцвеїссас совассаєса деакесесся свбЄсасасс Те зазасокЕсс ассазасстсяа асзксакЕкес чесне абсоспечаска агстаксвах 275 «авЕссплеюе Борслесвеюєю кзаеумеюєсвЕ ашезсссясс вфсстовее сет зв седаесостс аійсачосву зоБасос ее сгбдссвеса дараоссеки савекесесе зво пасасчнасе загс твчї сазссесево декавсавссв всабскшеаєс свецпесцево ЗІ тайсссесаса всесвзачкоде сеатоеФфавсс сксссксаєе сскчеатастє сабсавеево 3005 «чеватчЕсаса кстсесвссис селевзеаве баса ведете са коосаВкеее ЗО апевктесес вапаазачек Зеаскбестє касове Есадебеслиа Вебккссаее заза асачссвйсея зобасааско СЕсрлзсаще БЕК сомео бецпесаєзчаєа засос ІБ певсавсчес сежечевішЕ астешсаспьс сксасьсссс вссвсцекає савосескк За бобисссско песвецесою совосатеве пасссдеете щадне пес ЕТ газсттєсвся спедсспопвца КсссгЕцес дедсбосацє всзаксесть садедесяде 316 сагчасасста зсссксссцс састслссаве асхаесода сКссешеос весецрссшеє зЗади чассттєчаве скпастскає асесдпачссст скопавсяча зЗсзаєсцестеє бецесвеєла зана чечссвксатс всечешоеєс севквсзвсво ссеедев бастдеваев сте і154а сокчттосся свпЗссезсс всасотасаї всаксоваєк ссхесассек бескафаааия зво четосесава КеФсказеєсе секс сСЯце оссподнасесс спепкспевек кава есевух зва свасяцедес вссвовскоцє соц асвоатя Чеседесесяв соввсончеке сеть зт ччасатсодав ассеворочаа гебасасаье гайспасйава ската ваксешеошах зт пстсвткакс сагвйстааєе Кохсоспавтава апіесиасас сгавпатаїсвс бастєавехе зва ппіватеслаєл вгспазвтстсв апсдайвстад всвлаассла звсопцевнаА ВсЗасоєда ЕТ авсисваці ссісчвізоев седсгсбастса абпасаароЯ сасасадаєа паб зано твезассьс ссзеустваю пегтевечрєви разове бсессссиа васодасез апа асбсверсбе сасаєдцеста бодесостє азасктввава сеасодесоее ваБЕЕсв Зо сктесзасссосє зсезазссся завскскакс чЧесебазазе сазасечесе ззасасеває 8140 азсепавався Біпанвесьй асшбвеадвс сСтвайлоссосе паягсіваїта гавасазато Тева акаєссьчко бксусзссзач зЯдЕксдагза ссзаказесєе созасестс аввчссчача зла чезаксчнЕ СЕК аєчаай вацеацансо тТокзаєаска Фарш зопзавчавне Ф32й алі ссвсадсай зобесусеєед бсбасскісї дассаввосва абслевовск 5380 в«атскавсч чесні вЕ свеасесокк дізсваквав яКервеакавя васечеесоаь зе «ках свак сцасочкта хакстачкцає ссссскнлаємз дсачсочавкао ссасізаєчав. ап кезисЕсЕса ссесаснетх зсчссасав зекйсстесай соваеєосусв акаєсккоух 4550 встсщоавай Сас єи ссассасаеь арстсеавзає сессвсакє КткоаскЕка ча авазсосзсв авеісвсавацт сасавсоцаа зезвовсса азевснетев бЕсвевскда Но тКетасачка «чекай чса касчасвох бозаавасає змеасейреоає зтеасранцсах о каксавачески Кочевестмаї атклсасаски села каєвеа бшовбасьчс сбесісеоуа 00 седкзаатає свссвазесї збайачееве кока ассал чпсЕвЕісавк дедвавспеда Се ксЕсвасвет кгвакстсст сгбісадявас єЕвснспассаєс «аадивсаєсає КесвасВеак ях звацпіавессва сттвсевовац зоецетїкаав атсасасіяна савааветав?ї бвесавессну БЕЗ) скасксасааав сводвасваа дсасаєсвса КерсСазвазсе асзазеазає кетоз я ваз зсаесткткак Касавскакш ссвасткчева сасаваєскат скбесксксаз звашсвеке БИК) асчсовЕсвнаацн зеовочсоксв сеІксавзизаа зекбвчкака сссавасскс часове піво кекпексовно аісивсссеє саден счєв сексом самє ово. виг зБасазазаа Фделедекссоя спасає скмааазоєє спосцассво слодієсвася вав шессвозака єкоксаскЕа апаешееЗав стесасззат чевелпсаїся зсечаїлакс 5349 сацизссоЗлав бавцдссссес ссбосасато пвасскаккс айчоватеавї Есасозгасса ЗА тсекслісас аскоссаєта аідавававї атКкаскоттє апспдаєтоа асассдех чай пзасакчеа ссзаадсесса анвкзатлаксс зскцасасах зазекатйенка збвзавазсва БА зосазакає садвссаске чека асани