UA122197C2 - Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах - Google Patents
Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах Download PDFInfo
- Publication number
- UA122197C2 UA122197C2 UAA201500556A UAA201500556A UA122197C2 UA 122197 C2 UA122197 C2 UA 122197C2 UA A201500556 A UAA201500556 A UA A201500556A UA A201500556 A UAA201500556 A UA A201500556A UA 122197 C2 UA122197 C2 UA 122197C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- sequence
- soybean
- dna
- transformant
- base pairs
- Prior art date
Links
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 title claims abstract description 388
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 title claims abstract description 289
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 80
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 73
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 212
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 181
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 47
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 40
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical group CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 claims description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 claims description 17
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 14
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 10
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 8
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 6
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims description 3
- 241000995027 Empoasca fabae Species 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 5
- 241001143309 Acanthoscelides obtectus Species 0.000 claims 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241001523432 Zale Species 0.000 claims 1
- AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#C/N=C(/NC)NCCSCC=1N=CNC=1C AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 claims 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 claims 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 claims 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 100
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 89
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 49
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 48
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 39
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 30
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 26
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 13
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 102100028284 Collagen alpha-1(XXVI) chain Human genes 0.000 description 6
- 101710113648 Collagen alpha-1(XXVI) chain Proteins 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 5
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 3
- -1 M/NIZKEKZ"M) Chemical compound 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- LUBJCRLGQSPQNN-UHFFFAOYSA-N 1-Phenylurea Chemical compound NC(=O)NC1=CC=CC=C1 LUBJCRLGQSPQNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 241001124201 Cerotoma trifurcata Species 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108020001991 Protoporphyrinogen Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005135 Protoporphyrinogen oxidase Human genes 0.000 description 2
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 2
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 208000033937 musculocontractural type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- IYLGZMTXKJYONK-ACLXAEORSA-N (12s,15r)-15-hydroxy-11,16-dioxo-15,20-dihydrosenecionan-12-yl acetate Chemical compound O1C(=O)[C@](CC)(O)C[C@@H](C)[C@](C)(OC(C)=O)C(=O)OCC2=CCN3[C@H]2[C@H]1CC3 IYLGZMTXKJYONK-ACLXAEORSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102100028626 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Human genes 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 101100024000 Caenorhabditis elegans mom-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N Conferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OCC3C4(C)CCC(=O)C(C)(C)C4CC=C3C)=CC=C21 VPAXJOUATWLOPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030393 G-patch domain and KOW motifs-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000748095 Hymenopappus filifolius Species 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910016006 MoSi Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010081996 Photosystem I Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical compound OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- NUPIYIXBLUEVRR-UHFFFAOYSA-N benzenecarbothioic s-acid;pyrimidine Chemical class C1=CN=CN=C1.OC(=S)C1=CC=CC=C1 NUPIYIXBLUEVRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N conferone Natural products CC1=CCC2C(C)(C)C(=O)CCC2(C)C1COc3cccc4C=CC(=O)Oc34 JECGPMYZUFFYJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 230000005089 fruit drop Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 229910052982 molybdenum disulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- IYLGZMTXKJYONK-UHFFFAOYSA-N ruwenine Natural products O1C(=O)C(CC)(O)CC(C)C(C)(OC(C)=O)C(=O)OCC2=CCN3C2C1CC3 IYLGZMTXKJYONK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
- A01H6/542—Glycine max [soybean]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
- A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
- A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
- A01N65/20—Fabaceae or Leguminosae [Pea or Legume family], e.g. pea, lentil, soybean, clover, acacia, honey locust, derris or millettia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
- Edible Oils And Fats (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується трансгенної рослини сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах Pseudoplusia includens (соєвий п’ядак), Anticarsia gemmatalis (листовійка квасолі), Spodoptera frugiperda (капустяна совка) або Heliothis virescens (тютюнова совка). Винахід також стосується насіння трансгенної рослини сої; виділеної послідовності ДНК; полінуклеотиду, що містить послідовність стику події трансформації сої 9582.816.15.1; товарного продукту, отриманого з трансгенної рослини сої; способу боротьби з комахами та способу отримання трансгенної рослини сої.
Description
Домагання на пріоритет
У даній заявці вимагається пріоритет попередньої заявки на патент США 61/663700, поданої 25 червня, 2012. Зміст цієї заявки у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
Попередній рівень техніки
Гени, що кодують СтуїЕ ї СтгутАс 5упрго (СтуТАс), здатні надавати трансгенним рослинам резистентність до комах, наприклад резистентність до лускокрилих комах, а ген, що кодує РАТ (фосфінотрицинацетилтрансферазу), здатний надавати трансгенним рослинам стійкість до гербіциду фосфінотрицину (глюфозинату). Ген РАТ був успішно експресований в сої і використаний як селективний маркер для промислового продукування резистентних до комах трансгенних культур і для надання цим трансгенним рослинам стійкості до гербіциду глюфозинату.
Відомо, що експресія трансгенів в рослинах залежить від локалізації трансгенів в геномі рослини, що, ймовірно, зумовлено хроматиновою структурою (наприклад, гетерохроматином) або близькістю елементів регуляції транскрипції (наприклад, енхансерів) до сайта інтеграції (МУ/єеїзіпа єї а!., Апп. Веу. Сепеї, 22:421-477, 1988). У той же час, присутність трансгена в різних ділянках геному так чи інакше залежить від загального фенотипу рослини. З цієї причини часто буває необхідним вдаватися до скринінгу великого числа трансгенвмісних трансформантів для ідентифікації трансген-специфічного трансформанта, який характеризується оптимальною експресією вбудованого гена, що представляє інтерес. Так, наприклад, в цих рослинах і в інших організмах може спостерігатися широка варіабельність в рівнях експресії гена, вбудованого в ці трансформанти. Можуть також спостерігатися відмінності в просторових або часових профілях експресії, наприклад відмінності у відносних рівнях експресії трансгена в різних тканинах рослин, де вказані відмінності можуть не відповідати передбачуваним профілям елементів регуляції транскрипції, присутніх у вбудованій генній конструкції. З цієї причини, звичайно продукують від ста до тисячі різних трансформантів і скринують їх в пошуку одного трансформанта, який має потрібні рівні і профілі експресії трансгена і який може бути використаний в промислових цілях. Трансформант, який має потрібні рівні або профілі експресії трансгена, може бути використаний для інтрогресії цього трансгена в генетичне оточення
Зо іншого виду шляхом статевого ауткросингу із застосуванням стандартних методів схрещування.
Потомство таких кросів зберігає рівні експресії трансгена, характерні для вихідного трансформанта. Ця стратегія застосовується для забезпечення надійної експресії гена в різних сортах, добре адаптованих до умов культивування в певній місцевості.
Для того, щоб визначити, чи містить потомство статевого кросу трансген, що представляє інтерес, або групу таких трансгенів, бажано мати можливість детектувати наявність конкретної генетичної трансформації. Крім того, спосіб детектування конкретного трансформанта повинен відповідати нормам, встановленим Регуляторними органами для його апробації до виходу на ринок, а харчові продукти, одержані з рекомбінантних сільськогосподарських культур, повинні, наприклад, мати відповідне маркування, або такий спосіб може бути застосований для моніторингу якості навколишнього середовища, моніторингу якості сільськогосподарських культур, вирощених в польових умовах, або для моніторингу продуктів, одержаних після збирання врожаю, а також його проведення повинно відповідати нормам, затвердженим
Регуляторними органами або сторонами договору.
При цьому, присутність трансформанта може бути детектована будь-яким методом детектування нуклеїнових кислот, відомим фахівцям, включаючи, але не обмежуючись ними, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) або гібридизацію ДНК з використанням нуклеїновокислотних зондів. Такі методи детектування звичайно направлені на часто використовувані генетичні елементи, такі як промотори, термінатори, маркерні гени і т. п., оскільки для багатьох ДНК-конструкцій, кодуючі області є однаковими. Тому, такі методи не можуть бути використані для диференціації різних трансформантів, особливо тих трансформантів, які продукуються з використанням одних і тих же ДНК-конструкцій або майже аналогічних конструкцій, за винятком лише тих випадків, коли відома послідовність фланкуючої
ДНК, суміжної з вбудованою гетерологічною ДНК. Так, наприклад, в заявці на патент США Мо 2006/0070139, що стосується трансформанта кукурудзи ОА5-59122-7, описаний трансформант- специфічний ПЛР-аналіз. Виходячи з вищесказаного, очевидно, що необхідно розробити простій і диференціальний метод ідентифікації трансформанта сої ррАВеО582.816.15.1.
Короткий опис суті винаходу
У деяких своїх варіантах, даний винахід стосується нових трансгенних рослин трансформованої сої, резистентних до комах і стійких до гербіцидів, зокрема, даний винахід бо стосується трансформанта сої, який позначений ррАВе9582.816.15.1 і містить описані тут гени сгу1Е м3 (сгу!Е), сгутАс зупрго (сгуТАс) і раї мб (ра), вбудовані в специфічний сайт в геномі клітин сої. Репрезентативне насіння сої було депоноване в Американській колекції типових культур (АТСС) під реєстраційним номером, вказаним в параграфі (0033). ДНК рослин сої, що містять такий трансформант, включає послідовності стику/фланкуючі послідовності, описані в
Б даній заявці, які вказують на локалізацію вбудованої ДНК в геномі сої. «ЕО ІЮ МО:1 і ЗЕО ІО
МО:2 є діагностичною ознакою присутності трансформанта сої ррдвВ9582.816.15.1. Більш конкретно, послідовності, що оточують область стику в положеннях п.о. 1273/1274 5ЗЕО ІО МО: 1 і в положеннях п.о. 175/176 і п.о. 316/317 5ЕО ІЮ МО:2, є діагностичною ознакою присутності трансформанта сої рраАВеУ582.816.15.1. Нижче, в параграфі 10012| описані приклади послідовностей, що містять такі стики, які є характерними для ДНК сої, що містить трансформант сої ррАвВУ582.816.15.1.
У одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується рослини сої або її частини, яка є резистентною до Рзецйдорісивіа іпсіцдеп5 (соєвого п'ядака) і яка має геном, що містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО
ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮ МО 2, і їх комплементів. У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується насіння таких рослин.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу боротьби з комахами, який включає зараження комахами рослин сої, резистентних до комах, де вказані рослини сої мають геном, що містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; по. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІО МО:2 і п.о. в положеннях 75-215 БО ІОЮО МОС2, їі їх комплементів, де вказані послідовності є характерними ознаками присутності трансформанта сої ррАВО582.816.15.1, резистентного до комах. Присутність генів сгутЕ м3 (сгут) ї сгутАс 5упрго (сгутАс) в трансформанті сої ррАВ9582.816.15.1 надає такій рослині резистентність, наприклад, до Рбхецйдоріизіа іпсішдеп5 (соєвого п'ядака), Апіїсагвіа деттагаїї5 (листовійки квасолі), Еріпоїйа арогета, Отоїідез іпаісас5, Каспіріив5іа пи, зродоріега їидірегда, Зродорієта соб5тоїдев5, Зродорієга егідапіа, Неїоїйів мігезсеп5, Неїїосомегра 2ва, зріюзота мігдіпіса і ЕіІазптораїриз Ігдпозеї Ів.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу боротьби з бур'янами сої, який включає обробку сільськогосподарської культури сої гербіцидом глюфозинатом, де вказана сільськогосподарська культура сої включає рослини сої, що мають геном, який містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, що складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО
ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5БЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕБО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІЮ МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮО МО:2, і їх комплементів, де вказані послідовності Є діагностичними ознаками присутності трансформанта сої рорАВУО582.816.15.1. Присутність гена раї в трансформанті сої ррАВеУ582.816.15.1 надає стійкість до гербіциду глюфозинату.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу детектування трансформанта сої ррАВО582.816.15.1 в зразку, що містить соєву ДНК, де вказаний спосіб включає: (а) контактування вказаного зразка з першим праймером довжиною щонайменше в 10 п.о., який селективно зв'язується з фланкуючою послідовністю в положеннях п.о. 1-14273 5ЕО ІЮ
МО:1 або з її комплементом, і з другим праймером довжиною щонайменше в 10 п.о., який селективно зв'язується з послідовністю вставки в положеннях п.о. 1274-1577 5ЕО ІЮО МО:1 або з її комплементом; і проведення аналізу на амплікон, що утворюється між вказаними праймерами; або (Б) контактування вказаного зразка з першим праймером довжиною щонайменше в 10 п.о., який селективно зв'язується з послідовністю вставки в положеннях п.о. 1-175 ЗЕО ІЮ МО:2 або з її комплементом, і з другим праймером довжиною щонайменше в 10 п.о., який селективно зв'язується з фланкуючою послідовністю в положеннях п.о. 176-1687 5ЕО ІЮ МО:2 або з її комплементом; і (с) проведення аналізу на амплікон, що утворюється між вказаними праймерами.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу детектування трансформанта сої ррАВО582.816.15.1, де вказаний спосіб включає: (а) контактування вказаного зразка з першим праймером, який селективно зв'язується з фланкуючою послідовністю, вибраною з групи, що складається з п.о. в положеннях 1-1273 5ЕО
ІЮ МО:1 і п.о. в положеннях 176-1687 ЗЕБО ІЮ МО:2, або з її комплементами, і з другим праймером, який селективно зв'язується з ЗЕО ІЮ МО: З або з її комплементом; р) здійснення полімеразної ланцюгової реакції вказаного зразка; і с) проведення аналізу на амплікон, що утворюється між вказаними праймерами.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу схрещування рослини сої, де вказаний спосіб включає схрещування першої рослини сої з другою рослиною сої з одержанням третьої рослини сої, де вказана перша рослина містить ДНК, що включає одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІОЮ МО 1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5БЕО ІЮО МО2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІО МО:2, і їх комплементів; і проведення аналізу вказаної третьої рослини сої на присутність ДНК, що включає одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІЮ МО 71; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 ЗЕО ІЮО МО:2, і їх комплементів.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується виділеної молекули ДНК, яка є діагностичною ознакою присутності трансформанта сої ррАВУ582.816.15.1. Такими молекулами, крім БЕО ІЮО МО-1 і 2, є молекули довжиною щонайменше 25 п.о., що містять п.о. в положеннях 1273-1274 5ЕО ІЮ МО:1 і щонайменше 10 п.о. БЕО ІЮ МО:1 в кожному напрямі від п.о. 1273/1274 в області стику; амплікони довжиною щонайменше 25 п.о., що містять п.о. в положеннях 175-176 5ЕО ІЮ МО:2 і щонайменше 10 п.о. 5ЕО ІО МО:2 в кожному напрямі від п.о. 175/176 в області стику. Прикладами є п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮО МО:2, і їх комплементи.
У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується способу боротьби з комахами- шкідниками соєвих бобів, насіння або борошна з насіння, в якому міститься трансформант сої рорАВО582.816.15.1, де вказані боби, насіння або борошно з насіння містять ДНК, що включає одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258- 1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО
ІО МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 БЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 ЗЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮ МО:2, і їх комплементів.
Варіанти здійснення винаходу також стосуються клітин рослин сої і частин рослин сої, включаючи, але не обмежуючись ними, пилок, овули, квітки, паростки, коріння і листя, ядра вегетативних клітин, клітини пилка, насіння і борошно з насіння, а також яйцеклітину, що містять трансформант сої ррАВ 9582.816.15.1.
У деяких варіантах здійснення винаходу, трансформанту сої ррАВ 9582.816.15.1 можуть бути надані і інші ознаки, включаючи, наприклад, інший(і) ген(и) стійкості до гербіцидів і/або білки-інгібітори комах і послідовності регуляції транскрипції (тобто РНК-інтерферуючий агент, дДлЛРНК, фактори транскрипції і т. п.). Додаткові ознаки можуть бути внесені в геном рослини шляхом схрещування рослин, ретрансформації трансгенної рослини, що містить трансформант сої ррдаВ 9582.816.15.1, або шляхом надання нових ознак завдяки націленій інтеграції за допомогою гомологічної рекомбінації.
Інші варіанти здійснення винаходу включають вирізання полінуклеотидних послідовностей, які містять трансформант сої ррАВО582.816.15.1, включаючи, наприклад, кластер для експресії гена раї. Після вирізання полінуклеотидної послідовності, модифікований трансформант може бути перенацілений в специфічний сайт хромосоми, де додаткові полінуклеотидні послідовності присутні разом з трансформантом сої ррдіВе9582.816.15.1.
У одному зі своїх варіантів, даний винахід охоплює сайт-мішень хромосоми сої, локалізований на хромосомі 03 між фланкуючими послідовностями, представленими в ЗЕО ІЮ
МО:1 12.
У одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується способу одержання трансгенної рослини сої, де вказаний спосіб включає інсерцію гетерологічної нуклеїнової кислоти в положенні на хромосомі 03 між геномними послідовностями, представленими в 5ЕО ІЮ МО: 1 і 2, тобто між п.о. в положеннях 1-1273 5БЕО ІО МО:1 і п.о. в положеннях 176-1687 5ЕО ІЮ МО 2.
Крім того, варіанти здійснення винаходу також стосуються аналізів, які включають детектування присутності трансформанта, що розглядається, в зразку (наприклад, сої). Ці аналізи можуть бути здійснені на основі послідовності ДНК рекомбінантної конструкції,
вбудованої в геном сої, і на основі геномних послідовностей, фланкуючих сайт інсерції. Даний винахід також стосується наборів для проведення аналізів у відповідних умовах.
Зокрема, варіанти здійснення винаходу також стосуються клонування і аналізу послідовностей ДНК граничних областей, одержаних після інсерції Т-ДНК від ррАВО582 в лініях трансгенної сої. Ці послідовності є унікальними. Виходячи з послідовностей вставки і стику можуть бути ідентифіковані і сконструйовані трансформант-специфічні праймери. ПЛР-аналіз продемонстрував, що ці трансформанти можуть бути ідентифіковані за допомогою аналізу ПЛР- ампліконів, одержаних з використанням наборів трансформант-специфічних праймерів. Таким чином, ці і інші споріднені методи можуть бути застосовані для унікальної ідентифікації ліній сої, що містять трансформант згідно з винаходом.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу боротьби з комахами, який включає зараження комахами рослин сої, резистентних до комах, де вказані рослини сої включають ДНК, що містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1173- 1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО
ІЮО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮО МО:2, де вказані послідовності Є діагностичними ознаками присутності трансформанта сої ррАВО582.816.15.1, резистентного до комах.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу боротьби з комахами Рзепйдоріивіа іпсіцдеп5, Апіїсагбіа деттаїйайх5 або Бродорієга їидірегадаа, де вказаний спосіб включає зараження резистентних до комах рослин сої комахами Рзтеидоріивзіа іпсішдеп5, Апіїсагвіа деттагаїїв, Неїїоїпі5 мігезсеп5 або 5родорієга їгидірегаа, де вказані рослини сої включають ДНК, що містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО
ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕБО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІЮ МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕБО ІЮО МО:2, де вказана послідовність є діагностичною ознакою присутності трансформанта сої ррАдАвВе582.816.15.1, резистентного до комах.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу боротьби з бур'янами сої, який
Зо включає обробку сільськогосподарської культури сої гербіцидом глюфозинатом, де вказана сільськогосподарська культура сої включає рослини сої, які містять ДНК, що включає послідовність, вибрану з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІЮ МО 1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІЮ МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 ЗЕО ІЮ МО:2, де вказана послідовність є діагностичною ознакою присутності трансформанта сої ррАВеУ582.816.15.1.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується виділеної послідовності ДНК, що містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258- 1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО
ІО МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 БЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 ЗЕО ІО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮ МО:2.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу схрещування рослини сої, де вказаний спосіб включає схрещування першої рослини сої з другою рослиною сої з одержанням третьої рослини сої, де вказана перша рослина містить ДНК, що включає одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІОЮ МО 1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5БЕО ІЮО МО2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІО МО:2, і їх комплементів; і проведення аналізу вказаної третьої рослини сої на присутність ДНК, що включає одну або більше
БО послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІОЮ МО 1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 ЗЕО ІЮО МО:2, і їх комплементів.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується виділеної молекули ДНК, що містить послідовність стику, яка включає щонайменше одну послідовність, вибрану з групи, що складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО 10
МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-215 БО ІЮО МО:2, і їх комплементів. Один з варіантів здійснення винаходу стосується бо рослини сої або її частини, яка є резистентною до Рзешпйдоріивзіа іпсіцдеп5 (соєвого п'ядака) і містить ДНК, що має щонайменше одну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО 10
МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5БЕО ІЮО МО2, і їх комплементів.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується композиції, одержаної з рослини сої або її частин, де вказаною композицією є харчовою продукт, вибраний з групи, що складається з кормового соєвого борошна, харчового борошна, білкового концентрату і олії.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу боротьби з комахами-шкідниками соєвих бобів, насіння, кормового борошна або харчового борошна, в яких міститься трансформант сої ррАВе9582.816.15.1, де вказані боби, насіння, кормове борошно або харчове борошно містять ДНК, що включає одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО 10
МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 5ЕО ІЮ МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5БЕО ІЮО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІО МО:2; п.о. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮ МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5БЕО ІЮО МО2, і їх комплементів.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується насіння сої, що містить в своєму геномі послідовність ДНК, вибрану з групи, що складається з п.о. в положеннях 1258-1288 5ЕО ІО
МО:1; п.о. в положеннях 1223-1323 5ЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1173-1373 ЗЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 1073-1473 5ЕБЕО ІО МО:1; п.о. в положеннях 160-190 5ЕО ІЮО МО:2; п.0. в положеннях 125-225 5ЕО ІЮО МО:2 і п.о. в положеннях 75-275 5ЕО ІЮ МО:2, і її комплементи.
Інший варіант здійснення винаходу стосується насіння сої, що містить в своєму геномі гени сгутЕ, сгуТтАс ї раї трансформанта сої ррАвВе9582.816.15.1, і репрезентативного насіння сої, депонованого в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером РТА-12588.
Інший варіант здійснення винаходу стосується рослини сої, вирощеної шляхом культивування насіння сої згідно з будь-яким з цих двох варіантів. Інший варіант здійснення винаходу стосується насіння сої, продукованого цією рослиною сої, де вказане насіння містить в своєму геномі гени сгуїЕ, сгутАс і раї трансформанта сої рОАВУ582.816.15.1, які присутні в насінні сої, депонованому в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером РТА-12588.
Зо Інший варіант здійснення винаходу стосується частини цієї рослини сої, де вказана частина вибрана з групи, що складається з пилка, овул, квіток, паростків, коріння і листя, і де вказана частина містить вказаний трансформант. Інший варіант здійснення винаходу стосується композиції, одержаної з рослини сої або її частини, де вказаною композицією є харчовий продукт, вибраний з групи, що складається з кормового соєвого борошна, харчового борошна і олії.
У іншому варіанті здійснення винаходу, рослина сої містить послідовність ДНК, яка щонайменше на 9595 ідентична послідовності БЕО ІЮ МО:14. Один з варіантів здійснення винаходу стосується потомства рослини сої згідно з вищезгаданим варіантом, де вказана рослина має стійкість до гербіциду глюфозинату, де вказана стійкість зумовлена експресією білка, кодованого у вказаному трансформанті або у вказаному геномі.
Інший варіант здійснення винаходу стосується насіння сої, що містить геном, який включає послідовність ДНК, що щонайменше на 9595 ідентична послідовності «ЕМО ІЮ МО:14. Інший варіант здійснення винаходу стосується рослини, вирощеної шляхом культивування цього насіння сої.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується трансгенної рослини сої або її частини, що включає трансформант сої ррдавВе9582.816.15.1, де репрезентативне насіння сої, що містить трансформант сої ррдіВе9582.816.15.1, було депоноване в Американській колекції типових культур під реєстраційним номером РТА-12588.
Депонування насіння
За час розробки даного винаходу, щонайменше 2500 насінин лінії сої, що містить трансформант рравВе9582.816.15.1, були депоновані в Американській колекції типових культур (АТСС), 10801 Опімегейу Вошемага, Мапабхза5, МА, 20110, ії є загальнодоступними без яких- небудь обмежень (але відповідно до патентного права). Цей депозит був зареєстрований в
АТСС під депозитарним номером Мо РТА-12588 23 лютого 2012 р. компанією Юом/ Адгозсіепсе5
І (С. Вказаний депозит був встановлений на зберігання згідно з Будапештським договором про депонування насіння з метою проведення патентної процедури.
Короткий опис послідовностей
ЗЕО ІЮ МО:1 являє собою 5'і-фланкуючу граничну послідовність ДНК трансформанта сої ррАВУО582.816.15.1. Нуклеотиди 1-1273 складають геномну послідовність. Нуклеотиди 1274- 60 1577 складають послідовність вставки.
ЗЕО ІЮ МО:2 являє собою 3'-фланкуючу граничну послідовність ДНК трансформанта сої ррАВО582.816.15.1. Нуклеотиди 1-175 складають послідовність вставки. Нуклеотиди 176-316 складають реаранжовану послідовність рРОАВУО582. Нуклеотиди 317-1687 складають геномну послідовність.
ЗЕО ІЮ МО:З являє собою послідовність Т-ланцюга ДНК ррАВеО582, яка вказано нижче в таблиці 1.
ЗЕО ІЮ МО:4 являє собою олігонуклеотидний праймер 81615 ЕМ/2 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:5 являє собою олігонуклеотидний праймер 81516 КМ1 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:6 являє собою олігонуклеотидний праймер 81516 КМ2 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗБЕО ІЮ МО:7 являє собою олігонуклеотид 81516 КМЗ для підтвердження 3'-граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮО МО:8 являє собою олігонуклеотидний праймер 5'ВЕпа-01 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮО МО:9 являє собою олігонуклеотидний праймер 5'ВЕпа-02 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:10 являє собою олігонуклеотидний праймер АШБІТОВМІ для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:11 являє собою олігонуклеотидний праймер АШБІТОБМ2 для підтвердження 5'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:12 являє собою олігонуклеотидний праймер З'АТЕпао5 для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗЕО ІЮ МО:13 являє собою олігонуклеотидний праймер З'ТАТЕпа0б для підтвердження 3'- граничної геномної ДНК.
ЗБО ОО МО:14 являє собою передбачувану послідовність трансформанта сої ррАВО582.816.15.1. Ця послідовність включає геномну 5'-фланкуючу послідовність, послідовність-вставку Т-ланцюга ррАВе582 і 3'-фланкуючу геномну послідовність.
Зо Короткий опис графічного матеріалу
На фігурі 1 представлена карта плазміди ррАВУ582, що містить кластери експресії генів сгутЕ м3, сгутАс зупрго і раї мб.
На фігурі 2 вказана локалізація праймерів для підтвердження 5'- і 3і--граничної послідовності трансформанта сої ррдАвВе9582.816.15.1.
На фігурі З представлена геномна послідовність, розташована в певному порядку в трансформанті сої рРОАВО582.816.15.1.
Докладний опис даного винаходу
Обидва кінці послідовності-вставки трансформанта сої ррАВе582.816.15.1 були секвеновані і охарактеризовані. Були розроблені трансформант-специфічні аналізи. Цей трансформант був також картований по геному сої (хромосомі сої 03). Даний трансформант може бути підданий інтрогресії з одержанням більш елітних ліній.
Як згадувалося вище в розділі "Попередній рівень техніки", вбудовування і інтеграція трансгена в геном рослини включає деякі випадкові події (і, отже, слово "подія" включає таке вбудовування). Тобто, багато які методи трансформації, такі як трансформація агробактерією, біобалістична трансформація (тобто за допомогою "вистрілювання" генів) і трансформація, опосередковувана карбідом кремнію (тобто М/НІЗКЕКЗ"М), не дозволяють передбачити, в яку ділянку геному вбудовується даний трансген. Таким чином, ідентифікація фланкуючої геномної
ДНК рослини на обох сторонах вставки може мати важливе значення для ідентифікації рослини, що має дану вставку. Так, наприклад, можуть бути сконструйовані ПЛР-праймери, які генерують
ПЛР-амплікон по всій області стику вставки і геному хазяїна. Цей ПЛР-амплікон може бути використаний для ідентифікації унікальної вставки або вставки іншого типу.
Для кращого розуміння варіантів винаходу і для полегшення практичного здійснення цих варіантів фахівцем в даній галузі, в описі даного винаходу наводяться визначення термінів і приклади. Якщо це не обумовлено особливо, то такі терміни мають загальноприйняті значення, відомі фахівцю в галузі, до якої належить даний винахід. Номенклатура основ ДНК наводиться згідно зі ст. 37 Кодексу законів США (СЕК) в 5 1.822.
