KR102085131B1 - 곤충 저항성 및 제초제 내성 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 - Google Patents
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Abstract
대두 이벤트 9582.816.15.1은 상기 이벤트를 함유하는 대두 작물에게 곤충 저항성 및 제초제 내성을 부여하고, 작물 보호 및 저장된 산물의 보호를 위한 방법을 가능하게 하는 Cry1 F, Cry1Ac (synpro) 및 PAT를 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 개시내용의 실시양태는 대두 세포의 게놈 내의 특정 부위에 삽입된, 본원에 기재된 바와 같은 cry1 F v3 (cry1 F), cry1Ac synpro (cry1Ac) 및 pat v6 (pat)을 포함하는, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1로 지정된 신규한 곤충 저항성 및 제초제 내성 트랜스제닉 대두 형질전환 이벤트에 관한 것이다. 대표적인 대두 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 등록 번호 ATCC 기탁 번호 PTA-12588로 기탁되어 있다. 이러한 이벤트를 함유하는 대두 식물의 DNA는 대두 게놈 내의 삽입된 DNA의 위치를 특성화하는 본원에 기재된 접합부/플랭킹 서열을 포함한다.
Description
우선권 주장: 본 개시내용은 2012년 6월 25일자로 출원된 미국 가출원 61/663,700을 우선권 주장한다. 상기 출원의 정보는 전문이 포함된다.
Cry1F 및 Cry1Ac synpro (Cry1Ac)를 코딩하는 유전자는 트랜스제닉 식물에게 곤충 저항성, 예를 들어 인시류 곤충에 대한 저항성을 부여할 수 있고; PAT (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제)를 코딩하는 유전자는 트랜스제닉 식물에게 제초제 포스피노트리신 (글루포시네이트)에 대한 내성을 부여할 수 있다. PAT는, 곤충 저항성 트랜스제닉 작물 생산에서의 선택 마커로서, 그리고 트랜스제닉 식물에서 제초제 글루포시네이트에 대한 상업적 수준의 내성을 부여하는데 사용하기 위해 대두에서 성공적으로 발현되어 왔다.
식물에서의 트랜스진의 발현은, 아마도 염색질 구조 (예를 들어, 이질염색질) 또는 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 근접성으로 인해 식물 게놈에서의 그의 위치에 의해 영향을 받는 것으로 공지되어 있다 (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). 동시에, 게놈에서의 상이한 위치에서의 트랜스진의 존재는 상이한 방식으로 식물의 전반적인 표현형에 영향을 줄 것이다. 이러한 이유로, 도입된 관심 유전자의 최적 발현을 특징으로 하는 특정 트랜스제닉 이벤트를 확인하기 위해 종종 다수의 트랜스제닉 이벤트를 스크리닝할 필요가 있다. 예를 들어, 이벤트들 중 도입된 유전자의 발현 수준에 광범위한 편차가 있을 수 있다는 것이 식물 및 기타 유기체 내에서 관찰되었다. 또한, 발현의 공간적 또는 시기적 패턴에서의 차이, 예를 들어 다양한 식물 조직에서 트랜스진의 상대적인 발현에서의 차이가 있을 수 있으며, 이는 도입된 유전자 구축물 내에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다. 이러한 이유로, 수백종 내지 수천종의 상이한 이벤트를 생산하고, 이러한 이벤트들을 상업적인 목적을 위해 목적하는 트랜스진 발현 수준 및 패턴을 갖는 단일 이벤트에 대해 스크리닝하는 것이 통상적이다. 목적하는 수준 또는 패턴의 트랜스진 발현을 갖는 이벤트는 통상의 육종 방법을 사용하여 유성 이종교배에 의해 트랜스진을 다른 유전적 배경으로 유전자이입시키는데 유용하다. 이러한 교배의 자손은 최초 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 국부 성장 조건에 대해 잘 적응한 다수의 품종에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확실하게 하는데 사용된다.
유성 교배의 자손이 관심 트랜스진 또는 트랜스진 군을 함유하는지를 결정하기 위해 특정한 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 특정한 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들어 재조합 농작물로부터 유래된 식품의 시판전 승인 및 표지를 필요로 하는 규정을 따르거나, 또는 환경 모니터링, 필드에서의 작물의 형질 모니터링, 또는 작물 수확으로부터 유래된 산물의 모니터링에서의 사용에 도움이 될 뿐만 아니라, 해당 당사자가 규제 또는 계약 조건을 확실히 준수하도록 사용하는데에도 도움이 될 것이다.
핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 핵산 검출 방법에 의해 트랜스제닉 이벤트의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 많은 DNA 구축물의 경우에 코딩 영역이 상호교환가능하기 때문에, 일반적으로 이들 검출 방법은 흔히 사용되는 유전 요소, 예컨대 프로모터, 종결인자, 마커 유전자 등에 집중된다. 그 결과, 이러한 방법은 상이한 이벤트, 특히 동일한 DNA 구축물 또는 매우 유사한 구축물을 사용하여 생산된 것으로 삽입된 이종 DNA에 인접한 플랭킹 DNA의 DNA 서열이 공지되어 있지 않은 것들 사이를 구별하는데 유용하지 않을 수 있는다. 예를 들어, 이벤트-특이적 PCR 검정이 옥수수 이벤트 DAS-59122-7에 대해 미국 특허 출원 2006/0070139에 기재되어 있다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 확인을 위한 단순하고 차별적인 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다.
본 개시내용의 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은, 대두 세포의 게놈 내의 특정 부위에 삽입된, cry1F v3 (cry1F), cry1Ac synpro (cry1 Ac) 및 pat v6 (pat)을 포함하는, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1로 지정된 신규한 곤충 저항성 및 제초제 내성 트랜스제닉 대두 형질전환 이벤트에 관한 것이다. 대표적인 대두 종자는 국문명세서 식별번호 <0044>에서 확인되는 등록 번호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁되었다. 이러한 이벤트를 함유하는 대두 식물의 DNA는 대두 게놈 내로 삽입된 DNA의 위치를 특성화하는, 본원에 기재된 접합부/플랭킹 서열을 포함한다. 서열 1 및 서열 2는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 진단용이다. 보다 특히, 서열 1의 bp 1273/1274 및 서열 2의 bp 175/176 및 316/317에서의 접합부 주변의 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 진단용이다. 하기 국문명세서 식별번호 <0022>는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 대두의 DNA의 특징인 이들 접합부를 포함하는 서열의 예를 기재한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens) (대두 자벌레)에 대해 저항성이고, 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 게놈을 갖는, 대두 식물 또는 그의 부분을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 이러한 식물의 종자를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 곤충을 곤충 저항성 대두 식물에 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하며, 상기 대두 식물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 함유하는 게놈을 갖고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 존재의 특징인, 곤충을 방제하는 방법을 제공한다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 cry1F v3 (cry1F) 및 cry1Ac synpro (cry1Ac) 유전자의 존재는, 예를 들어 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레), 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) (벨벳콩 모충), 에피노티아 아포레마(Epinotia aporema), 오모이데스 인디카투스(Omoides indicatus), 라키플루시아 누(Rachiplusia nu), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 스포도프테라 코스모이데스(Spodoptera cosmoides), 스포도프테라 에리다니아(Spodoptera eridania), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens), 헬리오코베르파 제아(Heliocoverpa zea), 스필로소마 비르기니카(Spilosoma virginica) 및 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus)에 대한 저항성을 부여한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대두 작물에 글루포시네이트 제초제를 적용하는 것을 포함하며, 상기 대두 작물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 함유하는 게놈을 갖는 대두 식물을 포함하고, 상기 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 존재에 대한 진단용인, 대두 작물에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 pat 유전자의 존재는 글루포시네이트 제초제에 대한 내성을 부여한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은
(a) 대두 DNA를 포함하는 샘플을 서열 1의 bp 1-1273 또는 그의 상보물 내의 플랭킹 서열에 선택적으로 결합하는 적어도 10 bp 길이의 제1 프라이머, 및 서열 1의 bp 1274-1577 또는 그의 상보물 내의 삽입물 서열에 선택적으로 결합하는 적어도 10 bp 길이의 제2 프라이머와 접촉시키는 단계; 및
상기 프라이머 사이에 생성된 앰플리콘을 검정하는 단계; 또는
(b) 상기 샘플을 서열 2의 bp 1-175 또는 그의 상보물 내의 삽입물 서열에 선택적으로 결합하는 적어도 10 bp 길이의 제1 프라이머, 및 서열 2의 bp 176-1687 또는 그의 상보물 내의 플랭킹 서열에 선택적으로 결합하는 적어도 10 bp 길이의 제2 프라이머와 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 프라이머 사이에 생성된 앰플리콘을 검정하는 단계
를 포함하는, 상기 샘플 중에서 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은
a) 상기 샘플을 서열 1의 bp 1-1273 및 서열 2의 bp 176-1687, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 플랭킹 서열에 선택적으로 결합하는 제1 프라이머; 및 서열 3 또는 그의 상보물에 선택적으로 결합하는 제2 프라이머와 접촉시키는 단계;
b) 상기 샘플을 폴리머라제 연쇄 반응시키는 단계; 및
c) 상기 프라이머 사이에 생성된 앰플리콘을 검정하는 단계
를 포함하는, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배하여 제3 대두 식물을 생산하는 것을 포함하며, 상기 제1 대두 식물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 것인 단계; 및 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA의 존재에 대해 상기 제3 대두 식물을 검정하는 단계를 포함하는, 대두 식물을 육종하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 진단용인 단리된 DNA 분자를 제공한다. 이러한 분자는, 서열 1 및 2에 더하여, 서열 1의 bp 1273-1274 및 bp 1273/1274 접합부로부터 각각의 방향으로 서열 1의 적어도 10 bp를 포함하는 적어도 25 bp 길이의 분자; 서열 2의 175 - 176 및 bp 175/176 접합부로부터 각각의 방향으로 서열 2의 적어도 10 bp를 포함하는 적어도 25 bp 길이의 앰플리콘을 포함한다. 예는 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 대두 곡물, 종자 또는 종자 조분말에 의해 입증되는 바와 같은, 상기 곡물, 종자 또는 종자 조분말 내에 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함시키는 것을 포함하는, 상기 곡물, 종자 또는 종자 조분말에서 해충을 방제하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 실시양태는 또한 대두 이벤트 pDAB 9582.816.15.1을 함유하는 화분, 배주, 꽃, 싹, 뿌리 및 잎, 및 영양 세포의 핵, 화분 세포, 종자 및 종자 조분말, 및 난세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 대두 식물 세포 및 식물 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대두 이벤트 pDAB 9582.816.15.1은, 예를 들어 다른 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질 및 전사 조절 서열 (즉, RNA 간섭, dsRNA, 전사 인자 등)을 비롯한 다른 형질과 조합될 수 있다. 추가의 형질은 식물 육종, 대두 이벤트 pDAB 9582.816.15.1을 함유하는 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동 재조합을 통한 표적화 통합을 통한 새로운 형질의 추가를 통해 식물 게놈에 스태킹될 수 있다.
다른 실시양태는, 예를 들어 pat 유전자 발현 카세트를 비롯한 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 절제를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제시, 변형된 이벤트는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열이 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1과 스태킹되는 특정 염색체 부위에서 재-표적화될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 1 및 2에 제시된 플랭킹 서열들 사이의 염색체 03에 위치하는 대두 염색체 표적 부위를 포괄한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열 1 및 2에 제시된 게놈 서열들 사이, 즉 서열 1의 bp 1-1273과 서열 2의 bp 176-1687 사이의 염색체 03의 위치에 이종 핵산을 삽입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물을 제조하는 방법을 포괄한다.
추가로, 본 개시내용의 실시양태는 샘플 (예를 들어, 대두) 내의 대상 이벤트의 존재를 검출하기 위한 검정을 또한 제공한다. 검정은 대두 게놈 내로 삽입된 재조합 구축물의 DNA 서열, 및 삽입 부위에 플랭킹된 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 검정의 수행에 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.
개시내용의 실시양태는 또한 부분적으로, 트랜스제닉 대두 계통 내의 pDAB9582로부터의 T-DNA의 삽입으로 인해 생성된 경계 영역의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이들 서열은 고유하다. 삽입물 및 접합부 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머들이 존재할 수 있고 생성되었다. 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이들 이벤트를 확인할 수 있는 것으로 PCR 분석에 의해 입증되었다. 따라서, 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 본 개시내용의 이벤트를 포함하는 대두 계통을 고유하게 확인할 수 있다.
한 실시양태는 곤충을 곤충 저항성 대두 식물에 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하며, 상기 대두 식물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA를 포함하고, 상기 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 존재에 대한 진단용인, 곤충을 방제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 슈도플루시아 인클루덴스, 안티카르시아 겜마탈리스, 헬리오티스 비레센스, 또는 스포도프테라 프루기페르다를 곤충 저항성 대두 식물에 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하며, 상기 대두 식물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA를 포함하고, 상기 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 존재에 대한 진단용인, 슈도플루시아 인클루덴스, 안티카르시아 겜마탈리스 또는 스포도프테라 프루기페르다를 방제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 대두 작물에 글루포시네이트 제초제를 적용하는 것을 포함하며, 상기 대두 작물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 대두 식물을 포함하고, 상기 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 존재에 대한 진단용인, 대두 작물에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
한 실시양태는 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배하여 제3 대두 식물을 생산하는 것을 포함하며, 상기 제1 대두 식물은 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 것인 단계; 및 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA의 존재에 대해 상기 제3 대두 식물을 검정하는 단계를 포함하는, 대두 식물을 육종하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 서열을 포함하는 접합부 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공한다. 한 실시양태는 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)에 저항성이고, 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는, 대두 식물 또는 그의 부분을 제공한다.
한 실시양태는 대두 식물 또는 그의 부분으로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 대두 조분말, 미분말, 단백질 농축물 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물을 제공한다.