ктсасзавсї бю ЗВ чісвеібаксс басесаавісс засавосака безазанаке сеабзаєас зозваваай А) зеацпазакоєеа вас ксваса зрасЕтасв сднгазазав чає савававкЕв Б зсттветхса Квас сосаскячаї аватечесвва знедгегнсвав аванс ЕК автсзаздєви сдваванско здсвегвтахо ааасзсвее севфбесацки сЗмсксасеку БК тксавекакт зчесавсскс аздстекассв кеакакЕсаав зазсвайзоя згіватассаа ЕВ дацавзсвква апепвайсча ссвскаяевкс бтайсоче Фякеїкаксй соессуеках Заал ззакслсчах боМсззецан ксзоекавсла заебодогссова азшкетед чесне веве БІО асцечусчиа сЕсСвссвась саайфссесав згасає сспабсгазва веївацасва она кеачесваза асавесоксес Зслптзавсав спстєенасвиє века КЕ КеНІ зай стзвкедектс ассоссісва скоб ожд вескаесосве сстсвееснке секс віта сееїхскаказа астзвзасассев авчешисесес сосСсвсавскс зчаксксяак кесеосвав вич скоайавзать сьсестісайї КоКЄкжтваксо чо освеце лаз ОКсвЯ со сЕка Ба тстстопава сстсзаве БеКсовспеКЕ сежесессває есе кс саке ІК Сен твсаттскс кавссівасв сгпледатраєца тестер кате вка сакабсакек, ваш їзастсссвпа сказав с асваасвіса ссесдавеУє Бсзавекаве качає ав ссватнакта сєсессесчаке се аакКисх ачскасвсеє зо ве Єсбацессоє поза децасесцавї скслрсецаттв зІсєссвоать сосок аа свовцзабебс саксшекесву ай аспаєсстітс завгсгасасєс састдціпнсє зсесузчєоакоа спасваєсає безе вав сктсастасас ктІсвзсщатоє сцчсіІсеочс чесессітссасє саспсссшесе ссвасаох ат сша сс ееадеа зсассксаче вакчассває азвассаєсво гесБаваєте БТ зЕсзцачцема есе увасех счасчзазах часа ссаквссстя Сосстаєооса Ба засос Сесешежеюиа сшересотєх сарбеек тактова сруксає ке Вч чЧасласакся секчуесаецс сцпастсдасс свсатяпсвос Ксагопеїта аацвасопоя тен їкЕсапчеделпу злесЕзчессс вуса ктад дасасадостї чЧексостсєв сакезаєщаеєса УНІ зетовссвиФ сссесстозіта чдпесзассоат пстстсаскс апгелагаеакс кас єсви това тисетклх зеклесацет саячетоалаа свотапссставе впсспеске зессевлака ТЯ зеаксавічоса сзсбазсассас посваскесх сббацеєссає кекс зеееекерну Ка чосжазазчєс севпсскекс зчзісааасає багасосяко ссабесмчх сатсдпесота таБи чистраассщ ассшесіссе сцЗаачеаеКе чкізаксеки сс оеи Киеснкааки КК шпатоєссвсо забтеслсвнс зазнає яса Фе заижм йатайстлдекя ктклпесосат 718 сшіссіовзшс ссбсдедакско сазобсцеса себефісннт: Ззнарассостя асеодесо тп шертесюасеасзав сказ КшжокЕцеке совслсавееа «квас стелетиєсх Ми чисассвавзса КазвекекЕЗЕ совабегаєссв зартвсоток скесклавкя садкекове та рістедозає рікавсатса аазасеварсо зозавгівзсає аесатьовах сосадвства ТЕ скззатавос звЕстассає савсааеньвох аселеваєах «бкакскевоє Севеаскаве НІ тезцовссссс аксзаччасу сткАваккат песо аскасчесвос акеритек У яввавсвітав ссвевсцпава гасксопргаде аскатспита втеевоштеоа азенктеаки УЖНІ зчзавзайсева сгкасакста аісоуволаза свахтаєвавяя асєвоееелваєю севсвеаеве їни скзоазакако доесевацакї аегеазлякуо фиадсваємакс оса Кахаохитес тала візчістісва гЕсаслсстав арчщсачсвя вайгасесва ассцесесвь вже лиаде тая зсевксакеса СЕК чЧКОВ ЗеастчессїЕ пдссвасасєсют зЗадсстацеє Кене 059 дсщшотпюнесо взсбЕссеоЯ Сасасчааеце собесруєсве єсазсеЕнаво боагветщоеоє віх чачевиківа зсЗзодессоо сові сзавоц ссочеерося дсавйвоссву вашчтааска Іво ксозацаєчх заасассваза абксазвесвЕ басозсавнеяй астаховчаае кабеакекиаа ва щобсвосвац адисаоцаіся зтеросжесй сабатссаве сідежоксваа азатчуєсиреа пава їпсвасапата саздаісстз євебоюсада аевсовашеав сдавівсголе ваші пев взяй ззааозасса послаздава асвгаїєсстча зовсасавос ассчасяавсз асад аа аЗоп чвацеацаєсв засо чїтча КуІчКоааача тасаталеєс асасеотеаи «ек аве ва