Використовуваний тут термін "потомство" означає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, що містить трансформант сої ррАВео582.816.15.1. "Трансгенна рослина з генною модифікацією" (або "трансформант"| (емепі") одержують бо шляхом трансформації клітин рослин гетерологічною ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка включає трансгени, що представляють інтерес; регенерації популяції рослин, одержаних після вбудовування трансгена в геном рослини; і відбору конкретної рослини, відмінної тим, що вона має інсерцію в конкретному положенні геному. Термін "трансгенна рослина з генною модифікацією" ("емепі") означає вихідний трансформант і потомство трансформанта, які включають гетерологічну ДНК. Термін "трансгенна рослина з генною модифікацією" ("емепі") також означає потомство рослини, продукованої за допомогою статевого ауткросингу трансформанта і рослини іншого сорту, що включає геномну/трансгенну
ДНК. Навіть після повторного поворотного схрещування з рекурентним батьком, вбудована трансгенна ДНК і фланкуюча геномна ДНК (геномна/трансгенна ДНК), що походить від трансформованого батька, присутні в потомстві цього кросу в тій же самій хромосомній ділянці.
Термін "трансформант" ("емепі") також означає ДНК вихідного трансформанта і його потомства, що містять вбудовану ДНК і фланкуючу геномну послідовність, розташовану в безпосередній близькості від вбудованої ДНК, яка, як передбачається, повинна передаватися потомству, що одержує цю вбудовану ДНК, включаючи трансген, що представляє інтерес, внаслідок статевого схрещування однієї батьківської лінії яка містить вбудовану ДНК (наприклад, вихідного трансформанта і його потомства, продукованого після самозапилення), і батьківської лінії, яка не містить вбудовану ДНК. "Послідовність стику" або "гранична послідовність" охоплює положення, в якому ДНК, вбудована в геном, приєднана до ДНК геному нативної рослини сої, фланкуючого положення вставки, причому ідентифікація або детектування однієї або іншої послідовності стику в рослинному генетичному матеріалі будуть достатніми для виявлення такого трансформанта.
Даний винахід включає послідовності ДНК, які охоплюють інсерції в описаних тут трансформантах сої і фланкуючу ДНК аналогічної довжини. Конкретні приклади таких діагностичних послідовностей описані в даній заявці, однак, в даному винаході можуть бути використані і інші діагностичні послідовності, які перекриваються з послідовностями стику вказаних вставок або з послідовностями стику вказаних вставок і геномної послідовності, і такі послідовності можуть бути використані відповідно до варіантів здійснення винаходу.
Варіанти здійснення винаходу, зокрема, стосуються ідентифікації подій трансформації з використанням таких фланкуючих послідовностей, послідовностей стику і послідовностей
Зо вставки. Варіанти здійснення винаходу включають використання споріднених ПЛР-праймерів і ампліконів. Відповідно до варіантів здійснення винаходу, для детектування або ідентифікації комерційно доступних сортів або ліній трансгенної сої, виведених із запатентованих ліній трансгенної сої, можуть бути застосовані методи ПЛР-аналізу з використанням ампліконів, які охоплюють вбудовану ДНК і її граничні області.
Фланкуючі послідовності/послідовності стику використовуються як діагностичні ознаки присутності трансформантів сої роАВе582.816.15.1. На основі цих послідовностей були одержані трансформант-специфічні праймери. ПЛР-аналіз показав, що ці лінії рослини сої можуть бути ідентифіковані по різних генотипах сої шляхом аналізу ПЛР-ампліконів, одержаних з використанням наборів цих трансформант-специфічних праймерів. Таким чином, ці і інші аналогічні процедури можуть бути застосовані для ідентифікації унікальності цих ліній рослини сої. Ідентифіковані тут послідовності є унікальними.
Способи детектування згідно з варіантами винаходу є особливо цінними, якщо їх застосовувати в комбінації зі схрещуванням рослин, де, після визначення, яке саме потомство рослини містить даний трансформант, батьківська рослина, яка містить трансформант, що представляє інтерес, може бути схрещена з лінією іншої рослини для надання потомству однієї або більше додаткових ознак, що представляють інтерес. Ці методи із застосуванням ПЛР- аналізів є переважними для реалізації програм по схрещуванню рослин сої, а також по контролю якості, зокрема, товарного насіннєвого матеріалу трансгенної сої. На даний час існують і використовуються набори для ПЛР-детектування цих ліній трансгеної сої. Це дозволяє також прискорити реєстрацію продукту і його надходження на реалізацію.
Крім того, для ідентифікації конкретної геномної локалізації кожної вставки можуть бути використані фланкуючі/геномні послідовності сої. Ця інформація може бути використана для одержання молекулярних маркерних систем, специфічних для кожного трансформанта. Такі системи можуть бути використані для розробки прискореної стратегії схрещування і одержання даних по зчепленню.
Крім того, інформація про фланкуючу послідовність може бути використана для дослідження і характеризації процесів інтеграції трансгенів, властивостей сайта геномної інтеграції, відбору трансформантів, стабільності трансгенів і їх фланкуючих послідовностей і експресії генів (зокрема, процесів, що стосуються сайленсингу генів, профілю метилування трансгенів, ефектів положень і потенційних елементів, асоційованих з експресією, таких як
МАНЗ (області приєднання до матриції і т. п.).
Виходячи зі всього вищесказаного, абсолютно очевидно, що варіанти здійснення винаходу включають насіння, депоноване в АТСС під депозитарним номером, вказаним в параграфі 0033). Варіанти здійснення винаходу також включають стійку до гербіцидів рослину сої, вирощену з насіння, депонованого в АТСС під депозитарним номером, вказаним в параграфі
І0033). Варіанти здійснення винаходу також включають частини вказаної рослини, такі як листя, зразки тканини, насіння, одержане від вказаної рослини, пилок і т. п. (де вказані частини рослини містять сгтуїЕ, стгутАс, раї і ЗЕО ІЮ МО 1 і 2).
Крім того, варіанти здійснення винаходу також включають потомство рослин і/або потомство рослин, вирощених з депонованого насіння, переважно насіння рослини сої, резистентної до гербіцидів, де вказана рослина має геном, що містить описану тут детектовану послідовність "стику/фланкуючу послідовність дикого типу. Використовуваний тут термін "соя" означає рослину Сіусіпе тах і включає всі її сорти, які можуть бути виведені шляхом схрещування однієї рослини сої з іншою рослиною сої.
Даний винахід також включає способи одержання кросів з використанням рослини згідно з винаходом як щонайменше одного батька. Так, наприклад, даний винахід включає Е--гібрид рослини, що має, як одного або двох батьків, будь-які описані тут рослини. Даний винахід також стосується насіння, продукованого такими Е:-гібридами згідно з винаходом. Даний винахід включає спосіб продукування насіння Е/-гібриду шляхом схрещування описаної тут рослини з іншою рослиною (наприклад, інбредним батьком) і збирання одержаного гібридного насіння.
Даний винахід включає описану тут рослину, яка є або жіночою батьківською рослиною, або чоловічою батьківською рослиною. Характеризація одержаних рослин може бути проведена більш ефективно після ретельного дослідження рослин-батьків.
Рослина сої згідно з винаходом, резистентна до комах/стійка до глюфозинату, може бути виведена шляхом першого статевого схрещування першої батьківської рослини сої, вирощеної з насіння будь-якої з вказаних тут ліній, з другою батьківською рослиною сої, з одержанням множини рослин-потомків першого покоління, після чого проводять відбір потомства першого покоління, яке є резистентним до глюфозинату; самозапилення потомства першого покоління з
Зо продукуванням множини рослин-потомків другого покоління, а потім відбір з потомства другого покоління рослини, яка є резистентною до глюфозинату. Ці стадії можуть також включати поворотне схрещування рослини-потомка першого покоління або рослини-потомка другого покоління з другою батьківською рослиною сої або з третьою батьківською рослиною сої. Потім може бути засіяна культура сої, що дає насіння сої або її потомства згідно з винаходом.
Потрібно також зазначити, що дві різних трансгенних рослини можуть бути також схрещені з одержанням потомства, яке містить два доданих екзогенних гени що незалежно сегрегуються.
Після самозапилення відповідного потомства можуть бути одержані рослини, які є гомозиготними по обох доданих екзогенних генах. Поворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг з нетрансгенною рослиною також розглядається як вегетативне розмноження. Фахівцям відомі і інші методи схрещування, звичайно застосовувані для надання різних ознак і вирощування різних культур. Поворотне схрещування було використане для простої передачі добре успадкованої ознаки шляхом перенесення генів в потрібні гомозиготні сорти або в інбредну лінію, яка є рекурентним батьком. Джерело ознаки, що передається, називають батьком-донором. Як і очікувалося, одержана рослина має ознаки рекурентного батька (наприклад, сорту), і ця бажана ознака передається від батька-донора. Після першого схрещування відбирають рослини, що мають фенотип батька-донора, і ці рослини повторно схрещують (піддають поворотному схрещуванню) з рекурентним батьком. Як і очікувалося, одержана рослина має ознаки рекурентного батька (наприклад, сорту), і ця бажана ознака передається від батька-донора.
Аналогічним чином, резистентна до комах/стійка до глюфозинату рослина сої згідно з варіантом здійснення винаходу може бути трансформована додатковими трансгенами із застосуванням відомих методів. Методи трансформації, такі як трансформація агробактерією, біобалістична трансформація (тобто за допомогою "вистрілювання" генів) і трансформація, опосередковувана карбідом кремнію (тобто УУНІЗКЕК5"М), можуть бути застосовані для введення додаткового(их) трансгена(ів) в геном трансформанта сої ррАВе582.816.15.1. Відбір і характеризація трансгенних рослин, що містять нові вбудовані трансгени, можуть бути здійснені для ідентифікації рослин, які містять, крім генів сгуїЕ, сту! Ас, раї згідно з варіантами здійснення винаходу, стабільний інтегрант нового трансгена.
Молекули ДНК згідно з варіантами здійснення винаходу можуть бути використані як бо молекулярні маркери в методі схрещування із застосуванням маркерів (МАВ). Молекули ДНК згідно з варіантами здійснення винаходу можуть бути використані в методах із застосуванням маркерів (таких як АРІ Р-, ВЕГР-, ВАРО-, 5МР- ії 55К-маркери), які дозволяють ідентифікувати агрономічно цінні і генетично зчеплені ознаки, відомі фахівцям. Ознаки резистентності до комах і стійкості до гербіцидів можуть бути простежені у потомства кросу, одержаного шляхом схрещування з рослиною сої згідно з варіантами здійснення винаходу (або з її потомством і будь-яким іншим сортом або іншим різновидом рослини сої), із застосуванням МАВ-методів.
Маркерами для вказаних ознак є молекули ДНК, і МАВ-методи, добре відомі фахівцям, можуть бути застосовані для простеження ознаки (ознак) стійкості до гербіцидів у рослин сої, де щонайменше одна лінія рослини сої згідно з варіантами здійснення винаходу або її потомства є батьком або предком. Способи згідно з варіантами здійснення винаходу можуть бути застосовані для ідентифікації рослини сої будь-якого сорту, яка має трансформант, що розглядається.
Варіанти здійснення винаходу включають спосіб одержання рослини сої, резистентної до комах і стійкої до гербіцидів, де вказаний спосіб включає схрещування з рослиною згідно з винаходом. Більш конкретно, вказані способи можуть включати схрещування двох рослин згідно з винаходом або однієї рослини згідно з винаходом з будь-якою іншою рослиною. Переважні способи також включають відбір потомства вказаного кросу шляхом аналізу вказаного потомства на трангенну модифікацію, детектовану відповідно до варіанта здійснення винаходу, і на бажану продуктивність даного сорту (наприклад, врожайність). Так, наприклад, варіанти здійснення винаходу можуть бути застосовані для простеження події трансформації, що розглядається, у всіх циклах схрещування з рослинами, що мають інші бажані ознаки, такі як агрономічні показники, стійкість або резистентність до хвороб, стійкість або резистентність до нематод і час дозрівання насіння. Рослини, які містять трансформант, що розглядається, і які мають потрібну ознаку, можуть бути детектовані, ідентифіковані, відібрані і відразу використані, наприклад, в подальших раундах схрещування. Трансформант/ознака, що розглядається, може бути також зчеплений(а) з іншою(ими) ознакою(ами) резистентності до комах і/або з іншими ознаками стійкості до гербіцидів за допомогою схрещування, а потім може бути проведений моніторинг такого(ї) трансформанта/ознаки відповідно до варіантів здійснення винаходу. Одним з варіантів останнього аспекту є рослини, які містять трансген, що розглядається, об'єднаний з
Зо генами сгуїб і сгулАс, що надають резистентність до лускокрилих, якими є Рзецйдоріивіа іпсічадеп5 (соєвий п'ядак), Апіїсагзіа деттагцаїї5 (листовійка квасолі), Еріпопйа арогета, Отоіде5 іпдісаїи5, Васпіріизіа пи, бродорієга Мидірегда, Зродорієгта со5тоідез5, Зродорієга егідапіа,
Неїйоїпів мігезсеп5, Неїосомегра 7єа, Зріозота мігдіпіса і ЕІазтораїриз ІїдпозеїПи5.
Таким чином, варіанти здійснення винаходу можуть бути об'єднані, наприклад, з додатковими ознаками, що кодують резистентність до гліфосату (наприклад, резистентність до рослинних або бактеріальних ЕР5РБ5, СОХ, САТ), резистентність до глюфозинату (наприклад, резистентність до й51т-2, Баг), резистентність до гербіциду, інгібуючого ацетолактатсинтазу (АЇ 5) (наприклад, до імідазолінонів (таких як імазетапір|), до сульфонілсечовин, до сульфоаніліду триазолпіримідину, до піримідинілтіобензоатів і до інших хімічних речовин |СзвГІЇ,
ЗМиГА і т.п.)); резистентність до бромоксинілу (наприклад, Вхп); резистентність до інгібіторів ферменту НРРО /(4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази); резистентність до інгібіторів фітоєндезатурази (РОЗ); резистентність до гербіцидів, інгібуючих фотосистему ІЇ (наприклад, роБА); резистентність до гербіцидів, інгібуючих фотосистему І; резистентність до гербіцидів, інгібуючих протопорфіриногеноксидазу ЇХ (РРО) (наприклад, РРО-1), резистентність до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, СУР7БВІ1), резистентність до ферментів, розкладаючих дикамбу (див., наприклад, 05 20030135879), і з іншими ознаками, які можуть бути зчеплені з однією ознакою або у множині їх комбінацій, з метою ефективного знищення або попередження поширення заносних бур'янів і/або надання резистентності до будь-яких гербіцидів вищезазначених класів.
Крім того, трансформант сої ррАВео582.816.15.1 може бути зчеплений з однією або більше додатковими ознаками (наприклад, з резистентністю до комах, резистентністю до зараження патогенами або стійкістю до стресів і т. п.) або з продуктивними ознаками (наприклад, з підвищеною врожайністю, з підвищеною олійністю, поліпшеною якістю волокна і т. п.). Таким чином, варіанти здійснення винаходу можуть бути застосовані для вирощування сільськогосподарських культур з повним набором поліпшених агрономічних ознак, таких як якість культури, її пристосовність і економічний показник "витрати - ефективність боротьби з будь-якими шкідниками сільськогосподарських культур".
Методи інтеграції полінуклеотидної послідовності в специфічний сайт хромосоми рослинної клітини за допомогою гомологічної рекомбінації описані в літературі. Так, наприклад, сайт- бо специфічна інтеграція, описана в публікації патентної заявки на патент США Мо 2009/0111188
А1, яка вводиться в даний опис за допомогою посилання, включає використання рекомбіназ або інтеграз, опосередковуючих введення донорної полінуклеотидної послідовності в хромосому мішені. Крім того, в міжнародній патентній заявці Ме ММО 2008/021207, яка вводиться в даний опис за допомогою посилання, описана гомологічна рекомбінація, опосередковувана білками "цинкові пальці" і здійснювана для інтеграції однієї або більше донорних полінуклеотидних послідовностей в специфічні положення геному. Рекомбінази, такі як РІ Р/ЕКТ, описані в патенті
США Мо 6720475, який вводиться в даний опис за допомогою посилання, або СЕЕ/ ОХ, описані в патенті США Мо 5658772, який вводиться в даний опис за допомогою посилання, можуть бути використані для інтеграції полінуклеотидної послідовності в специфічний сайт хромосоми. І, нарешті, використання мегануклеаз для вбудовування донорних полінуклеотидів в специфічний сайт хромосоми було описане в публікації Рисніа еї аІ., РМАБ5 ОА 93 (1996) рр. 5055-5060).
Також існують і, в основному, застосовуються інші, по суті, відомі методи сайт-специфічної інтеграції в клітини рослин (Киптаг еї аї., Тгтепаз іп Ріапі Зеї 6(4) (2001), рр. 155-159). Крім того, системи сайт-специфічної рекомбінації, які були ідентифіковані у деяких прокаріотичних і нижчих еукаріотичних організмів, можуть бути використані і в рослинах. Прикладами таких систем є, але не обмежуються ними, система рекомбіназ К/К5 плазміди роК1 дріжджів гудозасспаготусез гоихії (Агакі еї аї. (1985), У. Мої. Віої. 182:191-203) і система біп/с5іх фага Ми (Маєзег апа КаніІтапп (1991), Мої. Сеп. Сепеї. 230:170-176).
У деяких варіантах здійснення винаходу можуть виявитися бажаними інтеграція або зчеплення з новим(и) трансгеном(ами) в безпосередній близькості від існуючої трансгенної вставки. Трансгенна вставка може розглядатися як переважний геномний локус, який був вибраний, виходячи з унікальних ознак, таких як єдиний інсерційний сайт, нормальна менделевська сегрегація і стабільна експресія, і переважна комбінація властивостей, включаючи стійкість до гербіцидів і агрономічна продуктивність в окремо взятому і в різних інших географічних регіонах. Потомство рослин, що містить інтегровані трансгени, повинно зберігати експресійні властивості трансгена у вже існуючих трансформантах. Крім того, оскільки вже були ідентифіковані геномні фланкуючі послідовності і їх локалізація в хромосомі потомства рослин, що містять такий трансген, то можуть бути проведені розроблені аналізи для детектування і підтвердження цього трансгена в потомстві рослин, що містять інтегрований
Зо трансген. І нарешті, інтеграція нового трансгена в специфічне положення хромосоми, яке тісно зчеплене з існуючим трансгеном, буде полегшувати інтрогресію трансгенів в інший генетичний фон за допомогою статевого ауткросингу із застосуванням стандартних методів схрещування.
У деяких варіантах здійснення винаходу, може виявитися бажаним вирізання полінуклеотидних послідовностей з трансгенної вставки. Так, наприклад, вирізання трансгена, описане в публікації заявки на патент США Мо 2011/191877, яка вводиться в даний опис за допомогою посилання, здійснюють з використанням нуклеаз "цинкові пальці" для видалення полінуклеотидної послідовності, що складається з генного експресійного кластера, з інтегрованої в хромосому трансгенної вставки. Полінуклеотидною послідовністю, що видаляється, може бути селективний маркер. Після вирізання і видалення полінуклеотидної послідовності, модифікована трансгенна вставка може бути знов вбудована шляхом інсерції полінуклеотидної послідовності. Вирізання полінуклеотидної послідовності і подальше повторне вбудовування модифікованої трансгенної вставки дає певні переваги, такі як можливість повторного використання селективного маркера або попередження спонтанних замін в транскриптомі рослини, які можуть відбуватися внаслідок експресії специфічних генів.
У даному винаході описаний специфічний сайт на хромосомі 03 в геномі сої, який може бути використаний для вбудовування в нього гетерологічних нуклеїнових кислот. Таким чином, варіанти здійснення винаходу стосуються способів введення гетерологічних нуклеїнових кислот, що представляють інтерес, в цей попередньо визначений сайт-мішень або в область, розташовану поблизу від цього сайта-мішені. Варіанти здійснення даного винаходу також охоплюють насіння сої і/або рослину сої, що містить будь-яку гетерологічну нуклеотидну послідовність, вбудовану в описаний тут сайт-мішень або в звичайне оточення цього сайта.
Одним з засобів досягнення такої націленої інтеграції є вирізання і/або введення іншої вставки замість описаного тут раї-експресуючого кластера. Взагалі кажучи, у варіантах здійснення винаходу може бути застосований будь-який метод, яким є, наприклад, але не обмежується цим, направлена гомологічна рекомбінація.
Використовуваний тут термін "зчеплення" гена, трансгена або ознаки означає об'єднання бажаних ознак в одній трансгенній лінії Зчеплення трансгенних ознак здійснюються селекціонерами за допомогою схрещування батьків, кожний з яких має одну з потрібних ознак, і подальшої ідентифікації потомства, яке має обидві ці потрібні ознаки. Іншим способом 60 зчеплення генів є перенесення двох або більше генів в ядро клітини рослини під час трансформації. Іншим способом зчеплення генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим геном, що представляє інтерес. Так, наприклад, зчеплення генів може бути застосоване для об'єднання двох або більше різних ознак, включаючи, наприклад, дві або більше різних ознак, таких як ознака(и) резистентності до комах і ознака(и) резистентності до
Б хвороб, а також дві або більше ознак резистентності до гербіцидів, і/або ознака(и) резистентності до комах і ознака(и) резистентності до гербіцидів. При "зчепленні генів", крім використання гена, що представляє інтерес, можна також використовувати селективний маркер.
Термін "гомологічна рекомбінація" означає реакцію між будь-якою парою нуклеотидних послідовностей, які мають відповідні сайти, що містять аналогічні нуклеотидні послідовності, за допомогою яких дві нуклеотидні послідовності можуть взаємодіяти (піддаватися рекомбінації) з утворенням нової послідовності рекомбінантної ДНК. Сайти кожної з аналогічних нуклеотидних послідовностей називаються тут "гомологічними послідовностями". Взагалі кажучи, частота гомологічної рекомбінації зростає у міру збільшення довжини гомологічної послідовності. Таким чином, якщо гомологічна рекомбінація відбувається між двома нуклеотидними послідовностями, що мають меншу міру ідентичності, то частота (або ефективність) рекомбінації знижується у міру збільшення дивергентності цих двох послідовностей. Рекомбінація може бути здійснена з використанням однієї гомологічної послідовності на кожного донора і молекулу-мішень, в результаті чого може бути одержаний продукт рекомбінації "простого кросинговеру".
Альтернативно, дві гомологічні послідовності можуть знаходитися на кожній з нуклеотидних послідовностей мішені і донора. Рекомбінація між двома гомологічними послідовностями на донорі і двома гомологічними послідовностями на мішені приводить до одержання продукту рекомбінації "подвійного кросинговеру". Якщо гомологічні послідовності на донорній молекулі фланкують послідовність, що піддається модифікації (наприклад, послідовність, що представляє інтерес), то рекомбінація за допомогою подвійного кросинговеру з молекулою- мішенню буде приводити до утворення продукту рекомбінації, в якому послідовність, що представляє інтерес, буде замінювати послідовність ДНК, яка спочатку знаходилася між гомологічними послідовностями на молекулі-мішені. Обмін послідовностями ДНК між мішенню і донором, який відбувається внаслідок події рекомбінації з подвійним кросинговером, називається "заміною послідовностей".
Зо Переважні рослини або насіння згідно з варіантами здійснення винаходу містять в своєму геномі ідентифіковані тут операторні нуклеотидні послідовності сгуїЕ, сгутАс 5зупрго і раї разом щонайменше з 20-500 або більше суміжними фланкуючими нуклеотидами, що знаходяться на обох сторонах вставки, як описано в даній заявці. Якщо це не обумовлено особливо, то термін "фланкуючі послідовності" означає послідовності, ідентифіковані в зЕО ІЮ МО:1 і ЗЕО ІЮ МО:2.
Як і очікувалося, всі ці фланкуючі послідовності або їх частини можуть передаватися потомству, яке буде мати вбудовану ДНК завдяки статевому схрещуванню з батьківською лінією, що включає вказаний трансген.
Варіанти здійснення винаходу включають тканинні культури регенерованих клітин рослини згідно з варіантами здійснення винаходу. Варіанти здійснення винаходу також включають рослину, регенеровану з вказаної тканинної культури, зокрема рослину, яка має здатність експресувати всі морфологічні і фізіологічні ознаки репрезентативного сорту. Переважні рослини згідно з варіантами здійснення винаходу мають всі фізіологічні і морфологічні ознаки рослини, вирощеної з депонованого насіння. Варіанти здійснення винаходу також включають потомство такого насіння і насіння, яке має якісні ознаки, що представляють інтерес.
Використовуваний тут термін "лінія" означає групу рослин, які мають незначні відмінності між собою щонайменше по одній ознаці або взагалі не мають родових відмінностей. Такі лінії можуть бути створені в результаті самозапилення і відбору або вегетативного розмноження декількох поколінь з одного батька із застосуванням методів культивування тканин або клітин.
Використовувані тут терміни "сорт" і "різновид" є синонімами і означають лінію, використовувану в промисловому виробництві.
Терміни "стабільність" або "стабільний", якщо вони стосуються даного компонента, означають, що даний компонент зберігається від покоління до покоління, а переважно щонайменше по трьох поколіннях.
Термін "комерційна цінність" рослини означає, що дана рослина має хорошу схожість і високу фертильність, що дозволяє фермерам вирощувати цю культуру на фермах зі стандартним сільськогосподарським обладнанням, а олія з описаними тут компонентами може бути екстрагована з насіння на стандартному обладнанні для помелу і екстракції.
Термін "агрономічно елітний" стосується лінії, яка має бажані агрономічні властивості, такі як висока врожайність, зрілість, резистентність до хвороб і т. п., а також резистентність до комах і бо стійкість до гербіцидів, що надаються трансформанту(ам), що розглядається(ються). Будь-які і всі описані агрономічні ознаки і контрольні точки можуть бути використані для ідентифікації таких рослин у вигляді або оцінного бала, або будь-якої граничної точки або обох граничних точок інтервалу значень, використовуваних для визначення властивостей таких рослин.
Як буде очевидно з даного опису, переважні варіанти наборів для детектування можуть, наприклад, включати зонди і/або праймери, які зв'язані з "послідовностями стику" або "послідовностями транзиції" і/або містять "послідовності стику" або "послідовності транзиції" (де геномна фланкуюча послідовність сої приєднана до послідовності вставки). Так, наприклад, ці набори включають полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, сконструйовані для ідентифікації однієї або обох послідовностей стику (де вставка приєднана до фланкуючої послідовності). Однією зі стандартних конструкцій є конструкція, що має один праймер, який гібридизується у фланкуючій області, і один праймер, який гібридизується у вставці. Такі праймери звичайно мають довжину щонайменше приблизно 15 залишків. При такому розташуванні, праймери можуть бути використані для генерування/ампліфікації детектованого амплікону, який вказує на присутність трансгена згідно з варіантом здійснення винаходу. Ці праймери можуть бути використані для генерування амплікону, який охоплює (і включає) послідовність стику, вказану вище.
Праймер(и), "що приєднується(ються)" до фланкуючої послідовності, звичайно не гібридизується(ються) в області, що знаходиться за межами приблизно 1200 основ або за межами області стику. Таким чином, типові фланкуючі праймери повинні бути сконструйовані так, щоб вони містили щонайменше 15 залишків будь-якого ланцюга в межах 1200 основ у фланкуючих послідовностях від початку вставки. Тобто, праймери, які містять послідовність відповідного розміру, що складається із залишків (або гібридизується з ними) в області, що складає в межах від пар основ 1 до 1273 5ЕО ІЮ МО:1 і/або пар основ 176-1687 5ЕО ІЮО МО2, входять в обсяг варіантів здійснення винаходу. Аналогічним чином, праймери вставки можуть бути сконструйовані в будь-якій ділянці вставки, однак, пари основ 1273-1873 і 13058-13658
ЗЕО ІЮ МО:14 можуть бути використані, наприклад, для конструювання кожного праймера без виключення.
Для фахівця в даній галузі також очевидно, що праймери і зонди можуть бути сконструйовані для гібридизації в стандартних умовах гібридизації і/або ПЛР-умовах, де
Зо вказаний праймер або зонд не є повністю комплементарним репрезентативній послідовності.
Тобто, в цьому випадку може бути допустима певна міра невідповідності або виродженості. Що стосується праймера, що складається приблизно з 20 нуклеотидів, то, звичайно, наприклад, один, два або т. п. нуклеотидів необов'язково будуть зв'язуватися з протилежним ланцюгом, якщо невідповідна основа знаходиться всередині або на кінці праймера, протилежного амплікону. Різні придатні умови гібридизації описані нижче. У зондах можуть бути також використані синтетичні нуклеотидні аналоги, такі як інозин. Можуть бути також використані зонди на основі пептидовмісної нуклеїнової кислоти (РМА), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо зазначити, що такі зонди і праймери є діагностичними показниками (тобто здатні ідентифікувати і диференціювати унікальні ознаки) присутності трансформанта згідно з варіантом здійснення винаходу.