한 실시양태는 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 대두 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말에 의해 입증되는 바와 같은, 상기 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말 내에 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함시키는 것을 포함하는, 상기 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말에서 해충을 방제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태는 서열 1의 bp 1258-1288; 서열 1의 bp 1223-1323; 서열 1의 bp 1173-1373; 서열 1의 bp 1073-1473; 서열 2의 bp 160-190; 서열 2의 bp 125-225; 및 서열 2의 bp 75-275, 및 그의 상보물로 이루어진 군으로부터 선택되는 DNA 서열을 대두 종자의 게놈 내에 포함하는 대두 종자를 제공한다. 추가 실시양태는 대두 종자의 게놈 내에 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 cry1F, cry1Ac 및 pat를 포함하고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 등록 번호 PTA-12588 하에 기탁된 대표적인 대두 종자를 갖는 대두 종자를 제공한다. 추가 실시양태는 이들 2개의 실시양태 중 어느 것의 대두 종자를 성장시키는 것에 의해 생산되는 대두 식물을 제공한다. 추가 실시양태는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 등록 번호 PTA-12588 하에 기탁된 대두 종자 내에 존재하는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 cry1F, cry 1Ac 및 pat 유전자를 대두 종자의 게놈 내에 포함하는, 이러한 대두 식물에 의해 생산된 대두 종자를 제공한다. 추가 실시양태는 화분, 배주, 꽃, 싹, 뿌리 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 이벤트를 포함하는 이러한 대두 식물의 부분을 제공한다. 추가 실시양태는 대두 식물 또는 그의 부분으로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 대두 조분말, 미분말 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물을 제공한다.
추가 실시양태에서, 대두 식물은 서열 14와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 한 실시양태는 글루포시네이트 제초제에 대해 내성을 나타내고, 상기 내성은 상기 이벤트 또는 상기 게놈 내에 코딩된 단백질의 발현으로 인한 것인, 상기 실시양태의 식물의 자손 대두 식물을 제공한다.
추가 실시양태는 서열 14와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열을 포함하는 게놈을 포함하는 대두 종자를 제공한다. 추가 실시양태는 이러한 대두 종자에 의해 생산된 식물을 제공한다.
한 실시양태는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하며, 여기서 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 대표적인 대두 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 등록 번호 PTA-12588 하에 기탁된 것인 트랜스제닉 대두 식물 또는 그의 부분을 제공한다.
종자 기탁
본 개시내용의 일부로서, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 대두 계통의 적어도 2500개의 종자를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 기탁하였고, 대중은 제한없이 (그러나 특허권 하에) 이용가능하다. ATCC 기탁 번호 PTA-12588로 지정된 기탁이 2012년 2월 23일자로 다우 아그로사이언시스 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)에 의해 이루어졌다. 이러한 기탁은 특허 절차의 목적상 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약의 조항에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 5' DNA 플랭킹 경계 서열이다. 뉴클레오티드 1-1273은 게놈 서열이다. 뉴클레오티드 1274-1577은 삽입물 서열이다.
서열 2는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 3' DNA 플랭킹 경계 서열이다. 뉴클레오티드 1-175는 삽입물 서열이다. 뉴클레오티드 176-316은 pDAB9582로부터 재배열된 서열이다. 뉴클레오티드 317-1687은 게놈 서열이다.
서열 3은 하기 표 1에서 부연설명된 pDAB9582의 T-가닥 DNA 서열이다.
서열 4는 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81615_FW2이다.
서열 5는 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81516_RV1이다.
서열 6은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 81516_RV2이다.
서열 7은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 81516_RV3이다.
서열 8은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'IREnd-01이다.
서열 9는 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'IREnd-02이다.
서열 10은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 AtUbi10RV1이다.
서열 11은 5' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 AtUbi10RV2이다.
서열 12는 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'PATEnd05이다.
서열 13은 3' 경계 게놈 DNA의 확인을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'PATEnd06이다.
서열 14는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 예상 서열이다. 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582 T-가닥 삽입물 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 포함한다.
도 1은 cry1F v3, cry1Ac synpro 및 pat v6 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB9582의 플라스미드 지도이다.
도 2는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 5' 및 3' 경계 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도시한다.
도 3은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 게놈 서열 배열을 도시한다.
도 2는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 5' 및 3' 경계 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도시한다.
도 3은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 게놈 서열 배열을 도시한다.
이벤트 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 삽입의 양 말단은 서열분석 및 특성화되어 있다. 이벤트 특이적 검정이 개발되었다. 이벤트는 또한 대두 게놈 (대두 염색체 03) 상에 맵핑되어 있다. 이벤트는 추가의 유망 계통에 유전자이입될 수 있다.
상기 배경기술 섹션에서 암시된 바와 같이, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 도입 및 통합은 일부 무작위 이벤트를 수반한다 (따라서 발현되는 주어진 삽입에 대한 명칭 "이벤트"). 즉, 많은 형질전환 기술 예컨대 아그로박테리움 (Agrobacterium) 형질전환, 바이오리스틱 형질전환 (즉 유전자 총), 및 탄화규소 매개 형질전환 (즉 위스커스(WHISKERS)™)로는, 게놈 내의 어느 곳에 트랜스진이 삽입될 것인지가 예측불가능하다. 따라서, 삽입물의 양쪽 측면의 플랭킹 식물 게놈 DNA를 확인하는 것이 주어진 삽입 이벤트를 갖는 식물을 확인하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 삽입물과 숙주 게놈의 접합부 영역에 걸쳐 PCR 앰플리콘을 생성시키는 PCR 프라이머를 설계할 수 있다. 이러한 PCR 앰플리콘은 고유하거나 독특한 삽입 이벤트 유형을 확인하는데 사용할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 기재를 용이하게 하고 본 실시양태를 수행하는데 통상의 기술자에게 지침이 되는 정의 및 실시예가 본원에 제공된다. 달리 나타내지 않는 한, 용어는 관련 분야의 통상의 기술자에 의한 통상의 용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 기재된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명명법이 사용된다.
본원에 사용된 용어 "자손"은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 부모 식물의 임의의 세대의 후손을 나타낸다.
트랜스제닉 "이벤트"는 이종 DNA, 즉 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물에 의한 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 삽입으로부터 생성된 식물 집단의 재생, 및 특정한 게놈 위치로의 삽입을 특징으로 하는 특정한 식물의 선택에 의해 생산된다. 용어 "이벤트"는 이종 DNA를 포함하는 최초 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는, 형질전환체와 또 다른 품종 사이의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친으로의 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 교배 자손 내에 동일한 염색체 위치에서 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA를 포함하는 하나의 부모 계통 (예를 들어, 최초 형질전환체 및 자가수정으로부터 생성된 자손)과 삽입된 DNA를 함유하지 않는 부모 계통의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA와 삽입된 DNA에 바로 인접한 플랭킹 게놈 서열을 포함하는, 최초 형질전환체 및 그의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭한다.
"접합부 서열" 또는 "경계 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점에 플랭킹된 대두 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 걸쳐있고, 식물의 유전 물질 내에서 하나 또는 다른 접합부 서열의 확인 또는 검출은 이벤트를 진단하는데 충분하다. 본원에 기재된 대두 이벤트에서의 삽입 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA에 걸쳐있는 DNA 서열이 포함된다. 이러한 진단용 서열의 구체적 예가 본원에 제공되지만; 삽입의 접합부, 또는 삽입 및 게놈 서열의 접합부에 중첩되는 다른 서열이 또한 진단에 유용하고, 본 개시내용의 실시양태에 따라 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 부분적으로 이러한 플랭킹, 접합부 및 삽입물 서열을 사용한 이벤트 확인에 관한 것이다. 관련 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 개시내용의 실시양태에 포함된다. 본 개시내용의 실시양태에 따라, 삽입된 DNA 및 그의 경계를 가로질러 걸쳐있는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석 방법을 사용하여 본 발명의 독점 트랜스제닉 대두 계통으로부터 유래된 상업화된 트랜스제닉 대두 품종 또는 계통을 검출 또는 확인할 수 있다.
플랭킹/접합부 서열은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 진단한다. 이들 서열에 기초하여 이벤트-특이적 프라이머가 생성되었다. 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이들 대두 계통이 상이한 대두 유전자형에서 확인될 수 있는 것으로 PCR 분석에 의해 입증되었다. 따라서, 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 이들 대두 계통을 고유하게 확인할 수 있다. 본원에서 확인된 서열들은 고유하다.
본 개시내용의 실시양태의 검출 기술은, 식물 육종과 관련하여, 관심 이벤트를 포함하는 부모 식물이 하나 이상의 추가의 관심 형질을 자손에게 부여하기 위해 또 다른 식물 계통과 교배된 후에 자손 식물이 주어진 이벤트를 포함하는지 여부를 결정하는데 특히 유용하다. 이들 PCR 분석 방법은, 특히 상업화된 트랜스제닉 대두 종자에 대한 대두 육종 프로그램뿐만 아니라 품질 관리에 유익하다. 이들 트랜스제닉 대두 계통에 대한 PCR 검출 키트가 또한 현재 제조되어 사용가능하다. 이는 또한 제품 등록 및 제품 책임관리에 유익하다.
추가로, 플랭킹 대두/게놈 서열을 각각의 삽입물의 게놈 위치를 구체적으로 확인하는데 사용할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 각각의 이벤트에 대해 특이적인 분자 마커 시스템을 제조할 수 있다. 이는 가속 육종 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는데 사용될 수 있다.
추가로, 플랭킹 서열 정보를 트랜스진 통합 프로세스, 게놈 통합 부위 특성화, 이벤트 분류, 트랜스진 및 그의 플랭킹 서열의 안정성, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵, 트랜스진 메틸화 패턴, 위치 효과 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등 관련)을 연구 및 특성화하는데 사용할 수 있다.
본 개시내용의 모든 관점에서, 본 개시내용의 실시양태가 국문명세서 식별번호 <0044>에서 확인되는 ATCC 기탁 번호 하에 입수가능한 종자를 포함한다는 것이 명백할 것이다. 본 개시내용의 실시양태는 국문명세서 식별번호 <0044>에서 확인되는 ATCC 기탁 번호로 기탁된 종자로부터 성장한 제초제-내성 대두 식물을 또한 포함한다. 본 개시내용의 실시양태는 상기 식물의 부분, 예컨대, 잎, 조직 샘플, 상기 식물에 의해 생산된 종자, 화분 등 (이들 식물의 부분은 cry1F, cry1Ac, pat 및 서열 1 및 서열 2를 포함함)을 또한 포함한다.
추가로, 본 개시내용의 실시양태는 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 후손 및/또는 자손 식물, 바람직하게는 제초제-저항성 대두 식물을 포함하며, 여기서 상기 식물은 본원에 기재된 바와 같은 검출가능한 야생형 접합부/플랭킹 서열을 포함하는 게놈을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "대두"는 글리신 맥스를 의미하고, 대두 식물로 육종될 수 있는 그의 모든 품종을 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 식물을 적어도 하나의 부모로서 사용하여 교배시키는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본원에 예시된 식물 중 임의의 것을 한쪽 또는 양쪽 부모로서 갖는 F1 하이브리드 식물을 포함한다. 본 개시내용의 이러한 F1 하이브리드에 의해 생산된 종자가 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 개시내용은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근-교배 부모) 식물과 교배시키고, 생성된 하이브리드 종자를 수확함으로써 F1 하이브리드 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 본 개시내용은 모친 또는 부친인 예시된 식물을 포함한다. 생성된 식물의 특성은 부모 식물들의 신중한 고려에 의해 개선될 수 있다.
먼저 본원에서 언급된 계통 중 어느 하나의 종자로부터 성장한 대두 식물로 이루어진 제1 부모 대두 식물과 제2 부모 대두 식물을 유성 교배시켜 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 글리포시네이트에 대해 저항성인 제1 자손 식물을 선택하는 단계; 제1 자손 식물을 자가수정시켜 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제2 자손 식물로부터 글리포시네이트에 대해 저항성인 식물을 선택하는 단계에 의해 본 개시내용의 곤충 저항성/글리포시네이트-내성 대두 식물을 육종할 수 있다. 이들 단계는 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물의 제2 부모 대두 식물 또는 제3 부모 대두 식물로의 역교배를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 본 개시내용의 대두 종자를 포함하는 대두 작물 또는 그의 자손을 식재할 수 있다.
독립적으로 분리된 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 후손을 생산하기 위해 2개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배시킬 수 있음을 또한 이해할 것이다. 적절한 자손의 자가수정은 첨가된 양쪽 외인성 유전자에 대해 동형접합인 식물을 생산할 수 있다. 부모 식물로의 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배가 또한 고려되며, 영양 번식이 또한 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 통상적으로 사용되는 기타 육종 방법들이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 역교배 육종은 단순하게 유전되는 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동형접합 재배품종 또는 근교계로 전달하는데 사용되어 왔다. 전달되는 형질의 공급원은 공여자 부모로 칭해진다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배품종)의 속성 및 공여자 부모로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 공여자 부모의 표현형을 보유하는 개체를 선택하고, 반복적으로 반복친에 교배 (역교배)시킨다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배품종)의 속성 및 공여자 부모로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다.
마찬가지로, 본 개시내용의 실시양태의 곤충 저항성/글루포시네이트-내성 대두 식물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 추가의 트랜스진으로 형질전환될 수 있다. 아그로박테리움 형질전환, 바이오리스틱 형질전환 (즉, 유전자 총), 및 탄화규소 매개 형질전환 (즉, 위스커스™)과 같은 형질전환 기술을 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 게놈에 추가의 트랜스진(들)을 도입할 수 있다. 새롭게 삽입된 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 식물의 선택 및 특성화는 본 개시내용의 실시양태의 cry1F, cry1Ac, pat 유전자에 더하여 신규 트랜스진의 안정한 구성요소를 함유하는 식물을 확인하도록 완료될 수 있다.