пілаєсстоєото авеажкаассх Кабсаслває сдааксктакс ссесассасі БЄаїссткста що тасіестсстя сзссаветкве дссстсладо ЕсЕссіаЕас засдтавссва здесспосавєс яБаей слеогзвазса асвасваавстї Ссслпбстнеєбс квЕшскскЄ сдазусастда здовсвесвасе че ссасадавак зезчовашеск дкадессосс амусескссяа впаепоавсаєсс адке фаєр ЯН васссвчєсса сассваскса себзосеченя зобочкщчакяа кещфхівасса ЄкаоВІКсв СТИ висно васвя сбщааєеккв бесасавсмх смеажсаєеен акраехня Мік мав сич часктеактс задасвовзсе сессіроцова Вокешседаєю осяє сиро весове Во авсуєстаст сітссюЮсестоя свелвссьсавоа павсесісас) вікостласації сдводедевее чай зЕкЕбасясов сасаєводцеа їсвевусзтбс засссавдває ссасаєсєтєсоа сасасаєту ява й стквадеєста їпдасзсчсв азщькскавз побопочаска тег атаза соктссава ВН. чакссясска сеяпуттяса бачає ддакасасав сесопуєкяє ябесртусея ізо «скасасвса засакелеся зосакзчек аобочековЕ зесазачача хекеЗззЯкЕя ліве шпсажекешки савазссвм саєсчксеачек вссосасласее Звозвеасосе Кс ЛІ ссаспечско згеассіна васолочаєєс састеєстайє вейсссскае пос стецеве зп тспессстста сіваагадис сссспцакст зсизсавтач сесссладчез ссатссслочу зів «спаслетат стдеосрвеа зсачктсчсот слосдсавени Кссситесаєс лає 4 попсаазстда звсссавсаст еаполеспста садексксац веЕсестосота авесосто чав тскааслає зоелтесвтеса сере мась досасимасск сеоевстоісяав певаевеаттх зас тдатсестасо Саєвтовсєсї завЯсвЕцта сЕсассвотв абатзааєсам счевЕссеха опе хвкшіасьас зЗассєссвве счеескссзся гецесоасвЕц їаакспдесух Сапвозакаа свое сесссодчеча стЕсскстса асссаодаси злакзаєаєя їбаксакааї со ооодася ве чес стекса сасцавссоа еапччсися споксоєсає свскссесаве кпсасваккех во зсгасакакскх дасавнсваа зесставсає асїсваксосра аасесдінта соокаввеца жна акчакаксос зааоцавака свИкесзаве веіккакковб запасвасва чесадеасакє КІ акац:спаяє спвавасжьа заїтевекча Босзачесва забксавазв кеакесєсвака час всекчаскаса ссачссчвса савбзссвва часуааасяаєс сзаябасцає абрастовеє їпаго аакасакадс уЗесудчЕвЕ ствуєсасод уссасчдассс яссраавскс Чазчевався ївоне сакесавсака даспасасвеа гсершьсаве чакуєссбуз айва с асбацдаєсае іт-щай кеккаксосах вевкоєасЕс спвавЕсСвоюс ват сатвє екс сствай сазатакмт іо ктсзагасвакх каведасУЕс сесваточтає Кассавлтса сствазсас вакскткт Мп за

Claims (31)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Трансгенна рослина сої, яка включає 5ЕО ІЮ МО:18 в своєму геномі.
2. Насінина сої, що включає геном, який містить ЗЕО ІЮ МО:18, присутню у репрезентативному насінні, депонованому в Американській колекції типових культур (АТСС) під реєстр. Мо РТА- 11993.
3. Насіння рослини сої за п. 1, де вказане насіння містить вказану ЗЕО І МО:18 в своєму геномі.
4. Рослина сої, одержана шляхом вирощування насіння за п. 2, де вказана рослина містить ЗЕО ІО МО:18 в своєму геномі.
5. Потомство рослини сої за п. 4, де вказане потомство містить ЗЕО ІЮ МО:18.
6. Експресійна касета для рослини сої, де експресійна касета містить залишки 1247-11507 послідовності БЕО ІЮО МО:18, уведені у сегмент геномної ДНК сої для одержання 5ЕО ІЮ МО:18 в геномі вказаної рослини сої.
7. Частина рослини за п. 4, де вказана частина вибрана з групи, яка складається з пилку, насінного зачатка, квітки, паростка, кореня і листа, і де вказана частина містить вказану ЗЕО ІЮ МО:18.
8. Виділена полінуклеотидна молекула, де вказана полінуклеотидна молекула містить ЗЕО ІЮ МО:18.
9. Виділений полінуклеотид, де вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка має 5ЕО ІЮО МО:18.