Потрібно зазначити, що при ПЛР-ампліфікації можуть виникати помилки, які можуть приводити, наприклад, до незначних помилок при секвенуванні. Тобто, якщо це не обумовлено особливо, то описані тут послідовності були визначені шляхом конструювання довгих ампліконів, що походять від геномних ДНК сої, з подальшим клонуванням і секвенуванням цих ампліконів. Тому недивно, що в послідовностях, одержаних і визначених таким способом, можуть бути виявлені незначні відмінності і деякі невідповідності, якщо брати до уваги необхідність проведення множини раундів ампліфікації для одержання амплікону, достатнього для секвенування геномних ДНК. Потрібно зазначити і брати до уваги, що будь-які уточнення, необхідні для виправлення помилок або невідповідностей такого типу, які звичайно виникають при секвенуванні, входять в обсяг варіантів здійснення винаходу.
Потрібно також зазначити, що деякі геномні послідовності нерідко є делетованими, наприклад, при вбудовуванні послідовності в процесі створення трансформанта. Таким чином, між фланкуючими послідовностями, що розглядаються, і геномними послідовностями, що є, наприклад, в базі даних СЕМВАМК, можуть спостерігатися деякі відмінності.
Компоненти послідовності ДНК-"вставки" представлені на кресленнях і більш детально обговорюються нижче в прикладах. Полінуклеотидні послідовності ДНК цих компонентів або їх фрагменти можуть бути використані як ДНК-праймери або зонди в способах згідно з варіантами здійснення винаходу.
У деяких варіантах здійснення винаходу, композиції і способи застосовуються для бо детектування присутності трансгенної/геномної області вставки в рослині сої і в її насінні і т. п.
Були одержані послідовності ДНК, що містять описану тут 5'-трансгенну/геномну послідовність стику в області вставки (між парами основ 1-1273 ЗЕО ІЮ МО і 1-4273 5ЕО ІЮ МО:14); їх сегменти і комплементи будь-яких репрезентативних послідовностей і будь-яких їх сегментів.
Були одержані послідовності ДНК, що містять описану тут 3'-трансгенну/геномну послідовність стику в області вставки (між парами основ 176-1687 ЗЕО ІО МО:2 і 13659-15170 5ЕО ІЮ МО:14); їх сегменти і комплементи будь-яких репрезентативних послідовностей і будь-яких їх сегментів.
Послідовність стику області вставки охоплює послідовність стику, розташовану між гетерологічною ДНК, вбудованою в геном, і ДНК, яка присутня в клітинах рослини сої і фланкує інсерційний сайт. Такі послідовності дозволяють діагностувати даний трансформант.
На основі цих послідовностей вставки і граничних послідовностей можуть бути сконструйовані праймери, специфічні для даного трансформанта. ПЛР-аналіз показав, що лінії рослини сої згідно з варіантами здійснення винаходу можуть бути ідентифіковані на різні генотипи сої шляхом проведення аналізу ПЛР-ампліконів, одержаних з використанням наборів цих праймерів, специфічних для даного трансформанта. Ці і інші споріднені методи можуть бути застосовані для ідентифікації унікальних властивостей цих ліній рослин сої, що містять трансформант сої ррАВе9582.816.15.1. Таким чином, ПЛР-амплікони, що походять від таких пар праймерів, є унікальними і можуть бути використані для ідентифікації цих ліній рослини сої.
У деяких варіантах здійснення винаходу, послідовності ДНК, які містять суміжний фрагмент нової трансгенної/геномної області вставки, також є аспектом даного винаходу. Даний винахід включає послідовності ДНК, які містять полінуклеотиди трансгенної послідовності вставки достатньої довжини і полінуклеотиди геномної послідовності сої достатньої довжини, що походять від однієї або більше з вищезазначених рослин сої, і/або послідовності, які можуть служити як праймери для продукування продукту-амплікону, використовуваного для ідентифікації однієї або більше з цих рослин сої.
Споріднені варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, які містять щонайменше 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжних нуклеотидів трансгенної частини ідентифікованої тут послідовності ДНК (такої як ЗЕО ІЮО МО:1 і її сегмент) або її комплементів і фланкуючу послідовність ДНК сої аналогічної довжини, що походить від вказаних послідовностей або їх комплементів. Такі послідовності можуть бути
Зо використані як ДНК-праймери в методах ампліфікації ДНК. Амплікони, продуковані з використанням цих праймерів, дозволяють ідентифікувати будь-які описані тут трансгенні рослини сої. Тому, варіанти здійснення винаходу також включають амплікони, продуковані з використанням таких ДНК-праймерів.
Варіанти здійснення винаходу також включають способи детектування присутності ДНК в зразку, який відповідає описаному тут трансформанту сої. Такі способи можуть включати: (а) контактування зразка, що містить ДНК, з набором праймерів, які, при їх використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з ДНК, що походить щонайменше від одного 3 цих трансформантів сої, продукують амплікон, що дозволяє ідентифікувати вказаний) трансформант(и); (Б) здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням амплікону, і (с) детектування амплікону.
Інші способи детектування згідно з варіантами здійснення винаходу включають спосіб детектування присутності ДНК в зразку, відповідному вказаному трансформанту, де вказаний спосіб включає: (а) контактування зразка, що містить ДНК, із зондом, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК, що походить щонайменше від одного 3 вказаних трансформантів сої, і який не гібридизується в жорстких умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини сої (яка не містить ДНК-вставку, що представляє інтерес); (Б) гібридизацію зразка і зонда в жорстких умовах; і (с) детектування гібридизації зонда з ДНК.
У інших своїх варіантах, даний винахід включає способи одержання рослини сої, що містить трансформант ррдвВе582.816.15.1 згідно з варіантом здійснення винаходу, де вказаний спосіб включає стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської лінії сої (яка містить експресійний кластер згідно з варіантом здійснення винаходу, що надає рослинам вказаної лінії ознаку стійкості до глюфозинату) з другою батьківською лінією сої (яка не має такої ознаки стійкості до гербіцидів) з одержанням множини потомства рослини; і (б) відбору потомства рослини з використанням молекулярних маркерів. Такі способи можуть включати, але необов'язково, додаткову стадію поворотного схрещування потомства рослини з другою батьківською лінією сої з одержанням чистосортної рослини сої, яка має вказану ознаку резистентності до комах і стійкості до глюфозинату.
Відповідно до іншого свого аспекту, даний винахід стосується способів визначення зиготності потомства кросів з вказаним трансформантом. Такі способи можуть включати бо контактування зразка, що містить ДНК сої, з набором праймерів згідно з варіантом здійснення винаходу. Вказані праймери, при їх використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК, яка походить від вказаних трансформантів сої, продукують перший амплікон, що дозволяє ідентифікувати вказані трансформанти сої. Такі способи також включають здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з продукуванням першого амплікону; детектування першого амплікону і контактування зразка, що містить ДНК сої, з другим набором праймерів (вказаний другий набір праймерів, якщо він використовується в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК рослин сої, продукує другий амплікон, що включає ендогенну послідовність геномної ДНК природної сої, яка не містить полінуклеотидної послідовності вказаного трансформанта); і здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з продукуванням другого амплікону. Вказані способи також включають детектування другого амплікону і порівняння першого і другого ампліконів в зразку, де присутність обох ампліконів вказує на зиготність трансгенної вставки.
Набори для детектування ДНК можуть бути розроблені із застосуванням описаних тут композицій і методів, добре відомих фахівцям в галузі детектування ДНК. Такі набори є придатними для ідентифікації ДНК, що розглядається, трансгенної сої в зразку і можуть бути застосовані в методах схрещування рослин сої, що містять цю ДНК. Вказані набори містять послідовності ДНК, комплементарні ампліконам, наприклад описаним тут ампліконам, або послідовностям ДНК, які є комплементарними ДНК, що міститься в трансгенних генетичних елементах трансформантів, що розглядаються. Ці послідовності ДНК можуть бути використані в реакціях ампліфікації ДНК або як зонди в методі гібридизації ДНК. Вказані набори можуть також містити реагенти і матеріали, необхідні для здійснення методу детектування. "Зонд" являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана стандартна детектована мітка або репортерна молекула (така як радіоактивний ізотоп, лиіганд, хемілюмінесцентний агент або фермент). Такий зонд може гібридизуватися з ланцюгом нуклеїнової кислоти-мішені, а у випадку варіантів здійснення винаходу - з ланцюгом геномної
ДНК одного з вказаних трансформантів сої, незалежно від того, чи походять вони від самої рослини сої або зразка, що включає ДНК трансформанта. Зондами згідно з варіантами здійснення винаходу є не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також і поліаміди і інші матеріали, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і можуть бути
Зо використані для детектування присутності цієї послідовності ДНК-мішені. "Праймери" являють собою виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які були піддані відпалу з ланцюгом ДНК-мішені за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду "праймер - ланцюг ДНК-мішені" і з подальшим подовженням ланцюга ДНК-мішені під дією полімерази, наприклад ДНК-полімерази. Пари праймерів згідно з варіантами здійснення винаходу можуть бути використані для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або із застосуванням інших стандартних методів ампліфікації нуклеїнових кислот.
Зонди і праймери звичайно мають довжину в 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, А5, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189,190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 216, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 00, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, зго, 321, Зз22, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359,
З6О, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, А15, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, А23, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 60 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, А76, 477, 478, 479,
480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 4687, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 або 1000, або 2000, або 5000, або більше полінуклеотидів. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню за допомогою гібридизації в умовах високої жорсткості. Переважно, зонди і праймери згідно з варіантами здійснення винаходу мають послідовності, повністю ідентичні послідовності-мішені, хоч можуть бути сконструйовані зонди, які відрізняються від послідовності-мішені і зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями, і такі зонди можуть бути сконструйовані стандартними методами.
Методи одержання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, в керівництві
МоїІесшіаг Сіопіпд: А І абогаїогу Мапаиаї, 2па едй., мої. 1-3, єд. Затргоок еї а!., Соїд ріпа Наїбог
І арогагогу Рге55, Соїа Зргіпд Нагбог, М.У., 1989. Пари ПЛР-праймерів можуть бути одержані з відомої послідовності, наприклад, з використанням комп'ютерних програм, розроблених для цієї мети.
Праймери і зонди, одержані на основі описаних тут фланкуючих послідовностей ДНК і послідовностей вставок, можуть бути використані для підтвердження (і, якщо це необхідно, для корекції) описаних послідовностей стандартними методами, наприклад шляхом повторного клонування і секвенування таких послідовностей.
Нуклеїновокислотні зонди і опраймери згідно 3 варіантами здійснення винаходу гібридизуються з послідовністю ДНК-мішені в жорстких умовах. Для детектування присутності
ДНК трансгенної вставки в зразку може бути застосований стандартний метод гібридизації нуклеїнових кислот або метод ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнової кислоти або їх фрагменти здатні специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнової кислоти в певних умовах. Вважається, що дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо ці дві молекули здатні утворювати антипаралельну структуру дволанцюжкової нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти "комплементарна" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо ці молекули мають повну комплементарність. Вважається, що молекули є "повністю комплементарними", якщо кожний нуклеотид однієї з цих молекул комплементарний нуклеотиду іншої молекули. Молекули, які є "повністю комплементарними", по суті гібридизуються одна з одною, але, при цьому, зберігають стабільність, достатню для їх гібридизації однієї з одною щонайменше в стандартних умовах
Зо "високої жорсткості". Стандартні умови високої жорсткості описані в керівництві затьгоок еї аї., 1989.
Дві молекули вважаються "мінімально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною, але, при цьому, зберігати стабільність, достатню для їх гібридизації однієї з одною щонайменше в стандартних умовах "низької жорсткості". Стандартні умови низької жорсткості описані в керівництві Затьгоок еї аї., 1989. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти могла служити як праймер або зонд, необхідно, щоб вона була лише мінімально комплементарна послідовності, здатній утворювати стабільну дволанцюжкову структуру в присутності конкретного розчинника і в присутності солі в певній концентрації.
Термін "жорсткі умови" або "умови жорсткості" функціонально визначений з точки зору гібридизації нуклеїновокислотного зонда з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто з конкретною послідовністю нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес), що проводиться відповідно до процедури специфічної гібридизації, обговорюваної в керівництві Затрьгоок еї аї., 1989, 9.52- 9.55. Див., також, затьгоок еї аї!., 1989, 9.47-9.52 і 9.56-9.58.
Залежно від мети застосування, умови гібридизації можуть варіюватися для досягнення різних мір селективності зонда або праймера з виродженою полінуклеотидною послідовністю відносно послідовності-мішені. У тих випадках, коли потрібна висока селективність, звичайно використовуються відносно жорсткі умови утворення гібридів однієї полінуклеотидної послідовності з іншою полінуклеотидною послідовністю, наприклад, в цьому випадку потрібно використовувати відносно низькі концентрації солі і/або високу температуру, наприклад концентрація Масі може складати приблизно від 0,02М до 0,15М, а температура може складати приблизно від 507С до 70"С. Жорсткі умови, наприклад, можуть включати щонайменше 2-кратне промивання гібридизаційного фільтра промивальним буфером високої жорсткості (0,2х5556, 0195 ДСН, 65"С). Відповідні умови жорсткості, стимулюючі гібридизацію ДНК, наприклад обробка 6,0х хлоридом натрію/цитратом натрію (550) приблизно при 45"С, з подальшим промиванням 2,0х5552 при 50"С, відомі фахівцям в даній галузі. Так, наприклад, концентрація солі в стадії промивання може бути вибрана з концентрацій солі, звичайно використовуваних в умовах низької жорсткості, а саме, приблизно 2,0х5552 при 50"С, і концентрацій солі, звичайно використовуваних в умовах високої жорсткості, а саме, приблизно 0,2х5552 при 507С. Крім того, температура в стадії промивання, яка в умовах низької жорсткості становить приблизно 22"С, бо тобто кімнатну температуру, може бути підвищена до температури гібридизації в умовах високої жорсткості, тобто приблизно до 65"С. Температура і концентрація солі можуть варіюватися або один з цих параметрів може залишатися постійним, а інший може змінюватися.
При таких селективних умовах можуть спостерігатися, якщо вони взагалі є, незначні невідповідності між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню. Детектування послідовностей
ДНК за допомогою гібридизації добре відоме фахівцям, і репрезентативні методи аналізів за допомогою гібридизації описані в патентах США МоМо 4965188 і 5176995.
У особливо переважному варіанті винаходу, нуклеїнова кислота згідно з варіантом здійснення винаходу може специфічно гібридизуватися з одним або більше проілюстрованими або описаними тут праймерами (або ампліконами або іншими послідовностями), включаючи комплементи і їх фрагменти, в умовах високої жорсткості. У одному з аспектів даного винаходу, маркерна молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення винаходу має послідовність нуклеїнової кислоти, представлену тут в одній 3 репрезентативних послідовностей, або комплементи і/або фрагменти цієї послідовності.
У іншому аспекті даного винаходу, маркерна молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення винаходу має послідовність, яка на 80-10095 або 90-10095 ідентична вказаним послідовностям нуклеїнової кислоти. У іншому аспекті даного винаходу, маркерна молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення винаходу має послідовність, яка на 95-10095 ідентична такій послідовності нуклеїнової кислоти. Ці послідовності можуть бути використані як маркери в методах схрещування рослин для ідентифікації потомства генетичних кросів. Гібридизація зонда з молекулою ДНК-мішені може бути детектована будь-якими методами, відомими фахівцям, і такими методами можуть бути, але не обмежуються ними, методи, здійснювані з використанням флуоресцентних міток, радіоактивних міток, міток на основі антитіл і хемілюмінесцентних міток.
Що стосується ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені (наприклад, за допомогою ПЛР), що проводиться з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, то термін "жорсткі умови" означає умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися тільки з послідовністю нуклеїнової кислоти-мішені, з якою може зв'язуватися праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), і переважно продукувати унікальний продукт ампліфікації, тобто амплікон.
Зо Термін "специфічний до (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизується в жорстких умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що містить таку послідовність-мішень.
Використовувані тут терміни "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означають продукт ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, яка є частиною нуклеїновокислотної матриці. Так, наприклад, для того, щоб визначити, чи може рослина сої, одержана в результаті статевого схрещування, містити трансгенну геномну ДНК рослини-трансформанта сої згідно з варіантом здійснення винаходу, ДНК, екстрагована із зразка тканини рослини сої, може бути піддана ампліфікації нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, яка включає праймер, що походить від фланкуючої послідовності, яка присутня в геномі рослини і знаходиться поблизу від інсерційного сайта вбудованої гетерологічної ДНК, і другий праймер, що походить від вбудованої гетерологічної ДНК, внаслідок чого може бути одержаний амплікон, який може бути використаний для детектування присутності трансгенної ДНК. Амплікон має довжину і послідовність, які також є придатними для детектування такого трансгена. Довжина амплікону може варіюватися в межах від загальної довжини пар праймерів плюс одна пара нуклеотидних основ і/або загальної довжини пар праймерів плюс приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, З6, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 216, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 912, 60 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332,
333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412,
А13, А14, 415, 416, 417, А18, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, АЗ0, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, А72, 473, 474, А75, А76, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар нуклеотидних основ (- будь-які з перерахованих вище приростів). Альтернативно, пара праймерів може походити від фланкуючої послідовності, розташованої на обох сторонах вбудованої ДНК, внаслідок чого може продукуватися амплікон, який включає повнорозмірну нуклеотидну послідовність вставки. Один з членів пари праймерів, що походить від геномної послідовності рослини, може знаходитися на певній відстані від вбудованої послідовності ДНК.
Така відстань може включати інтервал від однієї пари нуклеотидних основ і приблизно до двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. У використовуване тут поняття "амплікон", зокрема, не входять димери праймерів, які можуть утворюватися в реакції термоампліфікації ДНК.
Ампліфікація нуклеїнової кислоти може бути здійснена будь-яким з різних методів ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомих фахівцям, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Фахівцям відомі різні методи ампліфікації, і ці методи описані, іпіег аа, в патенті США Мо 4683195 і в патенті США Мо 4683202. Методи ПЛР-ампліфікації були розроблені для ампліфікації геномної ДНК довжиною до 22 т.п. о. Ці методи, а також інші методи ампліфікації
ДНК, відомі фахівцям, можуть бути застосовані для практичного здійснення даного винаходу.
Послідовність гетерологічної трансгенної ДНК-вставки або фланкуюча геномна послідовність трансформанта сої, що розглядається, можуть бути підтверджені (і скоректовані, якщо це необхідно) шляхом ампліфікації таких послідовностей, що походять від вказаного трансформанта, з використанням праймерів, що походять від описаних тут послідовностей, з подальшим проведенням стандартного секвенування ПЛР-амплікону або клонованої ДНК.
Амплікон, одержаний такими методами, може бути детектований різними способами.
Зо Найбільш добре відомими методами детектування ДНК-ампліконів є електрофорез в агарозному гелі і забарвлення етидійбромідом. Іншим таким методом є генетичний елементний аналіз, де сконструйований ДНК-олігонуклеотид перекривається з суміжною фланкуючою послідовністю геномної ДНК і з вбудованою послідовністю ДНК. Цей олігонуклеотид іммобілізують на ямках мікротитраційного ямкового планшета. Після ПЛР області, що представляє інтерес (що проводиться з використанням одного праймера у вбудованій послідовності і одного опраймера в суміжній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий ПЛР-продукт може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і може служити як матриця для проведення реакції подовження на одну основу з використанням
ДНК-полімераз і мічених даМмТР, специфічних до передбачуваної наступної основи. Аналіз зв'язаного продукту може бути здійснений шляхом кількісної оцінки флуоресцентного сигналу.
Флуоресцентний сигнал вказує на присутність вставки/фланкуючої послідовності, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу.
Іншим методом є метод піросеквенування, описаний У/іпде (Іппом. Рпапгта. Тесп. 00:18-24, 2000). У цьому методі, сконструйований олігонуклеотид перекривається з суміжною геномною
ДНК ії з послідовністю стику ДНК-вставки. Олігонуклеотид піддають гібридизації з одноланцюжковим ПЛР-продуктом області, що представляє інтерес (що проводиться з використанням одного праймера у вбудованій послідовності і одного праймера у фланкуючій геномній послідовності), і інкубують в присутності ДНК-полімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'-фосфосульфату і люциферину. Потім окремо додають ОМТР, і таке додавання приводить до продукування детектованого світлового сигналу. Світловий сигнал вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ.
Іншим методом, який може бути застосований для детектування амплікону згідно з варіантом здійснення винаходу, є поляризація флуоресценції. У цьому методі конструюють олігонуклеотид, який перекривається з геномною фланкуючою послідовністю і з послідовністю стику ДНК-вставки. Олігонуклеотид піддають гібридизації з одноланцюжковим ПЛР-продуктом області, що представляє інтерес (що проводиться з використанням одного праймера у вбудованій ДНК і одного праймера у фланкуючій геномній послідовності ДНК), і інкубують в присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно міченого ЧаМТР. Подовження на одну основу бо приводить до включення 4ЗаМмТР. Таке включення флуоресцентно міченого ДДМТР може бути визначене по зміні поляризації на флуориметрі. Зміна поляризації вказує на присутність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації, гіоридизації і подовження на одну основу.
ТАОМАМФ (РЕ Арріїєй Віозузіет5, Еовзіег Спу, Саїйї) являє собою метод детектування присутності ДНК і кількісної оцінки послідовності ДНК. Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, який перекривається з геномною фланкуючою послідовністю і з послідовністю стику ДНК-вставки. Зонд ЕКЕТ і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій послідовності ДНК і один у фланкуючій геномній послідовності) піддають реакції циклізації в присутності термостабільної полімерази і ЯМТР. У процесі специфічної ампліфікації, ДНК- полімераза Тад гідролізується по механізму "корекції", внаслідок чого, з гасильної молекули на зонді ЕКЕТ вивільняється флуоресцентна молекула. Флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності/трансгенної послідовності-вставки, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації і гібридизації.
Для детектування полінуклеотидної послідовності можуть бути застосовані описані методи "молекулярних маяків" (Веасоп5). Коротко, був сконструйований олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ, який перекривається з фланкуючою геномною послідовністю і з послідовністю стику ДНК- вставки. Унікальність структури зонда ЕКЕТ полягає в тому, що цей зонд має вторинну структуру, що підтримує флуоресцентну і гасильну молекули в безпосередній близькості одна від одної. Зонд ЕРЕТ і ПЛР-праймери (один праймер у вбудованій послідовності ДНК їі один у фланкуючій геномній послідовності) піддають реакції циклізації в присутності термостабільної полімерази і аМТР. Після успішної ПЛР-ампліфікації, гібридизація зонда ЕКЕТ з послідовністю- мішенню приводить до видалення вторинної структури зонда і до просторового розділення флуоресцентної і гасильної молекул. У результаті виникає флуоресцентний сигнал.
Флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої геномної послідовності/трансгенної послідовності-вставки, що свідчить про успішне здійснення ампліфікації і гібридизації.
Беручи до уваги той факт, що певна локалізація в геномі сої є особливо придатною для інсерції, можна сказати, що варіанти здійснення винаходу також включають насіння сої і/або рослину сої, що містять щонайменше одну несоєву ррАВУ582.816.15.1-вставку-трансформант, що знаходиться, в основному, поблизу від цього положення геному. Одним з варіантів є заміна
Зо одного з описаних тут трансформантів сої рОАВУ582.816.15.1 на іншу вставку. Взагалі кажучи, в конкретних варіантах здійснення винаходу, може бути, наприклад, здійснена направлена гомологічна рекомбінація. Технологія такого типу розглядається, наприклад, в УЛО 03/080809 А2 і у відповідній опублікованій заявці на патент США (05 20030232410). Таким чином, варіанти здійснення винаходу включають рослини і клітини рослин, що містять гетерологічну вставку (введену замість множини копій генів сгту!Е, сту!Ас або раї або разом з множиною копій цих генів), фланковану повнорозмірними ідентифікованими тут фланкуючими послідовностями (п.о. в положеннях 1-1273 5ЕО ІО МО:1 і п.о. в положеннях 1766-1687 ЗЕО ІЮ МО:2) або розпізнаваною частиною цих послідовностей. З застосуванням такого(их) способу(ів) може (можуть) бути також вбудованаїйї) додаткова копія (або додаткові копії) сгу!Е, сгу1тАс або раї.
Всі цитовані тут патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання в тій області, яка конкретно відповідає опису даного винаходу. Нижченаведені приклади наводяться для ілюстрації методів практичного здійснення варіантів винаходу і опису деяких переважних варіантів винаходу. Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження даного винаходу. При цьому, для фахівця в даній галузі очевидно, що методи, описані в нижченаведених прикладах, являють собою конкретно застосовувані підходи, представлені для ілюстрації переважних варіантів практичного здійснення винаходу. Однак, фахівцю в даній галузі, виходячи з опису винаходу, буде очевидно, що в ці конкретні варіанти здійснення винаходу може бути внесена множина змін, які дозволяють одержати такий же або аналогічний результат і не виходять за рамки суті і обсягу винаходу. Якщо це не обумовлено особливо, то всі проценти дані по масі, а всі співвідношення розчинників в суміші дані по об'єму, якщо це не вказано конкретно.
Якщо це не обумовлено особливо, то нижченаведені скорочення означають: п.о. - пара основ, "С - градуси Цельсія,
ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота,
ЕОТА - етилендіамінтетраоцтова кислота, т.п.0о. - тисяча пар основ, мкг - мікрограми, мкл - мікролітри, 60 мл - мілілітри,
М - молярна маса,
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція,
РТИШ - рослинна транскрипційна одиниця або експресійний кластер,
ДСН - додецилсульфат натрію,
ЗОЗ - буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0,
ТВЕ - буферний розчин, що містить суміш основи Тріс, борної кислоти і ЕОТА, рн 8,3.
Приклади
Приклад 1. Трансформація і відбір рослин-трансформантів сої ррАВе582.816.15.1, що містять гени СтуїЕ, Сту1Ас і РАТ
Трансгенну сою (Сіусіпе тах), що містить генну модифікацію рорАВвВе582.816.15.1, одержували за допомогою Адгобрасіегійт-опосередковуваної трансформації експлантатів в потовщеннях в сім'ядолі сої. Для ініціації трансформації використовували інактивований штам
ЕНАТОЇ1 Адгорасієгіит (Нооа еї аї., 1993), який несе бінарний вектор ррАВеО582 (фігура 1), що містить селективний маркер, раї мб і гени сгутЕ м3 ї сгутАс зупрго, що представляють інтерес, в області Т-ланцюга ДНК. Послідовність Т-ланцюга ДНК для ррАВеО582 представлена в 5ЕО ІЮ
МО:3З і описана нижче в таблиці 1.
Таблиця 1
Генні елементи, локалізовані на рОАВО582 конструкції
Адгорасіегійт-опосередковувану трансформацію здійснювали модифікованим методом, описаним 7епо еї аї. (2004). Коротко, насіння сої (сорти Мамегіск) пророщували на базальному середовищі, а потім виділяли потовщення сім'ядолі, і ці потовщення інфікували агробактерією.
У середовища для стимуляції утворення, подовження і укорінення паростків додавали цефотаксим, тиментин і ванкоміцин з метою видалення агробактерій. Для інгібування росту нетрансформованих паростків проводили відбір з використанням глюфозинату. Відібрані паростки переносили в середовище для укорінення з метою ініціації утворення коріння, а потім переносили в грунтову суміш для акліматизації паростків.
Верхівкові листя відібраних паростків забарвлювали глюфозинатом для скринінгу на передбачувані трансформанти. Скриновані паростки переносили в теплицю, залишали для акліматизації а потім листя забарвлювали глюфозинатом для повторного підтвердження
Зо стійкості до гербіцидів і детектування присутності передбачуваних трансформантів. Після цього брали зразки скринованих рослин і проводили їх молекулярний аналіз для підтвердження присутності селективного маркерного гена і/або гена, що представляє інтерес. Рослини То залишали в теплиці для самозапилення і одержували насіння ТТ.
Цей трансформант, тобто трансформант сої рОАВО582.816.15.1, одержували з незалежно трансформованого ізоляту. Рослини Ті піддавали поворотному схрещуванню і інтрогресії даного трансформанта в елітні сорти подальших поколінь. Даний трансформант відбирали, виходячи з його унікальних властивостей, таких як єдиний інсерційний сайт, нормальна менделевська сегрегація, стабільна експресія і чудова комбінація властивостей, включаючи резистентність до комах, стійкість до гербіцидів і агрономічні показники. У нижченаведених прикладах представлені дані, які були використані для характеризації трансформанта сої ррАВО582.816.15.1.