마커 보조 육종 (MAB) 방법에서 본 개시내용의 실시양태의 DNA 분자가 분자 마커로서 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같은, 유전적으로 연관된 농경학상 유용한 형질을 확인하는 방법 (예컨대, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP 및 SSR)에서 본 개시내용의 실시양태의 DNA 분자가 사용될 수 있다. MAB 방법을 사용하여 본 개시내용의 실시양태의 대두 식물과의 교배의 자손 (또는 그의 자손 및 임의의 기타 대두 재배품종 또는 품종)에서 곤충 저항성 및 제초제-내성 형질을 추적할 수 있다. DNA 분자가 이러한 형질에 대한 마커이고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 MAB 방법을 사용하여 본 개시내용의 실시양태의 적어도 하나의 대두 계통 또는 그의 자손이 부모 또는 선조인 대두 식물에서 제초제-저항성 형질(들)을 추적할 수 있다. 본 이벤트를 갖는 임의의 대두 품종을 확인하는데 본 개시내용의 실시양태의 방법이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 본 개시내용에서 구현되는 식물로 육종하는 것을 포함하는, 곤충 저항성/제초제-내성 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 본 개시내용에서 구현되는 2종의 식물, 또는 본 개시내용에서 구현되는 1종의 식물과 임의의 다른 식물을 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 본 개시내용의 실시양태에 따라 검출가능한 이벤트 및 유리한 품종 성능 (예를 들어 수율)에 대해 자손을 분석함으로써 상기 교배의 자손을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 다른 바람직한 형질, 예컨대 농경학상 형질, 질환 내성 또는 저항성, 선충류 내성 또는 저항성 및 성숙기를 포함하는 식물과의 육종 사이클 동안 본 이벤트를 추적하는데 본 개시내용의 실시양태가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 이벤트 및 목적하는 형질을 포함하는 식물을 검출하고, 확인하고, 선택하고, 추가의 육종 라운드에 신속하게 사용할 수 있다. 본 이벤트/형질은 또한 육종 동안 추가의 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가의 제초제 내성 형질과 조합될 수 있고, 본 개시내용의 실시양태에 따라 추적될 수 있다. 후자의 실시양태는 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레), 안티카르시아 겜마탈리스 (벨벳콩 모충), 에피노티아 아포레마, 오모이데스 인디카투스, 라키플루시아 누, 스포도프테라 프루기페르다, 스포도프테라 코스모이데스, 스포도프테라 에리다니아, 헬리오티스 비레센스, 헬리오코베르파 제아, 스필로소마 비르기니카 및 엘라스모팔푸스 리그노셀루스를 포함하는 인시류 종에 대한 저항성을 부여하는 cry1F 및 cry1Ac 유전자와 조합된 본 이벤트를 포함하는 식물이다.
따라서, 본 개시내용의 실시양태는, 예를 들어 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 박테리아 EPSPS, GOX, GAT), 글루포시네이트 저항성 (예를 들어, dsm-2, bar), 아세토락테이트 신타제 (ALS)-억제 제초제 저항성 (예를 들어, 이미다졸리논 [예컨대 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 다른 화학물질 [Csr1, SurA 등]), 브로목시닐 저항성 (예를 들어, Bxn), HPPD (4-히드록시페닐-피루베이트-디옥시게나제) 효소의 억제제에 대한 저항성, 피토엔 데새투라제 (PDS)의 억제제에 대한 저항성, 광화학계 II 억제 제초제 (예를 들어, psbA)에 대한 저항성, 광화학계 I 억제 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시다제 IX (PPO)-억제 제초제 (예를 들어, PPO-1)에 대한 저항성, 페닐우레아 제초제 (예를 들어, CYP76B1)에 대한 저항성, 다캄바-분해 효소 (예를 들어, US 20030135879 참조)를 코딩하는 형질과 조합될 수 있으며, 다른 것들은 단독으로 또는 다수의 조합으로 스태킹되어 잡초 이동을 효과적으로 방제 또는 방지하는 능력 및/또는 상기 언급된 부류의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다.
추가로, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1은 1종 이상의 추가의 인풋 형질 (예를 들어, 곤충 저항성, 병원체 저항성 또는 스트레스 내성 등) 또는 아웃풋 형질 (예를 들어, 증가된 수율, 개선된 오일 프로파일, 개선된 섬유 품질 등)과 조합될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태를 사용하여 임의의 수의 농작물 해충을 유연하게 비용 효율적으로 방제하는 능력과 함께 개선된 작물 품질의 완전한 농경학상 패키지를 제공할 수 있다.
상동 재조합을 통해 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 특정 염색체 부위 내로 통합시키는 방법이 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0111188 A1에 기재된 바와 같은 부위 특이적 통합은 염색체 표적으로의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 매개하기 위한 레콤비나제 또는 인테그라제의 사용을 기재한다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 번호 WO 2008/021207는 1개 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 게놈의 특정 위치 내로 통합시키기 위한 아연 핑거 매개-상동 재조합을 기재하고 있다. 레콤비나제, 예컨대 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 6,720,475에 기재된 바와 같은 FLP/FRT 또는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,658,772에 기재된 바와 같은 CRE/LOX의 사용은 폴리뉴클레오티드 서열을 특정 염색체 부위로 통합시키는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 특정 염색체 위치로 표적화하기 위한 메가뉴클레아제의 용도가 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에 기재되어 있다.
식물 세포 내에서의 부위 특이적 통합을 위한 다른 방법이 일반적으로 공지되어 있고 이용가능하다 (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). 또한, 여러 원핵 및 하등 진핵 유기체에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템이 식물에서의 사용에 적용될 수 있다. 이러한 시스템의 예는 효모 자이고사카로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 레콤비나제 시스템 (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) 및 파지 뮤(Mu)의 Gin/Gix 시스템 (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 신규 트랜스진(들)을 기존의 트랜스제닉 이벤트에 근접하게 통합시키거나 스태킹하는 것이 바람직하다. 트랜스제닉 이벤트는, 고유한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정적인 발현, 및 여러 환경적 위치 내의, 그리고 여러 환경적 위치에 걸친 농경학상 성능 및 제초제 내성을 비롯한 효능의 우수한 조합에 기초하여 선택된 바람직한 게놈 유전자좌를 고려할 수 있다. 통합된 트랜스진을 포함하는 자손 식물은 기존의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지하여야 한다. 또한, 이벤트를 포함하는 자손 식물의 게놈 플랭킹 서열 및 염색체 위치가 이미 확인되어 있기 때문에, 통합된 이벤트를 포함하는 자손 식물은 그의 검출 및 확인을 위해 종래 개발된 검정을 사용할 수 있다. 마지막으로, 기존의 트랜스진에 근접하게 연결된 특정 염색체 위치로의 새로운 트랜스진의 통합은 통상의 육종 방법을 사용한 유성 이종교배에 의해 다른 유전적 배경으로의 트랜스진들의 유전자이입을 촉진할 것이다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 이벤트로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 절제하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0191877에 기재된 바와 같은 트랜스진 절제는 유전자 발현 카세트로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 염색체상 통합된 트랜스제닉 이벤트로부터 제거하기 위한 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 기재한다. 제거되는 폴리뉴클레오티드 서열은 선택 마커일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 제거 시, 변형된 트랜스제닉 이벤트가 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 재표적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 변형된 트랜스제닉 이벤트의 후속 재표적화는 선택 마커의 재사용 또는 특정 유전자의 발현으로부터 초래되는 식물 트랜스크립톰에 대한 의도하지 않은 변화를 극복하는 능력과 같은 이점을 제공한다.
본원은 이종 핵산의 삽입을 위해 사용될 수 있는 대두 게놈 내의 염색체 03 상의 특정 부위를 개시한다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 관심 이종 핵산을 이러한 미리 확립된 표적 부위 내로 또는 이러한 표적 부위에 근접하게 도입하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 실시양태는 개시된 표적 부위에 또는 이러한 부위에 일반적으로 근접하게 삽입된 임의의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포괄한다. 이러한 표적화된 통합을 달성하기 위한 한가지 선택사항은 본원에 예시된 pat 발현 카세트를 절제하고/거나 그 대신 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 표적화된 상동 재조합이 본 개시내용의 실시양태에 따라 사용될 수 있다.
본원에 사용된 유전자, 이벤트 또는 형질 "스태킹"은 목적하는 형질을 하나의 트랜스제닉 계통 내로 조합하는 것을 지칭한다. 식물 육종가는 각각 목적하는 형질을 갖는 부모들을 교배시킨 후 이들 목적하는 형질을 둘 다 갖는 후손을 확인함으로써 트랜스제닉 형질을 스태킹시킨다. 유전자를 스태킹시키는 또 다른 방식은 2개 이상의 유전자를 형질전환 동안 동시에 식물의 세포핵 내로 전달하는 것에 의한다. 유전자를 스태킹시키는 또 다른 방식은 트랜스제닉 식물을 또 다른 관심 유전자로 재-형질전환시키는 것에 의한다. 예를 들어, 2종 이상의 상이한 곤충 형질, 곤충 저항성 형질(들) 및 질환 저항성 형질(들), 2종 이상의 제초제 저항성 형질, 및/또는 곤충 저항성 형질(들) 및 제초제 저항성 형질(들)을 포함하는 2종 이상의 상이한 형질을 조합하는데 예를 들어 유전자 스태킹이 사용될 수 있다. 관심 유전자에 더하여 선택 마커를 사용하는 것이 또한 유전자 스태킹으로 간주될 수 있다.
"상동 재조합"은 2개의 뉴클레오티드 서열이 상호작용 (재조합)하여 새로운 재조합 DNA 서열을 형성할 수 있는, 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 상응하는 부위를 갖는 뉴클레오티드 서열의 임의의 쌍 사이의 반응을 지칭한다. 유사한 뉴클레오티드 서열의 부위는 각각 본원에서 "상동 서열"로 지칭된다. 일반적으로, 상동 서열의 길이가 증가함에 따라 상동 재조합의 빈도가 증가한다. 따라서, 동일하다고는 할 수 없는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 상동 재조합이 발생할 수 있지만, 2개의 서열 사이의 차이가 증가함에 따라 재조합 빈도 (또는 효율)는 감소한다. 각각의 공여자 및 표적 분자 상의 1개의 상동 서열을 사용하여 재조합이 달성될 수 있고, 이에 의해 "단일-교차" 재조합 산물이 생성된다. 대안적으로, 2개의 상동 서열이 각각의 표적 및 공여자 뉴클레오티드 서열 상에 놓일 수 있다. 공여자 상의 2개의 상동 서열과 표적 상의 2개의 상동 서열 사이의 재조합으로 "이중-교차" 재조합 산물이 생성된다. 공여자 분자 상의 상동 서열이 조작하고자 하는 서열 (예를 들어, 관심 서열)에 플랭킹되면, 표적 분자와의 이중-교차 재조합은, 관심 서열이 표적 분자 상의 상동 서열 사이에 원래 있었던 DNA 서열을 대체한 재조합 산물을 야기할 것이다. 이중-교차 재조합 이벤트를 통한 표적과 공여자 사이의 DNA 서열 교환은 "서열 대체"로 명명된다.
본 개시내용의 실시양태의 바람직한 식물 또는 종자는 본원에서 확인되는 바와 같은 작동가능한 cry1F, cry1Ac synpro 및 pat 뉴클레오티드 서열을, 본원에서 확인되는 바와 같은 삽입물 양쪽 측면의 적어도 20-500개 또는 그 초과의 인접 플랭킹 뉴클레오티드와 함께 게놈에 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 플랭킹 서열에 대한 언급은 서열 1 및 2와 관련하여 확인된 것들을 지칭한다. 이들 플랭킹 서열의 전부 또는 일부는 이벤트를 포함하는 부모 계통의 유성 교배의 결과로서 삽입된 DNA를 수용하는 자손에게 전달되는 것으로 예상할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 본 개시내용의 실시양태의 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 이러한 조직 배양물로부터 재생된 식물은, 특히 상기 식물이 예시된 품종의 모든 형태학적 및 생리학적 성질을 발현할 수 있는 경우에, 또한 포함된다. 본 개시내용의 실시양태의 바람직한 식물은 기탁된 종자로부터 성장한 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특성을 갖는다. 본 개시내용의 실시양태는 관심 품질 형질을 보유하는 종자 및 이러한 종자의 자손을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 "계통"은 적어도 하나의 형질에 대해 개체들 사이에 유전자 변이를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 일군의 식물이다. 이러한 계통은 여러 세대의 자가-수분 및 선택, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 단일 부모로부터의 영양 번식에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재배품종" 및 "품종"은 동의어이고, 상업적인 생산에 사용되는 계통을 지칭한다.
"안정성" 또는 "안정적"은 주어진 성분과 관련하여, 이러한 성분이 세대에서 세대로, 바람직하게는 적어도 3 세대 동안 유지되는 것을 의미한다.
"상업적 유용성"은 통상의 농업 장비를 사용하여 농부에 의해 작물이 생산될 수 있고 통상의 분쇄 및 추출 장비를 사용하여 종자로부터 기재된 성분을 갖는 오일이 추출될 수 있도록, 우수한 식물 생장력 및 높은 번식력을 갖는 것으로서 정의된다.
"농경학상 우량한"은 계통이 본 이벤트(들)로 인해 곤충 저항성 및 제초제 내성에 더하여, 바람직한 농경학상 특성, 예컨대 수율, 성숙, 질환 저항성 등을 갖는 것을 의미한다. 임의의 및 모든 이들 농경학상 특성 및 데이터 포인트는 이러한 식물을 정의하는데 사용되는 특성의 포인트로서 또는 특성 범위의 어느 한쪽 끝 또는 양쪽 끝에서 이러한 식물을 확인하는데 사용될 수 있다.
통상의 기술자는 본 개시내용의 관점에서, 바람직한 실시양태의 검출 키트가 예를 들어 "접합부 서열" 또는 "전이 서열" (대두 게놈 플랭킹 서열이 삽입물 서열과 만나는 곳)에 대해 지시되고/거나 이를 포함하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 이는 한쪽 또는 양쪽 접합부 서열 (삽입물이 플랭킹 서열과 만나는 곳)을 확인하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머 및/또는 앰플리콘을 포함한다. 한가지 통상적인 설계는 플랭킹 영역에서 혼성화하는 1개의 프라이머, 및 삽입물에서 혼성화하는 1개의 프라이머를 갖는 것이다. 이러한 프라이머는 종종, 각각 약 적어도 ~15개 잔기의 길이이다. 이러한 배열로, 프라이머는 본 개시내용의 실시양태의 이벤트의 존재를 나타내는 검출가능한 앰플리콘을 생성/증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 표시된 바와 같은 접합부 서열에 걸쳐있는 (그리고 이를 포함하는) 앰플리콘을 생성하는데 이들 프라이머가 사용될 수 있다.