10. Спосіб одержання рослини сої, де вказаний спосіб включає стадію, на якій вбудовують трансген у ДНК-сегмент вказаного геному сої для одержання ЗЕО ІЮ МО:18 у вказаному геномі.
11. Спосіб захисту рослини від бур'янів, що включає стадію, на якій вносять на поле щонайменше один з таких гербіцидів як арилоксіалканоат, гліфосат, біалафос, фосфінотрицин або глюфозинат, де вказане поле засіяне рослиною за п. 1.
12. Спосіб за п. 11, де вказані гербіциди відбирають і наносять одночасно і/або послідовно.
13. Спосіб за п. 11, де вказаний гербіцид арилоксіалканоат вибраний із групи, що складається з Зо 2,4-О0; 2,А-ОВ; МОСРА і МСРВ.
14. Спосіб за п. 11, де вказаний спосіб включає внесення на вказане поле щонайменше одного додаткового гербіциду.
15. Спосіб за п. 14, де щонайменше одним додатковим гербіцидом є дикамба.
16. Спосіб за п. 11, де вказаний спосіб включає стадію, на якій сіють насіння на поле через 14 днів після внесення гербіциду(ів), де вказану рослину вирощують із вказаної насінини.
17. Спосіб за п. 11, де вказані щонайменше два гербіциди наносять в один вегетаційний період.
18. Спосіб за п. 11, де вказаний щонайменше один гербіцид наносять на верхівку вказаної рослини.
19. Стабільно трансформована дводольна рослина, яка містить полінуклеотид, що має щонайменше 95 95 ідентичність до молекули нуклеїнової кислоти, що містить зЕО ІЮ МО:18.
20. Стабільно трансформована дводольна рослина за п. 19, де вказана дводольна рослина походить від рослини Стуусіле тах.
21. Клітина рослини сої, що містить експресійну касету, трансгенно вбудовану у хромосому 15 вказаної клітини рослини, для отримання 5ЕО ІЮ МО:18.
22. Спосіб ідентифікації 5ЕО І МО:18 у зразку, де вказаний спосіб включає стадію, на якій детектують послідовність стику БЕО ІЮ МО:18, присутню у насінні, депонованому в АТСС під реєстр. Мо РТА-11993, з використанням зонда або щонайменше одного праймера, що специфічно зв'язується із вказаною послідовністю стику або ампліфікує вказану послідовність, де вказана послідовність стику містить залишки 1246-1247 5ЕО ІЮО МО:19 або залишки 176-177 БО ЗЕО ІО МО:20, де вказаний зонд має послідовність зЕО ІЮ МО:14, і де вказаний щонайменше один праймер має послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІО МО:13.
23. Спосіб за п. 22, де вказаний спосіб також включає стадію, на якій ампліфікують ДНК- фрагмент з нуклеїнової кислоти, присутньої у вказаному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням першого праймера і другого праймера, де вказаний перший праймер специфічно зв'язується з послідовністю вставки у ЗЕО ІЮ МО:18 або в її комплементі, а другий праймер специфічно зв'язується з послідовністю у фланкуючій послідовності, вибраній з групи, що складається з БЕО ІЮ МО:1 і БЕО ІЮ МО:2.
24. Спосіб визначення зиготності генетично модифікованої рослини сої, що містить ЗЕО ІЮ МО:18, присутню у насінні, депонованому в АТСС під реєстр. Мо РТА-11993, де вказана 5ЕО ІЮ
МО:18 містить трансгенну конструкцію, що фланкована 5'-фФланкуючою геномною ДНК сої і 3'- фланкуючою геномною ДНК сої, де вказаний спосіб включає стадії, на яких: одержують зразок геномної ДНК із вказаної рослини сої; одержують зразок шляхом контактування вказаного зразка ДНК: а) з першим трансгенспецифічним праймером, що містить 5ЕО ІЮО МО:12, і з другим трансгенспецифічним праймером, що містить 5ЕБО ОО МО: 13, де вказаний перший трансгенспецифічний праймер специфічно зв'язується з вказаною трансгенною конструкцією, а вказаний другий трансгенспецифічний праймер специфічно зв'язується з вказаною 5'- фланкуючою геномною ДНК сої або з вказаною 3'-фланкуючою геномною ДНК сої, і де вказаний перший трансгенспецифічний праймер і вказаний другий трансгенспецифічний праймер продукують трансгенспецифічний амплікон при здійсненні ПЛР в умовах проведення аналізу ТАОМАМ, Б) з еталонним прямим праймером, що містить 5ЕБО ІЮ МО:15, і еталонним зворотним праймером, що містить 5ЕО ІЮ МО:16, які продукують еталонний амплікон з ендогенного еталонного гена сої при здійсненні ПЛР в умовах проведення аналізу ТАОМАМ; с) з флуоресцентним трансгенспецифічним зондом, що містить 5ЕО ІЮ МО:14, ї який гібридизується із вказаним трансгенспецифічним ампліконом; а) з флуоресцентним еталонним зондом, що містить 5ЕО ІЮО МО':17, і який гібридизується із вказаним еталонним ампліконом; проводять ПЛР підданого контактуванню зразка в умовах кінцевої точки аналізу ТАОМАМ флуоресцентним методом; дають кількісну оцінку вказаного трансгенспецифічного зонда, який гібридизується із вказаним трансгенспецифічним ампліконом, де вказану оцінку здійснюють флуоресцентним методом; дають кількісну оцінку вказаного еталонного зонда, який гібридизується із вказаним еталонним ампліконом, де вказану оцінку здійснюють флуоресцентним методом; порівнюють кількість гібридизованого трансгенспецифічного зонда з кількістю гібридизованого еталонного зонда за інтенсивністю флуоресценції; і визначають зиготність генетично модифікованої рослини сої шляхом порівняння інтенсивності флуоресценції гібридизованого флуоресцентного трансгенспецифічного зонда і гібридизованого Зо флуоресцентного еталонного зонда.