Приклад 2. Характеризація експресії білка в трансформанті сої рРОАВО582.816.15.1
Були охарактеризовані біохімічні властивості рекомбінантних білків Сту!Р, Стуї1Ас і РАТ в трансформанті сої ррАВе582.816.15.1. Кількісний твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) являє собою відомий біохімічний аналіз, який може бути здійснений з метою характеризації біохімічних властивостей білків і підтвердження експресії цих білків в трансформанті сої рРОАВО582.816.15.1.
Приклад 2.1. Експресія білка РАТ, СтгуїЕ і СтуТАс в тканинах рослини
Зразки тканини сої виділяли з тестованих рослин і готували для аналізу на експресію. Білок
РАТ екстрагували з тканин рослин сої з використанням забуференого фосфатом фізіологічного розчину, який містить детергент твін-2го (РВОТ), що включає 0,595 альбумін бичачої сироватки (В5А). Тканину рослини центрифугували, потім водний супернатант збирали, розводили відповідним буфером, якщо це необхідно, і аналізували з використанням набору для "сендвіч"-
ЕГІЗА РАТ. Цей набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками (Епмігоіодіх, Рошапа, МЕ). За допомогою цього аналізу вимірювали концентрації експресованого білка РАТ.
Білок Стгу1їР екстрагували з тканин рослин сої з використанням забуференого фосфатом фізіологічного розчину, що містить детергент твін-20 (РВ5Т). Тканину рослини центрифугували, потім водний супернатант збирали, розводили відповідним буфером, якщо це необхідно, і аналізували з використанням набору для "сендвіч"-Е ІЗА Сту1!Е. Цей набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками (5ігагедіс Оіадповіїсв5 Іпс., Межагк, ОЕ).
За допомогою цього аналізу вимірювали концентрації експресованого білка СтуїР.
Білок СгуТАс екстрагували з тканин рослин сої з використанням забуференого фосфатом фізіологічного розчину, який містить детергент твін-20 (РВ5ЗТ), що включає 0,595 альбумін бичачої сироватки (В5А). Тканину рослини центрифугували, потім водний супернатант збирали, розводили відповідним буфером, якщо це необхідно, і аналізували з використанням набору для "сендвіч"-ЕГІ5А Стгу1тАс. Цей набір використовували відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками (5ігаїгедіс Оіадповіїс5 Іпс., Мемжагк, ОЕ). За допомогою цього аналізу вимірювали концентрації експресованого білка Сту1Ас.
Аналіз по детектуванню здійснювали для оцінки стабільності експресії а також вертикального успадкування (між поколіннями) і горизонтального успадкування (між лініями всередині покоління) трансформанта ррадвВе582.816.15.1 в рослинах сої.
Приклад 2.2. Експресія білків СтуїР, Сту1ТАс і РАТ в тканинах рослини
Рівні білків Стуїб, СтутАс і РАТ визначали в трансформанті сої ррАВе582.816.15.1 відповідно до протоколів, описаних вище. Розчинні білки, екстраговані з тканини листя сої, аналізували за допомогою кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІБА).
Покоління трансформантів сої з генною модифікацією рравВе582.816.15.1 від Т» до Тє мали стабільну експресію (не сегрегувалися), і така експресія спостерігалася у всіх лініях. У таблиці 2 представлений середній рівень експресії трансгенних білків в трансформанті сої ррАВО582.816.15.1.
Таблиця 2
Середній рівень експресії різних трансгенних білків в трансформанті сої ррАВО582.816.15.1 (ТрансформантсоїррАВУ5В2.816.15.1.юЮ/..:.і.:.: | 89 | 186 | 99
Приклад 3. Клонування і характеризація послідовності ДНК у вставці і у фланкуючих граничних областях трансформанта сої ррАВе582.816.15.1
Для характеризації і опису геномного інсерційного сайта визначали послідовність граничних областей фланкуючої геномної Т-ДНК трансформанта сої рравВе582.816.15.1. Була підтверджена геномна послідовність трансформанта сої рОАВео582.816.15.1, що включає 1273 п.о. 5'-фланкуючої граничної послідовності (ЗЕС ІЮО МО:1) ії 1371 п.о. 3'-"фланкуючої граничної послідовності (ЗЕО ІЮ МО:2). ПЛР-ампліфікація граничних послідовностей трансформанта сої рорАВО582.816.15.1 підтвердила, що граничні області походять від вихідної рослини сої, а області стику являють собою унікальні послідовності трансформанта сої ррдАв9582.816.15.1.
Області стику можуть бути використані для трансген-специфічної ідентифікації трансформанта сої РОАВО582.816.15.1. Крім того, інсерційний сайт Т-ланцюга був охарактеризований шляхом ампліфікації геномного фрагмента, відповідного області ідентифікованих фланкуючих граничних послідовностей, що походять від геному нетрансформованої сої. Порівняння трансформанта сої РОАВО582.816.15.1 з рослиною, що має нетрансформовану геномну послідовність, виявило делецію оригінального локусу приблизно в 21 п.о., утворену в процесі інтеграції Т-ланцюга.
Загалом, характеризація вставки і граничної послідовності трансформанта сої ррАВУО582.816.15.1 показала, що в геномі сої присутня інтактна копія Т-ланцюга ррАвВУ9582.
Таблиця З
Список праймерів і їх послідовностей, використовуваних для підтвердження геномної ДНК трансформанта сої ррАвВ9582.816.15.1
ЗЕ Назва (|Розмір . . бо .
Підтвердження 5'-
ФЕО граничної геномної ДНК, 1 81615 ЕМ? 50 використовуваної разом
МО А - ТТАСАСССТТАССАТСОСАСАСАСТТАсАасіз АШБІТОКМІ або КМ2, і
І разом з 5ІКЕпа-01 або
БІАЕпа-б02
Підтвердження 3'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
ІЮ |81516 ВМ1| 27 |ІСАТТСАТаТОСТТСсСТААТасСсасААТТОа використовуваної разом
МО:5 з З'РАТЕпа05 або
З'РАТЕпаоб
Підтвердження 3'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
ІЮ |81516 ВМ2| 25 |ААТТТСАСАТТТАССССАСТТаСсА використовуваної разом
МО:б з З'РАТЕпа05 або
З'РАТЕпаоб
Підтвердження 3'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
ІЮ |81516 ВУЗІ 28 (дсАдсатТасСсАаТтаАсапААсатААТААтТаА |використовуваної разом
МО:7 з З'РАТЕпа05 або
З'РАТЕПаОбОМА 5ЕО Підтвердження 5'-
І | БІАєпа-01| 29 СОАОСТТТСТААТТТСАААСТАТТСоСОС | раничної геномної ДНК,
МОВ використовуваної разом
І з 81615 ЕМУ2 5ЕО Підтвердження 5'-
І |БІВЕпа-02| 30 |ТССТАСАТСАТСАСТТСАТАСАААССТОСА | РанИчНОЇ геномної ДНК,
МО 9 використовуваної разом
І з 81615 ЕМУ2 5ЕО Підтвердження 5'-
І АШЬЙОВМІ| 29 |СОСТССТАСАТСАТСАСТТСАТАСАдАСС /Раничної геномної ДНК,
МО-10 використовуваної разом
І з 81615 ЕМУ2
Підтвердження 5'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
І |АШБіТОвАМ2| 28 ІСАСТСатТатТСАаТоСААТаАССААТАА використовуваної разом
МО 11 з 81615 ЕМ/1, ЕМУ2 або
РМЗ
Підтвердження 3'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
ІЮ |З'РАТЕпаоб5І 20 (аСТоСТоСААдсСассСАаттТАс використовуваної разом
МО: 12 з 81615 ЕМ, ЕУ2 або
КК)
Підтвердження 3'-
ЗЕО граничної геномної ДНК,
ІЮ |З'РАТЕпаобвІ 20 ІССАаТТАайаССАсСТТАСССА використовуваної разом
МОЗ з 81615 ЕМ, ЕУ2 або
КК)
Таблиця 4
Умови проведення стандартної ПЛР-ампліфікації граничних областей і трансген-специфічних послідовностей в трансформанті сої рОАВУ9582.816.15.1 . то |Попередня : Кінцеве
Послідовність Набір праймерів ПЛР денатурація Денатурація Подовження подовження мішень суміш! 5 ("С/сек.) |("С/хв.:сек.) о
С/хв.) С/хв.)
Б-гранична 81615. ЕМ/2/АШЬІТОВМ 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область
Б-гранична 81615. ЕМ/2/Б'ВЕпі-01 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область
Б-гранична 81615. М/З/Б'ВЕпі-01 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область 3-гранична З'РАТЕпаОБ/81615. ВМ 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область 3-гранична З'РАТЕпаОБ/81615. ВМ? 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область 3-гранична З'РАТЕпа0в/81615. ВМ 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область 3-гранична З'РАТЕпаОв/81615 ВМ? 9Б/З 98/10 68/4:00 72/10 область
По всьому 98/10 68/4:00 т2гло локусу 81615 ЕМ/2/81615 ВУЗ 95/3 32 цикли вставки
Таблиця 5
ПЛР-суміш для стандартної ПЛР-ампліфікації граничних областей і трансген-специфічних послідовностей в трансформанті сої рОАВУ582.816.15.1
ПЛР-суміш А ПЛР-суміш В
Іхреакційна ще .
ГаРто КОН Ж: ЗД Г Ро ПОН КОН ЕК ОО
АссРіїте ріх бирегМіх 20. МНохбуфер А Тад 11111111 - 1111 МоСіг (25 мм) 777.7иИБ57З06 щЩщ 8-11 - 111 дамтрР (25 мкм)
Праймер, 10 мкм 02 |Праймер, 10 мкМ
Гідроліз ГДНК Гідроліз ГДНК 11111111 - 11171 ПА тТаа(бодумкл) ; Об'єм дози, що
ПЛР-суміш С ПЛР-суміш ЮО
Іхреакційна ще .
Мас» (25 мМ)| 15 |МоСі» (25 мм) 77717иИБ5КБ706 ДГ амтР (25 мМ) 8 амте 5 мм)
ПЛР-праймерадаптора(10мкм)| 1 |Праймер 1 (10 мкм)
Гніздовий праймер СОЇ - по мкм) 700 Дровймеросомм
Сфери, зв'язані з ДНК 11175 |ДНК-матриця
ГА Тад (5 од./мкл) ГА Тад (5 од./мкл) ; Об'єм дози, що
Приклад 3.1. Підтвердження геномних послідовностей сої
Вирівнювання 5'- і 3-фланкуючих граничних областей з повнорозмірною геномною "шотган"- послідовністю хромосоми 03 (ЗІусіпе тах показало, що трансген трансформанта сої ррАВО582.816.15.1 був вбудований в хромосому 03 геному сої. Для підтвердження інсерційного сайта в геномі трансформанта сої ррАВе582.816.15.1 здійснювали ПЛР з використанням різних пар праймерів (фігура 2, таблиця 3, таблиця 4 і таблиця 5). Геномну ДНК трансформанта сої рорАВО582.816.15.1 і інші трансгенні або нетрансгенні лінії сої використовували як матрицю. Для підтвердження того, що 5-граничні послідовності є скоректованими, був вибраний праймер, сконструйований так, щоб він зв'язувався з елементом промотору гена АШБІі10, наприклад
АШБІіТОВМІ1, і праймер, сконструйований так, щоб він зв'язувався з клонованою 5'-кінневою граничною послідовністю на хромосомі 03 геному сої, де вказаний праймер був позначений 81615 РМУ2, і ці праймери були використані в цілях ампліфікації ДНК-сегмента, який охоплює елемент промотору гена АШБІ10 до 5'-кінцевої граничної послідовності. Аналогічним чином, для підтвердження клонованої 3'-кінцевої граничної послідовності, раї-специфічний праймер, наприклад З'РАТЕпа05, і праймери, сконструйовані для клонованої 3'-кінцевої граничної послідовності і позначені 81615 МІ і 81615 ЕМ2, були використані з метою ампліфікації ДНК- сегментів, які охоплюють ген раї до 3'-кінцевої граничної послідовності. ДНК-фрагменти передбаченого розміру були ампліфіковані тільки з геномної ДНК трансформанта сої рорАВУО582.816.15.1. з використанням кожної пари праймерів, але не із зразків ДНК, що походять від інших трансгенних ліній сої або нетрансгенного контролю. Одержані результати показали, що клоновані 5'- і 3'і-граничні послідовності являють собою фланкуючі граничні послідовності вставки Т-ланцюга для трансформанта сої рОАВеУ582.816.15.1..
Для додаткового підтвердження присутності в геномі сої ДНК-вставки, геномну ДНК, що не містить вставки Т-ланцюга в трансформанті сої рОАВУо582.816.15.1, піддавали ПЛР-ампліфікації по всіх граничних послідовностях рослини сої. Праймер 81615 ЕМУ2, сконструйований для 5'- кінцевої граничної послідовності, і один праймер 81615 КУЗ, сконструйований для 3'-кінцевої граничної послідовності, використовували з метою ампліфікації ДНК-сегментів, що містять локус, в який був інтегрований Т-ланцюг рОрАВУО582. Як і очікувалося, ПЛР-реакції, що
Зо проводяться з використанням пари праймерів 81615 ЕМУ2 і 81615 КМЗ, дозволяли одержати приблизно 1,8 т.п.о. ДНК-фрагмента, що походить від всіх контрольних ліній сої, але не з ррАВО582.816.15.1. Вирівнювання ідентифікованих 5- і З-граничних послідовностей трансформанта сої ррдвВе582.816.15.1 з повнорозмірною геномною "шотган"-послідовністю хромосоми 03 СіІусіпе тах показало, що в локусі вихідного геному була присутня делеція приблизно в 21 п.о. (фігура 3). Одержані результати показали, що трансген трансформанта сої рорАВО582.816.15.1 був вбудований в сайт хромосоми 03 геному сої.
Приклад 4. Характеризація трансформанта сої ррдв9582.816.15.1 за допомогою саузерн- блот-аналізу
Саузерн-блот-аналіз проводили з метою визначення профілю інтеграції в трансформанті сої ррАВО582.816.15.1. В результаті цих експериментів були одержані дані, які продемонстрували інтеграцію і цілісність трансгенів сгутАс і сгуїб в геномі сої. Трансформант сої ррАВО582.816.15.1 був охарактеризований як повнорозмірний трансформант, який утворений за допомогою простої інтеграції і містить одну копію РТО сгуТтАс ї сгу1їб, що походить від плазміди ррАВО582.
Дані саузерн-блот-аналізу дозволяють передбачити, що фрагмент Т-ланцюга був вбудований в геном трансформанта сої ррдавВе582.816.15.1. Більш ретельний саузерн-блот- аналіз був проведений з використанням зондів, специфічних до генів сгутАс і сгуїР, що містяться в області інтеграції Т-ланцюга ррАВе582.816.15.1, ії з використанням описаних тут рестриктуючих ферментів, які мають сайти розщеплення, локалізовані в плазміді, і продукують фрагменти, що гібридизуються, які знаходяться всередині плазміди, або фрагменти, які охоплюють область стику плазміди і геномної ДНК сої (граничні фрагменти). Молекулярна маса, одержана виходячи з саузерн-гібридизації для комбінації рестриктуючого ферменту і зонда, була унікальною для даного трансформанта, що забезпечувало його точну ідентифікацію. Ці аналізи також показали, що даний плазмідний фрагмент був вбудований в геномну ДНК сої без реаранжування РТИ сгутАс і сгуїЕ.
Приклад 4.1. Збирання зразків листя сої і виділення геномної ДНК (ГДНК)
Геномну ДНК екстрагували з тканини листя, зібраного від окремих рослин сої, що містять трансформант сої рОАВе582.816.15.1. Крім того, ГДНК виділяли із звичайних рослин сої сорту
Мамегіск, що мають генетичний фон, який є репрезентативним для лінії даної рослини, де бо відсутні гени сгуТАс і сгут1г. Окрему геномну ДНК екстрагували з ліофілізованої тканини листя згідно зі стандартним методом СТАВ. Після екстракції, ДНК кількісно оцінювали на спектрофлуориметрі з використанням реагенту РІСО СКЕЕМ (Іпмігодеп, Сагізрайд, СА).
Приклад 4.2. Гідроліз і розділення ДНК
Для молекулярної характеризації трансформанта сої ррдАвВ9582.816.15.1 за допомогою саузерн-блот-аналізу, десять мікрограмів (10 мкг) геномної ДНК піддавали гідролізу. Геномну
ДНК, що походить від трансформанта сої ррАВУ582.816.15.1 і від нетрансгенної лінії сої сорту
Маметіск, гідролізували шляхом додавання приблизно п'яти одиниць вибраного рестриктуючого ферменту на мкг ДНК і відповідного реакційного буфера до кожного зразка ДНК. Кожний зразок інкубували приблизно при 37"С протягом ночі. Рестриктуючі ферменти Авзеї, Ніпапі, М5іїЇ і Маеє використовували окремо для кожного гідролізату (Мем/ Еподіапа Віоїар5, Ірвм/сп, МА).
Рестриктуючі ферменти Мої! ії Ара!! використовували разом для подвійного гідролізу (Мем/
Епоіапа Віоїабе5, Ірзм/сй, МА). Крім того, позитивний по гібридизації контрольний зразок одержували шляхом об'єднання плазмідної ДНК, ррАВеО582, з геномною ДНК нетрансгенної сої сорту Мамегіск. "Коктейль" з плазмідної ДНК/геномної ДНК гідролізували із застосуванням тих же самих методів і з використанням того ж самого рестриктуючого ферменту, які були вибрані для тест-зразків.
Після інкубування гідролізатів протягом ночі додавали 25 мкл розчину Оціск-Ргесір. Рійб (ЕддеВіозубієт»5, Ссайпегериго, МО), і гідролізовані зразки ДНК осаджували ізопропанолом.
Осаджену ДНК ресуспендували в 15 мкл 1х буфера для завантаження (0,0195 бромфенолового синього, 10,0 мМ ЕОТА, 10,095 гліцерину, 1,0 мМ Тріс, рН 7,5). Зразки ДНК ї маркери молекулярної маси піддавали електрофорезу в 0,8595 агарозних гелях з 0,4х буфера ТАЕ (Ріхпег Зсіепійіс, РІН5ригой, РА) при 35 вольтах приблизно протягом 18-22 годин для розділення фрагментів. Гелі забарвлювали етидійбромідом (Іпмігодеп, Сагіб5райд, СА), ії ДНК візуалізували шляхом опромінення ультрафіолетом (УФ).
Приклад 4.3. Перенесення за допомогою саузерн-блот-аналізу і обробка мембрани
Саузерн-блот-аналіз проводили, в основному, як описано в публікації МетеїїпкК, еї аї. (1994).
Коротко, після електрофоретичного розділення і візуалізації ДНК-фрагментів, гелі піддавали депуринізації шляхом додавання 0,25М НСІ приблизно протягом 20 хвилин, а потім обробляли денатуруючим розчином (0,М Маон, 1,5М Масі) приблизно протягом 30 хвилин і
Зо нейтралізуючим розчином (1,5М Масі, 0,5М Тріс, рН 7,5) протягом щонайменше 30 хвилин.
Перенесення за допомогою саузерн-блот-аналізу проводили протягом ночі на найлонових мембранах з використанням капілярної системи, що містить 10х5552. Після перенесення, ДНК зв'язували з мембраною з використанням реагентів для перехресного зшивання при УФф- випромінюванні, а потім мембрану швидко промивали 2х55С-розчином. З застосуванням такого способу одержували саузерн-блот-мембрани, готові для гібридизації.
Приклад 4.4. Мічення ДНК-зонда і гібридизації
ДНК-фрагменти, зв'язані з найлоновою мембраною, детектували з використанням міченого зонда (таблиця 6). Зонди одержували шляхом ПЛР-включення нуклеотиду, міченого дигоксигеніном (01), (0ІО-11|-аОТР, в ДНК-фрагмент, ампліфікований з плазміди ррАВеО582 з використанням праймерів, специфічних до генних елементів. Генерування ДНК-зондів шляхом
ПЛР-синтезу здійснювали з використанням набору для синтезу ПЛР-зонда, міченого БІС (Коспе
Ріадповійсв, Іпаіапароїї5, ІМ), відповідно до процедур, рекомендованих виробниками.
Мічені зонди аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі для визначення їх якості і кількості. Потім потрібну кількість міченого зонда використовували для гібридизації з
ДНК-мішенню на найлонових мембранах з метою детектування специфічних фрагментів методами, в основному, описаними для одержання розчину СІ ЕАБУ НУВ (Коспе Оіадповіїйсв,
Іпаіапароїїв, ІМ). Коротко, блоти на найлоновій мембрані, що містять іммобілізовану ДНК, швидко промивали 2х556С і попередньо гібридизували з 20-25 мл попередньо нагрітого розчину ріс ЕАБУ НУВ в посудинах для гібридизації приблизно при 45-557С протягом приблизно 2 годин в печі для гібридизації. Потім розчин для попередньої гібридизації декантували і замінювали на х15 мл попередньо нагрітого розчину БІС ЕАБУ НУВ, що містить потрібну кількість специфічних зондів, денатурованих шляхом нагрівання в термокомірці протягом приблизно п'яти хвилин. Потім проводили стадію гібридизації приблизно при 45-557С протягом ночі в печі для гібридизації.
Після закінчення гібридизації зонда розчини БІС ЕАБУ НУВ, що містять зонди, декантували в очищені пробірки і зберігали приблизно при -207С. Ці зонди можуть бути повторно використані два рази у відповідній процедурі, рекомендованій виробниками. Блоти на мембранах швидко обполіскували і два рази промивали в очищених пластикових контейнерах промивальним буфером в умовах низької жорсткості (2х55С, 0,195 ДСН) приблизно протягом п'яти хвилин при бо кімнатній температурі, а потім два рази промивали промивальним буфером в умовах високої жорсткості (0,1х55С, 0,195 ДСН), кожного разу протягом 15 хвилин приблизно при 65"7С. Блоти на мембранах швидко промивали іх малеїновокислотним буфером, взятим з набору промивальних і блокувальних буферів БІС (Коспе Оіадпобвіїс5, Іпаіапароїї5, ІМ), приблизно протягом 5 хвилин. Потім проводили блокування в 1х блокувальному буфері протягом 2 годин і інкубування з антитілом проти ОІС-АР (лужної фосфатази) (Косне Оіадпозвіїсв, Іпаіапароїїв, ІМ) в їх блокувальному буфері протягом мінімум 30 хвилин. Після 2-3 промивань їх промивальним буфером, специфічні ДНК-зонди залишалися зв'язаними з блотами на мембрані, і БІс-мічені
ДНК-стандарти візуалізували з використанням хемілюмінесцентної системи детектування нуклеїнових кислот (СОР-5ТАК) (Коспе Оіадпозвіїйсв, Іпаіапароїї5, ІМ) відповідно до рекомендацій виробників. Блоти експонували з хемілюмінесцентною плівкою один або декілька разів для детектування фрагментів, що гібридизуються, і для візуалізації стандартів молекулярної маси.
Плівки проявляли в проявнику плівок АГ/-РКО 100 РІО (Копіса Міпона, ОзакКа, Чарап), і зображення сканували. Число і розмір детектованих смуг були задокументовані для кожного зонда. ОІС-мічений маркер молекулярної маси ДНК Ії (Біб МУУМ ІІ) ї СІС-мічений маркер молекулярної маси ДНК МІ! (БІС МУУМ МІЇ) візуально спостерігалися після детектування ІС, як описано в даній заявці, а тому вони були використані для визначення розміру фрагмента, що гібридизується, на саузерн-блотах.
Таблиця 6
Локалізація і довжина зондів, використовуваних в саузерн-блот-аналівзі
Приклад 4.5. Результати саузерн-блот-аналізу
Розміри передбачуваних і спостережуваних фрагментів, а також конкретні гідролізати і зонд, де вказані гідролізати і зонд були одержані на основі відомих рестрикційних сайтів ферментів для РТИШ сгуїТАс і сгу!Е, представлені в таблиці 7. Виходячи з цих гідролізатів і гібридизації були ідентифіковані два типи фрагментів: внутрішні фрагменти, в яких відомі сайти ферментів фланкують область зонда і повністю входять до складу інсерційної області РТ сгуТАс і сгуїЕ; і граничні фрагменти, в яких один відомий сайт ферменту локалізований на одному кінці області зонда, а інший сайт, як і очікувалося, локалізований в геномі сої. Розміри граничних фрагментів варіюються залежно від типу трансформанта, оскільки, в більшості випадків, сайти інтеграції
ДНК-фрагментів є унікальними для кожного трансформанта. Граничні фрагменти являють
Зо собою засіб для визначення локалізації рестрикційних сайтів ферментів відносно інтегрованої
ДНК і для оцінки числа ДНК-вставок. Саузерн-блот-аналізи, які проводяться на багатьох поколіннях сої, що містять трансформант рраАВвВе582.816.15.1, давали результати, які дозволяють передбачити, що низькокопійні інтактні РТО сгутАс і сгуї!бї, що походять від плазміди РОАВО582, були вбудовані в геном трансформанта сої ррАВе582.816.15.1.
Таблиця 7
Передбачувані і спостережувані фрагменти, що гібридизуються, в саузерн-блот-аналізі
Передоачувані Спостережуваний
ДНК-зонд Рестриктуючі ферменти Зразки р р розмір фрагмента 2 по фрагмента (п.о.) ррАвоб582 13476 »14000
А зе! Трансформант сої оОАВО582.816.15.1| 286 78500 ррАвоб582 15326 215000
Стутас Мві Трансформант сої шк ро оОАВО582.816.15.1| 007 "10000 ррАвоб582 4550 -4500
Моїх Арац
Трансформант сої 4550 -АБОО ррАвВУ582.816.15.1 ррАвоб582 8071 -8000 мое Трансформант сої оОАВО582.816.15.1) 72969 77500 ррАвоб582 11044 11000 су1Е Мі оОАВО582.816.15.1| 007 "10000 ррАвоб582 7732 700
Ніпати Трансформант сої оОАВО582.816.15.1| 172 77700 ррАвоб582 15320 15000 рес мів
Трансформант сої немає немає ррАвВУ582.816.15.1 ррАвоб582 15320 15000
ЛА мів
Трансформант сої немає немає ррАвВУ582.816.15.1 ррАвВО582 5239 -5000 оівЕР мае
Трансформант сої немає немає ррАвВУ582.816.15.1 1. Розміри передбачуваних фрагментів одержані на основі карти плазміди рОАВО582. 2. Розміри спостережуваних фрагментів були обчислені приблизно по даних, одержаних в цих аналізах, і по вказаних розмірах фрагментів маркера ІІ ї маркера МІ! молекулярної маси ріс-міченої ДНК.
Рестриктуючі ферменти Авеї і М5іЇ зв'язуються з унікальними рестрикційними сайтами в плазміді РОАВО582 і розщеплюють їх. Потім, ці ферменти відбирали для характеризації вставки гена сгутАс в трансформанті сої рОАВО582.816.15.1. Було передбачено, що граничні фрагменти розміром »7286 п.о. або »9479 п.о. гібридизуються із зондом після гідролізу ферментами Авзеї і
Мі5іїЇ, відповідно (таблиця 7). Одиночні смуги гібридизації сгутАс розміром приблизно 8500 п.о. і 210000 п.о. спостерігалися у випадку використання ферментів Аве! і М»еїїЇ, відповідно.
Гібридизація зонда зі смугами такого розміру, передбачувано, вказує на присутність одного сайта інсерції гена сгулАс в геномі трансформанта сої ррАвВе9582.816.15.1. Рестриктуючі ферменти Мої! і Араї/! були вибрані для подвійного гідролізу і виділення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю сгуїАс рослини (РТИ; промотор/ген/термінатор) (таблиця 7).
Передбачені 4550 п.о.--фрагменти спостерігалися у випадку використання зонда після подвійного гідролізу ферментами Мої! і АраГ!І. Результати, одержані при ферментативному гідролізі зразків РОАВО582.816.15.1 з подальшою гібридизацією зонда, показали, що інтактна
РТШ сгутАс, що походить від плазміди ррАВеО582, була вбудована в геном трансформанта сої ррАВО582.816.15.1.
Рестриктуючі ферменти Мае! і Мей зв'язуються з рестрикційними сайтами в плазміді рорАВО582 і розщеплюють їх. Потім, ці ферменти відбирали для характеризації вставки гена сгуїб в трансформанті сої ррдв9582.816.15.1. Було передбачено, що граничні фрагменти розміром »5569 п.о. і »9479 п.о. гібридизуються із зондом після гідролізу ферментами Маєеї і
Мі5іїЇ, відповідно (таблиця 7). Одиночні смуги гібридизації сгу!Е розміром «7500 п.о. і »10000 п.о. спостерігалися у випадку використання ферментів Маеї і М5іїЇ, відповідно. Гібридизація зонда зі смугами такого розміру, передбачувано, вказує на присутність одного сайта інсерції гена сгуїЕ в геномі трансформанта сої ррАВе9582.816.15.1. Рестриктуючий фермент Ніпаї! був вибраний для виділення фрагмента, що містить транскрипційну одиницю сгуїб рослини (РТИ; промотор/ген/термінатор) (таблиця 7). Передбачений 7732 п.о.-фрагмент спостерігався у випадку використання зонда після гідролізу ферментом Ніпаї. Результати, одержані при ферментативному гідролізі зразків ррАВеУ582.816.15.1 з подальшою гібридизацією зонда, показали, що інтактна РТИШ сгуї1Р, що походить від плазміди рОАВО582, була вбудована в геном трансформанта сої ррдАвВе9582.816.15.1.