플랭킹 서열에서 "터치 다운"하는 프라이머(들)는 전형적으로 약 1200개 염기 정도를 넘어서 또는 이에 따라 접합부를 넘어서 혼성화하도록 설계되지 않는다. 따라서, 전형적인 플랭킹 프라이머는 삽입물의 시작점으로부터 플랭킹 서열로의 1200개 염기 이내의 어느 한쪽 가닥의 적어도 15개 잔기를 포함하도록 설계될 것이다. 즉, 서열 1의 염기쌍 1 내지 1273 및/또는 서열 2의 염기쌍 176 내지 1687로부터의 (또는 그에 혼성화하는) 적절한 크기의 서열을 포함하는 프라이머가 본 개시내용의 실시양태의 범위에 속한다. 삽입물 프라이머도 마찬가지로 삽입물 상의 어느 곳에서든 설계될 수 있지만, 서열 14의 염기쌍 1273 내지 1873 및 13058 내지 13658이 예를 들어 비-배타적으로 이러한 프라이머 설계의 경우에 사용될 수 있다.
통상의 기술자는 프라이머 및 프로브가 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건 범위 하에서 혼성화하도록 설계될 수 있으며, 여기서 프라이머 또는 프로브는 예시된 서열에 완벽하게 상보적이지 않다는 것을 또한 인식할 것이다. 즉, 어느 정도의 미스매치 또는 축중성이 허용될 수 있다. 대략 20개 뉴클레오티드 프라이머의 경우에, 미스매칭되는 염기가 앰플리콘과 대향하는 프라이머의 내부 또는 말단에 존재하는 경우에, 예를 들어 전형적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드는 대향 가닥과 결합하는 것이 필요하지 않다. 다양한 적절한 혼성화 조건이 하기에 제공된다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브 뿐만 아니라, 펩티드 핵산 (PNA) 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 것은 이러한 프로브 및 프라이머가 본 개시내용의 실시양태의 이벤트의 존재를 진단한다 (이를 고유하게 확인 및 구별할 수 있다)는 것이다.
PCR 증폭에서 오류가 발생할 수 있고, 이는 예를 들어 미미한 서열분석 오류를 초래할 수 있다는 것을 주지해야 한다. 즉, 달리 나타내지 않는 한, 본원에 열거된 서열은 대두 게놈 DNA로부터 긴 앰플리콘을 생성한 후, 이러한 앰플리콘을 클로닝하고 서열분석함으로써 결정되었다. 게놈 DNA로부터 서열분석을 위한 충분한 앰플리콘을 생성하기 위해 필요한 많은 증폭 라운드를 고려하면, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 통상의 기술자는 이들 유형의 통상적인 서열분석 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 조정이 본 개시내용의 실시양태의 범위에 속한다는 것을 인식하고 이에 주의해야 한다.
이벤트 생성 동안 서열이 삽입되는 경우에, 예를 들어 일부 게놈 서열이 결실되는 것은 드물지 않다는 것을 또한 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, 진뱅크 (GENBANK)에 열거된 게놈 서열과 본 플랭킹 서열 사이에 약간의 차이가 또한 나타날 수 있다.
DNA 서열 "삽입물"의 성분이 도면에 예시되고, 하기 실시예에서 보다 상세하게 논의된다. 이들 성분의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편이 본 개시내용의 실시양태의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 대두 식물로부터 식물 및 종자 등에서 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에 제공된 5' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 1의 염기쌍 1 내지 1273과 서열 14의 1 내지 1273 사이), 그의 절편 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 본원에 제공된 3' 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 2의 염기쌍 176 내지 1687과 서열 14의 13659 내지 15170 사이), 그의 절편 및 예시된 서열의 상보물 및 그의 임의의 절편을 포함하는 DNA 서열이 제공된다. 삽입 영역 접합부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종 DNA와 삽입 부위에 플랭킹된 대두 세포로부터의 DNA 사이의 접합부에 걸쳐있다. 이들 서열은 주어진 이벤트를 진단할 수 있다.
이들 삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성될 수 있다. 이들 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 본 개시내용의 실시양태의 대두 계통이 상이한 대두 유전자형에서 확인될 수 있는 것으로 PCR 분석에 의해 입증되었다. 이들 및 다른 관련 절차를 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 대두 계통을 고유하게 확인할 수 있다. 따라서, 이러한 프라이머 쌍으로부터 유래된 PCR 앰플리콘은 고유하며, 이들 대두 계통을 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신규 트랜스진/게놈 삽입 영역의 인접 단편을 포함하는 DNA 서열은 본 개시내용의 한 측면이다. 트랜스진 삽입물 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및 상기 언급된 3종의 대두 식물 중 하나 이상으로부터의 대두 게놈 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열 및/또는 이들 대두 식물 중 하나 이상을 진단하는 앰플리콘 산물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열이 포함된다.
관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열 (예컨대 서열 1 및 그의 절편)의 트랜스진 부분의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열 또는 그의 상보물, 및 이들 서열로부터의 유사한 길이의 플랭킹 대두 DNA 서열 또는 그의 상보물에 관한 것이다. 이러한 서열은 DNA 증폭 방법에서 DNA 프라이머로서 유용하다. 이들 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급된 대두 이벤트 중 임의의 것을 진단한다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 이러한 DNA 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘을 또한 포함한다.
본 개시내용의 실시양태는 샘플 중에서 본원에서 언급된 대두 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 또한 포함한다. 이러한 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 이들 대두 이벤트 중 적어도 하나로부터의 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용하였을 때 상기 이벤트(들)를 진단하는 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 추가의 검출 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을, 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 대두 이벤트로부터의 DNA와는 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 대두 식물 (비-이벤트-관심 DNA)과는 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 두는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중에서 상기 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 제1 부모 대두 계통 (상기 계통의 식물에 글루포시네이트 내성을 부여하는 본 개시내용의 실시양태의 발현 카세트를 포함함) 및 제2 부모 대두 계통 (이러한 제초제 내성 형질이 결여됨)을 유성 교배시킴으로써 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 분자 마커를 사용하여 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 실시양태의 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하는 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 자손 식물을 제2 부모 대두 계통에 역교배시켜 곤충 저항성 및 글리포시네이트 내성 형질을 포함하는 순수-육종 대두 식물을 생산하는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 상기 이벤트와의 교배의 자손의 접합성을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대두 DNA를 포함하는 샘플을 본 개시내용의 실시양태의 프라이머 세트와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는, 상기 대두 이벤트부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우에 상기 대두 이벤트를 진단하는 제1 앰플리콘을 생산한다. 이러한 방법은, 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 대두 DNA를 포함하는 샘플을 제2 프라이머 세트와 접촉시키는 단계 (상기 제2 프라미어 세트는 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우에 상기 이벤트의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는 천연 대두 게놈 DNA의 내인성 서열을 포함하는 제2 앰플리콘을 생산함); 및 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제2 앰플리콘을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 제2 앰플리콘을 검출하는 단계 및 샘플에서 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 양쪽 앰플리콘의 존재는 트랜스진 삽입의 접합성을 나타낸다.
본원에 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트를 개발할 수 있다. 키트는 샘플 내의 본 대두 이벤트 DNA의 확인에 유용하고, 이러한 DNA를 함유하는 대두 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 키트는 예를 들어 본원에 개시된 앰플리콘에 대해, 또는 본 이벤트의 트랜스진 유전 요소 내에 함유된 DNA에 상보적인 DNA 서열에 대해 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이들 DNA 서열은 DNA 증폭 반응에서, 또는 DNA 혼성화 방법에서 프로브로서 사용될 수 있다. 키트는 또한 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 함유할 수 있다.
"프로브"는 통상의 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소)에 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이러한 프로브는 표적 핵산 가닥에 혼성화할 수 있고, 본 개시내용의 실시양태의 경우에, 대두 식물로부터 유래되거나 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래된 상기 대두 이벤트 중 하나로부터의 게놈 DNA 가닥에 혼성화할 수 있다. 본 개시내용의 실시양태에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 그 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 포함한다.
"프라이머"는 핵산 혼성화에 의해 표적 DNA 가닥에 어닐링하여 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이에 하이브리드를 형성하고, 이어서 폴리머라제, 예를 들어 DNA 폴리머라제에 의해 표적 DNA 가닥을 따라 연장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 개시내용의 실시양태의 프라이머 쌍은, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 통상의 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭에 대한 그의 사용을 지칭한다.
프로브 및 프라이머는 일반적으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 또는 1000 또는 2000 또는 5000개 폴리뉴클레오티드 또는 그 초과 길이이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 개시내용의 실시양태에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 완전한 서열 유사성을 갖지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 유지하는 프로브가 통상의 방법에 의해 설계될 수 있다.
프로브 및 프라이머의 제조 및 사용 방법이, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재되어 있다. PCR-프라이머 쌍은, 예를 들어 그러한 목적으로 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용하는 것에 의해 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.
본원에 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입물 서열에 기초한 프라이머 및 프로브는 통상의 방법, 예를 들어 이러한 서열의 재-클로닝 및 서열분석에 의해 개시된 서열을 확인하는데 (그리고, 필요하다면 수정하는데) 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상의 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 사용하여 샘플 내의 트랜스진 이벤트로부터 DNA의 존재를 확인할 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 상황 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자가 역-평행, 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있는 경우에, 2개의 분자는 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다. 핵산 분자는 그들이 완전한 상보성을 나타내는 경우에, 또 다른 핵산 분자의 "상보물"인 것으로 언급된다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 것의 뉴클레오티드에 상보적인 경우에, 분자는 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 완전한 상보성을 나타내는 분자는 일반적으로 통상의 "고-엄격성" 조건 하에 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 것이다. 통상의 고-엄격성 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다.
2개의 분자는 이들이 적어도 통상의 "저-엄격성" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하는 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있다면 "최소 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 통상의 저-엄격성 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 작용하기 위해서는, 사용되는 특정한 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열의 최소 상보성을 나타낼 것만을 필요로 한다.
용어 "엄격한 조건"은 또는 "엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55]에 논의된 특정 혼성화 절차에 의해 표적 핵산 (즉, 특정한 관심 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 또한, 문헌 [Sambrook et al, 1989 at 9.47-9.52 및 9.56-9.58]을 참조한다.
구상되는 적용에 따라, 표적 서열에 대한 혼성화의 선택성의 정도를 다르게 달성하기 위해 다양한 조건의 엄격한 조건 또는 프로브 또는 프라이머의 폴리펩티드 서열 축중성을 사용할 수 있다. 높은 선택성을 필요로 하는 적용의 경우에, 1개의 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위해 비교적 엄격한 조건을 전형적으로 사용할 것이며, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서의 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 바와 같은 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건을 선택할 것이다. 엄격한 조건은, 예를 들어 혼성화 필터를 고-엄격성 세척 완충제 (0.2X SSC, 0.1% SDS, 65℃)로 적어도 2회 세척하는 것을 수반할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격성 조건, 예를 들어 약 45℃에서 6.0X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어서 50℃에서 2.0X SSC로의 세척이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서 약 2.0X SSC의 저 엄격성 내지 50℃에서 약 0.2X SSC의 고 엄격성으로 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃의 저 엄격성 조건에서 약 65℃의 고 엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염은 둘 다 달라질 수 있거나, 또는 다른 변수는 변화시키면서 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지시킬 수 있다. 이러한 선택 조건은 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치 (존재하는 경우)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,965,188 및 5,176,995의 교시는 혼성화 분석 방법을 예시한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 실시양태의 핵산은 고 엄격성 조건 하에서, 본원에 예시되거나 제안된 프라이머 (또는 앰플리콘 또는 기타 서열), 그의 상보물 및 단편 중 1개 이상에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 실시양태의 마커 핵산 분자는 예시된 서열, 또는 그의 상보물 및/또는 단편 중 하나에서 본원에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 갖는다.
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용의 실시양태의 마커 핵산 분자는 이러한 핵산 서열과 80% 내지 100% 또는 90% 내지 100% 서열 동일성을 공유한다. 본 개시내용의 추가의 측면에서, 본 개시내용의 실시양태의 마커 핵산 분자는 이러한 서열과 95% 내지 100% 서열 동일성을 공유한다. 이러한 서열은 유전적 교배의 자손을 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수의 방법에 의해 검출될 수 있고; 이들은 형광 태그, 방사성 태그, 항체 기반 태그 및 화학발광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
특정한 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 표적 핵산 서열의 (예를 들어, PCR에 의한) 증폭과 관련하여, "엄격한 조건"은 프라이머 쌍이, 상응하는 야생형 서열 (또는 그의 상보물)을 갖는 프라이머가 결합할 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 하고, 바람직하게는 고유한 증폭 산물인 앰플리콘을 생산하게 하는 조건이다.
용어 "(표적 서열)에 특이적인"은 프로브 또는 프라이머가 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열을 포함하는 샘플 내의 표적 서열에만 혼성화하는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 부분인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 산물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 대두 식물이 본 개시내용의 실시양태의 대두 식물로부터의 트랜스제닉 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지 여부를 결정하기 위해, 삽입된 이종 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 및 삽입된 이종 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하는 핵산 증폭 방법에 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를 적용하여 이벤트 DNA의 존재를 진단하는 앰플리콘을 생산할 수 있다. 앰플리콘은 또한 이벤트를 진단하는 길이 및 서열을 갖는다. 앰플리콘은 프라이머 쌍 플러스 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합된 길이 및/또는 프라이머 쌍 플러스 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합된 길이 (플러스 또는 마이너스 임의의 상기 열거된 증분)로부터의 길이 범위일 수 있다. 대안적으로, 프라이머 쌍은 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 플랭킹 서열로부터 유래되어, 전체 삽입물 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앰플리콘을 생산할 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 거리를 두고 위치할 수 있다. 이러한 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍 내지 약 20000개의 뉴클레오티드 염기 쌍 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 명확하게 배제한다.
핵산 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 특히 미국 특허 번호 4,683,195 및 미국 특허 번호 4,683,202에 기재되어 있다. 최대 22 kb의 게놈 DNA를 증폭하기 위한 PCR 증폭 방법이 개발되어 있다. 이들 방법뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 다른 방법이 본 개시내용의 실시양태의 실시에 사용될 수 있다. 본 대두 이벤트로부터의 이종 트랜스진 DNA 삽입물의 서열 또는 플랭킹 게놈 서열은, 본원에 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터 이러한 서열을 증폭시키고 이어서 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA를 표준 DNA 서열분석함으로써 확인할 수 있다 (그리고 필요하다면 수정할 수 있다).