25. Спосіб за п. 24, де вказана 5'-фланкуюча геномна ДНК сої містить ЗЕО ІО МО':1, а вказана 3'- фланкуюча геномна ДНК сої містить 5ЕО ІЮ МО:2.
26. Спосіб за п. 24, де вказаний другий трансгенспецифічний праймер зв'язується з 5ЕО ІЮ МО:21.
27. Спосіб за п. 24, де вказаний еталонний ген включає послідовність або гібридизується з послідовністю, вибраною з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО:15, 5ЕО ІО МО:16 і 5ЕО ІЮ МО:17.
28. Спосіб за п. 24, де вказані трансгенспецифічні праймери складаються з ЗЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІО МО:13, вказані еталонні праймери складаються з БЕО ІЮ МО:15 і 5ЕО ІЮО МО:16, вказаний трансгенспецифічний зонд складається з 5ЕО ІЮ МО:14, а вказаний еталонний зонд складається з БЕО ІЮ МО:17.
29. Набір для здійснення способу за п. 24, де вказаний набір містить вказаний перший трансгенспецифічний праймер, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:12, вказаний другий трансгенспецифічний праймер, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:13, вказаний еталонний прямий праймер, що має послідовність 560 ІЮ МО:15, вказаний еталонний зворотний праймер, що має послідовність 5ЕО ІЮ МО:16, вказаний трансгенспецифічний зонд, що має послідовність ЗЕО ІЮ МО:14, і вказаний еталонний зонд, що має послідовність зЗЕО ІЮ МО:17.
30. Виділений полінуклеотид, який щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності ЗЕ ІЮ МО:18. БО
31. Полінуклеотид, який містить послідовність зЗЕО ІЮ МО:18. 0000 Компютернаверстка О.Гергіль 00000000 Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601
UAA201401402A 2011-07-13 2012-07-13 Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів UA114716C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161507444P 2011-07-13 2011-07-13
US201161515634P 2011-08-05 2011-08-05
PCT/US2012/046706 WO2013010094A1 (en) 2011-07-13 2012-07-13 Stacked herbicide tolerance event 8264.42.32.1, related transgenic soybean lines, and detection thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA114716C2 true UA114716C2 (uk) 2017-07-25

Family

ID=47506575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201401402A UA114716C2 (uk) 2011-07-13 2012-07-13 Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів

Country Status (18)

Country Link
US (1) US9732353B2 (uk)
EP (1) EP2731419A4 (uk)
JP (1) JP6076974B2 (uk)
KR (1) KR20140044388A (uk)
CN (2) CN103826443B (uk)
AR (1) AR087185A1 (uk)
AU (1) AU2012280941B2 (uk)
BR (1) BR102012017486A2 (uk)
CA (1) CA2841543A1 (uk)
CL (1) CL2014000093A1 (uk)
IL (1) IL230403B (uk)
MX (1) MX2014000533A (uk)
RU (1) RU2636021C2 (uk)
TW (1) TW201317353A (uk)
UA (1) UA114716C2 (uk)
UY (1) UY34199A (uk)
WO (1) WO2013010094A1 (uk)
ZA (1) ZA201400476B (uk)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103562392B (zh) 2010-12-03 2016-07-20 Ms技术有限责任公司 植物细胞中草甘膦抗性编码核酸分子的优化表达
EP3382028A1 (en) 2010-12-03 2018-10-03 Dow AgroSciences LLC Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1, related transgenic soybean lines, and detection thereof
WO2012075429A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Dow Agrosciences Llc Stacked herbicide tolerance event 8291.45.36.2, related transgenic soybean lines, and detection thereof
TW201317353A (zh) 2011-07-13 2013-05-01 Dow Agrosciences Llc 具疊加除草劑耐受性之品件８２６４．４２．３２．１，相關基因轉殖大豆品系以及測定該品件的方法
KR20150070148A (ko) 2012-09-14 2015-06-24 바이엘 크롭사이언스 엘피 Hppd 변이체들 및 사용 방법들
WO2014124373A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising gougerotin and an insecticide
CA2899303A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising gougerotin and a biological control agent
JP2016511245A (ja) 2013-02-11 2016-04-14 バイエル クロップサイエンス エルピーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｐ ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に基づく生物学的防除剤および殺真菌剤を含む組成物
CN110172466A (zh) 2013-03-07 2019-08-27 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 毒素基因及其使用方法
CN105555135B (zh) 2013-04-19 2018-06-15 拜耳作物科学股份公司 涉及邻苯二甲酰胺衍生物应用的用于改善对转基因植物生产潜能的利用的方法
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
WO2015160620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide
WO2015160618A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent
WO2015160619A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
WO2017042259A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Hppd variants and methods of use
CN105445218B (zh) * 2015-11-25 2018-12-18 中国科学院南京土壤研究所 中红外光谱油菜籽蛋白质含量检测自适应模型的建立方法
CN105567682B (zh) * 2016-01-12 2019-01-29 吉林省农业科学院 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用
CN106119245B (zh) * 2016-06-18 2019-10-18 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9001的核酸序列及其检测方法