Приклад 4.6. Відсутність послідовностей кістяка
Саузерн-блот-аналіз також проводили з метою підтвердження відсутності гена резистентності до спектиноміцину (5ресК), елемента ОгіКер і білка ініціації реплікації ЧА (елемента ІА) в трансформанті сої рОрАВУ582.816.15.1. Як і очікувалося, в зразках трансформанта сої ррАавВе582.816.15.1, якої-небудь специфічної гібридизації з геном резистентності до спектиноміцину, з елементом ОГгі Кер або з елементом ІА не спостерігалося в тому випадку, якщо в саузерн-блот-аналіз були включені відповідні позитивний контроль (з ррАВУО582, доданою до геномної ДНК МамегіскК) і негативний контроль (геномна ДНК МамегіскК).
Зо Після гідролізу ферментом Мбвії і гібридизації з хгреск-специфічним зондом, в зразку позитивного контролю (з ррАВУО582, доданою до геномної ДНК Мамегіск) спостерігалася одна очікувана смуга розміром 15320 п.о. 5рескК-зонд не гібридизувався із зразками негативного контролю і з трансформантом сої ррАвВе582.816.15.1. Аналогічним чином, в зразку позитивного контролю (з ррАВУО582 плюс Мамегіск) детектувалася одна очікувана смуга розміром 15320 п.о., але ця смуга була відсутня в зразках негативного контролю і в трансформанті сої ррАВеО582.816.15.1 після Мв5іІ-гідролізу і гібридизації з Я А-зондом. Інша очікувана смуга розміром 5329 п.о. детектувалася в зразку позитивного контролю (з ррАВУО582, доданою до геномної ДНК
Мамегіск), але була відсутня в зразках негативного контролю і в трансформанті сої рорАВО582.816.15.1 після Мае!І-гідролізу і гібридизації з Огікер-специфічним зондом. Ці дані вказують на відсутність гена резистентності до спектиноміцину, елемента ОгіКер і білка ініціації реплікації «ТА в трансформанті сої рРОАВУ582.816.15.1.
Приклад 5. Випробування для оцінки агрономічних показників і випробування в польових умовах на врожайність і стійкість до гербіцидів
Було проведено декілька агрономічних випробувань для порівняння агрономічних показників трансформанта сої ррдве9582.816.15.1 і нульової ізолінії - МамегісК. Більшість випробувань в польових умовах проводили в різних географічних регіонах в Сполучених Штатах, де культивували сорт сої, що містить трансген рравВе582.816.15.1. Були проведені додаткові випробування в польових умовах за межами цих регіонів, і відібрані сорти сої, що містять трансформант рравВе582.816.15.1, поміщали в потенційно стресові умови, які спостерігаються при вирощуванні культур в регіонах, менш сприятливих для вирощування сої. Через зміну навколишнього середовища при проведенні невеликого числа випробувань в польових умовах, на деяких ділянках випробування були перервані.
Експеримент проводили по схемі повних рандомізованих блоків з двома повторностями для кожного розташування ділянки. Було використано вісім ділянок, що включають трансформант сої рОАВУО582.816.15.1. Кожна ділянка складалася з двох рядів довжиною 12,5 фута, а усього було засіяно 30 дюймів. Протягом всього сезону, польові ділянки обробляли відповідно до звичайної агрономічної практики і із знищенням бур'янів.
Насіння для випробувань одержували в зимовому розсаднику в Пуерто-Ріко. Насіння трансформанта сої ррдвВе9582.816.15.1 і Мамегіск вирощували в тому ж самому розсаднику і 60 обробляли аналогічним чином для мінімізації якої-небудь відмінності в джерелі походження насіння. Потім насіння повертали в Північну Америку, де його упаковували і розподіляли по різних регіонах для посіву. Протягом всього сезону оцінювали різні агрономічні властивості.
Властивості і стадії росту, якщо для них були одержані дані, вказані в таблиці 8.
Таблиця 8
Список агрономічних показників, визначених у випробуваннях в польових умовах, що проводяться для порівняння трансформантів сої РОАВО582.816.15.1 з рослинами Мамегіск 1. Поява появи сходів: величина густини стояння рослин, ділена на Обчислено, виходячи з число насіння, висадженого на ділянку в один метр, і помножена на| густини стояння рослин на 100 ранній стадії 2. Потужність проростання: потужність проростання становить 0905, якщо на ділянці всі рослини гинули, і 10095, якщо на ділянці всі М1-М3 рослини мали нормальний вигляд на ділянці 4. Величина густини стояння рослин на фазі росту К2: число рослин на репрезентативній 1-метровій ділянці ряду на фазі росту 2 2
Ес: ій ПИ ИН бальною оцінкою 0-10095
Мт іній ПИШИ: ЛИН ураженій комахами 7. Висота рослини: середня висота рослин в сантиметрах на кожну ділянку, виміряна від поверхні грунту до верхівки після обпадання листя 8. Вилягання рослин: процент вилягання на час збирання урожаю, де 095 - без вилягання, а 10095 - всі рослини на ділянці вилягали на землю
Петре Пе іній П.П рослин, у яких стручки були сухими на вигляд 10.Обпадання плодів:процент стручків, обпалихназемлю | г ВВ б |/ о ііі іні іііівііноіісьКй НИНІ: ТИН 1390
Кен інн іосівннйй ПИШИ. ТИН реєстрували їх масу в грамах
Після закінчення вегетаційного періоду, дані, одержані зі всіх ділянок, об'єднували і проводили аналіз по всіх ділянках. Аналіз даних проводили з використанням МР Рго 9.0.3 (ЗА5, Сагу, МС). Для аналізу використовували змішану модель, де елемент (ділянка) розглядався як фіксований ефект, а розташування, тобто розташування блока, і повторність розглядалися як випадкові ефекти. Виходячи з цього аналізу, обчислювали величини для різних показників культур із застосуванням методу найменших квадратів, як показано в таблиці 9. У випадку змінних, для яких вимірювали значущий ефект елемента, здійснювали розділення середніх із застосуванням І-критерію Стьюдента з метою проведення порівняння між рослинами
Мамегіск і трансформантами сої ррдвВе9582.816.15.1. Величина імовірності для визначення значущості складала р-0,05.
Таблиця 9
Величини, визначені із застосуванням методу найменших квадратів за результатами аналізу для всіх ділянок з метою порівняння трансформантів сої рРОАВО582.816.15.1 і рослин Мамегіск.
Для кожної ознаки, величини, за якими не стоїть та ж сама буква, значущо відрізняються по 1- критерію Стьюдента (р-0,05) ррАвВУ582.816.15.1
Величина густини стояння рослин на стадії росту
Всі оцінені ознаки, за винятком таких параметрів, як дні до цвітіння, дозрівання і маса 100 насінин, були однаковими для трансформанта сої ррівВе582.816.15.1 і для рослини сорту
Мамегіск. Трансформант сої ррАВ.816.15.1 зацвітав приблизно на 2 дні пізніше, ніж рослина сорту МамегісК. Така відмінність в 2 дні не є дуже суттєвою для фермерів і не впливає на продуктивність даної культури. Ділянки розглядалися як квітучі, якщо приблизно 5095 рослин на ділянці мало квітки, що розпустилися. Трансформант сої ррАВУ582.816.15.1 також дозрівав на один день пізніше, ніж рослина сорту МамегісК в кінці сезону, але, з агрономічної точки зору, таке уповільнення дозрівання не дає значущого ефекту, який міг би впливати на продуктивність даної культури. Аналогічним чином, маса 100 насінин трансформанта сої ррАвВ9582.816.15.1 статистично відрізнялася від маси 100 насінин рослини сорту МамегісК, але така відмінність не приводила до значного зниження врожайності. Одержані результати показали, що трансформант сої ррАВе9582.816.15.1 може розвиватися не так, як рослина сорту МамегіскК, з точки зору деяких агрономічних показників, однак, такі відмінності є мінімальними і не виходять за межі звичайних показників соєвих культур при їх обробці на стандартних фермах.
Для проведення тесту на стійкість трансформанта сої рОАВеО582.816.15.1 до гербіциду, цей трансформант висівали на дослідні поля штату Санта-Ісабель, Пуерто-Ріко. Рослину сорту
МамегісКк, яка була вперше трансформована для продукування трансформанта сої рорАВУО582.816.15.1, висівали в кожний розсадник і використовували в експериментах як контроль. Насіння для Тз-розсадника одержували після відбору насіння рослини покоління Т2 з однієї клітини, а насіння для Т--розсадника одержували після відбору насіння покоління Тз з однієї клітини. Чотири лінії трансформанта тестували для кожного покоління. Кожну лінію висівали на ділянку шириною в 4 ряди і довжиною 7,5 фута. Відстань між рядами становила 30 дюймів. Рослини на ділянках вирощували при освітленні приблизно протягом 2,5 тижнів для компенсації короткого світлового дня в Пуерто-Ріко. Кожний розсадник обприскували глюфозинатом в нормі 411 г е.к/га. Одну ділянку з контрольними рослинами Мамегіск обприскували глюфозинатом в тій же нормі, а іншу ділянку не обприскували і використовували як контроль для порівняння з трансформантом. Трансформант сої ррАВе582.816.15.1 виявляв
Зо стійкість до гербіциду глюфозинату. На протилежність цьому, жодна з рослин МамегісК не була стійкою до обробки гербіцидами.
Приклад 6. Характеризація інсектицидної активності трансформанта ррдаве582.816.15.1
Випробування в польових умовах і в теплиці проводили для характеризації рівня захисту рослини, що забезпечується білками СтуїАс і СтуїЕ в трансформанті сої рОАВО582.816.15.1, від шкідників сої, включаючи лускокрилих комах (Іерідоріегап), включаючи Апіїсагзіа деттайаїї5 (листовійку квасолі), Рзецдоріивзіа іпсіндеп5 (соєвого п'ядака), Зродоріегаїтидірегаа (капустяну совку) і Неїїоїпі5 мігезсеп5 (тютюнову совку).
Випробування в теплиці проводили приблизно на 4-тижневих рослинах. П'ятнадцять рослин використовували для оцінки трансформантів сої ррдвВе582.816.15.1 і контрольних рослин
Мамегіск. Для випробування на ураження комахами кожного тестованого виду (новонародженими личинками А. детртаїгїаїй5, Р. іпсіцдев5 і 5. їшїидірегда), з кожної рослини вирізали три листових диски, і усього було використано 45 листових дисків на рослину і на вид комахи. Вирізаний перфоратором 1,4-см лист, заражений однією новонародженою личинкою, поміщали на тест-площадка на поверхні 295 водного агару і закривали перфорованою пластиковою кришкою.
Смертність комах і міру пошкодження листя оцінювали після зараження личинками.
Личинки, які не реагували на легкий дотик, вважалися загиблими. Смертність комах, які знаходилися на рослинному матеріалі, що містить трансформант сої рОАВО582.816.15.1, була значно вищою (смертність для Зродоріегаїтидірегда становила 8695, смертність для Апіїсагвіа деттаїарй5 становила 10095 і смертність для Рзецйадоріизіа іпсіцдеп5 становила 10095), ніж смертність комах, присутніх на контрольних рослинах Мамегіск (таблиця 10). Пошкодження листя визначали візуально шляхом оцінки процента поїдання листового диска комахами.
Результати, одержані шляхом проведення експериментів в теплиці, показали, що на трансформанті сої ррАВе9582.816.15.1 спостерігалося значно менше пошкодження листя і значно більша смертність комах, ніж на контрольних рослинах Мамегіск, заражених личинками
Апіїсагвіа деттаїаї5, Рзецдорієивіа іпсіддепвз і 5родорієга Ігидірегаа.
Оцінку ефективності рослин-трансформантів сої рОАВУ582.816.15.1, вирощених в польових умовах, проводили шляхом збирання зразків листя з ділянок розсадника рослин зі зрілим насінням в Санта-Ісабель, Пуерто-Ріко, з подальшим відсиланням цього листя в Індіанаполіс,
ІМ, для біоаналізу. Ділянка розсадника для рослин-трансформантів сої ррдавВе582.816.15.1 покоління Тз була засіяна приблизно 180 рослинами в чотири ряди. Кожний ряд мав довжину 2,3 м, а відстань між рядами становила 76,2 см, причому, в кожному ряду, відстань між окремими рослинами становила 5,1 см. Біоаналізи проводили на одному трійчастому листі, який повністю сформувався, головного стебла, що має приблизно чотири вузли, розташовані нижче меристеми. Тканину трійчастого листа вирізали у 10 окремих рослин сої, що несуть ррАВО582.816.15.1, і у 10 окремих рослин Мамегіск. Потім листя упаковували і віддавали в
Зо лабораторію. У цій лабораторії, з кожного трійчастого листа перфоратором вирізали один або два диски діаметром 3,33 см, і усього було одержано 16 листових дисків. Кожний листовий диск поміщали на тест-площадка на поверхні 295 агару, заражали однією новонародженою личинкою 5. пидірегаа і закривали перфорованою пластиковою кришкою. Листові диски зберігали в камері з регульованими умовами навколишнього середовища протягом 7 днів, а потім оцінювали кількість загиблих комах і міру пошкодження листа. Личинки, які не реагували на легкий дотик, вважалися загиблими. Пошкодження листя визначали візуально шляхом оцінки процента поїдання листового диска комахами.
Смертність комах і міру пошкодження листя оцінювали після зараження личинками.
Личинки, які не реагували на легкий дотик, вважалися загиблими. Смертність комах, які знаходилися на рослинному матеріалі, що містить трансформант сої ррАВе9582.816.15.1, була значно вищою (смертність для Зродоріегаїгидірегаа становила 6895), ніж смертність комах, присутніх на контрольних рослинах Мамегіск (смертність для Зродоріегаїтидірегда становила 095) (таблиця 10). Пошкодження листя визначали візуально шляхом оцінки процента поїдання листового диска комахами. Результати, одержані шляхом проведення біоаналізу листя, показали, що личинки Бродорієга їидірегда, що знаходяться на трансформанті сої рорАВО582.816.15.1, значно меншою мірою пошкоджували листя і мали більш низьку виживаність (що також визначається як більш висока смертність комах), ніж личинки 5родоріега
Ттгидірегаа, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Ефективність трансформантів сої РОАВО582.816.15.1 оцінювали в першому випробуванні в польових умовах (перше випробування в польових умовах описане в таблиці 10). Насіння сої покоління Та, що містить трансформант сої ррАВУ582.816.15.1, і насіння нетрансформованої сої сорту Мамегіск висівали на довільно розташованих ділянках з 2 повторностями. Кожна ділянка- дублікат мала 2 ряди довжиною 2,3 м, а відстань між рядами становила 0,76 м. Було висаджено 40 насінин на ряд з відстанню між рослинами цього ряду 5,7 см. Відповідно до плану випробувань, одну ділянку з двох ділянок-дублікатів обприскували гербіцидом глюфозинатом в нормі 411 г е.к./га, а іншу ділянку з двох дублікатів не обприскували, в результаті чого, тільки необприскані рослини Мамегіск залишалися живими і піддавалися біоаналізу.
Листя для біоаналізу збирали з рослин сої на стадії росту К2. За декілька днів до збирання листя для біоаналізу, з одного нижнього листового вузла (найбільш старого листа) на одних і бо тих же рослинах вирізали перфоратором листові диски, і ці диски аналізували на експресію
Зо білків СтуТАс і СтуїтїЕ ЕГІЗА-методом, аналогічним методу, описаному в прикладі 2 (таблиця 12).
Трійчасті листи, які повністю сформувалися, основного стебла, що не виявляють яких-небудь ознак ураження або знебарвлення і знаходяться в чотирьох вузлах нижче меристеми, відрізали і використовували для біоаналізу. Від кожної з 15 рослин відрізали один трійчастий лист як дублікат. Ці листи зберігали при 15"7С і піддавали біоаналізу. Листочки кожного трійчастого листа відрізали, після чого з центра кожного листочка трансформанта сої ррдаве582.816.15.1 вирізали один диск діаметром 3,33 см, а з кожного листочка рослини Мамегіск вирізали два диски діаметром 3,33 см. Ці листові диски поміщали в окремі марковані ямки 32-ямкових пластикових планшетів для біоаналізу, де кожна ямка містила тонкий шар агару. На кожний листовий диск саджали одну новонароджену личинку Р. іпсіцдеп5, новонароджену личинку А. детітаїайх або новонароджену личинку 5. їпидірегда. Планшети для біоаналізу закривали клейкими пластиковими листами, які були перфоровані для забезпечення вентиляції. Тканини листя трансформанта сої ррАВео582.816.15.1 заражали 30 личинками кожного виду, і такими ж 30 личинками заражали тканини листя рослини МамегісК. Пластикові планшети, що містять заражені листові диски, витримували при 257С і при відносній вологості 4095 (КН). Через 7 днів, личинки були ідентифіковані як загиблі личинки (тобто вони не рухалися при їх стимуляції гострим зондом), як личинки, які не розвивалися (вони мали менший розмір, ніж личинки, присутні на листі рослини МамегісК), або як живі личинки (тобто вони мали нормальний розмір і були чутливі до подразника).
Смертність комах оцінювали після зараження личинками. Смертність комах, які знаходилися на рослинному матеріалі, що містить трансформант сої ррАВе9582.816.15.1, була значно вищою (смертність для Зродоріегаїтидірегда становила 9795, смертність для Апіїсагзіа деттагаїї5 становила 10095 і смертність для Рзецйдоріизіа іпсіцдеп5 становила 10095), ніж смертність комах, присутніх на контрольних рослинах Мамегіск (таблиця 10). Результати, одержані шляхом проведення біоаналізу листя, показали, що личинки Зродоріега Ігидірегаа, Апіісагзіа деттацаїйїй5 і Рзешдоріизіа іпсішдеп5, що знаходяться на трансформанті сої ррАвВе9582.816.15.1, значно менше пошкоджували листя і мали більш низьку виживаність (що також визначається як більш висока смертність комах), ніж личинки 5родоріега Ігидірегаа, Апіїсагзіа деттагаїї5 і Рзецаоріивіа іпсічдеп5, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Зо Ефективність трансформанта сої рОрАВУ582.816.15.1 оцінювали у другому окремому випробуванні в польових умовах (друге випробування в польових умовах описане в таблиці 10).
Насіння сої покоління Та, що містить трансформант сої рорАВУ582.816.15.1, і насіння нетрансформованої сої сорту Мамегіск висівали на довільно розташованих ділянках з 4 повторностями. Кожна дубльована ділянка мала 4 ряди довжиною 6,1 м, а відстань між рядами становила 1,02 м. Було висаджено 160 насінин на ряд з відстанню між рослинами цього ряду 3,8 см. Між випробуваними ділянками і навколо них висаджували додаткові ряди рослин
Мамегіск для приманювання природних популяцій комах-шкідників.
Листя для біоаналізу збирали з рослин сої на стадії росту К2. Листя для додаткового біоаналізу збирали з тих же рослин сої на стадії росту К5. За декілька днів до збирання листя для біоаналізу, з одного нижнього листового вузла на одних і тих же рослинах вирізали перфоратором листові диски, і ці диски аналізували на експресію білків СтутАс і СтуїЕ ЕГІБА- методом, аналогічним методу, описаному в прикладі 2 (таблиця 12). Трійчасті листи, що повністю сформувалися, основного стебла, які не виявляють яких-небудь ознак ураження або знебарвлення і знаходиться в чотирьох вузлах нижче меристеми, відрізали і використовували для біоаналізу. Від кожної з 15 рослин відрізали один трійчастий лист як дублікат, де 4 трійчасті листи кожного дубліката використовували для біоаналізу на Р. іпсійдеп5, 4 трійчасті листи кожного дубліката використовували для біоаналізу на 5. їгидірегаа, 4 трійчасті листи на дублікат використовували для біоаналізу на Н. мігезєсеп5 і З трійчасті листи кожного дубліката використовували для біоаналізу на А. детітаїаїї5. Потім, від кожного трійчастого листа відрізали два бічних листочки, і ці листочки поміщали в окремі марковані чашки Петрі, що містять тонкий шар агару. На кожний листочок саджали личинок в двох інших вікових стадіях, а саме Р. іпсіцдеп5, А. детітаїйаїїє, 5. їидірегаа або Н. мігезсеп5. Тканини листя трансформанта сої ррАВО582.816.15.1 і тканини листя рослини Мамегіск заражали 64 личинками Р. іпсіцдепв, 5.
Тгидірегаа і Н. мігезсеп5. Тканини листя трансформанта сої ррдаве582.816.15.1 ії контрольних рослин Мамегіск заражали 48 личинками А. детитагїаїї5. Чашки Петрі, що містять заражені листочки, закривали кришками і витримували при 25"С і при відносній вологості 4095 (КН).
Через 4 дні, личинки були ідентифіковані як загиблі личинки (тобто вони не рухалися при їх стимуляції гострим зондом), як нежиттєздатні личинки (вони реагували на подразник, але були нездатні самостійно приймати колишнє положення, якщо їх перевертали), як личинки, які не розвивалися (вони мали менший розмір, ніж личинки, присутні на листі рослини Мамегіск), або як живі личинки (тобто вони мали нормальний розмір і були чутливі до подразника).
Процедура біоаналізу рослин на стадії росту К5 була аналогічна процедурі біоаналізу рослин на стадії росту К2, за винятком того, що для біоаналізу 5. їидірегаа і Н. міге5сеп5 всі три листочки відрізали від кожного трійчастого листа, і на кожний листочок саджали одну личинку у другій віковій стадії. Внаслідок цього, на листочках трансформанта сої ррдавВе9582.816.15.1 і рослини МамегісК знаходилося 48 личинок 5. Ігидірегаа і Н. мігезсепв.
Смертність комах оцінювали після зараження личинками для біоаналізів листя рослини на стадіях росту К2 і К5. Смертність комах, які знаходилися на рослинному матеріалі, що містить трансформант сої ррАВУ582.816.15.1, була значно вищою (смертність для Зродоріегаїтидірегаа в біоаналізі листя на стадії К2 становила 6995, а в біоаналізі на стадії Е5 становила 54905; смертність для Апіїсагзіа детітагаїйй5 в біоаналізі листя на стадіях К2 і К5 становила 10095; смертність для Неїоїпі5 мігез5сеп5 в біоаналізі листя на стадії К2 становила 9595, а на стадії К5 - 7095; а смертність для Рзецйдорісивіа іпсіцадепз5 в біоаналізі листя на стадії К2 становила 10095, а на стадії К5 - 9895), ніж смертність комах, присутніх на контрольних рослинах Мамегіск (таблиця 10). Результати, одержані в біоаналізі листя, показали, що личинки Бродоріега ПШидірегаа,
Апіїсагзіа детитагйаїїх, Рзецадоріизіа іпсішдеп5 і Неїоїпіх мігезсеп5, що знаходяться на трансформанті сої рРОАВО582.816.15.1, значно менше пошкоджували листя і мали більш низьку виживаність (що також визначається як більш висока смертність комах), ніж личинки 5родоріега
Тгидірегада, Апіїсагзіа деттаїаїв5, Рзецйдорішивіа іпсійдепвз і Неїоїпі5 мігезсеп5, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Боби сої збирали з рослин трансформанта сої ррдвеУ582.816.15.1 і з рослин Мамегіск, вирощених у другому випробуванні в польових умовах, і піддавали біоаналізу на виживаність личинок Н. мігезсеп5. Два найбільш верхніх боби на головному стеблі відрізали у шести рослин, вибраних довільно в кожній дубльованій ділянці. Кожну партію бобів поміщали в пластикові чашки Петрі і заражали однією личинкою Н. міге5сепз у другій віковій стадії. Цей експеримент проводили так, щоб на партії бобів, зібраних з трансформанта сої ррдАвВе9582.816.15.1 ї з контрольних рослин МамегісК, знаходилося 24 личинки. Чашки Петрі витримували в тих же умовах, які були описані раніше для біоаналізу, що проводиться на відрізаному листі. Через 2 дні оцінювали виживаність личинок Н. мігезсеп5 відповідно до процедури, описаної для біоаналізів листя.
Смертність комах оцінювали після зараження соєвих бобів личинками. Смертність комах, які знаходилися на соєвих бобах, що містять трансформант сої ррдіВе9582.816.15.1, була значно вищою (смертність для Неїоїпіє мігезсеп5 в біоаналізі соєвих бобів становила 5095), ніж смертність комах, присутніх на соєвих бобах контрольних рослин Мамегіск (таблиця 10).
Результати, одержані в цьому аналізі на соєвих бобах, вирощених в польових умовах, показали, що личинки Неїйоїпі5 мігезсеп5, що знаходяться на трансформанті сої рОАВО582.816.15.1, мали значно більш низьку виживаність (що також визначається як більш висока смертність комах), ніж личинки Неїїоїпі5 мігезсеп5, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Верхівки (найбільш верхню частину головного стебла, що несе два або три трійчасті листи, що сформувалися, і гроно незрілих бобів) трансформанта сої ррАВе9582.816.15.1 ії контрольних рослин сої Мамегіск заражали в польових умовах яйцями Н. мігез5сеп5. Частини сирної серветки, що несе приблизно двадцять яєць Н. мігез2сеп5, поміщали на верхівки п'яти довільно вибраних рослин в кожній дубльованій ділянці (усього було протестовано 20 рослин), і закріпляли в певному місці пластиковим затискачем для паперів. На верхівки рослин надівали мішки з ситової тканини, а вільні кінці сітчастого мішка зав'язували вузлом навколо основного стебла.
Моніторинг вилуплення з яєць проводили щодня в репрезентативній партії сітчастих мішків.
Після вилуплення личинок зі всіх яєць, в кожному сітчастому мішку, надітому на кожну з п'яти рослин, підраховували число живих личинок Н. мігезсепв.
Середнє число живих личинок комах, поміщених на верхівки рослин-трансформантів сої рорАВО582.816.15.1, було значно нижчим (0,00 комах Неїйоїйпіб мігез5сеп5 в біоаналізі верхівок рослини сої), ніж число личинок комах, поміщених на верхівки контрольних рослин Мамегіск (таблиця 11). Результати, одержані в цьому аналізі, показали, що личинки Неїїоїпів мігез5сепв, що знаходяться на трансформанті сої ррАВе582.816.15.1, мали значно більш низьку виживаність, ніж личинки Неїоїпі5 мігезсеп5, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Число природних личинок Р. іпсіндеп5 у випробуваннях на ділянках підраховували один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів. Зразки брали з двох центральних рядів кожної ділянки. У довільно вибраних ділянках між центральними двома рядами поміщали білий клапоть тканини розміром 91їх91 см. Рослини, що знаходяться на ділянці ряду, розташованого поблизу від бо одного краю клаптя, перегинали через цей клапоть, а потім 15 разів трусили для струшування всіх комах, що там є. Цю процедуру повторювали для ряду з протилежного краю клаптя.
Личинки оцінювали на вигляд і розмір: личинки довжиною «б мм були визначені як невеликі личинки, а личинки довжиною 26 мм були визначені як великі личинки. Всі комахи були видалені з клаптя для подальшого аналізу. Потім клапоть переносили у друге, довільно вибране положення між двома центральними рядами, і процес взяття зразків повторювали, в результаті чого одержували два субзразки на ділянку в кожний момент взяття зразка.
Середнє число комах, підрахованих в ряду довжиною 1,82 м, засіяному трансформантом сої рорАВО582.816.15.1, було значно нижчим (0,00 комах Рзецйдоріивіа іпсійдепв5), ніж число комах, підрахованих в ряду довжиною 1,82 м, засіяному контрольними рослинами Мамегіск (таблиця 11). Результати, одержані в цьому аналізі, показали, що зараження трансформанта сої рорАВО582.816.15.1 личинками Рзхецпдоріивзіа іпсіцдеп5 було значно нижчим, ніж зараження личинками Рзеипдоріизіа іпсіцдеп5, що знаходяться на контрольних рослинах Мамегіск.
Результати, одержані в цих експериментах з повторностями, показали, що личинки лускокрилих (Іерідоріега), що знаходяться на трансформанті сої ррдавВе9582.816.15.1, мали значно більш низьку виживаність, ніж личинки комах всіх тестованих видів, присутні на контрольних рослинах Мамегіск. Таким чином, трансформант сої ррАвВе582.816.15.1 мав інсектицидну активність відносно комах-шкідників даного широкого ряду.