이들 방법에 의해 생산된 앰플리콘은 다수의 기술에 의해 검출될 수 있다. 아가로스 겔 전기영동 및 브로민화에티듐에 의한 염색은 통상적인 널리 공지된 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 이러한 방법은, DNA 올리고뉴클레오티드가 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열 및 삽입된 DNA 서열 둘 다 중첩되도록 설계된 제네틱 비트(Genetic Bit) 분석이다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. (삽입된 서열에서 1개의 프라이머 및 인접한 플랭킹 게놈 서열에서 1개를 사용한) 관심 영역의 PCR 이후에, 단일-가닥 PCR 산물은 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있고, DNA 폴리머라제 및 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 표지된 ddNTP를 사용하는 단일 염기 연장 반응을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 결합된 산물의 분석은 형광 신호의 양을 정량화하는 것을 통해 완료될 수 있다. 형광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인한 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
또 다른 방법은 문헌 [Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)]에 기재된 바와 같은 파이로시퀀싱 기술이다. 이 방법에서 올리고뉴클레오티드는 인접한 게놈 DNA와 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일-가닥 PCR 산물에 혼성화되도록 설계되고 (삽입된 서열에서의 1개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서의 1개), DNA 폴리머라제, ATP, 술푸릴라제, 루시페라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션된다. DNTP는 개별적으로 첨가되고, 혼입은 측정되는 광 신호를 생성한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중-염기 연장으로 인한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
형광 편광은 본 개시내용의 실시양태의 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 이 방법에 따라서, 올리고뉴클레오티드는 게놈 플랭킹 및 삽입된 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심 영역으로부터의 단일-가닥 PCR 산물에 혼성화되고 (삽입된 DNA에서의 1개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서의 1개), DNA 폴리머라제 및 형광-표지된 ddNTP의 존재 하에 인큐베이션된다. 단일 염기 연장은 ddNTP의 혼입을 야기한다. 형광 표지된 ddNTP의 혼입은 형광계를 사용한 편광에서의 변화로서 측정될 수 있다. 편광에서의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인한 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
택맨(TAQMAN)® (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간략하게, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 게놈 플랭킹 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로프 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 1개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서의 1개)는 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 특이적 증폭 동안, Taq DNA 폴리머라제 프루프리딩 메카니즘은 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터 형광 모이어티를 방출한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 나타낸다.
폴리뉴클레오티드 서열 검출에 사용하기 위한 분자 비콘이 기재되어 있다. 간략하게, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 플랭킹 게놈 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되도록 설계된다. FRET 프로브의 고유한 구조는 형광 및 켄칭 모이어티를 근접하게 유지시키는 이차 구조를 함유하게 한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 1개의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열에서 1개)가 열안정성 폴리머라제 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 성공적인 PCR 중폭에 이어서 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 이차 구조를 제거하고 형광 및 켄칭 모이어티를 공간적으로 분리시킨다. 형광 신호가 발생한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인한 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 나타낸다.
삽입을 위해 우수한 대두 게놈 내의 위치가 개시되어 있고, 본 개시내용의 실시양태는 이러한 게놈 위치의 일반적인 근접부에 적어도 1개의 비-대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 삽입물을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포함한다. 한가지 선택사항은 본원에 예시된 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1로부터의 것 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로, 예를 들어 표적화된 상동 재조합이 특정한 실시양태에서 사용된다. 이러한 유형의 기술은, 예를 들어 WO 03/080809 A2 및 상응하는 공개된 미국 출원 (US 20030232410)의 주제이다. 따라서, 본 개시내용의 실시양태는 본원에서 확인되는 플랭킹 서열 (서열 1의 bp 1-1273 및 서열 2의 bp 176-1687)의 전부 또는 인식가능한 부분에 플랭킹된 (cry1F, cry1Ac 또는 pat 유전자의 다중-카피를 대신하는 또는 이를 수반하는) 이종 삽입물을 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다. cry1F, cry1Ac 또는 pat의 추가의 카피 (또는 추가의 카피들)가 또한 이러한 방식(들)으로의 삽입을 위해 표적화될 수 있다.
본원에서 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공개물은 본 명세서의 명백한 교시와 상반되지 않는 정도로 그 전문이 참조로 포함된다. 하기 실시예는 본 개시내용의 실시양태의 실시를 위한 절차를 예시하고 본 개시내용의 특정의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 이들 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 그의 실시를 위해 바람직한 방식을 예시하기 위해 사용된 특정한 접근법을 나타낸다는 것이 통상의 기술자에게 이해되어야 한다. 그러나 통상의 기술자는 본 개시내용의 관점에서, 본 개시내용의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고, 많은 변화가 이들 구체적 실시양태에서 이루어질 수 있으며 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 달리 나타내지 않는 한 부피 기준이다.
달리 나타내지 않는 한 하기 약어가 사용된다.
bp 염기 쌍
℃ 섭씨 온도
DNA 데옥시리보핵산
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
kb 킬로베이스
μg 마이크로그램
μL 마이크로리터
mL 밀리리터
M 몰 질량
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
PTU 식물 전사 단위 또는 발현 카세트
SDS 소듐 도데실 술페이트
SSC 염화나트륨 및 시트르산나트륨의 혼합물을 함유하는 완충 용액, pH 7.0
TBE 트리스(Tris) 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물을 함유하는 완충 용액, pH 8.3
실시예
실시예 1: Cry1F, Cry1Ac 및 PAT 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 형질전환 및 선택
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스)를 대두 자엽절 체외외식편의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 생성하였다. T-가닥 DNA 영역 내에 선택 마커, pat v6 및 관심 유전자, cry1F v3 및 cry1 Ac synpro를 함유하는 이원 벡터 pDAB9582 (도 1)를 운반하는, 무력화된 아그로박테리움 균주 EHA101 (Hood et al., 1993)을 사용하여 형질전환을 개시하였다. pDAB9582에 대한 T-가닥 DNA 서열은 서열 3에 제공되고, 하기 표 1에서 부연설명된다.
<표 1> pDAB9582 상에 위치하는 유전자 요소
아그로박테리움-매개 형질전환을 문헌 [Zeng et al. (2004)]의 변형된 절차를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 대두 종자 (cv 매버릭(Maverick))를 기본 배지에서 발아시키고, 자엽절을 단리하고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 싹 개시, 싹 신장 및 착근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 글루포시네이트 선택을 사용하여 비-형질전환된 싹의 성장을 억제하였다. 선택된 싹을 뿌리 발생을 위해 착근 배지로 옮긴 다음, 소식물의 순응을 위해 토양 혼합물로 옮겼다.
추정 형질전환체를 스크리닝하기 위해, 선택된 소식물의 말단 소엽에 글루포시네이트를 칠하였다. 스크리닝된 소식물을 온실로 옮기고, 순응되게 한 후, 글루포시네이트를 잎에 칠하여 내성을 재확인하고, 추정 형질전환체인 것으로 간주하였다. 스크리닝된 식물을 샘플링하고, 선택 마커 유전자 및/또는 관심 유전자의 확인을 위해 분자 분석을 수행하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정되도록 하여 T1 종자를 생성시켰다.
이러한 이벤트, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1이 독립적인 형질전환된 단리물로부터 생성되었다. T1 식물을 역교배하고 후속 세대에 걸쳐 우량한 품종으로 유전자이입시켰다. 이벤트를 그의 고유한 특성, 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리, 안정적인 발현, 및 곤충 저항성, 제초제 내성 및 농경학적 성능을 비롯한 효능의 우수한 조합에 기초하여 선택하였다. 하기 실시예는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 특성화하는데 사용된 데이터를 함유한다.
실시예 2: 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서의 단백질 발현의 특성화
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서 발현된 재조합 Cry1F, Cry1Ac, 및 PAT 단백질의 생화학적 특성을 특성화하였다. 정량적 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)은, 단백질의 생화학적 특성을 특성화하고 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서의 이들 단백질의 발현을 확인하기 위해 사용될 수 있는 관련 기술분야에 공지된 생화학적 검정이다.
실시예 2.1: 식물 조직에서의 PAT, Cry1F 및 Cry1Ac 단백질의 발현
대두 조직의 샘플을 시험 식물로부터 단리하고, 발현 분석을 위해 준비하였다. 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 세제 트윈(Tween)-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액 (PBST)을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 PAT 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고; 수성 상청액을 수집하고, 필요에 따라 적절한 완충제로 희석하고, PAT ELISA 키트를 사용하여 샌드위치 포맷으로 분석하였다. 키트는 제조업체의 제안된 프로토콜 (엔비롤로직스(Envirologix), 메인주 포틀랜드)에 따라 사용하였다. 이러한 검정은 발현된 PAT 단백질의 농도를 측정하였다.
세제 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액 (PBST)을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1F 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고; 수성 상청액을 수집하고, 필요에 따라 적절한 완충제로 희석하고, Cry1F ELISA 키트를 사용하여 샌드위치 포맷으로 분석하였다. 키트는 제조업제의 제안된 프로토콜 (스트래티직 다이아그노스틱스 인크.(Strategic Diagnostics Inc.), 델라웨어주 뉴어크)에 따라 사용하였다. 이러한 검정은 발현된 Cry1F 단백질의 농도를 측정하였다.
0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 세제 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액 (PBST)을 사용하여 대두 식물 조직으로부터 Cry1Ac 단백질을 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고; 수성 상청액을 수집하고, 필요에 따라 적절한 완충제로 희석하고, Cry1Ac ELISA 키트를 사용하여 샌드위치 포맷으로 분석하였다. 키트는 제조업체의 제안된 프로토콜에 따라 사용하였다 (스트래티직 다이아그노스틱스 인크., 델라웨어주 뉴어크). 이러한 검정은 발현된 Cry1Ac 단백질의 농도를 측정하였다.
검출 분석을 수행하여, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서의 발현 안정성 및 유전가능성을 수직적 (세대 간) 및 수평적 (세대 내의 계통 간) 둘 다로 조사하였다.
실시예 2.2: 식물 조직에서의 Cry1F, Cry1Ac 및 PAT 단백질의 발현
상기 기재된 프로토콜을 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서 Cry1F, Cry1Ac 및 PAT 단백질의 수준을 결정하였다. 가용성의 추출 가능한 단백질은 대두 잎 조직으로부터 정량적 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 측정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 T2에서 T6 세대까지, 발현은 안정하였고 (분리되지 않고), 모든 계통에 걸쳐서 일관되었다. 표 2는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서 트랜스제닉 단백질의 평균 발현 수준을 열거한다.
<표 2> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서 상이한 트랜스제닉 단백질의 평균 발현 수준
실시예 3: 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 삽입물 및 플랭킹 경계 영역 내의 DNA 서열의 클로닝 및 특성화
게놈 삽입 부위를 특성화하고 기재하기 위해, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 플랭킹 게놈 T-DNA 경계 영역의 서열을 결정하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 게놈 서열은 5' 플랭킹 경계 서열 (서열 1) 1273 bp 및 3' 플랭킹 경계 서열 (서열 2) 1371 bp를 포함하는 것으로 확인되었다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 경계 서열에 기초한 PCR 증폭은, 경계 영역이 대두 기원의 것이고 접합부 영역은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 고유한 서열임을 확인시켜주었다. 접합부 영역은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 이벤트-특이적 확인을 위해 사용될 수 있다. 또한, T-가닥 삽입 부위는, 비형질전환된 대두의 게놈으로부터 확인된 플랭킹 경계 서열의 영역에 상응하는 게놈 단편을 증폭함으로써 특성화하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1과 비형질전환된 게놈 서열의 비교는, T-가닥 통합 동안 원래의 유전자좌로부터 약 21 bp의 결실이 발생했음을 보여주었다. 전반적으로, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 삽입물 및 경계 서열의 특성화는 pDAB9582로부터의 T-가닥의 무손상 카피가 대두 게놈 내에 존재함을 나타내었다.
<표 3> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에서 대두 게놈 DNA의 확인에 사용된 프라이머 및 그의 서열의 목록
<표 4> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 경계 영역 및 이벤트-특이적 서열의 표준 PCR 증폭을 위한 조건
<표 5> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 경계 영역 및 이벤트 특이적 서열의 표준 PCR 증폭을 위한 PCR 혼합물
실시예 3.1: 대두 게놈 서열의 확인
5' 및 3' 플랭킹 경계는 염색체 03으로부터의 글리신 맥스 전체 게놈 샷건 서열과 정렬되었고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 03에 삽입되었음을 나타낸다. 대두 게놈으로부터 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 삽입 부위를 확인하기 위해, 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다 (도 2, 표 3, 표 4 및 표 5). 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 기타 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 대두 계통으로부터의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. 5' 경계 서열이 맞는지 확인하기 위해, At Ubi10 프로모터 유전자 요소에 결합되도록 설계된 프라이머, 예를 들어 AtUbi10RV1, 및 대두 게놈 염색체 03 상의 클로닝된 5' 말단 경계에 결합되도록 설계된 81615_FW2로 지정된 프라이머를 사용하여 At Ubi10 프로모터 유전자 요소로부터 5' 말단 경계 서열에 걸쳐있는 DNA 절편을 증폭하였다. 유사하게, 클로닝된 3' 경계 서열의 확인을 위해, pat 특이적 프라이머, 예를 들어 3'PATEnd05, 및 클로닝된 3' 말단 경계 서열에 따라 설계된 81615_RV1 및 81615_RV2로 지정된 프라이머를 사용하여 pat 유전자로부터 3' 경계 서열에 걸쳐있는 DNA 절편을 증폭하였다. 예상되는 크기의 DNA 단편을, 다른 트랜스제닉 대두 계통 또는 비-트랜스제닉 대조군으로부터의 DNA 샘플로부터가 아닌, 오직 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 게놈 DNA로부터 각각의 프라이머 쌍으로 증폭하였다. 결과는 클로닝된 5' 및 3' 경계 서열이 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대한 T-가닥 삽입물의 플랭킹 경계 서열임을 나타낸다.
대두 게놈 내의 DNA 삽입을 추가로 확인하기 위해, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 대해 T-가닥 삽입물을 함유하지 않는 게놈 DNA 상에서 대두 경계 서열에 걸쳐 PCR 증폭을 완료하였다. 5' 말단 경계 서열에 따라 설계된 프라이머 81615_FW2, 및 3' 말단 경계 서열을 위해 설계된 하나의 프라이머 81615_RV3을 사용하여 pDAB9582 T-가닥이 통합된 유전자좌를 함유하는 DNA 절편을 증폭하였다. 예상된 바와 같이, 81615_FW2 및 81615_RV3의 프라이머 쌍에 의해 완료된 PCR 반응은 pDAB9582.816.15.1이 아닌 모든 다른 대두 대조군 계통으로부터 대략 1.8 kb DNA 단편을 생성하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 확인된 5' 및 3' 경계 서열과 염색체 03으로부터의 글리신 맥스 전체 게놈 샷건 서열의 정렬은 원래의 유전자좌로부터 약 21 bp 결실을 나타내었다. (도 3). 이들 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 트랜스진이 대두 게놈 염색체 03의 부위 내로 삽입되었다는 것을 입증한다.