CN106086010B (zh) * 2016-06-18 2019-10-18 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9008的核酸序列及其检测方法
CN106086011B (zh) * 2016-06-18 2019-10-18 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9004的核酸序列及其检测方法
AU2017365169B2 (en) 2016-11-23 2022-07-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and Axmi991 toxin genes and methods for their use
MX2019007593A (es) 2016-12-22 2019-12-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Evento de elíte ee-gm5 y métodos y kits para identificar dicho evento en muestras biológicas.
BR112019012947A2 (pt) 2016-12-22 2019-11-26 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto de soja, para proteção de plantas, para produção de uma planta, para identificação, pares de iniciadores, para confirmação da pureza de sementes, para determinação do estado de zigosidade, para redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento de plantas, processo para controle de ervas daninhas, uso, sondas, estojo e método de detecção da presença do evento de elite
WO2018119336A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Athenix Corp. Use of cry14 for the control of nematode pests
WO2018136611A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Bayer Cropscience Lp Use of bp005 for the control of plant pathogens
CN110431234B (zh) 2017-01-18 2024-04-16 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 Bp005毒素基因及其使用方法
BR112019018056A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
WO2019083810A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
WO2019233863A1 (de) 2018-06-04 2019-12-12 Bayer Aktiengesellschaft Herbizid wirksame bizyklische benzoylpyrazole
US20220289691A1 (en) 2019-07-22 2022-09-15 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino-substituted pyrazoles and triazoles as pest control agents
AU2020317609A1 (en) 2019-07-23 2022-02-24 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
BR112022000942A2 (pt) 2019-07-23 2022-05-17 Bayer Ag Compostos de heteroaril-triazol como pesticidas
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
EP4037485A1 (en) 2019-10-02 2022-08-10 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
BR112022006774A2 (pt) 2019-10-09 2022-06-28 Bayer Ag Compostos de heteroaril-triazol inovadores como pesticidas
KR20220081359A (ko) 2019-10-09 2022-06-15 바이엘 악티엔게젤샤프트 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물
CN114641467A (zh) 2019-11-07 2022-06-17 拜耳公司 用于防治动物有害物的取代的磺酰胺
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
WO2021099271A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
CN110885898B (zh) * 2020-01-09 2022-06-10 福建中医药大学 鉴别皱果苋与2种常见混淆品的分子特异性标记引物及方法
US11959072B2 (en) 2020-01-31 2024-04-16 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
CN115551839A (zh) 2020-02-18 2022-12-30 拜耳公司 作为农药的杂芳基-三唑化合物
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
MX2022012878A (es) 2020-04-16 2022-12-08 Pairwise Plants Services Inc Metodos para controlar el tama?o del meristema para la mejora de cultivos.
KR20230007398A (ko) 2020-04-21 2023-01-12 바이엘 악티엔게젤샤프트 해충 방제제로서 2-(헤트)아릴-치환된 축합 헤테로시클릭 유도체
EP4146628A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Bayer Aktiengesellschaft Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
EP4149929A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Bayer Aktiengesellschaft Triazine and pyrimidine (thio)amides as fungicidal compounds
US20230192617A1 (en) 2020-05-19 2023-06-22 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds
BR112022024489A2 (pt) 2020-06-02 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Métodos para o controle do tamanho do meristema para melhora da cultura agrícola
BR112022024394A2 (pt) 2020-06-04 2023-01-31 Bayer Ag Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas
CN116057056A (zh) 2020-06-10 2023-05-02 拜耳公司 作为杀真菌剂的氮杂双环取代的杂环化合物
WO2021257775A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
EP4167738A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft Composition for use in agriculture
EP4168404A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection
WO2021255089A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
WO2021255091A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides
EP3929189A1 (en) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides
JP2023532548A (ja) 2020-07-02 2023-07-28 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 有害生物防除剤としてのヘテロサイクレン誘導体
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
MX2023007290A (es) 2020-12-18 2023-07-04 Bayer Ag Uso del inhibidor de dhodh para el control de hongos fitopatogenicos resistentes en cultivos.