Таблиця 10
Оцінка числа загиблих лускокрилих комах, яка проводиться шляхом біоаналізу листя і бобів сої, одержаних від трансформанта сої ррАВУо582.816.15.1, у порівнянні з контрольними рослинами
Маметгіск
Трансформант сої . рансфор Маметгіск г. . рОАВО582.816.15.1
Вид і вікова стадія Загальне Загальне
Випробування тестованого Тест Число Число . число число шкідника загиблих загиблих тестованих тестованих личинок личинок личинок личинок
Новонароджена Біоаналіз
Теплиця личинка А. 45 45 З 45 листя деттаїаїїв5
Новонароджена Біоаналіз
Теплиця й 45 45 З 45 ц личинка Р. іпсіцдепз |листя
Новонароджена Біоаналіз
Теплиця личинка 5. пистяЯ 39 45 45 тидірегда
Санта- Новонароджена й й
Біоаналіз
Ісабель, личинка 5. 11 16 16 . . листя
Пуерто-Ріко ПНгидірегда
Новонароджена Біоаналіз личинка А. 30 30 З 30 листя
Перше деттаїаїїв5 випробування ІНовонароджена Біоаналіз 30 30 30 в польових личинка Р. іпсіцдепз |листя умовах Новонароджена Бі . іоаналіз личинка 5. пистяЯ 23 30 2 30 тидірегда
Личинка А. Біоаналіз деттагцаї5 на 2-іїй /|листя на 48 48 48
Друге віковій стадії стадії К2 випроб вання Личинка Р. Біоаналіз
У іпсімдепв на 2-ій |листя на 64 64 64 в польових пиши щі й умовах віковій стадії стадії К2
Личинка 5. Біоаналіз
Ігидірегаа на 2-ій листя на 44 64 64 віковій стадії стадії К2
Таблиця 10
Оцінка числа загиблих лускокрилих комах, яка проводиться шляхом біоаналізу листя і бобів сої, одержаних від трансформанта сої ррАВУо582.816.15.1, у порівнянні з контрольними рослинами
Маметіск
Трансформант сої . що оОАВО582.816.15.1 Мамегіск
Вид і вікова стадія Загальне Загальне
Випробування тестованого Тест Число Число шкідника загиблих число загиблих число тестованих тестованих личинок личинок личинок личинок
Личинка Н. Біоаналіз мігезсепв на 2-ій листя на 61 64 64 віковій стадії стадії К2
Личинка А. Біоаналіз деттагцаї5 на 2-іїй /|листя на 48 48 4 48 віковій стадії стадії К2
Личинка Р. Біоаналіз іпсіцшаепвз на 2-ій листя на 63 64 64 віковій стадії стадії К2
Личинка 5. Біоаналіз
Ігидірегаа на 2-ій листя на 26 48 1 48 віковій стадії стадії К2
Личинка Н. Біоаналіз мігезсепв на 2-ій листя на 34 48 З 48 віковій стадії стадії К2
Личинка Н. Біоаналіз мігез5сепз на 2-ій й 12 24 4 24 т щі бобів віковій стадії
Таблиця 11
Середнє число живих лускокрилих комах, присутніх на трансформанті сої рРОАВУ582.816.15.1, у порівнянні з контрольними рослинами Мамегіск
Вид і вікова стадія
Місце т випробувань тестованого Тест Трансформант сої Мамегіск розу шкідника оОАВО582.816.15.1 мігезсепз стадії
Оцінка в
Невелика «т велика польових умовах 2,25 на 1,82 м личинка Р. їм 0,00 на 1,82 м ряду , на перший ряду іпсіндепо тиждень
Невелика хз велика Оцінка в
Друге польових умовах 6,25 на 1,82м личинка Р. - 0,50 на 1,82 м ряду випробування в І на другий ряду іпсіндепо польових умовах тиждень
Невелика «з велика|Оцінка в 22,75 на 1,82 мМ личинка Р. польових умовах | 0,00 на 1,82 м ряду я іпсіпдепе на третій тиждень ряду
Оцінка в
Невелика «т велика польових умовах 4,00 на 1,82 м личинка Р. В 0,00 на 1,82 м ряду , на четвертий ряду іпсіндепо тиждень
Таблиця 12
Середній рівень експресії різних трансгенних білків, виділених з рослинних матеріалів трансформанта сої ррдіВе9582.816.15.1, використовуваних для біоаналізу на інсектицидність
Вікова стадія т польових умовах рослини тканина роАВУ582.816.15.1
Перше випробування в 2 листя 52,9 польових умовах випробування в ваг листя 0,79 2,73 польових умовах випробування в вь листя 0,39 2,28 польових умовах
Приклад 7. Передбачувана послідовність трансформанта сої ррАВе582.816.15.1
ЗБО ОО МО:14 являє собою передбачувану послідовність трансформанта сої ррАВО582.816.15.1. Ця послідовність містить геномну 5-Фланкуючу послідовність, передбачувану вставку Т-ланцюга рОАВе582 і геномну 3-фланкуючу послідовність. Що стосується 5ЕО ІЮО МО:14, то залишки 1-1273 складають геномну 5'і-фланкуючу послідовність, залишки 1274-13658 являють собою залишки вставки Т-ланцюга ррАВе582, залишки 13659- 13821 являють собою залишки, що утворюються після реаранжування плазміди ррАВеО582, а залишки 13822-15170 складають 3'--фланкуючу послідовність. Таким чином, послідовність стику або транзиція біля 5'-кінця вставки знаходиться в положеннях залишків 1273-1274 5ЕО І
МО:14. Послідовність стику або транзиція біля 3'-кінця вставки знаходиться в положеннях залишків 13658-13659 5БЕО ІЮ МО: 14.
Потрібно зазначити, що ЗЕО ІЮ МО:14 являє собою передбачувану послідовність трансформанта сої ррдіВе9582.816.15.1, і така послідовність була зібрана після вирівнювання послідовностей 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:2 і ланцюга ррАВУО582. Фактична послідовність вставки Т-ланцюга трансформанта сої ррдАв9582.816.15.1 може дещо відрізнятися від ЗЕ ІЮ
МО:14. У процесі трансформації, а саме введення вставки Т-ланцюга в геном клітини рослини, нерідко утворюються деякі делеції або інші альтерації вставки. Крім того, при ПЛР-ампліфікації можуть виникати помилки, які можуть приводити до незначних помилок секвенування. Так, наприклад, перераховані тут фланкуючі послідовності були визначені шляхом генерування ампліконів з геномних ДНК сої, з подальшим клонуванням і секвенуванням цих ампліконів. При цьому, нерідко, для виявлення незначних відмінностей і невеликих розходжень в послідовностях, одержаних і визначених таким способом, може бути потрібне проведення множини раундів ампліфікації, необхідних для продукування амплікону, довжина якого є достатньою для його секвенування з геномних ДНК. Фахівцю в даній галузі очевидно і потрібно звернути увагу, що будь-які корекції, які необхідно проводити через помилки або розходження, що часто зустрічаються при секвенуванні такого типу, входять в обсяг даного винаходу. Таким чином, релевантний сегмент плазмідної послідовності, що тут розглядається, може містити деякі незначні зміни. Так, наприклад, рослина, яка містить полінуклеотид, що має послідовність, яка деякою мірою ідентична послідовності вставки, що тут розглядається, входить в обсяг даного винаходу. Що стосується ідентичності послідовності ЗЕО ІО МО:14, то така полінуклеотидна послідовність повинна бути щонайменше на 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9590, 9695, 9795, 9895, 9995 ідентична послідовності, що розглядається або описана тут. Фланкуючі послідовності плюс послідовність вставки можуть бути підтверджені, як описано в розділі "Депоноване насіння". Таким чином, можуть бути ідентифіковані деякі відмінності між послідовністю ЕС 10 МО:14 і фактичною вставкою Т-ланцюга трансформанта сої ррАВО582.816.15.1.
При ознайомленні з проілюстрованими і описаними тут ідеями винаходу, фахівцю в даній галузі повинно бути очевидно, що в структуру і деталі опису даного винаходу можуть бути внесені зміни, що не виходять за рамки основної концепції винаходу. Авторами заявлені всі модифікації що не виходять за рамки суті і обсягу, визначених в прикладеній формулі винаходу.
Всі публікації і опубліковані патентні документи, цитовані в даній заявці, вводяться в даний опис за допомогою посилання так, як якби кожна конкретна публікація або патентна заявка була конкретно і окремо введена за допомогою посилання.
списожЖ посліІДОВНОСТЕЙ «їх» ож ддховсієпсев СБС «ій» БезистентнияМй до комах їі стійкий до рероіїцидів брранодормане сої зевІ.ніш. 15,3 «130 7037 «БО» 34 «АТО» Ракевсївн чзехвіст 3,5 «іо» 1 «Вії» 1577 «Вї8з ДНК «2її» пбіусіе тах «400» 1 звкессчатссо сузчазузаяє зазсзазчаЗ Завааїасасхї аацасбсодда созсвискоє Бо астссазесе сезчасаззоз асзазбтавзає ззазсаесао бассосасов сачіссваєх 150 засаззаєса Сабакассацч сакавааскє засзоссЕсаа абзаксекек засбеБеекає 180 сасспавсса збассткаах ауссЕсакса ктакассузсс азадассваа абзвсосадака о ексасскас асуссасстах дакаасвевза сассїсазає зкасассаба ссзаавактав 309 зесстасасаа сттзасваїсх аскасатеєса Ссегагсссаа ссзавнатааї базсзаавца 3650 зкзавссіза актазикаке Брааєнаняк зуззачекче чзсзавквасье ЕсКЕКесВЄ 420 чивазаваза азчсавассв засаааовау Севсвосскх лодассузаа сасссазаче «йо аксачеззоз аопсдачевсз зозазчачасоя вссзаоссоста чазвайсзсса соссабсазвке щай тацеспсзаас ссадсаацає зассачідеб ссізкеЗсеЄ БобссоЗасУ йакзсасвав вай
КсСоазасаскс заабсссесх гсасеядачоєс асзвакчсте сссзсвзаєка сосзезасай 5 счаксзсаскх чсзусоасасо ваассссазавс зсазаатаєе азсасасіссе засссссовад 729 савазссоєкад пдесзечсаас азс ссазаса зстовоасс засватакке зссзаассва 780 багсассаба чазазссастак зестававос сассвасаев асчавочсацю ссассевавя 45 кІчсесуєсе задастсскЕ свзчсвасккс сакссвсзва Ксасцдаавса осзасакцеа а тасччасвЕ: ззасабсчасз суузсасаса чабсасссзка асчекссзвзза СабачавочЕ зва засасаозва суззссазі зкосзазовос аатасзачасо сзсабсвааас всосзавсвеЗ 1555 чсаачччакк зчазсассса касттсесаз Єссзсаваса аФфувевеко зечваиесаа 19585 зазаєхказа чсказаваксак ксссуасає абабссгасцтях баззвабееех сассовосса 1140 сассазкаст авсЕсЕВЕСК сСаставався басксктада сазбзаксса СазвсазвикЕ 1559 «ЕссЗздазаї взбассзеусас сСсававауваз сбазассс сессоссазда чсссазазко 1250 «СвастаскЕ заассзуєса зеассаесвзо ассвааацьс аздцсссзває аЯббсчаа 1329 свзззваско чЧеавссцась сесасавєс авасссосво сгтачссзсає закастасто 1389 вссзочаслист авсозасчсоя зссаснюкво Зодассвава аботозекта басевозксї 1349 вастстзавсс згзкаврзаче аадаєсзавео сздодссасу ссесуздусаву садаосусвиа 1305 вшессзЗзсдсв азаазачсазоа ссссоасазка вссздвесааа зассссзеосЗ вособосвоще. ізкй сазесзчабєса зчакасх 1577 «айв й «її» 1687 «ій ДНК «2їі3» біусіве мах саййз цизсаксазас всвосзсаєбсов Ссссаскзчає Зсссуслсаає зассзксаке зазккасесх о свеізсясача коасастсзва ассвассан сссзузсава сеїсазвсоз абчочносво їй засасасввз ааваозчіссчєс звсЗКоагКаї сазустокек аадоецчесває сезабскаса хво зсзчасавца ссоссосссса зззазасвазу сбоузссзззуз васоваазак свое ай зер кскоя чес секака заачсоцссеУ звогзачаєу саззЗЗЗЗх азс зо ддсзаззвазса сСсосзаскзса асссазчесас сазказчсссоз закзсассач асосасчкУ збо пточчсссзса заксзсеатса ссачіаЕкос суссессес зазвзкссєза зсзакеєкає 20 тавгаззазчача зачазксссз бзеаказрсс авсзводека зассасаєта кесссвацає зо кпкзазсесси сасасасссс вскузаззає аксосвазавее збзбсдссає зестосадеу 54ао штгаставчє бзссссвдеасу засьазУсасе бзчаабсазас ссасаасвЕ зво сва вой ззкзссссаа зсусуссаза сакстассакста зкдссаззаа часзкодвава зчїекикнає КО соецзсаасвсос зсавсузека сзагттсзсає сзазЗагазас асзавосакт єбсасозаас 720 кекс раца дпазчвасаккта сзасстасск зосасвадая ваазевсвоЗу бсссзваазЗ т8о0 зічавеззає всасазсозаз сгззазасата зсзавсвесва чсасзайта авабекосах ай сссксакчсє сасссосава серюкааає зксеьнакККЕ саке березова за
Есе соБЕБесказ ссеусссказа задссацксв ЗзЕбгостає ахубзаладе зво двзаскзассс азсзпскваЗ асавивстос сасовчекоаза сасзсчасац сексссасоє ї0295 кзуссасеяе сссчесасає азбоссзевис зщдесезазако сзїсзвзузаза стбасвазвау їо8о сазЗкзеЗиКЕ саззозавсвс зазасзсозса змазосавка сбссавассо свавсозаае ї14й
Казнскскка зосазесщск оУковгсасс вакккосасва пасок свзеу Зозасчаззва до стасзоузвзаза асасзавяс Фасакссосу зсссвекко очах зоасосооУсо їй ззассскзза зоаазаденЕ соссвссссо басзксанавя ассаккакта «секс ове ї3хО
Касаксесст Єсесстазвкя зсззвазсозса бсагтсавсоа Зако ККчеЄ взбоаседакх 38 сааскцвзса сзактсзаче зскосзаї: саксчезнає чазвазсазаса зазвкзавае 14588 взстясксаа сОзсссрсос Ссдасасосс ссвзазазчозу ссацачуєсе: закгассоце 1508 чассзвссєзає заабкцаавЕ зсув е сеїЕссксзу сассосзвасьв Есссозуєе і555 сзесссачач Ксссаооаз азсоуавсса асвсвкссое сзакуєсаса азЕезкоесЕ їз сссазчаєкза ассссссозао Коссскосся зоуЗаскоїза боса сс седдазоває і68о пезбеаа 1687 «ВМО З «Зі» 18381 казаз ДНК «ії» шШетУЧНЯ ПОПЛІДОВНіСтТЬ «Ва х «вай» Побрідсвністєть плазміди роднавах «00» 3 зчсдасасс зссвсассва зазтазчсс сзааказік чазаєсваав аезскищиває БО кчачесссас азчусксавакк сеассоссаус сугасаатає сасесвосЗч абсскзаосо 179 зчзечезагсаї аадесосоае салавасссс азесасакх засоваКх азс 385 кзазчезаазс аваастозаса ссвоізесосач зозаЗсчне осзосзачее зеаоаааваав 258 цезазсекося козезастоай ссзававає Каїсуасиса сазаессовнася засоаоааава заз соска ссса зузсзисоава сіскзсззаз зсссзЧсзкоз аскзасчаєс саззчассова зво твазсксссв сстссабдяє зазссбасссо авачазедаке ссуУбчЗсайса сксссЗЗе 429 звехЗссасса акцевааавьЕ аксаєсузСс абкадвокав зсводаасак СвавсасоЗа чно ссжуурссса засазузесс аскзавекає чвассзааеа зпсазвдвасза абсоцашесво 545 савассаєтт зчесссобеЕЕа асчачассся Бссасовасх сзакасавнай чсвссаксе 50о їаспсвзасс забаакссаєв сазвазаїдєз сазавсазасвсє заззавеьсав зацазакоця 6 таакскксзсвз асасаксака счасзаазчав зас сссе сзазазавкс зобов ка тво казадсосась бусассазає ааасузсаза аазаласава задздааача забазазиво тво пзаззаєсоє ззаззазсасу азвакасисс сваасзсовака зсчасоесасзяа сеЕсвневаве пад десвассссс застссвсня сасвгссаза вазкаазаса аївасчскза азазасзвева. а0о зассзсвавеза соФссзааес созвосасу загосссззЗза сзассуєсвеа ддассзчеоЗЕ ща катсчасзва ссачсвасаз зоззсозссай ад ЕЗса зссоддсасас всзачксЗе Той сктассазвесх свадосаєсза згасскЕкос ссзвосссяза забаацасва ссазосвавяа 10яй асаасксккзс зсгазасаа соасссватас асакзксвсс безекаккяя ссваЕтаскке 1148 асодссткауЗ сс ксака асесаЗєсує остозЕсбеЕ срок свЕ себсоаада 1209 а«саакасссв вачекксоккс сесвсваксс ззассссаво Ексссзалає себзааавсї 1250 ссУссковає босетосасо зочассваяа базаассксвоа бос ає всесссвада 1329
Бессосчаске сусесссоУке сзаксссавї СЕсзбатаєч БесессоЗЕС садчасєсса їі385 свассттаза ссззазчасча сЕссссм ссаассзека дасавсвкес базрсогсоа 3440 ссапоаЕКЕс асззатаєса Ссоцавесоє гсавасаавее заз сувасавьсв 1509 сесуксзчаєс сабо сЕ збсосззакст зУсаєказке єссзУбвсЗЕ зесзчабсозває 1560
Козака акосчацкес ссосаассаа сзуаззассвя сакадсзчане закакосаця 1639 ассазчеЕчеЗк сесаєсасває сусебсавса абсссчазує счачаїсссосо засозацазча ї689 ччазсассзчч асщоссссос собузовКоЄ сссссгесст свозачесвкс сскксУссУ 1745 азсссчесес ЄзсосчУч ЗчЧесЕско зесоискказ ссссвксвоЗ сескссаєов ів ссосасибоа ббодацчсесеи сеосккоксес вузссозаса ассзаєсЗаз сзлзавадаєка їв ачассястЗза ваззаасаца цссаїсасна састкссюр ссесассчас ззскасанав 150 кссасаскав взусвсгосаї часу ссаасссоза сазкостсаа сЕссчЗаая ї980 аксьзазачас сСсоссскЗсо аасасвоазка асЗзссссчак сасазосаєс засзассвса аз сестсасова сБбЕсЗазабс сопссоєсте сазвссакат ссвзазссяса авссссизею хо кзачесоцех казадасось закссьсся засавозео задчасссодас збазссаско хо
КоОласазковз ссасдасаца сгтсзссайсї бзасссасскЗ стасвосаза саксбчсвЕза дих всасссасаз ссваззаєска зачавссосса чдзваасассава сасбозссва сЄЗчдсвазає зави кодаєссацес сазазчвазе сссасассса собаче за сасзавеае скобеесоса 2346 асівзбаавсаї ссзозестас ссвасссзаз ссозастсосз асссзсаачч дазаєстаса 2400 сссссксазчі сассазчзас адессзуске ссссовасає воссавсяв бесавсосяо 2450 сечаЗзсссоз бабсазгасса сессовескса бзуасьсове даасесссба Есасочвису з8аВ сесзчачессце бавадссссяв зсбокЗвозда чадуєсвосе сеїсбацевсос озЗсадеаису 2580 скдасаасоз свосвасьсс севесстасу зач ссва соосчесоза Зссакесуа 2540 ттоасазЗаєча зуасссавеч собесстасяа зчзаассекасс взасос сс оз9аа 2790 чезчссказ савсссвовзо абз зЕсКовачоя вУбУудевЕЕК саедевозога а275о чесассвакса сассодсаса сссадазаса усззсассає бпасаческЕ часова Іо «твссссазЗа саасацесзча здсассосоузЗа асчаокаске сосзкУуєчссо ааєбсакцесв 88 сескгоасЗсЗ стзасссаях зазассапса астсазаєес сказасвчса ссазкаєтсє 25430 стакцчоавссса Сечсобасс всасссасав асассаседа КБсосадазазча абсасссвора зопо кксссхоаЗ уазаддсасас асаєссссаУї сптодвассае зазссЧассаца зЗазсокоачеє зо5о0 ксаскччсзз зЗасаскссс зоазипусасоє сточацацео Вс чосїсас зосзстогса 3179 зсассвасов зЗсааскесосос своасастасо чоцосзцазе ссзсбасяос бсесвосавика зіво зсгскодачаває сквстоссдсоа чЧІкБчУссозкоа адачувестх созсбзессва сссвасваца за49 свасзЧчасас сучсЗаксса БЕасассссо аЗзЕсасвсосс спасзссасо абсвасвска 3350 сасссасоеку сссазєзазс сазбссадек ссасауБоЗза басяцасвес сесацчетосу 30 чсазечатє зЗсасасксчас сусессчаче сСзчакссссазУє частяссзса ссбоаазаска 3аий засстчаск: зчазсеїасе сзуваууссо бчавзкаексє сттсасекої ссазаксяза 34850 косу сава часова са ассзассасс згасазасся аск ссаво сс еов 1540
Ческскскуа бдзасескос ссзЗагаада вузаазазее згозачачуааЗ десадасаса зей псзадасуєь соссзасчач зоздзасккас сссавчаєсс слааєтбссзуа з3зайсвасо зво зпссаассача сучас ча аззаччассаа сеідасаєтевс сзвзобсазазча ччсзаозася 3720 стУусссвазах чаазесасУвс асасссссоч зЧасостсгсла сцазсассас ссаасасясе зво тсгсассауава засачзоцав зусавасіса ачцссстасає зазаєюассач сазана цчЕ зад зсаксзчазза сісксзачас ссбозвасох ассссаксзу асасаасцос зазозсзчада зай сачссадкч: чУссрзачасу зчЕссассЄ ссассастстс аЗзеоссавчє сосасбздоа зва зЗчЕвссса бсеассстасаб сасктсссесе бедасасаче КУсеЧаскас ассузекеза 35520 зсгувучатсеь роз зезасоссса ззвоозадас ссзвувсзос сасосавоц оо
Качасавссс сгоазасскосе зЧавчазсаває сзоескзсссоя задвацососке чесадацеча 4149 ачачездссза заздазаєтза з3зЗчасааза чазазаачкії ачазсззчаа зсавзсаккух 00 суусасавацча азсовавчаз сСсаобсузкя сЕсЕУссеає зЗааогсссав сзкоавгасеє жлвй
Кссазасбза сазсовасата чезакзассе асоассдсзвзов сзааачечев сасаезсабоє за чсозаосаба соббосгтова сссссзаєза стоссозаоае саакоїчса абссссзаву аз80 ачесссзаацв асоасассеко асбтасскссї сосссцрассча сосазозаабє зссвссазца 3445 акачечасев свасавсорую сбепсстоасе звасзсова адорусасчсУ засосезаву 505 засаецваєза ссассчсссе зусосесасся сСсссрзазсоа содавосєсоза зсссасззо авЕй зазіссясаяє сутзсссспчас сзсузсїаса сссгтоЗсУує застасттас зазуазазсе зви чззачаваа ссКзсеїсасс акссесуаза бзаазавсев сзскзавЕцаа ссдазаися 468а шевассакЯає счауцазоааа зіссасосаа зсзасасезяо сасебсасаає чазсграсвока 4740 савспесаача азвубсзсзаз зосасссаса оксстспсва сезсзастаї зазбачазасе ав8о0 асчазуазчеда сесвесезЗкЗ сехоскаасо абоєісовзас стзсзвачач авадсвсвов 4850 ссззсзЗаво зчзезсзасзає сс сдааа зсвасаузвач стабччучан басасасоси 920 ксссазессЗа скакакоесо зазазазісаз ачсасесссс годавйссово авзчесода азво пзачасвує зааазскова збсзвсассса СзУєсовоке сезбачачске сезохсасца Заай зазазсчазче азссаостсв абсассстача чессозссас сазовеваєє сесассавка зіва каставассв стукіт зазтасавиї ссвзсосккосо ззуаоссаа сабсвавако 5Убо сактсаслав свозсавсаї СсбоЧркосаЗ зсгтоссаЗа чеавссузеої чесабсозказ. БОМ анаессасаав задасккгавь сгозсоессяак гаєсссазза седасассва зазсасткай зва асгсасскукс чУчксвосас зсессзсвос сдассодазаво зссаозсезчаєа суваактакся 5340 зЗсззсассає сузгазксїа сссззазаск сасазаазаз зсвазасасса сасзавесоа ЖЕО сзЗаваскваса савацдасвча сазадосася сасавсгазчеа асассовосУ ачаєстаскца 5аБо атгассзачя ачассасоача зоб дЧаса заазчсасаво бесвасссва сосааакое 55 зазстдазата сссзазаесяє сесасакзса зааоасазасс абессастао сосок 5У58О пикскаосдаа сасоузазчео савецссоса чосзедопос уаваасоваєсь вггчсаквева 56490 зазсечсосчс засозссвак кузастаднас ссозоаааска ассвессвзаз асосвасатс 700 зазчвассосвза Сесссасосо азадзастаєа зпаззсассах чсавасесяз саачазоасаЗ БВ ассвакаєз: зЗадсасзкаєсч савсскабук ссвазаасза заваксасасв закасаво зво сесахаскчс саузасзвода азаазчаасас згазайвссу заазазаача асезвзузсЗай ваз чазазздасс ктчзазасзх аздесасезчас зЗасавсвака зааазчаачаа зчапвазЗуея 5340 зечассЗбда зададцасата заззасасаї Зсззуцкада заасусазвУЗ зсааазахеа вад асстсавссво заасовассв бзросссосяс сасебавссб СесасвеееК сосок авх «по сера ссск зачібссссо згзсадозаа ссазасссср сасссцезав васавззваза зі засіває зазесавЕвЕ сессзвазУса стчазаакас аасосссовазу завакссзсаз Свв
Усова ссвасзаоЯ всевсвакис сзасаксеас Зазкосвкс секасавока виво «чксдзасзас сосгзазоссоа заоч сезао босдазчавсуч абезазчастя чекасасасе 5300 саксзасаєо бсоабсзссас ссассосавеб сессссотса зазоакксУає ссозкчекоз «350 акксчичеЕ заастсессЗ асайсвоссга зчзчзавесЕ здеакоссссокє заказчасеє «ах0 шЕсЕсстчса садагазазсе ащсЕзабсза ссавацааба завис ссззавасся авіа заассассссз зузсазчавя чосксзусаа соїссассзу зссбасчову засос 540 зчачсочааа псвуассезча ссзвусссчое сгтазвазаз3 зЗзачасвєсдса Кбсваїбсай 5500 кзЗзасасчазс засчсизсвча сзассасвас вссасісКс чесзсссаза ассассава БББО ксесксвосса ссср євзоя КосСачеассеє свасссасас сепсис Сосасавече 780 сестизике зазвевасози зва суссусавсо ассвасвзєсх зуакавкоа тва їстзастаФз осссассоосз ассасбасоза БррасассЗКЕ сессозчсаса асаодацесє вай счаавсзкчс соцадассуз зсстазадча сеча сваа басззвосваиє бозоадоссеця 5800 чсказсаста аскзвостаз всвссесоФо Коїстсссксос аавобасчась сбзоЗооаова езаз песазкссяє зебазвассас ваккзассоз зчавасскасє асзазатосацч Сосетсзазчайа того тіксзасчУує зусескодач зсевсоовссса зчдсабсазав асазазчстаєса озсосссяса това сскчаесоузас акасковнаса угаксасзаї ссасасесчає ссусассосу зебабссаста 7140 стчассазац састсазчахса садсвссасо сзбеЕзаасто бесбоцассач заббсаст 7200 сскасксстас созасезкзЗ чоаакозсвас бесасааєсза сатассЗсся сЕсаасссою 7250 ссазазсзсу каказаассї бебссвасаєс ссбабзсвзоЗз азасссесса асабецасає Уха спазсявксаз сабо васскоаоЗа зЗасаваааеек честагааза себоссесада т73заз стеКассаесс зсесУубсраса дадауванов засазесцчає зусссозасч аазесескох 74439 всадаавсзас даасзссссвс сбазчсвачч чЕссаячссає сассскачсос абакасссає 75090 цскссуссса засос казса асвонадсає беасвссвес аводоскссов Бессокесе т75ей пакасаксяє зоасзссчазч ссззсзасає аассасзссс забадсаєка ссазчабесо тео ачосассвач сазавокЕес сосгссвасоУоз сбесассак ссзодаєсаз сабссаскоз 7580 вуцсзасвка зссвозесваз ассоссссзщ сзасаасаєо сзоззасаззаз сасавеєзссза 7745 ачедессасу сасесоссазу счасаєссас саезасбаїсяє зЕссчсгяа заз зесо 7805 саскассссо абссасосса звсозбозваскЯа ззасавебосо сосаксвЕКЕ созагасаце тво зпсоводсозвса зсптзсакооб сзовсзаеок ссавссізус засексоачеє зсексодавд аа суесзатасс веЕсСассеКовЕ сосквуЗсаа сасадсзаає чсазЗазайь сссссозаас 7980 сзссззачтя акавссузес зобов васЄ саєесоса зсбусзавуо гсзазщсзуа вва зиссзасксьа чазвацазчсзс азвазчзасачє ззасасьоїа ббсзебоссаї ссавссзаає 8169 оедцисксаза пасачаєвеоа ссозосасса сагозассоає якскссзасо СЄчсбоаЗу То сеспосезЗає зачсссгосс содасдчацаа звазавУсоя сссоавзоазацу бсзвасакоє ваг каавасавсЕх азсчаковас зувасксяЯсь ксавзасссо зассксчся чЗазесавсях зво цсвастазає сзсудасзча соадазвачеас зЗуасабссасс зєгсаазала чеозсзасї 8380 зкгсзасзчазч австізоаска сзспссссозча сао заї зазсоастаєо сазвсакасеє 3409