실시예 4: 서던 블롯을 통한 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 특성화
서던 블롯 분석을 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 통합 패턴을 확립하였다. 이들 실험은 대두 게놈 내에 cry1Ac 및 cry1F 트랜스진의 통합 및 완전성을 입증하는 데이터를 생성하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1은 플라스미드 pDAB9582로부터의 단일 카피의 cry1Ac 및 cry1F PTU를 함유하는 전장 단순 통합 이벤트로서 특성화되었다.
서던 블롯 데이터는 T-가닥 절편이 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 게놈 내에 삽입되었음을 시사하였다. 상세한 서던 블롯 분석은 pDAB9582.816.15.1의 T-가닥 통합 영역 내에 함유된 cry1Ac 및 cry1F 유전자에 특이적인 프로브, 및 플라스미드 내에 위치한 절단 부위를 갖고 플라스미드 또는 플라스미드와 대두 게놈 DNA의 접합부에 걸쳐있는 단편 (경계 단편)에 대해 내부의 혼성화 단편을 생산하는 설명적 제한 효소를 사용하여 수행하였다. 제한 효소와 프로브의 조합에 대해 서던 혼성화로부터 나타난 분자량은 이벤트에 대해 고유하였고, 그것의 확인 패턴을 확립하였다. 이들 분석은 또한 플라스미드 단편이 cry1Ac 및 cry1F PTU의 재배열 없이 대두 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.1: 대두 잎 샘플 수집 및 게놈 DNA (gDNA) 단리
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 개별 대두 식물로부터 수확한 잎 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, cry1Ac 및 cry1F 유전자가 없는 물질 계통을 대표하는 유전적 배경을 함유하는, 통상의 대두 식물, 매버릭으로부터 gDNA를 단리하였다. 동결건조된 입 조직으로부터 표준 CTAB 방법에 따라 개별 게놈 DNA를 추출하였다. 추출 후에, 피코 그린 시약 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 분광형광측정법으로 DNA를 정량하였다.
실시예 4.2: DNA 소화 및 분리
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 서던 블롯 분자 특성화를 위해, 게놈 DNA 10 마이크로그램 (10 μg)을 소화시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭으로부터의 게놈 DNA를 DNA μg당 대략 5 유닛의 선택된 제한 효소 및 상응하는 반응 완충제를 각 DNA 샘플에 첨가하여 소화시켰다. 각각의 샘플을 대략 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제한 효소 AseI, HindIII, NsiI, 및 NdeI를 단일 소화에 개별적으로 사용하였다 (뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치). 제한 효소 NotI 및 ApaLI를 이중 소화를 위해 함께 사용하였다 (뉴잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입스위치). 또한, 플라스미드 DNA, pDAB9582를 비-트랜스제닉 대두 품종, 매버릭으로부터의 게놈 DNA와 조합함으로써 양성 혼성화 대조군 샘플을 제조하였다. 플라스미드 DNA / 게놈 DNA 칵테일을 시험 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 사용하여 소화시켰다.
소화물을 밤새 인큐베이션한 후, 25μL 퀵-프리시프 플러스(Quick-Precip Plus) 용액 (에지 바이오시스템즈(Edge Biosystems), 메릴랜드주 게이더스버그)을 첨가하고, 소화된 DNA 샘플을 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 DNA 펠릿을 15 μL의 1X 로딩 완충제 (0.01% 브로모페놀 블루, 10.0 mM EDTA, 10.0% 글리세롤, 1.0 mM 트리스 pH 7.5) 중에 재현탁시켰다. 이어서 DNA 샘플과 분자 크기 마커를 35 볼트에서 대략 18-22시간 동안 0.4X TAE 완충제 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베니아주 피츠버그)를 함유하는 0.85% 아가로스 겔을 통해 전기영동하여 단편을 분리시켰다. 겔을 브로민화에티듐 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)로 염색하고, 자외선 (UV) 광 하에서 DNA를 시각화하였다.
실시예 4.3: 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석은 본질적으로 문헌 [Memelink, et al. (1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, DNA 단편의 전기영동 분리 및 시각화에 이어, 겔을 0.25M HCl로 대략 20분 동안 탈퓨린화하고, 이어서 대략 30분 동안 변성 용액 (0.4 M NaOH, 1.5 M NaC1)에 노출시킨 후, 적어도 30분 동안 중화 용액 (1.5 M NaCl, 0.5 M 트리스 pH 7.5)에 노출시켰다. 서던 전달은 10X SSC와 함께 위킹 시스템을 사용하여 나일론 막 상에서 밤새 수행하였다. 전달 후, UV 가교에 이어서 2X SSC 용액으로 막을 간략하게 세척하여 DNA를 막에 결합시켰다. 이러한 방법은 혼성화를 위해 준비된 서던 블롯 막을 생산하였다.
실시예 4.4: DNA 프로브 표지화 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 단편을 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다 (표 6). 프로브는 디곡시제닌 (DIG) 표지된 뉴클레오티드, [DIG-11]-dUTP를, 유전자 요소에 특이적인 프라이머를 사용하여 플라스미드 pDAB9582로부터 증폭시킨 DNA 단편에 PCR-기반 혼입시켜 생성하였다. PCR 합성에 의한 DNA 프로브의 생성은 PCR DIG 프로브 합성 키트 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 제조업체의 권고된 절차에 따라 수행하였다.
표지된 프로브를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 그의 품질 및 양을 결정하였다. 이어서, DIG 이지 히브(DIG Easy Hyb) 용액 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)에 대해 기재된 바와 같은 절차를 본질적으로 사용하여, 특이적 단편의 검출을 위해 나일론 막 상의 표적 DNA에 대한 혼성화를 위해 목적하는 양의 표지된 프로브를 사용하였다. 간략하게, 고정된 DNA를 함유하는 나일론 막 블롯을 2X SSC로 간략하게 세척하고, 혼성화 용기 내의 예열된 DIG 이지 히브 용액 20-25 mL와 함께 대략 45-55℃에서 약 2시간 동안 혼성화 오븐 내에서 예비-혼성화시켰다. 이어서 예비-혼성화 용액을 기울여 따라내고, 열 순환기에서 대략 5분 동안 가열하여 변성시킨 목적하는 양의 특이적 프로브를 함유하는 예열된 DIG 이지 히브 용액 ~15 mL로 대체하였다. 이어서 혼성화 단계를 혼성화 오븐 내에서 대략 45-55℃에서 밤새 수행하였다.
프로브 혼성화의 말미에, 프로브를 함유하는 DIG 이지 히브 용액을 깨끗한 튜브로 기울여 따라내고, 대략 -20℃에서 보관하였다. 이들 프로브는 제조업체의 권고된 절차에 따라서 2회 동안 재사용가능하다. 막 블롯을 간략하게 세정하고, 실온에서 대략 5분 동안 저 엄격성 세척 완충제 (2X SSC, 0.1% SDS)로 깨끗한 플라스틱 용기 내에서 2회 세척한 다음, 대략 65℃에서 각각 15분 동안 고 엄격성 세척 완충제 (0.1X SSC, 0.1% SDS)로 2회 세척하였다. 막 블롯을 대략 5분 동안 DIG 세척 및 차단 완충제 세트 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)로부터의 1X 말레산 완충제로 간략하게 세척하였다. 이어서 2시간 동안 1X 차단 완충제 중에서 차단하고, 또한 최소 30분 동안 1X 차단 완충제 중에서 항-DIG-AP (알칼리성 포스파타아제) 항체 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)와 함께 인큐베이션하였다. 1X 세척 완충제로 2-3 회 세척한 후, 특이적 DNA 프로브는 막 블롯에 결합된 채로 남았고, CDP-스타 화학발광 핵산 검출 시스템 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)를 제조업체의 권고에 따라 사용하여 DIG-표지된 DNA 표준을 시각화하였다. 블롯을 하나 이상의 시점 동안 화학발광 필름에 노출시켜서 혼성화 단편을 검출하고 분자 크기 표준을 시각화하였다. 필름을 올-프로 100 플러스(All-Pro 100 Plus) 필름 현상제 (코니카 미놀타(Konica Minolta), 일본 오사카)로 현상하고, 영상을 스캔하였다. 검출된 밴드의 개수 및 크기를 각각의 프로브에 대해 기록하였다. 기재된 바와 같이 DIG 검출 후에 보이는, DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II (DIG MWM II) 및 DIG-표지된 DNA 분자량 마커 VII (DIG MWM VII)를 사용하여 서던 블롯 상의 혼성화 단편 크기를 결정하였다.
<표 6> 서던 분석에 사용된 프로브의 위치 및 길이
실시예 4.5: 서던 블롯 결과
cry1Ac 및 cry1F PTU의 공지된 제한 효소 부위에 기초한, 특정한 소화물 및 프로브에 의해 예상되는 단편 크기 및 관찰된 단편 크기를 표 7에 제공한다. 이들 소화물 및 혼성화로부터 2 유형의 단편이 확인되었다: 공지된 효소 부위가 프로브 영역에 플랭킹되고 cry1Ac 및 cry1F PTU의 삽입 영역 내에 완전히 함유되어 있는 내부 단편, 및 공지된 효소 부위가 프로브 영역의 한쪽 말단에 위치하고 제2 부위가 대두 게놈 내에 있는 것으로 예상되는 경계 단편. 대부분의 경우에, DNA 단편 통합 부위가 각 이벤트에 대해 고유하기 때문에, 경계 단편 크기는 이벤트에 따라 다르다. 경계 단편은 제한 효소 부위를 통합된 DNA와 관련하여 위치시키고 DNA 삽입의 개수를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 대두의 다중 세대에 대해 완료된 서던 블롯 분석은, 플라스미드 pDAB9582로부터의 낮은 카피의 무손상 cry1Ac 및 cry1F PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 시사하는 데이터를 생성하였다.
<표 7> 서던 블롯 분석에서의 예상 및 관찰된 혼성화 단편. 1. 예상 단편 크기는 pDAB9582의 플라스미드 맵에 기초함. 2. 관찰 단편 크기는 이들 분석으로부터 대략적으로 고려되며, DIG-표지된 DNA 분자량 마커 II 및 마커 VII 단편의 표시된 크기에 기초함.
제한 효소 AseI 및 NsiI는 플라스미드 pDAB9582 내의 고유한 제한 부위에 결합하고 절단한다. 이어서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 cry1Ac 유전자 삽입물을 특성화하기 위해 선택되었다. >7286 bp 또는 >9479 bp의 경계 단편은 각각 AseI 및 NsiI 소화 이후에 프로브에 의해 혼성화될 것으로 예상되었다 (표 7). AseI 및 NsiI 소화를 사용할 경우에, 각각 약 8500 및 >10000 bp 의 단일 cry1Ac 혼성화 밴드가 관찰되었다. 이러한 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 게놈 내에 cry1Ac 유전자에 대한 단일 삽입 부위의 존재를 시사한다. 제한 효소 NotI 및 ApaLI는 이중 소화를 수행하고 cry1Ac 식물 전사 단위 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)를 함유하는 단편을 방출시키기 위해 선택되었다 (표 7). NotI 및 ApaLI 이중 소화 후에 프로브에 의해 예상 4550bp 단편이 관찰되었다. pDAB9582.816.15.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화에 의해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB9582로부터의 무손상 cry1Ac PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다.
제한 효소 NdeI 및 NsiI는 플라스미드 pDAB9582 내의 제한 부위에 결합하고 절단한다. 이어서, 이들 효소는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 cry1F 유전자 삽입물을 특성화하기 위해 선택되었다. > 5569 bp 및 > 9479의 경계 단편은 각각 NdeI 및 NsiI 소화 이후에 프로브에 의해 혼성화될 것으로 예상되었다 (표 7). NdeI 및 NsiI를 사용할 경우에, 각각 -7500 bp 및 >10000 bp의 단일 cry1F 혼성화 밴드가 관찰되었다. 이러한 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 게놈 내에 cry1F 유전자에 대한 단일 삽입 부위의 존재를 시사한다. 제한 효소 HindIII은 cry1F 식물 전사 단위 (PTU; 프로모터/유전자/종결인자)를 함유하는 단편을 방출시키기 위해 선택되었다 (표 7). HindIII 소화 후에 프로브에 의해 예상 7732 bp 단편이 관찰되었다. pDAB9582.816.15.1 샘플의 효소 소화에 이은 프로브 혼성화에 의해 수득된 결과는, 플라스미드 pDAB9582로부터의 무손상 cry1F PTU가 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 나타내었다.
실시예 4.6: 백본 서열의 부재
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내에서 스펙티노마이신 저항성 유전자 (specR), Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA (trf A 요소)의 부재를 확인하기 위해 서던 블롯 분석을 또한 수행하였다. 적절한 양성 (매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582) 및 음성 (매버릭 게놈 DNA) 대조군을 서던 분석에 포함시킬 경우에, 스펙티노마이신 저항성, Ori Rep 요소 또는 trf A 요소에 대한 특이적인 혼성화는 예상되지 않는다. NsiI 소화 및 specR 특이적 프로브에 의한 혼성화에 따라, 양성 대조군 샘플 (매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582)에서 15320 bp의 하나의 예상되는 크기의 밴드가 관찰되었다. specR 프로브는 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 샘플에는 혼성화하지 않았다. 유사하게, NsiI 소화 및 trfA 프로브에 의한 혼성화 이후에, 15320 bp의 하나의 예상되는 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (pDAB9582 플러스 매버릭)에서는 검출되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 샘플에서는 부재하였다. NdeI 소화 및 OriRep 특이적 프로브에 의한 혼성화 이후에, 5329 bp의 또 다른 예상되는 크기의 밴드가 양성 대조군 샘플 (매버릭 게놈 DNA에 첨가된 pDAB9582)에서는 검출되었으나, 음성 대조군 및 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 샘플에서는 부재하였다. 이들 데이터는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내에서의 스펙티노마이신 저항성 유전자, Ori Rep 요소 및 복제 개시 단백질 trfA의 부재를 나타낸다.