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
BR112023015909A2 (pt) 2021-02-11 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para modificar níveis de citocinina oxidase em plantas
CA3211121A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture in plants
WO2022207494A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
BR112023022763A2 (pt) 2021-05-06 2024-01-02 Bayer Ag Imidazóis anulados substituídos por alquilamida e uso dos mesmos como inseticidas
EP4337661A1 (de) 2021-05-12 2024-03-20 Bayer Aktiengesellschaft 2-(het)aryl-substituierte kondensierte heterocyclen-derivate als schädlingsbekämpfungsmittel
AR126172A1 (es) 2021-06-17 2023-09-27 Pairwise Plants Services Inc Modificación de factores de transcripción de la familia de factores reguladores del crecimiento en soja
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
WO2023278651A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
US20230078990A1 (en) 2021-08-12 2023-03-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
KR20240039209A (ko) 2021-08-13 2024-03-26 바이엘 악티엔게젤샤프트 활성 화합물 조합물 및 이를 포함하는 살진균제 조성물
AR126798A1 (es) 2021-08-17 2023-11-15 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas
CA3229873A1 (en) 2021-08-25 2023-03-02 Bayer Aktiengesellschaft Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides
US20230074699A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
CA3232804A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
WO2023060028A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
CA3234455A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
WO2023078915A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds
WO2023099445A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
US20230284577A1 (en) 2022-01-31 2023-09-14 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2023148036A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in soybean
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
US20230357789A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023215704A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
US20230416771A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240000031A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006792A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024030984A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030237110A9 (en) 1998-05-12 2003-12-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides and polypeptides derived from corn seedling
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
US20070083945A1 (en) * 2000-03-10 2007-04-12 Byrum Joseph R Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
US20030031757A1 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Kraft Food Holdings, Inc. Stable and bioavailable iron fortified beverages
EP1320299B1 (en) 2001-08-22 2005-06-08 Solae L.L.C. Soybean meal with a reduced fat and soluble sugar content, and methods of making and using the same
JP2004027091A (ja) 2002-06-27 2004-01-29 Nisshin Oillio Ltd 圧搾大豆油及びその製造方法
WO2004011601A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Monsanto Technology, Llc Corn event pv-zmir13 (mon863) plants and compositions and methods for detection thereof
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
WO2004074443A2 (en) 2003-02-18 2004-09-02 Monsanto Technology Llc Glyphosate resistant class i 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps)
KR101077334B1 (ko) 2003-09-29 2011-10-26 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 이들의 방법
FR2865738B1 (fr) 2004-02-03 2008-06-20 Agronomique Inst Nat Rech Utilisation de genes codant des canaux potassiques pour modifier un phenotype relatif a une taille d'au moins un organe de stockage d'une plante
WO2005103266A1 (en) 2004-03-26 2005-11-03 Dow Agrosciences Llc Cry1f and cry1ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof
MXPA06012634A (es) 2004-04-30 2007-02-08 Dow Agrosciences Llc Nuevos genes con resistencia a los herbicidas.
RU2389797C2 (ru) * 2004-06-07 2010-05-20 Басф Плант Сайенс Гмбх Улучшенная трансформация сои
US7750207B2 (en) 2004-09-01 2010-07-06 Monsanto Technology Llc Zea mays ribulose bisphosphate carboxylase activase promoter
AR050891A1 (es) 2004-09-29 2006-11-29 Du Pont Evento das-59122-7 de maiz y metodos para su deteccion
ATE543907T1 (de) 2004-10-29 2012-02-15 Bayer Bioscience Nv Stresstolerante baumwollpflanzen
CA2595171C (en) * 2004-12-21 2015-03-17 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
PT1871901E (pt) 2005-04-11 2011-09-29 Bayer Bioscience Nv Acontecimento elite a5547-127 e processos e kits para identificar um tal acontecimento em amostras biológicas
PT1885176T (pt) 2005-05-27 2016-11-28 Monsanto Technology Llc Evento mon89788 de soja e métodos para a sua deteção
ZA200802239B (en) 2005-08-24 2009-09-30 Pioneer Hi Bred Int Methods and compositions for the expression of a polynucleotide of interest