Ясвзссазавч абазаєзчває сзазасссзз ззосссасвзса ззасвссвУє саазчазавка. вабБо савссчезозає адксааовиас стдазчакста ссбсзвосвза басавсозссв засасоваво вхо заісвавсзсУу сессаччасоц згбсассоса дссассссса чесосавусс ссабоадова вно чкасцпсссзе састсаєсаєсс звссесосіс зазсазказаєсє зеЕзаскаса ссовесвоава вай сзаацаєссьс чУсуУсУсаЗа гоайсссссва одзбозачасє сазуатвос асеясовазох 7600 авзчсаайцскоа чачскЕстаз зпадачаваси аскзгсодча зЗавоссекса ссаздзосцад й76о чзачаческоава вазазасоза саасавзза ззазаачеса зазсцодана саввсвесчЕ 829 дсасазвоза десзазузав Зевс оса саса застстсаз акозевачеє 880 схевазссозаї ассззсзсаз сбасчассса сзоКусазас звасосзкес абадсвсся 8за40 зчазусктас собсстзаас сбадсчесзає сссзузбако засочстуства ЕСКЕКовВ до
Зсразчвачазч счсаксесса стясаєсеото сесзсабцає досадазаєу ссаковадав Зоб сччечастсо засадізасс тассосусту завсасчавна зуусасусач асзсзузада 5129 всасзаасвах сасеусрока ессссзесес сосічачсза даззсачава сексасавача зів ачЕссчсоксе кассстзакс чізаскасає оссоЗБУЄх ассосячсаса аззадодаєа ваао поазачавоя: сзсозссясса кзсасзазаї Сдчазцазсаас досоазозазс сзвазессва 30 садскчсЗко заззазчава соссасссаза сзасассяса зсбсасваса ассзвсаскає 5350 частксаззаз Чачовковаз зсасссвсво стсссзсаає сззазасасоз асзвазоста за25 казазсаййс СебЕссзбас сососеЧаста гасебсвуєє асчиччадча задо каєвя захо статзчасе: ззазчасонасе сокосзаасс савсззазозс сасавудасс зсасасоцке з540 зттазпсцес сасзссассз зазаЗзссаза зкасескссв зЗаазосзаса «зо содає звой резастзаз зазвсуззв3 здвгасасссає суттчакзас часа сгсссзчавоЗа. зако пузасєчазса зссазчевсай бсасссвова сссозесасе баєсзазаєс сСасрсзаааа 4720 ззвозевзвасак сб асву ЗСКаскаав чавсечакех зскассасаа заактасвав 788 зазаєвтссяс сСрУссотсвавс СаккроазЗза Ссшзсасквза Зоаооасесва За оОо Ззвай зчссассає зсассассах зчаскЗазЗааз абсачедаса саваїсаєєс зсазкассає зз09 сзасазвеска сссцчазааеє сзкззчавав збаавсаста сагзазскаа поазазсзаєа 9950 савзадзсача азазчсовоЗ сасовкссвоз абаксзасся взассассоза асаскззува МО 4о ачассзсзуа ассвссзасоа зазасатеабс беЕсвасссяд сссзазеоос азсгдчазаєа 1008 сссзаассус сосабасаса сзачсозчакс акксаскУєє бзБЕкоЗзесч соб ассаа ї05а0 забсдасаззкс савячекасо зссщсаєцес часссвУсе ссссгоасасав вубоЗКЯсо і0209 десусссавї свазасрсава соссподасУ сібазасуєсу Зсосзссває сззодссдас 10960 сецсаззоааа сссаузазє зассакссова засасазсак свзачнакоса абЯсесвоцЗа 50329 чззазастає ззаазсвсса сзсаазскся зсаачайаса зассаасабя сзасасавіах 32389 зсвасскаеа сссезайасуя ззвзазкчагас ащчвсасзазча бестасвику соачааєсакУу 1044й зисивоаваса сзсаздавасс ззазааадвач аасосвосеЗа азчавайдаає сссзчЗаваавсу ао5Ой саазчсаскза счасавозак уааназаача ззабаззчкс зУБчЧаскасо аавуззозсак МОБ ваацдчасаса сЗбазадсас завасуєзза дзсазааннує ззосссакса сзазвузчайко збо ксавссосовз ствковавео СС вВсвеве Бробозкзсса сере расео соузвщквесо ї0550 сакзсазоасфа вссезачесоз зсассезгча звасаазчада зазсскоазсч саваскаске 30740
КсЕксзадаас всрузузаса савсегсксвуа зЗавасссзса загс ача бебссакчко 2800 кесззачаса авчассачзссУ ачаєсазасс еєчесСасазчеа зесчасабза свсазсаче чОове0 тчакзсЗсс аасозттзся СсЗазасакс касазсуавас кксзазасач зуссасавни 10380 ассасвлазчва соззассуася асосазацчац зксЯсзачяє зуасасосек чзУуссошскче 10980 коузочесаас засос УЗ сосочсасечс стасзссзаЗ ссскозуаазя севачадсде 31849 сквсчассує зсзасковув збассзкука сосессасає додсаєсзва ззссоудеосе 19 зазчасссовса СсЗсасасає актхосесай зескакоачеч зсусавачеє Сбазоєсгах 11159 чзУссоуссаск асавусекко сзавдсзчассс агетектазя стзевсзаЗзЗ сеча часа аа сасацсссз часасеаккус чсзсачссоаЗ асасазасає зебачеасови зрсевкчею 11280
ЕЕ кЗзсаа зуЗЯаЕКесх аусезссадче бсссссавоз ссачесаввос сазібассса 3330 засосчазеє звссссчачсс газазсссавз ачосеіазсуно «ЕКададскс сзвасссаска 11400 зсаасодсса ссаусУбасе зазасссзос сеечастацча своддодосся чассозсоче ї145о вакачсттос Кадецдессаес сеча осссасстота срдазасазк госазедаце 11520 азчаскессс сссадазача сазусачоса чеудазсссва зоазсавнузчея засгатое 11580 сксазсстесь сусодааасу ссбузсстай зсуву Сас бацсвою зсзааосаав 11635 ззгзсссявеЕ сзсвааслача сзкассзако ссвезчсаазз абазстааачь аскесавкксак 1ї4у705 сестаатата аксвезсусак кессзататає аскасазвкеє ссзаврчавоКе гассчесуєс 1780 чтасцевакс зЗасессасав забдаатсссс загзчассссо бБсвассса ззабдаваси ї1850 асасцесаик абзассеЕссо сзабссадес сзесасзуача акта как звик оасачс 11880
Ффсассаски ссзосЕсзга асбскасака сассезЗзазаз аказаиВКсє зезакацссса 1940 зкЕкажнасаєс чкахаскках зазуззвсзає аксссузаау заабасецес сзаасассса ї2900 кЕЗасазлає аавсззуєсаст чсассвтаус сслачсеавава зсабаласкє акгзасчсав 12059 чЕсхавакьс ззааасасуЄ сааєсзастза сбабабсвас гозсасакка ссзсечвеоа 32129 затассзауь зсзаессаї засоснатаєс асзусаЗсся зсссссваЄ сассадчевад 13180
Засссзвета застозчауає сззсоасасзс асавззасас йсасассакс ссассзаввос і884й соежсазсза скЗссастач зссзЕкКсгта счсзсазасо састочаав сазосовастх 12350
Стачаєсзазсв ссавасодає зечассесво сасастазнав всдосаста бабака ї5550 взазсЕзесках дова а 12351 «хіх 4 «Е3їз 30 «бій» ВВЕ «Еі3з Штучна послідовність «202 «па» Праяймер 81635 НА «ЗО0х й ктзсвсост азчассоаца савоскачаде 30 «МОм 5
«еїїз 7 «ій» ДНК «іх шШтуУуМмна ВПОСЛідсвнЯст» ся кайі» Праймев 815365 ВУХ «ЗП» 5 часссвкаєс ссксссзасз счзааху 47 «МО» б «із 25 «вій» ВЕ сжій» Штучна послідсвністіх «вах «яйа3з Прабмеюв ВІБІ1я 92 «ЗО» Б заєтесасаїє сеЕасоссви буоезЗа 5 «ій 7 «Вії» В «ід» ДЕК «йіжх Штучна поспідсвнійть «их «даЯз Повимер ЯІщіК ВУЗ «480х 7 зЗавзчсосвая Єчедтааоує засаакса еВ сиїійх В каїї» З «ній ДНК «вій» Штучна поспілсвнастть апа х каа3і» Праймер З ІВЕва- ОЇ «ері» 8 пчазоскссск зассссадає Бакксзузчаи КЗ «їй» З «дії» й «аз ДЕК «Вії» Штучна послідовна» «вах «ва» Нраймер 5'ЇВЕпВа-ої «ЗО» З сосстазаїєса бозагісвсв сазасскоса зо «ій» Ба «ії» 728 «йіїйх ДНК «е5ї3з Штучна послідовність
«ЙйЙх «Вяїз Човщімев ВІОВІЗОВУЗ «0й» 10 тачкссезаз ссабсачсо збесааасо и «свій» «513» В «йійх ДНЕ «аії3» Штучва послідовність «ах «ва3» Прабймев АЕЦПВЗЛОКИХ «00» 13 сасеозсзії сазкссзаєо асеозасав 8 «йійх 18 «Хії» 80 «ій МИК «їй» Щтучна посплідоввісте «аби» «ша» Позвймер З'РАТКВПаЙйХ «ЗО» 13 чексостссав зассачссау ЗО «аїйх 43 «Вії» о еиїйх ДНК каїі» шШетУчнЯ пшсліІДдОоВВістВ «Ва» «кіз Праймео З'БАТЕКЯО Є «воОб» 13 ссачессазус сачзсбавссв ки «із «хіїз ї5УО «йіах ДН «813» Штучна послідсовмі сх «ВО «йеЯх Ппереддачувавз сгсммсідовнійть брамнсфоюманев сої зва. ві.9,3 «ох 14 зсассозксс садазччзУє Зазсасласья зчаззеасяасе лдасассчуууа сеосасекоє що зстссавзщЕс ссзасадласа зкзаптазає дазакаскас сгассссвкса сват таасе 15 засазазкса багасассоц гасзачакк аабсзсЕсказ збаабссвбає засво Еак 180 стассосзакста зкКкассїсаає «чЕЕссаїса бакаккчцзсч азазаккайи вкскабсвавка. й
КсЕсзЕЕтаж асчЕгаЕкас заївастайза бакккклавс: зкзсастата сбазазакєай зао зсссасасза сссчасзак: зсстасвесва бубаксстсна ссззазабазї Сазсзазацза 35 всаваксксза зсКазабсаєсеЕ сгсзасазає ачавазекУї зсзавазвске БІ такацчі захо чсавоззаад аспоесазаєса дасааасаву сбтасзососб зазассзача сасбезаВе 480 збсвасвнаса здсзаздієсса зсоузаазаса ессавссосба здадассавссвз буссатавсе зав таздсссавас ссзасаяазає закеззкас сстабсасс бсбсбосЧаба забусвсвав «ай ккзааєсаско ачаасевжсоб боеасаваазчен асзузасоасус сЕсвзеваєта сосакззвосва 5БО їзасасасту зсчаясзчасз закессаазо зсазЗвайаєь засесяипксс ааєсбсссвау 720 савсеєсксва десакасаас зуб савкз асесвуссео аасвасвссе ускодассав тво
Бваксзссяса Ззвзазссасає актосззоеасс састаакакс азсуаазсачо ссассвайсс вас бгзсасєсессс аачаттесес сзасзастке сабссзозач сСбЄзкдаааосв сточасакука що З касучасаккх ззасасцаса созасвсосса зарасссзса абабосазаа Габадвасах зво ачзсавкзазсУ ССЗзЕлЕсачце чссазасасе авсесозаєв сзкагсачеє звссозвасасу 1628 зЗсазвоасавкс чузасвесся сцссссаказ Ксосасавзвоуєса аозасчассс звозасктай ово
Чазассслав убаззаваєтаї ссескозсає дгахсвазоває саваассвес сассзаоюва. 1159 кастазсаст авт гастазавЕс Саксксїказа сабсзасвеса сезсевасв ї200 височЗазай асактечсас сгазаачаве сСсводвесвкЕ СЕссссбозЗ ЗзуЕдавшкс їз ссхтцссжсЕс даассачесаз Зевссаїсає ассзвавоаїх апдсссчазї зб сзавах 1359 сачаавжсрс зсаасеєчацча ксбасадчоаєо аавессзЗссс кезассусас васабкаскс і380 ассячаєсс авихузчьаа зксасочаесс зосессвава зкБоксаакка сазееказсх іа засстсатеє чзукакезацї зайзасвзазеЕ содсчссабо сссозоасдсвай содоссзсаса 1509 зусксабаса ззваззусаце сеісєсзсузсз аосчасозаз зазсусавкса асскзеводе 1559 свасоучакса здакактек зсстазацара сзЗавевсота гази сакдвасеха ч620 кзакствзуа ссоазаксавУує сесссвобес асачезазої сасссазада вес ї689 каозксисе ЗзЕсасаттчє бзеказеодла аавакаєсає сзоассассуз ассзаасаса 1740 засассазає згозассаця ссосазасда здакссзстзЗза бсаїакчзасс зазасаасаава зво васавабсца зссассааво сзоксзсоїї сЕссзасачао ассеекеЕсас савсобвцаєа 1860 саааазксв сваЕсскасоас даассвасаа ссабасааазв зкасссаята асассвайаа 1320 ассззаззак асачасазЕк Ссасавсвся СКакасзчата звазавоксас СЕСКсоваова 19589 васксассза СЕссакзадс соасссясас сззасаавьз зсазааднада абазазазза 2540 азазавзасах ачдсасозаче вссссзааваа згасуаааєа састссвавсо свабадуйс зіпо стасовессай сСбаксассва СЕКС сваскс сассусєввак ссадаавваваєа азасоадтває січ
ЧсЕзазаава бакзазссочї ззвсоаксакс ааассесзас чзасточассс гасзчасдчасо аа чеказавасс чкозЕсчссу всузавова забвазсозс зісазадеєяо сеспсаоссоа за сасасаєчаоу сабсасоеаЕ савстсазаа сасаваєвих сгтсстсавс сізазаатай 2340 чесаассаце сзваазааслас ссбасзсча дасвасоастс васасаєсчєя ссассссаве 2499 асквзссасе десбсвисоус сстадессво бсосовоста чесубосссо КосЕсЕсЕКе 2450 усЕЕСссКсС абзазасзає асосавазеб СссКсбссво забесзуВЕ бсзвакткске з520 зававюстсава заваєтесотке їсаавсссов сбассзозаве сзазасаває косо 2585 шетасссстоє сазазвсоско засеЕкчисЕ Соч саавос ссвексвсає акакоасеосре «о кчзЗЕсСсазав сокускаакс схзоаассдчай засозаввесо козак зає састачаєах а сассссзвзасс стодчассзузч чесссасваа бабссвссоза сЕБасссваа Сзаєекаазчі тей кктаЯссзвасє азгсасеЕскт соуабсквоасаа ЕЕссассса загобачсеяє базсссоїач во скат оасаає счазвЕтоо дчассааєста азс сро вкЕсвасачач абсессвсзу 2880 зопаасаасаї ссацЗазссау саБассосях асзаккцдєск овясвассив задо 1940 сосссазсца адачасузує зескоазасдес Сесссесвоа сабсслеосо боссісасав зап засто ЗсстЧчачеее зекоссузя кузУсУсчч ккацеске ссаасоков зво ксесззЗзасто сассасостса кокзассзза ядосскоссссесо ссбосвазес зЗазвсзаскза 3120 сєзазсзодач Чассзаазос согковазоууа асададсесає сзвосасасії суседесско 3180 скззовзаста бузавксктас ассзаачовсе сссзїзазоЯ саавазссосва ссозвасвиох 3250 сксавссссо боаззасзсУ азаакссасе скчсесаасає зазкчасоме сбозксвсая 3300 ссзксвзавсза ссксвссски зссзаскЗ взузксосбеЕ Фокс саЗвс гака ссаву зай вгдсадасив ссвссєдацс сессссвзоЗа асшссояеоасо сстсдчасва за ЗзЗоадає за8а кезЗасасацес сасічсдаає загсассасза асбсацасссає саасббаавєе свссостаса. зава ссазасаскоа сссзчасаєс басавассзава чаксзаасраа ссксачавадс ассазвовеко 3540 цзссаасадас чезчУсксаас сазсстазуза позакстсяає асксастасоа сссззозеаа 3500 кхаскррес сессаввескає засосссяса сстасссаає сосазаєссазео бесеоваста зако саацозаази сівзсвсстсс сачісаєка зоЗасауссєе засксстасс васаєвссся 3780 акаде саа ссзкаскана сссоовоссв авссвасссосва Берсабоачас сесароедася 3789 сек чК застосо асечетзаЗчо сссавассоає зозуФзчачає сассссозсва зв840 поиссссясзвза сасезоссзчо зассзсясса асбссссаес стае ЕКсавесиКу 3905 еозЗазчссає стусаккзса часозачасе сдачассьое сгесазавоо ккЕчзсВувеки 3950 сЕчисЕвсає сезаззаоує секоадсвисс сасасбаває ссссоЗЕса зазодчачеов 4050 сс сзаса дастузчсасєс заксасассс зусаоасссвоа ааасвасовс зосассаавов зано чсескозбаз чассссалое сазодсавса зсузЗачЧсасе стддзасуаєс састсссаєа 4340 кастсвасса кессовссово зсЗзсеасссзцс ссдосовззаас сазчеячзесса засссстада за чачсассзває чесстсасця звсесвесасо сбассасвсо сасзавсвзес ахссцчабосац за азачааксас ссауаєбсоо Ксгоачезчавоу сасасасаєсє Безвасосада воза 3530 ссзазазззес сазцсссасс зУсодачаса сесссздаєса сасесессачЧа спосо 380 стгтасассає базБбсзасаїо ваБецсаас Ссссосзасу срассасчки зазавосое 4440 акчискссас саставсска зоззвіскася бсасачекас сзучкзавача висо ска 4505 чісазессаа саачасазсо засастсочся зсссассоас асбсозакса КсссосвБату зако шссасєсаксза сасозсасве асосстсоза бовасесазко свзсессаса ЗбчаосасВа 820 зЕзссЕтсач сссодчозаї час есаса стазссриве саздЗкчЧас совагчаску 3680 сесзсасібай заскозассс здасссочаус зесссацза ччсозсчаак чексковкоа 37430 стескссссаваа сгсазасзУУу беозачасня збеедаскоа ссвсскабаба дассцсовве за0 стсвайссткас сзазчічссес сссзасгчач боссзсссозза сСзчаздазчаза заз сявсаз «ко зазачзаксява Зсасоссзаз зозссоксова зсзазчазчаа севассссаа засесоваск захо ссадцазачах саассуєоза стоззассува засво збсавстчас акзасовке жав азоазвззаа счасакао авозчазчавсо зіЗссасасо сттззаазасо став ааче :049 чскасссайс асассссєскас сазавчабаз асузавасав зсксввоцусє басасевзає 5іва зссачтсзаз азчкбасах дчвазассскс вазасссеєзЗа засссавасес зесзрасвиа 5Зіво зсдосаваса боазасачіє загогосска чуассуутсс ассссдуєса стсесадесе за2о0 сзачесссає коддсазвазкицс ддссаєсової сасавксаєске оКессСсоас асгазасчеку Бона чсхзз-зассаз сотсззасчач заосесзз3 саказасчає «сссавачаєс вачасоваваФч 53 всрусзрас арка є закстшчаче БЕскрзаала зазаєсаоЕ чссзаваааз 5АбО сссЕкоссва чав сасссадчазза засрневрза сазовазаа аазссоча аво чичазезсава сассчезиазс азачайцеса зазваєссазчь сазсоскся сосасчавсх 552О спсззтасза саччссссав зосбдасасса зсесачсвак зактсекчс Фдсзоазвсязах за чадкесасву сабесасчав зсакаєсскво сечавсястс азкоавевсає ззазсвааоу 5540 сптосзасесе сзуавазаздссе зчвзазододзсуса косссаєссяс сусоссосся єзезасЗоаа 5700 ззаесзссас сзаззакач чассксався збсодесквкс стзсбодаає здав 5755 зсчсозахсає сзаззазсаз засзааєсвсс зивсвасосї сесбубесех дача щи стзвазЕссс всзазаауєЕ сзбекесчсс скзубовссоз ссасавеоке сзсасзасту ак сесасазада зазссастуа ззазчскоасвя бсазссасоса сдазоазсазад дасваєвоку пай всзчваксцав здессачсазс СЗЗ чачея зачзаЗУкева сосавасвзає асбсабсаєске вп чсавкцаста сасездесвасс саззазлазач: акчачччева ЕКасзвосксих сосавосоку вп чсесакззсза аасессвсуаз ззсавсбсав сбасчссвє козобакчсе всаасстату 5іО вазчачазазс абасаєтоає ааавнєія асавессссу Бзазассавс ззауаскака БіВО
Чосастасає асссосстссог зебччссазсЗ сСуассвзаазла зссЗУаагає гКтсссуавйа 8240 січасазацче сБоазчаїсЗаз зсафррмоавава ссзаазасасо ассесзсаУсе часесечеуу 8399 ачсхсккоас сабозаазаа счзвусазіба дссгзаксат срадаастсо чісассзаса 35 таакжессаї Сзеасусасса аассасеуве стоссадасу паза сКессесузЗає 5320 тЕгззсвсса аавасссассо ззазакасас засасбевяє гбасаззсеса спочачався 54380 чакстчссає сабаазжвакйс зсазазаває Ксбаквбеосс ссаассавее Єгоаає сов 8540 зкказазасо соказаєтає сезсодозс аскасцсаєо ассасазвва вЗаазаєсва 550) сузсасзада сзсссосазі астассчаса акгкраскуй завсвсазкай чазвазсайа щеКО счскзсасзча ассчасузай сайсасаазо зсазаслайц ссзсосасає база БО ччссзчазакЕ асссазсакк чзвзусаачакс зсучавсккс Казсеюаче зечасстсав 8780 кЕсвадсссвв Вс сзава авакасксав ассдссопає зкоусаодво; Зувссавстов 5845 ссзкскаЕ ЗесеоссКК Чосзвсасоз чачсссазуу скозсодчесає зсеоссовава ез90 свассссзста сасвзазачії: досоасазсза ссазссовас сааасссаза аззсааєсах БЕ ссвазчабока чсаксавзуза ссодасчссЕ зодазалайи сезбучайзї абссасогазу 7050 стсачсзача ззсадассаа гасрорсаєс згасосавсс сасзгосзва заспавоазває 7аво зсасацасас аазчассосссак ассзосачаа сзсзазчазазч аасзсзсача зассдаваая тай чаацазссаз зозавзцавав зазвзкссссєзаа засчсавуса скчасаасаа свабзЗававау тав задвазатаа чУуссозезаї счсвазова асасацауаа сасасатаая збсузааааєя 7260
Кзвзовсзсозза вачсзаосссс абсасзвачу забсстабос сссастасев абсствеках 7320 акжесссоез чесавєтсскУ сосесзчазкк ссесбасаєз ззувассаас БесЗчсасее 7380 зсчЧчазаасва чаавазаксєх зоакоагавосу вссЕкесска зезсвосаза часвсваєте. 7440 сзаазчазвакс сказу сззакссяас авабодасвас вассопсваса сло 7апо састсосссзо зассоссесча дсазосстча чягсЕзачзо сбаячсачва заесозавкца 7т5БО зассчяисас асасссайєса зсасКоссЯЄ зксасесайс савекосівЕ суссвувасх тео «сщшесссоази ЗзссточассоЗ тесссУуцась гебосдатасс зЕссррючаа боскБОЗисе 7680 кксЕсЗзасод дінзужевсКо Скасасазвс азазоаЯасса зссадссаза заазеззааза. 7740 всксцстада дассазуєса бобсаачаес ззайзчєєхс зусавссбЕ ассазазакска 7880 ссазззасе ссссзазазе зузаачсаза сссоувесаай оссгзссісва задзачезає т7вей всусасссаа ССсзаєУаса соуззсаздсас чесовсувсс сна сснещо етос 72
Ксздвастас саазчсксастс секкакссяї чсзсеусусаз зебдссавоес сасассваєс тя ччасастесус чаказестося суссочавса асосзчсзомес сккчасзчиса сазстаосав во сазссзекас азкзасссза ссвоечсекає сзоасвастає всезастася стактсЗзека 105 чкасвасаса забоссочвас чБУусооздач асподаєкеї ачацчаскооу бодочсасав Віко совесссвзаз сзачауссда сазставскеЯє оскачвсаєє зесЯсескеї сбсссавова а5о казасстстазч сасевсосза гсезсвсвує збсоасавссз весосззчайа бссвеоезсада 8250 сосазскоессс дазазасессу асадезаскс сезвудессу зсесюруусв базавзацчаву 8340 саксаодесо осасасссза коЗасакаєс чаасзоаваєо асчасссвзса сочасчосщев Сея сосасачесає гастасіачу саууоасаєса забсаєзчоса сСсасовасеч чес од 8360 вссвзавкес зсекиссає кгтасуучає сазбазччасчнак чезУусвесас дасваєутає 8520 счЕкосссад сосцасбсвоаз зсосчсасад засос адсвссоссаї абадазУсе 8580 ссссаасасс сдосаєсваса вксаасаак збе сесЕЕ засоузасву засрссоссса 8640
Бадаасиссс ссаваїстує сзкосзссч стасзоузазо ачсодавсаз бзасацеве 89700 ччасдчачасс ссессасадчя асззвозасох босасствоЗ сазазчуєтьа зссвсозсою вто тазчисабака сссасУсвсо зЕссачаєсс Бзусзаквас аусУустазеа гсассаЗаує нг
КсесзввУвсо боббдезсас агоссацсояс єцазЗссаас ваасзвезаєтсе сабосозсаЗ чо саскзосссаз абсоссазсва гсазазадаа скжЕскКсКЕ азакцассссу бевксксвУу вай ассзвачавссс зскоазазчасз асссосзбказ чзссзавеово кссазсааса зсакссазчав ОО садочках акбоззакас ссасксзек: сосассзваса косассачає абсусаскся зово тубсзазчсас засос та сесскаєсса собсавеуес азкбзачаса аввкосскссах за стксксосяве зсазсвссач сзавсзастас абесксзавх аск соває стачсчаи зх с ссасскс чавачсчєеса акассєссає стссесоста зусззвзсасаз сазасчсеад зач заакЕсксс здоввссеку чазсчасває сузвссоаскс сдаасесаєко осУусевосвоє Зз30о засчсссцва зсадчачьскоа асо зЗазазач васзсваваз зеочівакУ сс све 3
Ехсцсссзаї сачаєскдоус ссвзачасазча басзвссчзас табсзсассоя абососаскис заго савассттчсє зачбаосксх сстзвечавке оса чак дзазазадчч вита восва зав8о зЗазааісаза сазкзсставас зчасксазсза сздоасячаво ссзссссаач аксссавосх 3545 ксдсзачасс засаззсаас сазассУуєзз абочвоздаза азкасодасв гсдесасеов. з505 зазачзчочає зчзасзецссса адазазасска Сзбеасасьс ссуозщевзооє КочасчаУса зва стакссвааса баоссусвис здааазагачи сдазссдвав стсазаусої зоасвадакв. 720 ссазссцача зассасаєссу зазасаоссса зузвссосзач асссассгса Ссадасвоза ТВО сусизазасвс чадасачесв зсесаосскзч засво са ссстддссвс весадоссс зай вазсссозко сдасаацезку сссабсассо асзссасксо сссеЕБацеса сазасаєках з500 ссзчсзвсезас ссзчаасцуава ассссзчкя зкчччзезасс скозаззасса зуавесковада азез тоачсовбусс азассвюдсв асо сссзааадац зазссассся ссздадавос 10025 шпиксдстаза збчазавача ссзазчавзинаа чсззазфющас аачазчзазазча ачскозчавса 105885 пазазосддас абсогобаса дачавассаа азаважее дасаскосеє сбасзавске 58149 ксззсвсозаї зазстссяазч сізчабсассва сабадссабо збессасасбя сздзсадаасуя 10200 сзгссасацс асгсаочаваз сббассгвсс бузаєсссазс Фсчессссоа акчссавбую 30260 кЗсЕЗЕсЕКЕ чвачачісвя авзазсзсає ссссзосася ККосссссас абчасчозау 1320 чвзаєкзесакс заачазсчзса асттсавиза суздостаксс буссзааастз сзазазадаса аз сасачасзса чагазасаза асаассвосу сЕсбзсессе зЗевокесоссч васоЗаааЗе Усзав зузачкссса сазузазікс чзсСексвавос сззсеззас басвеЕсоске зсассассоє 32509 зсасавачаа Ззозгасзчас авачекоасЗї сСсассвеівсає зазассзацза зсзасассов 130560 счвацчсбоаваа Бссззсвваоб Чдсабсувоза зуавабссас соааасваса ссзбавсскя 10650 савсзавсоас астзсдалес зазаздалвзса баззузавасе сасаєсвсвс зеваєсявоу 10689 ахтасззкуда зостасозазв пдсзаскобсс кугасосоаоє часезгусає садссезвзеза 10745 узаззазазсї сасассзва чзасазача сазссссузсе зааксгтааса зазческакозу їп8ро щезстасаса спуксзесова ссччисвЕчЕ сассавачеач созааакасе ЕБссзвааае іа сзчасзаспеєє созассзача сСсіосодазавас сзаасдааса бссзесасся зсазазсзода 109520 чЕКасесста асозазузах чзазсвассаз ссбаатсасо сазазчобовя Есзестасод 10980 азаксквскЕ ацазагасве ааїаксстУє сЗзсацззсвка стззачааєс зчаксезсках 131050 сзтаназасє асавзававає сеБавекЯасс Ксзастаккк квачассчех вкбаодаюу 31100 срсавассає ссзооаасс ассасосаєо ассзбувоса адавчассаву саасасуава 11150 сассозсаче зсосассзаса асссасссоа звасссзсва чадавясаза сзксдеасв. іа вссзчассзаз савсасазач асзаавсвавау ссасчсавсає Єбазцзаєвек зоссзааасЕ їх280 аскцчазвкавс часа зсзоааастс кзЗасазаачс абзсектсаа сСбсазсссва Хо асдцсзетзЗ ааасвсбсаза зосодссссве асЗсззачаче заавсасеса овес Уух 11400 ччскоссКК Зсозасасоз чазсосзаця кучеоЗссоє зедссасоо аястткоссу 1140 гасзаазчкочу стасоазосас ссвасказвае Єкавасуссс зззезсаз зсдсоаЗссяс 11528 скавсставов ссучссгоса здозаавсссаз зазозусвакєса боссаацчясоє засабсоаася 11580 зеЕссвасас сзсузававна асоасуузвазч сабсасзкза чЗсссассавз завосачаєса 11559 зхасзсочаса сасєзсзсаас ствсзсссза адабзаавцаа сЗзкасачабса саззакшста 11799 хзскоссовазча акасузачаа зчаакасабсаз аваєссцчазаз ззначаасса чоасчавзава 33750 внасосєза зазсасвазс аскзасзЗаса асеавецаазва авадазавеа зас а 11820 сізсзазача засатвувУуу зсасакагвна зЗугудазав збалующева азвосавися. її тессасааза завассссаєс сссосастась бЄвессосста басбеєксоса бассасееве 11940 чессстзачЕ ссСсоставає ззгозавосаа чЯсссзасВс собцваваса вуааааааке 125900