실시예 5: 농경학 및 수율 필드 실험 및 제초제 내성
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 농경학상 효능을 눌 모본 - 매버릭과 비교하기 위해 반복된 농경학 실험을 수행하였다. 대부분의 필드 실험은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 대두 품종이 재배되는 미국 전역에 걸쳐 별개의 지리적 위치에서 식재되었다. 이들 위치 이외의 곳에서 추가의 필드 실험을 완료하였고, 이는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 대두 품종을 비-바람직한 위치에서 성장시킴으로 인해 발생하는 잠재적인 스트레스에 노출시키기 위해 선택되었다. 소수의 필드 실험 내에서의 환경적 가변성으로 인해, 일부 부위에서의 연구는 중단되었다.
실험은 무작위 완전 블록 설계로 설정하고 위치당 2회차로 하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 포함하여 8 엔트리가 존재하였다. 각각의 획지는 2 열로 12.5 피트의 길이로 이루어졌고, 30인치 떨어져서 식재되었다. 전체 시기에 걸쳐서, 필드 획지를 정상적인 농경학적 실시 하에 유지시키고 잡초가 없도록 하였다.
푸에르토리코에서의 겨울 묘포에서 연구를 위한 종자를 생산하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 종자를 동일한 묘포에서 성장시키고 유사한 방식으로 처리하여 임의의 종자 공급원 가변성을 최소화하였다. 다음으로, 종자를 북미로 다시 옮겨 포장하고 다양한 식재 위치로 배포하였다. 시기 전체에 걸쳐 다수의 농경학적 특성을 측정하였다. 데이터를 수집했을 때의 이들 특성 및 성장 단계는 표 8에 열거되어 있다.
<표 8> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 매버릭과 비교하기 위한, 필드 실험에서 측정된 농경학적 특성의 목록
성장 시기의 말미에, 모든 위치로부터의 데이터를 조합하고, 위치 횡단 분석을 수행하였다. 데이터 분석은 JMP® Pro 9.0.3 (SAS, 노스캐롤라이나주 캐리)을 사용하여 수행하였다. 엔트리가 고정 효과로 간주되고, 위치, 엔트리에 따른 위치 및 복제 효과가 무작위인 것으로 간주되는 경우에 혼합 모델을 분석을 위해 사용하였다. 분석으로부터의 최소 제곱 평균을 표 9에 보고한다. 유의한 엔트리 효과가 측정되는 변수에 대해서는 스튜던트 T 검정을 사용하여 후속 평균 분리를 수행하여 매버릭과 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 비교하였다. 유의성을 결정하기 위한 확률 수준은 p=0.05에서 설정되었다.
<표 9> 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1과 매버릭을 비교하는 위치 횡단 분석으로부터의 최소 제곱 평균. 동일한 글자로 연결되지 않은 수준은 스튜던트 T 검정에 따르면 p=0.05에서 유의하게 상이하다.
개화까지의 일수, 성숙 및 100 종자 중량을 제외하고 측정된 모든 형질은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1과 매버릭 사이에서 동등한 것으로 나타났다. 대두 이벤트 pDAB.816.15.1은 매버릭에 비해 약 2일 늦게 개화되었다. 2일의 지연은 생산자에게는 심각한 지연이 아니며, 작물 성능을 손상시키지 않는다. 획지에서 대략 50%의 식물이 꽃을 피우는 것으로 나타났을때 획지는 개화된 것으로 간주되었다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15는 또한 시즌 말미에 매버릭보다 1일 늦게 성숙되었지만, 이러한 지연은 작물 성능을 손상시킬 유의한 농경학적 차이를 야기하지 않았다. 유사하게, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15의 100 종자 중량은 매버릭과 통계학상 상이하였지만, 수율에 있어서 유의한 감소를 야기하지 않았다. 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15가 매버릭과 상이하게 발생할 수 있지만, 그러한 차이는 최소한이며 상업적으로 성장시킨 대두의 정상 범위를 벗어나지 않음을 나타낸다.
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 제초제 내성을 시험하기 위해, 이벤트를 효능 실험에서 푸에르토리코 산타 이사벨에 식재하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 생산하도록 본래 형질전환된 재배품종 매버릭을 각각의 묘포에 식재하고 대조군으로서 실험에 포함시켰다. T3 묘포용 종자는 T2 단계에서 단일 식물 선택으로부터 유래되었고, T4 묘포용 종자는 T3 단계에서 단일 식물 선택으로부터 유래되었다. 4개 계통의 이벤트를 각 세대별로 시험하였다. 각 계통을 4 열 너비 및 7.5 피트 길이의 획지에 식재하였다. 열 사이의 간격은 30 인치였다. 획지를 대략 2.5 주 동안 조명 하에 성장시켜 푸에르토리코의 짧은 광주기를 보완하였다. 각 묘포에 글루포시네이트를 411 g ae/ha의 비율로 분무하였다. 대조군 식물 매버릭의 하나의 획지에 동일한 비율로 글리포시네이트를 분무하였고, 두번째 획지에는 분무하지 않고 이벤트에 대한 대조군 비교로서 사용하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1은 글리코시네이트 제초제 적용에 내성을 나타냈다. 대조적으로, 매버릭 식물은 어떤 것도 제초제 처리에 대해 내성이 없었다.
실시예 6: 대두 이벤트 pDAB 9582.816.15.1에 대한 살곤충 활성의 특성화
안티카르시아 겜마탈리스 (벨벳콩 모충), 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레), 스포도프테라 프루기페르다 (가을 거염벌레) 및 헬리오티스 비레센스 (담배나방)를 비롯한 하기 인시류 곤충을 포함하는 대두 해충에 대해 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 내의 Cry1Ac 및 Cry1F 단백질에 의해 제공되는 식물 보호 수준을 특성화하기 위해 필드 및 온실 평가를 수행하였다.
온실 실험은 대략 4주령의 식물에 대해 수행하였다. 15그루의 식물을 사용하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 대조군을 평가하였다. 시험된 각각의 곤충 종 (에이. 겜마탈리스, 피. 인클루덴스 및 에스. 프루기페르다 부화 유충)에 대해 각 식물로부터 3개의 잎 절편을 잘라내어, 곤충 종당 식물당 총 45개의 잎 절편으로 하였다. 1.4 cm 잎 펀치를 2% 물 한천 상의 시험장에 놓고, 1마리의 부화 유충을 침입시키고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다.
침입 이후의 사멸률 및 잎 소모를 평가하였다. 온화한 프로빙에 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 식물 물질 상에 놓인 곤충의 사멸률은 매버릭 대조군 상에 놓인 곤충보다 유의하게 더 높았다 (스포도프테라 프루기페르다의 경우에 86% 사멸률, 안티카르시아 겜마탈리스의 경우에 100% 사멸률, 및 슈도플루시아 인클루덴스의 경우에 100% 사멸률). 표 10. 잎 손상은 곤충에 의해 소모된 잎 절편의 백분율을 육안으로 점수를 매겨 평가하였다. 온실 실험으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1이 매버릭 대조군 식물과 비교하여 안티카르시아 겜마탈리스, 슈도플루시아 인클루덴스 및 스포도프테라 프루기페르다의 침입에 대해 유의하게 더 낮은 잎 손상 및 더 높은 곤충 사멸률을 보유함을 나타내었다.
필드-성장 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 식물의 효능 평가는 푸에르토리코 산타 이사벨에 있는 종자 증식 묘포 획지로부터 잎 샘플을 수집하고, 이들 잎을 생물검정을 위해 미국 인디애나주 인디애나폴리스로 보내어 수행하였다. T3 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 식물을 위한 묘포 획지는 4열로 배열된 대략 180그루의 식물로 이루어졌다. 각각의 열은 2.3 m 길이에 76.2 cm 이격되었고; 개별 식물은 각각의 열 내에서 5.1 cm 이격되었다. 생물검정은 분열조직으로부터 대략 4 마디 아래에 위치한 하나의 완전히 펼쳐진 주 줄기 삼출엽에 대해 수행하였다. 삼출엽 조직을 10그루의 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 보유하는 개별 대두 식물 및 10그루의 매버릭 식물에서 떼어내었다. 잎을 포장하여 실험실로 옮겼다. 실험실에서, 1 또는 2개의 3.33 cm 직경의 잎 절편을 각각의 삼출엽으로부터 펀칭하여 총 16개의 잎 절편을 제공하였다. 각각의 잎 절편을 2% 한천 상의 시험장에 놓고, 1마리의 부화 에스. 프루기페르다 유충을 침입시키고, 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉하였다. 잎 절편을 제어된 환경 챔버 내에서 7일 동안 유지시키고, 이때 사멸률 및 잎 소모를 평가하였다. 온화한 프로빙에 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 잎 손상은 곤충에 의해 소모된 잎 펀치의 백분율을 육안으로 점수를 매겨 평가하였다.
침입 이후의 사멸률 및 잎 소모를 평가하였다. 온화한 프로빙에 반응하지 않는 유충은 죽은 것으로 간주하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 식물 물질 상에 놓인 곤충의 사멸률은 매버릭 대조군 상에 놓인 곤충 (스포도프테라 프루기페르다의 경우에 0% 사멸률)보다 유의하게 더 높았다 (스포도프테라 프루기페르다의 경우에 68% 사멸률). 표 10. 잎 손상은 곤충에 의해 소모된 잎 절편의 백분율을 육안으로 점수를 매겨 평가하였다. 이러한 잎 생물검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 스포도프테라 프루기페르다 유충이 메버릭 대조군 식물에 노출된 스포도프테라 프루기페르다 유충에 비해 유의하게 더 낮은 잎 손상 및 곤충 생존 (또한 더 높은 곤충 사멸률로 기재됨)을 보유함을 나타내었다.
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 효능은 제1 필드 실험에서 평가하였다 (표 10의 제1 필드 실험). 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 T4 세대로부터의 대두 종자, 및 비형질전환된 대두 품종인 매버릭의 종자를 무작위 완전 블록 설계로 2회차로 식재하였다. 각 회차의 획지는 2열의 2.3 m 길이로 이루어졌고, 0.76 m 이격되었다. 열당 40개의 종자를 열 내에서 5.7 cm 이격되게 식재하였다. 실험을 식재하고, 한 회차에는 글루포시네이트 제초제를 411 g ae/ha로 분무하고, 다른 회차에는 분무하지 않음으로써, 생물검정을 위해 분무되지 않은 회차에서만 매버릭 식물이 생존하게 하였다.
대두 식물이 R2 성장 단계일 때 생물검정을 위한 잎을 수집하였다. 생물검정을 위해 잎을 수집하기 수일 이전에, 동일한 식물 상의 1 마디 더 아래의 잎 (및 더 노화된 잎)으로부터 잎 펀치를 취하고, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 ELISA 방법을 사용하여 Cry 1Ac 및 Cry 1F 단백질의 발현에 대해 분석하였다 (표 12). 생물검정을 위해 손상 또는 변색의 어떤 징후도 나타내지 않는, 분열조직으로부터 4 마디 아래에 위치한, 완전히 펼쳐진 주 줄기 삼출엽을 떼어내었다. 단일 삼출엽을 회차당 15그루의 식물의 각각으로부터 떼어내었다. 잎을 15℃에서 저장하고 생물검정하였다. 각각의 삼출엽의 소엽을 떼어내고, 단일의 3.33 cm 직경의 절편을 각각의 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 소엽의 중심으로부터 잘라내고, 2개의 3.33 cm 직경의 절편을 각각의 매버릭 소엽으로부터 잘라내었다. 이들 잎 절편을 32-웰 플라스틱 생물검정 트레이의 분리 및 표지된 웰에 개별적으로 넣었고; 각각의 웰은 한천 박층을 함유하였다. 단일의 부화 피. 인클루덴스 유충, 부화 에이. 겜마탈리스 유충 또는 부화 에스. 프루기페르다 유충을 각각의 잎 절편에 놓았다. 생물검정 트레이를 천공된 접착성 플라스틱 시트로 밀봉하여 통풍되게 하였다. 각각의 종에 대해, 30마리의 유충은 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1로부터의 잎 조직에 노출시키고, 30마리의 유충은 매버릭으로부터의 잎 조직에 노출시켰다. 침입된 잎 절편이 담긴 플라스틱 트레이를 25℃ 및 40% 상대 습도 (RH)로 유지시켰다. 7일 후, 유충이 죽었는지 (예리한 프로브로 자극했을 때 움직임이 없음), 발육이 저해되었는지 (매버릭 잎에 붙어있는 유충에 비해 크기가 작음), 또는 살아있는지 (크기가 정상이며 자극에 반응함) 결정하였다.
침입 이후의 사멸률을 평가하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 식물 물질 상에 놓인 곤충의 사멸률은 매버릭 대조군 상에 놓인 곤충보다 유의하게 더 높았다 (스포도프테라 프루기페르다의 경우에 97% 사멸률, 안티카르시아 겜마탈리스의 경우에 100% 사멸률, 및 슈도플루시아 인클루덴스의 경우에 100% 사멸률). 표 10. 이러한 잎 생물검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 스포도프테라 프루기페르다, 안티카르시아 겜마탈리스 및 슈도플루시아 인클루덴스 유충이 매버릭 대조군 식물에 노출된 스포도프테라 프루기페르다, 안티카르시아 겜마탈리스 및 슈도플루시아 인클루덴스 유충보다 유의하게 더 낮은 곤충 생존 (또한 더 높은 곤충 사멸률로 기재됨)을 보유함을 나타내었다.
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 효능을 제2 별개의 필드 실험에서 평가하였다 (표 10의 제2 필드 실험). 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 T4 세대로부터의 대두 종자 및 비형질전환된 대두 품종인 매버릭의 종자를 무작위 완전 블록 설계로 4회차로 식재하였다. 각 회차의 획지는 4열의 6.1 m 길이로 이루어졌고, 1.02 m 이격되었다. 열당 160개의 종자를 열 내에서 3.8 cm 이격되게 식재하였다. 실험 획지 사이 및 그 주변에 추가의 열의 매버릭을 식재하여 천연 곤충 해충 집단을 유인하였다.