US8243272B2 (en) * 2005-09-19 2012-08-14 Jmar Llc Systems and methods for detecting normal levels of bacteria in water using a multiple angle light scattering (MALS) instrument
NZ567807A (en) * 2005-10-28 2011-09-30 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide (2,4-D and pyridyloxyacetate) resistance genes with aryloxyalkanoage dioxygenase activity
WO2011066360A1 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Detection of aad-12 soybean event 416
US7951995B2 (en) * 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
HUE031454T2 (en) * 2006-12-07 2017-07-28 Dow Agrosciences Llc New selectable marker genes
CN100558902C (zh) 2007-01-24 2009-11-11 中国农业科学院油料作物研究所 转基因油菜外源基因整合事件Rf1外源插入载体旁侧序列及其应用
US20080184393A1 (en) * 2007-01-31 2008-07-31 Zhang Zhanyuan J Auto-Regulated Expression Of Bacterial Isopentenyltransferase Gene Promotes T-DNA Transformation In Soybean
US7943825B2 (en) * 2007-04-12 2011-05-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Metacaspase II in engineering soybean for disease resistance
WO2008141154A2 (en) 2007-05-09 2008-11-20 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
JP2008295322A (ja) 2007-05-30 2008-12-11 Cb:Kk 食用種子加工物
AU2008300548B2 (en) 2007-09-21 2015-04-09 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
CN101889090B (zh) 2007-10-05 2018-01-23 陶氏益农公司 用于将分子物质转移入植物细胞中的方法
BRPI0822484B1 (pt) 2008-03-03 2021-08-31 Ms Technologies, Llc Anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshiquímico sintase) mutante, linhagem de células de hibridomas e método para detectar a presença de um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição
CN102118966A (zh) 2008-06-11 2011-07-06 陶氏益农公司 表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关的性状组合
EP2924118A1 (en) 2008-07-01 2015-09-30 Monsanto Technology LLC Recombinant DNA constructs and methods for modulating expression of a target gene
US8344209B2 (en) 2008-07-14 2013-01-01 Syngenta Participations Ag Plant regulatory sequences
CN102131921A (zh) 2008-08-05 2011-07-20 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 生产己二酰基-7-adca的菌株
WO2010079032A1 (en) 2008-12-17 2010-07-15 Basf Plant Science Gmbh Production of ketocarotenoids in plants
US8293533B2 (en) * 2008-12-19 2012-10-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific integration and stacking of transgenes in soybean via DNA recombinase mediated cassette exchange
EP2389442A4 (en) * 2009-01-22 2012-07-04 Syngenta Participations Ag MUTANT HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
JP2013511294A (ja) * 2009-11-23 2013-04-04 バイエル・クロップサイエンス・エヌ・ヴェー 除草剤耐性植物及びそれを識別するための方法
EP2503871B1 (en) * 2009-11-24 2017-06-14 Dow AgroSciences LLC Aad-12 event 416, related transgenic soybean lines, and event-specific identification thereof
BR112012012522A2 (pt) 2009-11-24 2015-09-15 Dow Agrosciences Llc controle de voluntárias dicotiledôneas com add em culturas monocotiledôneas
EP3382028A1 (en) 2010-12-03 2018-10-03 Dow AgroSciences LLC Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1, related transgenic soybean lines, and detection thereof
TW201317353A (zh) 2011-07-13 2013-05-01 Dow Agrosciences Llc 具疊加除草劑耐受性之品件８２６４．４２．３２．１，相關基因轉殖大豆品系以及測定該品件的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2841543A1 (en) 2013-01-17
CN103826443A (zh) 2014-05-28
IL230403B (en) 2018-04-30
BR102012017486A2 (pt) 2015-08-04
AR087185A1 (es) 2014-02-26
KR20140044388A (ko) 2014-04-14
ZA201400476B (en) 2015-09-30
TW201317353A (zh) 2013-05-01
EP2731419A4 (en) 2015-04-29
US9732353B2 (en) 2017-08-15
AU2012280941B2 (en) 2017-06-22
RU2014105285A (ru) 2015-08-20
AU2012280941A1 (en) 2014-02-06
US20130055453A1 (en) 2013-02-28
MX2014000533A (es) 2015-01-14
UY34199A (es) 2013-02-28
RU2636021C2 (ru) 2017-11-17
EP2731419A1 (en) 2014-05-21
WO2013010094A1 (en) 2013-01-17
JP6076974B2 (ja) 2017-02-08
CL2014000093A1 (es) 2014-11-21
CN103826443B (zh) 2017-12-19
JP2014523251A (ja) 2014-09-11
CN107603978A (zh) 2018-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA114716C2 (uk) Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів
US11819022B2 (en) Stacked herbicide tolerance event 8264.44.06.1, related transgenic soybean lines, and detection thereof
JP6262284B2 (ja) Ａａｄ−１２イベント４１６、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびそのイベント特異的な同定
US8785728B2 (en) AAD-12 event 1606 and related transgenic soybean lines
KR101899619B1 (ko) Aad-1 식물에 관련된 잡초 방제 방법 및 식재-전 및/또는 발아-전 제초제 적용
BR112013015745B1 (pt) polinucleotídeos referente ao evento de tolerância a herbicida 8291.45.36.2, cassete de expressão, sonda, bem como processos para identificação do evento, determinação da zigosidade, produção de uma planta de soja transgênica e produção de uma proteína em uma célula de planta
UA122197C2 (uk) Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах
JP2021180680A (ja) トウモロコシ事象ｍｏｎ８７４２９及びその使用方法
US20230348927A1 (en) Transgenic soybean event gm_csm63714 and methods for detection and uses thereof
NZ615200B2 (en) Methods of weed control involving aad-1 plants, and re-plant and/or pre-emergence herbicide applications