СОжщезакос бассккоскКс чзавчсасесза зЗаабасаасс ссзазЗазчаадї сСсчеаачКЕ 32059 зчзкачзасстьсс акасскссзоа ззвядачасс взскзачаск азчзссазсаба сааозвасесза 12320 сасаосссосо зеубеасзабса содссаасся ссасзксЗаЗз асзсстаєсвзу гзадоеїксаЗ із зчзасацдаассв свазасвосао вачичсочаї гааЕаассса звазачекас зазаксаазеа 157250 кисесаЗзеса чссеседазо Сечецчччее сеасзассчає аєсоссксася ссовосссса 12309 чаазастазЗу аасаЯсссвст зсбозчасавяє суазауаєе зкетасусУє засаксазчса ваза їсзаазчачесч зосесазовс спасвскаса сасазвоккУ стстазвсчесса судацасяса 178820 зззксставзму сстзсзУсуя сректатазУ сесбсозавс забссасоса соч аса. 12480 хчзаЗУсЕЕса зчасасасза сосккас абкапасася чекозаваса засасчосоє 12549 вкуусакчакє чес ерре оасешасуза соБозЗазсво ссевеєрссбс савазессацзче ї550 пашоссзоату асссозузвсу зуаазчасессо заасссзчацо ссасчузасеї: абдачскхах їізево адстсочасс саскваснс засозази застав созоостсков сквовгацчоає їз щиссаваассз чседасазкач сескквасо ссабсосзвиу сезчакосках соусу дах 12780 заказчскасчч кзЗдасавоавс сссскессад «аацасвовес зассаваачча зсссвачага 12849 зачсазаста гззсессоач ссссЕкосаз аазеспосоз кссвзазусяс зазззещева 12805 чзесрмзасчаа ссвавазеч: соззЕЕЗЕвя саадаваксї сзассобаса кавзвузаєве 12555 ваезсайєчкса ктсассвсоа зрагаассяд бабаеоссяла сасзбастаєс заїшссссади 13055 ассскквЕса ссоссзбабо савгосгасяє сзсазаатаа сссосУЗеча соска ізо асссвучасєо «пагаасзка схассаслає сЕстаосчакє созвссЯстя Саудавекав взіяй васасчосско сочссцссас сасесосаєь ссасавсКеб зозгоугастх зазааззкаай ї3298 застссакочї асксозакктса аасасоУсака сгсчсаваза зсзасатсос зчазазадяка 13250 сзакскавахт азскбзисоаї аазаказоза зководсаєь зсазбосавв саавававсяба 13329 ззсткассча сзсазЗссса васгссзцазе СасЕксазивз асізассава Єсачссощка їі3380 свскзссзба закоааацас гзачкасчає акгсзгЗЗкУї дабасавсаус дчссчоавеке їз440 скачсассоя зебачцассс зеккаааєссо сдачдсвазесз сабасвсавка часасасзаса ІЗ ксаксетсакб закасссовяє забазссасо ассзавескЗЕ ббЕсасосвзЕ ззабвсаско 35 зЗаваавссвУєс заксстазас аззстассада сазасзсзчас ксзасасає сазазасако зво чесавечЕче сассаацеЕка сессбажнусс авкекческЕ чесоувоачаса вущикевеух 13580 ксачваззас вазусчусоаа вочавассокаа заоч десакзаскс бозескосоке 13740 чесззацезс Сбучеоказоа чсЗсвувуУв зсгазсочза сузазсадаа зеусесЗаЕ 53800 зезасссяя: сасезасаче ссопзасасас сазасссавка ссЗзЗсоаЧчее зсзазссоа 138650 скассазкак ссстоссвсо сссвавачі сззасзавтає сабсзсззач ачавацазео 13320 кечеваастай сссазбузаз ссоачассахя бозссесав зекскаацсв кисвеакає 388 сосаєссзаза чагассвача асбакчесвос сасбзссссвза счрасссаєса ачсбассоса ї4050 чегавстачє абссовассв дсресасав сеасУсвивео савзЗсувсс сазааозсии 14100 звасайєкасс асазкуссоаа азазасзузча аачацеЕсссх сабодасаво сссасавоза 14160 кхвсвзаскса сассазузая засаїчаваси айексасоа авасксксазо чузазазаса із ссчезаксскта сгокчесаєза Заададісва сестоксдач азузсчаакса дасасзсаво 42858 ззасазззаес асзабаанкак сазвуєстабаа згазавсвбое бавбосстсвї щбзорече 14349 зассчачаса засубзаваїє КЕсоеБЕБЕЕ ІЕС ссСаса зраскевсо веБОСсЕЕККЄ їз кзассЗсесс заззазссяа ссЯчеЕсЕсесс сабасчбсаза забчавасєда босавечасе 154595 засасквааккс БосозОочЧК зазсакзакув сЗаевссов ссссвусвас счзкссска 14520 сасачсосвс забачссоав зрососовача зазвсбевоза ааосудоася свв. ї«5890 сасаацасає зесвусацеся ссзстокайа сосбазасса васовавасс сбадесацчеє 14540 чисту закс ассасскзка сааваасосчсс асзасстасзча вавсцрвфача азазасасава 57050 чезизЗкасст сссдссвсав стссцассве ссгаздсетссо чеЗоаавссс азвусазазеа 147650 сстпессактї ссстасаєба аладссакєса брассттссс свесосассї сабеваєкка за82о асззсузачі деассаєкса асазсзбсссє усстазкасся зсжсазссоз абсзсувикеов 134880 часактссза сгссассасз взабчазасоаз зсазазабос азсззссесЕ саабсаєесс 14549 кщеркчаакцс посксвааач чазисавзаза Сссавсеакс сзсчассаск закзававеза 35
ЕБсЗзеастче БЕК сазбавссав осо ЗзО зогтассссз засос 1506590 дзазасоазчай ссазсасакс «часова Зсавоасвасо сосбобсачає сзавкокусе і5вїа зачзсессесКа срччучасіс базезсвУсЕ ссббкозазу заїстабтай 15179
Claims (15)
1. Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до гербіциду і підвищену стійкість до комахи, де вказана трансгенна рослина сої містить послідовність ДНК, що містить в собі ЗЕО ІЮ МО: 14, де вказаним гербіцидом є глюфосинат, і де вказаною комахою є Рзейдоріивзіа іпсійидепв (соєвий п'ядак), Аліїсагзіа деттага!із (листовійка квасолі), броаорієга птидірегда (капустяна совка) або Нег/оїпіх мігезсеп5 (тютюнова совка).
2. Насіння трансгенної рослини сої за пунктом 1, де вказане насіння містить послідовність ДНК, що містить 5ЕО ІО МО: 14.
3. Трансгенна рослина сої за п. 1, де трансгенна рослина сої стійка до Рхейайоріизіа іпсіидепе (соєвий п'ядак) і стійка до глюфосинату.
4. Трансгенна рослина сої, отримана шляхом вирощування насіння за п. 2, де вказана рослина сої містить послідовність ДНК, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності зЕО ІЮ МО: 14, де вказана рослина сої має стійкість до гербіциду і застосовується для підвищення стійкості рослини до комах, де вказаним гербіцидом є глюфосинат, і де комахою є Рзеидоріивіа іпсіидепе (соєвий п'ядак), Алі/сагзіа деттаїгйа/5 (листовійка квасолі), броаорієга пидірегаа (капустяна совка) або Не/іоїйіз уігезсепв (тютюнова совка).
5. Трансгенна рослина сої за п. 1, де вказана ДНК містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з пар основ 1258-1288 послідовності ЗЕБЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1223-1323 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; пар основ 1173-1373 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1073- 1473 послідовності «ЕО ІО МО: 1; пар основ 160-190 послідовності БЕО ІЮ МО: 2; пар основ 125-225 послідовності БХЕО ІЮО МО: 2 і пар основ 75-275 послідовності ХЕО ІЮО МО: 2, і їхніх комплементів.
6. Виділена послідовність ДНК, що містить одну або більше послідовностей, вибраних з групи, яка складається з пар основ 1258-1288 послідовності БЕО ІО МО: 1; пар основ 1223-1323 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; пар основ 1173-1373 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1073- 1473 послідовності «ЕО ІО МО: 1; пар основ 160-190 послідовності зБЕО ІО МО: 2; пар основ 125-225 послідовності зЕО ІЮ МО: 2 і пар основ 75-275 послідовності 560 ІЮО МО: 2, де вказана послідовність є діагностичною відносно присутності ФЕО ІЮ МО: 14.
7. Полінуклеотид, що містить послідовність стику події трансформації сої 9582.816.15.1, де вказана послідовність стику містить принаймні одну послідовність, вибрану з групи, яка складається з пар основ 1258-1288 послідовності ЗЕБЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1223-1323 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; пар основ 1173-1373 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1073- 1473 послідовності «ЕО ІЮО МО: 1; пар основ 160-190 послідовності зБЕО ІО МО: 2; пар основ 125-225 послідовності БХЕО ІЮО МО: 2 і пар основ 75-275 послідовності ХЕО ІЮО МО: 2, і їхніх комплементів.
8. Товарний продукт, отриманий з трансгенної рослини сої за п. 1, де вказаний товарний продукт вибраний з групи, що складається з кормового соєвого борошна, харчового борошна, соєвого білкового концентрату і соєвої олії, і де вказаний продукт містить ДНК, що містить ЗЕО ІО МО: 14.
9. Частина трансгенної рослини сої за п. 1, де вказана частина вибрана з групи, що складається з пилку, зародків, квіток, пагонів, коренів і листя, і де вказана частина містить ДНК, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності ЗЕО ІЮ МО: 14.
10. Спосіб боротьби з комахами, де вказаний спосіб включає включення в раціон комах Зо трансгенної рослини сої, де вказана трансгенна рослина сої містить ДНК, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 14, таким чином здійснюючи боротьбу з комахами, де вказаною комахою є Рзепйайоріимвіа іпсіидепе (соєвий п'ядак), Алі/сагзіа деттаїгйа/5 (листовійка квасолі), броаорієга пидірегаа (капустяна совка) або Не/іоїйіз уігезсепв (тютюнова совка).
11. Спосіб захисту сільськогосподарської культури сої від пошкодження гербіцидом глюфосинатом, де вказаний спосіб включає садіння сільськогосподарської культури сої, яка включає трансгенну рослину сої за п. 1, нанесення гербіциду глюфосинату на сільськогосподарську культуру сої, де вказана сільськогосподарська культура сої включає рослини сої, що містять ДНК, яка містить послідовність, вибрану з групи, що складається з пар основ 1258-1288 послідовності 5ЕО ІЮО МО: 1; пар основ 1223-1323 послідовності БЕО ІЮ МО: 1; пар основ 1173-1373 послідовності «ЕО ІЮ МО: 1; пар основ 1073-1473 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1; пар основ 160-190 послідовності БЕО ІЮО МО: 2, пар основ 125-225 послідовності зЕО ІЮ МО: 2 і пар основ 75-275 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2.
12. Трансгенна рослина сої за будь-яким з пп. 1, 3, 4 або 5, де вказана трансгенна рослина сої містить вставку ДНК, що експресує гени СтуїЕ, СтгулАс і РАТ, де вказана вставка ДНК фланкована послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1 на 5'-кінці і послідовністю 5ЕО ІО МО: 2 на 3'-кінці.
13. Спосіб боротьби зі шкідниками соєвих бобів, насіння, кормового борошна або харчового борошна, де спосіб включає надання можливості для вказаних шкідників поглинати вказані соєві боби, насіння, кормове борошно або харчове борошно, які отримані з рослин сої, які містять послідовність ДНК, що містить 5ЕО ІЮ МО: 14, таким чином здійснюючи боротьбу зі шкідниками, де вказаним шкідником є Рвгеиййоріивіа іпсійдепе (соєвий п'ядак), Аплі/сагвіа деттагаїїв (листовійка квасолі), 5ройоріега Гидірегаа (капустяна совка) або Неї/оїйіх мгезсепв5 (тютюнова совка).
14. Спосіб отримання трансгенної рослини сої за будь-яким з пп. 1, 3, 4 або 5, де вказаний спосіб включає трансформацію рослини сої послідовністю ДНК, що містить кодуючі послідовності генів СгтуїР, СтуТАс і РАТ в межах послідовності ЗЕО ІЮО МО: 14.
15. Застосування трансгенної рослини сої за будь-яким з пп. 1, 3, 4 або 5, або насіння за п. 2 для отримання трансгенної сільськогосподарської культури сої, що має стійкість до гербіциду і підвищену стійкість до комахи, де зазначеним гербіцидом є глюфосинат, і де вказаною комахою є Резейдоріивіа іпсіидепв (соєвий п'ядак), Аліїсагзіа деттагпа/і5 (листовійка квасолі), бройоріега бо тидірегда (капустяна совка) або Не/іоїйіз мігезсепв5 (тютюнова совка).
На фігурі І представлена карта плазмідн рІПОАВОЗЕО, що містить кластери експресії генів сгу!Е УЗ, сту! Асі ра! уб Гранична область ДНК В Надіндукування Е Нурколнттяв ей КІВ зреєй 00005 З ще. 0 Інтронпромотору з? аю «В | шо у р КВ
НА. Е. У. ОБ Е за опт щу і опе і ще рОАВоВ82 ше | 13 їь Гранична область Т-ДНК А се ще т.е. ооо веовк у тк я Гранична область Т.ДНКА ою Е | ши Гранична область Т-ДНК А з х КЕ; з Промотов я СвУМУ пень: АХ МООВЕ ЖИТА ха - РАТУє жк. ще сх и В Прометор т? СУМУ 7 в й студе вумо МСЕ ТВ у Фіг Діаграма, що ілюструє локалізацію праймерів для підтвердження 5. і У-граничної послідовності трансформанта сої РрАВУЗ2,816.15.1. ККУ ЮХ : . суму зве щ скУшу «І1ВАХ жі перопе КЕ ока, СИТА Шо | зн пото пор ніна) -- а - каоо 7 і НІ ях ж Я ж ві вен Уввяенжуа ЗАТЕ / КАТЕ нн дн: «А ово день вуз
Фіг.2
Діаграма, на якій представлена геномна послідовність, розташована в певному порядку в трансформанті сої рАВО5У2,К16 15,1 Інсерційний сайт Т-ДНК ; У-фланкуюча область 3У-фланкуюча область | Кк Я нний ен они пн ї х З зале | ї Ї п езтеш ку; і ь - - .ВВІ5 УЗ І ЗВУ докору 81815 ЕМ вотнуг с Інсерційний сайт Т-ДНК ЗІ п.о.-делеція батьківської ЕІДНК
Фіг.З
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261663700P | 2012-06-25 | 2012-06-25 | |
PCT/US2013/047539 WO2014004458A2 (en) | 2012-06-25 | 2013-06-25 | Insect resistant and herbicide tolerant soybean event pdab9582.816.15.1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
UA122197C2 true UA122197C2 (uk) | 2020-10-12 |
Family
ID=49783996
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
UAA201500556A UA122197C2 (uk) | 2012-06-25 | 2013-06-25 | Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10455834B2 (uk) |
EP (1) | EP2864481A4 (uk) |
JP (2) | JP6385343B2 (uk) |
KR (1) | KR102085131B1 (uk) |
CN (2) | CN112273114B (uk) |
AR (1) | AR091548A1 (uk) |
AU (1) | AU2013280641B2 (uk) |
BR (1) | BR112014031900B8 (uk) |
CA (1) | CA2874773C (uk) |
CL (1) | CL2014003506A1 (uk) |
IL (1) | IL236383B (uk) |
MX (1) | MX354787B (uk) |
RU (1) | RU2650626C2 (uk) |
TW (1) | TW201406952A (uk) |
UA (1) | UA122197C2 (uk) |
UY (1) | UY34877A (uk) |
WO (1) | WO2014004458A2 (uk) |
ZA (1) | ZA201409169B (uk) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
UY34878A (es) | 2012-06-25 | 2014-01-31 | Dow Agrosciences Llc | ?MÉTODO DE DETECCIÓN DEL EVENTO DE SOJA pDAB9582.816.15.1 ?. |
NZ726117A (en) | 2014-06-20 | 2017-10-27 | Dow Agrosciences Llc | Vegetative insecticidal proteins useful for control of insect pests |
CN104846084B (zh) * | 2015-04-30 | 2019-02-01 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测玉米植物dbn9927的核酸序列及其检测方法 |
CN104878092B (zh) * | 2015-04-30 | 2018-10-26 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测玉米植物dbn9953的核酸序列及其检测方法 |
CN104878096B (zh) * | 2015-04-30 | 2019-01-15 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9868的核酸序列及其检测方法 |
KR20180043838A (ko) | 2015-09-11 | 2018-04-30 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | Hppd 변이체 및 사용 방법 |
MX2019007592A (es) | 2016-12-22 | 2019-12-16 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Evento de élite ee-gm4 y métodos y kits para identificar dicho evento en muestras biológicas. |
BR112019012499A2 (pt) | 2016-12-22 | 2020-04-14 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | moléculas de ácido nucleico, dna, plantas, produto de soja, métodos para produção de um produto, proteção de plantas, produção de uma planta, identificação do evento de elite ee-gm5, confirmação da pureza de sementes, determinação do estado de zigosidade, redução da perda de rendimento e para aumento do rendimento, processo para controle de ervas daninhas, uso da planta, uso de uma semente de soja, par de iniciadores, sonda, estojos e métodos de detecção da presença do evento de elite ee-gm5 |
JP6822679B2 (ja) | 2018-09-13 | 2021-01-27 | Necプラットフォームズ株式会社 | 電話交換機、保留音通知方法および保留音通知プログラム |
US20230210075A1 (en) * | 2019-08-09 | 2023-07-06 | Beijing Dabeinong Biotechnology Co., Ltd. | Nucleic Acid Sequence for Detecting Soybean Plant DBN8002 and Detection Method Therefor |
CN115449521B (zh) * | 2021-06-09 | 2024-08-30 | 杭州芳韵生物科技有限公司 | 一种同时表达抗虫基因和抗除草剂基因的双元载体及其应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6489542B1 (en) * | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
CA2384967A1 (en) * | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use |
CN1643147B (zh) * | 2002-03-14 | 2010-04-14 | 联邦科学和工业研究组织 | 监测和调节基因沉默的方法和工具 |
MXPA05011795A (es) * | 2003-05-02 | 2006-02-17 | Dow Agrosciences Llc | Evidencia de maiz tc1507 y metodos para deteccion del mismo. |
BRPI0507088A (pt) * | 2004-01-26 | 2007-06-19 | Renessen Llc | alimento de soja com alto teor de proteìna |
ES2743789T3 (es) * | 2004-03-26 | 2020-02-20 | Dow Agrosciences Llc | Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento |
UA96578C2 (uk) * | 2005-08-24 | 2011-11-25 | Пайонир Хай-Бред Интернешнл, Инк. | Однодольна трансгенна рослина, що містить полінуклеотид, що кодує поліпептид, що обумовлює толерантність до гліфосату |
CN101370940A (zh) * | 2006-01-12 | 2009-02-18 | 德福根有限公司 | 作为昆虫防治剂的dsRNA |
TR200805941T2 (tr) | 2006-02-10 | 2009-02-23 | Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited (Mahyco) | Transgenik brinjal (solanum melongena) içeren EE-1 olgusu |
ES2498976T3 (es) | 2006-05-26 | 2014-09-26 | Monsanto Technology, Llc | Planta y semilla de maíz correspondiente al evento transgénico MON89034 y procedimientos para su detección y uso |
MX2010005352A (es) * | 2007-11-15 | 2010-07-02 | Monsanto Technology Llc | Plantas y semillas de soya correspondientes al evento transgenico mon87701 y metodos de deteccion del mismo. |
CN102066566A (zh) * | 2008-06-13 | 2011-05-18 | 拜尔生物科学公司 | 转基因植物中的棉铃虫昆虫抗性管理 |
CA2781598C (en) * | 2009-11-23 | 2020-06-02 | Bayer Cropscience N.V. | Herbicide tolerant soybean plants and methods for identifying same |
JP6261863B2 (ja) * | 2009-11-24 | 2018-01-17 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Aad−12イベント416、関連するトランスジェニックダイズ系統、およびそのイベント特異的な同定 |
UA115766C2 (uk) * | 2010-12-03 | 2017-12-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Трансгенна стійка до гербіцидів рослина сої, яка містить пакетовану подію 8264.44.06.1 |
BR112013015745B1 (pt) | 2010-12-03 | 2021-01-19 | Ms Technologies, Llc | polinucleotídeos referente ao evento de tolerância a herbicida 8291.45.36.2, cassete de expressão, sonda, bem como processos para identificação do evento, determinação da zigosidade, produção de uma planta de soja transgênica e produção de uma proteína em uma célula de planta |
BR102012019434B1 (pt) * | 2011-07-26 | 2021-11-09 | Dow Agrosciences Llc | Métodos de controle de pestes, de insetos, molécula e sequência de dna diagnóstica para o evento de soja 9582.814.19.1 |
-
2013
- 2013-06-25 JP JP2015520388A patent/JP6385343B2/ja active Active
- 2013-06-25 MX MX2014015681A patent/MX354787B/es active IP Right Grant
- 2013-06-25 CN CN202010365523.1A patent/CN112273114B/zh active Active
- 2013-06-25 AU AU2013280641A patent/AU2013280641B2/en active Active
- 2013-06-25 BR BR112014031900A patent/BR112014031900B8/pt active IP Right Grant
- 2013-06-25 RU RU2015101993A patent/RU2650626C2/ru active
- 2013-06-25 US US14/410,762 patent/US10455834B2/en active Active
- 2013-06-25 TW TW102122532A patent/TW201406952A/zh unknown
- 2013-06-25 EP EP13810112.6A patent/EP2864481A4/en not_active Ceased
- 2013-06-25 UY UY0001034877A patent/UY34877A/es not_active Application Discontinuation
- 2013-06-25 CN CN201380044436.4A patent/CN104583404A/zh active Pending
- 2013-06-25 CA CA2874773A patent/CA2874773C/en active Active
- 2013-06-25 KR KR1020157001624A patent/KR102085131B1/ko active IP Right Grant
- 2013-06-25 WO PCT/US2013/047539 patent/WO2014004458A2/en active Application Filing
- 2013-06-25 AR ARP130102234 patent/AR091548A1/es active IP Right Grant
- 2013-06-25 UA UAA201500556A patent/UA122197C2/uk unknown
-
2014
- 2014-12-12 ZA ZA2014/09169A patent/ZA201409169B/en unknown
- 2014-12-21 IL IL236383A patent/IL236383B/en active IP Right Grant
- 2014-12-23 CL CL2014003506A patent/CL2014003506A1/es unknown
-
2018
- 2018-06-05 JP JP2018107882A patent/JP6778235B2/ja active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2628099C2 (ru) | Объект сои 9582.814.19.1, придающий устойчивость к насекомым и устойчивость к гербицидам | |
UA122197C2 (uk) | Трансгенна рослина сої, яка має стійкість до глюфосинату і підвищену стійкість до комах | |
UA114716C2 (uk) | Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів | |
JP7039493B2 (ja) | 生物学的試料中の遺伝子導入ダイズイベントdbn9004の有無を検出するための核酸配列、それを含有するキット、およびその検出方法 | |
MX2013011275A (es) | Evento de algodon transgenico mon 88701 y sus metodos de uso. | |
UA127944C2 (uk) | Рослина маїсу dbn9936 і спосіб застосування під час детектування її послідовності нуклеїнової кислоти | |
JP7443491B2 (ja) | ダイズ植物dbn8002を検出するための核酸配列およびそのための検出方法 | |
WO2021026689A1 (zh) | 用于检测大豆植物dbn8007的核酸序列及其检测方法 | |
UA127176C2 (uk) | Спосіб одержання трансгенної рослини кукурудзи, стійкої до гербіциду гліфосату і/або глуфосинату, нуклеотидна послідовність і спосіб її виявлення | |
CN110881367A (zh) | 一种玉米事件t抗-4及其使用方法 | |
CN104718293B (zh) | 大豆事件pDAB9582.816.15.1检测方法 | |
CN116574724B (zh) | 抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1003及其检测方法 | |
WO2024051077A1 (zh) | 转基因大豆事件cal16及其检测方法 | |
WO2021137255A1 (en) | Brinjal (solanum melongena) event ee-6726, kit and method of detection of event ee-6726 | |
CN116716293A (zh) | 抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1004及其检测方法 | |
CN116574725A (zh) | 抗虫耐草甘膦转基因玉米事件kj1183及其检测方法 |