대두 식물이 R2 성장 단계일 때 생물검정을 위한 잎을 수집하였다. 대두 식물이 R5 성장 단계일 때 동일한 식물로부터 추가의 생물검정을 위한 잎을 수집하였다. 각각의 생물검정을 위해 잎을 수집하기 수일 이전에, 동일한 식물 상의 1 마디 더 아래의 잎으로부터 잎 펀치를 취하고, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 ELISA 방법을 사용하여 Cry 1Ac 및 Cry 1F 단백질에 대해 분석하였다 (표 12). 생물검정을 위해 손상 또는 변색의 어떤 징후도 나타내지 않는, 분열조직으로부터 4 마디 아래에 위치한, 완전히 펼쳐진 주 줄기 삼출엽을 떼어내었다. 단일 삼출엽을 회차당 15그루의 식물의 각각으로부터 떼어내었고; 회차당 4개의 삼출엽은 피. 인클루덴스의 생물검정을 위해 사용하였고; 회차당 4개의 삼출엽은 에스. 프루기페르다의 생물검정을 위해 사용하였고; 회차당 4개의 삼출엽은 에이치. 비레센스의 생물검정을 위해 사용하였고; 회차당 3개의 삼출엽은 에이. 겜마탈리스의 생물검정을 위해 사용하였다. 각각의 삼출엽에서 2개의 측면 소엽을 떼어내고, 한천 박층을 함유하는 분리 및 표지된 페트리 플레이트에 넣었다. 피. 인클루덴스, 에이. 겜마탈리스, 에스. 프루기페르다 또는 에이치. 비레센스의 2마리의 제2령 유충을 각각의 소엽에 놓았다. 피. 인클루덴스, 에스. 프루기페르다 및 에이치. 비레센스에 대해, 64마리의 유충을 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 식물로부터의 잎 조직에 노출시켰다. 에이. 겜마탈리스에 대해서는 48마리의 유충을 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 대조군 식물로부터의 잎 조직에 노출시켰다. 침입된 소엽이 담긴 페트리 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 25℃ 및 40% RH로 유지시켰다. 4일 후, 유충이 죽었는지 (예리한 프로브로 자극했을 때 움직임이 없음), 죽기 직전인지 (유충이 자극에 대해 반응하지만 뒤집어진 경우에 스스로 바로잡을 수 없음), 발육이 저해되었는지 (매버릭 잎에 붙어있는 유충에 비해 크기가 작음), 또는 살아있는지 (크기가 정상이며 자극에 반응함) 결정하였다.
R5 단계에서의 생물검정 절차는, 에스. 프루기페르다 및 에이치. 비레센스의 경우에 각각의 삼출엽으로부터 모든 3개의 소엽을 떼어내고 단일의 제2령 유충을 각각의 소엽에 놓은 것을 제외하고, R2 단계에 사용된 절차와 동일하였다. 이는 48마리의 에스. 프루기페르다 및 에이치. 비레센스의 유충이 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭으로부터의 소엽에 노출되게 한다.
R2 및 R5 잎 생물검정 둘 다에 대해 침입 이후의 사멸률을 평가하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 식물 물질 상에 놓인 곤충의 사멸률은 매버릭 대조군 상에 놓인 곤충보다 유의하게 더 높았다 (스포도프테라 프루기페르다의 R2 잎 생물검정의 경우에 69% 사멸률 및 R5 잎 생물검정의 경우에 54% 사멸률, 안티카르시아 겜마탈리스의 R2 및 R5 잎 생물검정 둘 다의 경우에 100% 사멸률, 헬리오티스 비레센스의 R2 잎 생물검정의 경우에 95% 사멸률 및 R5 잎 생물검정의 경우에 70% 사멸률, 및 슈도플루시아 인클루덴스의 R2 잎 생물검정의 경우에 100% 사멸률 및 R5 잎 생물검정의 경우에 98% 사멸률). 표 10. 이러한 잎 생물검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 스포도프테라 프루기페르다, 안티카르시아 겜마탈리스, 슈도플루시아 인클루덴스 및 헬리오티스 비레센스 유충이 매버릭 대조군 식물에 노출된 스포도프테라 프루기페르다, 안티카르시아 겜마탈리스, 슈도플루시아 인클루덴스 및 헬리오티스 비레센스 유충보다 유의하게 더 낮은 곤충 생존 (또한 더 높은 곤충 사멸률로 기재됨)을 보유함을 나타내었다.
제2 필드 실험에서 성장한 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 대두 식물로부터 대두 꼬투리를 수집하고, 에이치. 비레센스 유충으로 생물검정하였다. 각 회차의 획지 내에서 무작위로 선택된 6그루의 식물로부터 주 줄기 상의 2개의 최상부 꼬투리를 떼어내었다. 각각의 꼬투리 세트를 플라스틱 페트리 디쉬에 넣고, 단일의 제2령 에이치. 비레센스 유충을 침입시켰다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 대조군 식물로부터 수확한 한 세트의 꼬투리에 24마리의 유충이 노출되도록 실험을 설계하였다. 페트리 디쉬를 앞서 기재한 떼어낸 잎 생물검정과 동일한 조건 하에 유지시켰다. 2일 후에, 잎 생물검정에 대해 기재된 절차를 사용하여 에이치. 비레센스 유충의 생존을 관찰하였다.
대두 꼬투리의 침입 이후의 사멸률을 평가하였다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1을 함유하는 대두 꼬투리 상에 놓인 곤충의 사멸률은 매버릭 대조군 꼬투리 상에 놓인 곤충보다 유의하게 더 높았다 (헬리오티스 비레센스의 대두 꼬투리 생물검정의 경우에 50% 사멸률). 표 10. 이러한 필드-성장 대두 꼬투리에 대한 검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 헬리오티스 비레센스 유충이 매버릭 대조군 식물에 노출된 헬리오티스 비레센스 유충보다 유의하게 더 낮은 곤충 생존 (또한 더 높은 곤충 사멸률로 기재됨)을 보유함을 나타내었다.
필드 내의 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 및 매버릭 대조군 대두 식물의 말단 (2 내지 3개의 펼쳐진 삼출엽 및 미성숙 꼬투리 다발을 보유하는 주 줄기의 최상부 섹션)에 에이치. 비레센스의 알을 침입시켰다. 에이치. 비레센스로부터의 대략 20개의 알이 담긴 치즈 천 섹션을 각 회차의 획지 내에서 무작위로 선택된 5그루의 식물의 말단에 놓고 (총 20그루의 식물이 시험됨), 플라스틱으로 덮인 종이 클립으로 고정시켰다. 천 메쉬 백을 말단에 위치시키고, 메쉬 백의 개방된 끝을 꼬아 매듭지어 주 줄기에 단단히 고정시켰다. 대표적인 메쉬 백 세트에서 알의 부화를 매일 모니터링하였다. 모든 알이 부화된 후, 5그루의 식물에 부착된 각 메쉬 백 내에서 살아있는 에이치. 비레센스 유충의 개수를 계수하였다.
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 대두 말단에 놓아둔 살아있는 곤충 유충의 평균 수는 매버릭 대조군의 말단에 놓아둔 곤충보다 유의하게 더 낮았다 (헬리오티스 비레센스의 대두 말단 생물검정의 경우에 곤충의 개수는 0.00). 표 11. 이러한 검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 헬리오티스 비레센스 유충이 매버릭 대조군 식물에 노출된 헬리오티스 비레센스 유충보다 유의하게 더 낮은 곤충 생존 개수를 보유함을 나타내었다.
실험 획지 내의 천연 피. 인클루덴스 유충의 계수는 4주의 기간에 걸쳐 매주 1회 수행하였다. 각각의 획지의 중심의 2개의 열을 샘플링하였다. 중심의 2개의 열 사이의 무작위로 선택된 위치에 91 cm x 91 cm 백색 천을 놓아두었다. 시트의 한쪽 가장자리에 인접한 열의 섹션 내 식물은 천에 걸려 구부러졌고, 15회 흔들어 존재하는 임의의 곤충을 털어내었다. 이러한 과정을 천의 반대쪽 가장자리의 열에서도 반복하였다. 유충을 종 및 크기별로 계수하였다: 유충 < 6 mm 길이는 소형 유충으로 계수하고, 유충 ≥ 6 mm 길이는 대형 유충으로 계수함. 다음 측정 이전에 천에서 모든 곤충을 제거하였다. 천을 2개의 중심 열 사이의 무작위로 선택된 두번째 위치로 옮기고 샘플링 과정을 반복하여, 각 샘플링 날짜에 획지당 2개의 하위샘플을 생성시켰다.
대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 1.82 m 열에 걸쳐 계수된 곤충의 평균 수는 매버릭 대조군의 1.82 m 열에 걸쳐 계수된 곤충의 개수보다 유의하게 더 낮았다 (슈도플루시아 인클루덴스의 경우에 곤충의 개수는 0.00). 표 11. 이러한 검정으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에의 슈도플루시아 인클루덴스의 침입은 매버릭 대조군 식물에 노출된 슈도플루시아 인클루덴스의 침입보다 유의하게 더 낮음을 나타내었다.
이들 반복된 실험으로부터 수득된 결과는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1에 노출된 인시류 유충은 시험된 모든 곤충 종에 있어서 매버릭 대조군 식물에 노출된 유충보다 유의하게 더 낮은 생존을 보유함을 나타내었다. 따라서, 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1은 이러한 넓은 범위의 해충 곤충에 대해 살곤충 활성을 갖는다.
<표 10> 대조군 매버릭 식물과 비교하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1로부터의 대두 잎 및 꼬투리 물질에 대해 생물검정된 인시류 곤충에 대한 곤충 사멸률 계수
<표 11> 대조군 매버릭 식물과 비교하여 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 상에 존재하는 살아있는 인시류 곤충의 평균 수
<표 12> 곤충 생물검정에 사용된 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1 식물 물질로부터 단리된 상이한 트랜스제닉 단백질의 평균 발현 수준
실시예 7: 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 예상 서열
서열 14는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 예상 서열을 제공한다. 이 서열은 5' 게놈 플랭킹 서열, pDAB9582의 예상 T-가닥 삽입물 및 3' 게놈 플랭킹 서열을 함유한다. 서열 14와 관련하여, 잔기 1-1273은 5' 게놈 플랭킹 서열이고, 잔기 1274-13658은 pDAB9582 T-가닥 삽입물의 잔기이고, 13659 - 13821은 pDAB9582 플라스미드로부터의 재배열 잔기이고, 잔기 13822 - 15170은 3' 플랭킹 서열이다. 따라서, 삽입물의 5' 말단과 관련하여 접합부 서열 또는 전이는 서열 14의 잔기 1273 - 1274에서 발생한다. 따라서, 삽입물의 3' 말단과 관련하여 접합부 서열 또는 전이는 서열 14의 잔기 13658 - 13659에서 발생한다.
서열 14는 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 예상안이고, 서열 1, 서열 2, 및 pDAB9582의 t-가닥의 정렬로부터 어셈블리되었음을 주목해야 한다. 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 T-가닥 삽입물의 실제 서열은 서열 14와 약간 다를 수 있다. T-가닥 삽입물을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 형질전환 과정 동안, 삽입물의 일부 결실 또는 다른 변경이 일어나는 것은 드물지 않다. 또한, PCR 증폭에서 오류가 발생할 수 있고, 이는 미미한 서열분석 오류를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에 열거된 플랭킹 서열은 대두 게놈 DNA로부터 앰플리콘을 생성한 후, 앰플리콘을 클로닝하고 서열분석함으로서 결정되었다. 게놈 DNA로부터 서열분석을 위한 충분한 앰플리콘을 생성하기 위해 필요한 많은 증폭 라운드를 고려하면, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 통상의 기술자는 이러한 유형의 통상적인 서열분석 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 보정이 본 개시내용의 범위에 속한다는 것을 인식하고 이에 주의해야 한다. 따라서, 본원에 제공된 플라스미드 서열의 관련 절편은 일부 미미한 변이를 포함할 수 있다. 따라서, 본 삽입물 서열과 일부 범위의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물은 본 개시내용의 범위에 속한다. 서열 14의 서열에 대한 동일성은 본원에 예시 또는 기재된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 플랭킹 서열 플러스 삽입물 서열의 서열은 기탁된 종자를 참고로 하여 확인될 수 있다. 따라서, 서열 14와 대두 이벤트 pDAB9582.816.15.1의 실제 T-가닥 삽입물 사이의 일부 차이가 확인될 수 있다.
본 개시내용의 원리를 예시 및 기재하였으나, 본 개시내용은 이러한 원리로부터 벗어나지 않고 배열 및 세부 내용이 변형될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명자들은 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 있는 모든 변형을 청구한다.
본 명세서에 인용된 모든 공개물 및 공개 특허 문헌은, 각각의 개별 공개물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본원에 참조로 포함된다고 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Dow Agrosciences LLC
<120> INSECT RESISTANT AND HERBICIDE TOLERANT SOYBEAN EVENT
9582.816.15.1
<130> 70971
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1577
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 1
atatcgatcc cggagggagt gagtagagag gaaatacact aacactggga tcgcacttct 60
actccaggtt ccgataaaca ataagtaaat aaaatactac tactttatca tagtttaatt 120
aacaaaatta tatatactgg tataaaattt aatactttaa ataatcatgt gattttttat 180
tatctaatta gtattttaat agtttcatta tatattggtg aaaaattaaa atatcaaata 240
tttcatttat acgttattat aataatataa tattttaaat atacactata ttaaaaataa 300
atttatacaa cttgataatt attacattta tgtatcttaa ttaaaataat tagtaaaaga 360
ataaatttaa attaaatatt tttaataaat agaaagttgt gtgataactt tttttatagt 420
gtaagaaaaa aggcaaatca aacaaagaag ttacaccctt aggatcgaga cacttagagc 480
atcagtaaca agcaagtcca acgagagacg atcaacccta gaaattatca tgccataatt 540
tagcccaaac ttaacaagat aattagtact cctattgcct tctctcgatg aatgcacaaa 600
ttgaacactc aaatcttcct tcacaaagtc acgaatgctt ttcacaattg tgcataacaa 660
tgatacactt gtggcggatg aattccagac acagaatatt aacatactcc aactcccaag 720
caattcttaa gccatgcaac agtgtcaata actcagcctt aacaatattt gttgaaccaa 780
tatcaccata gaaaccatat atctaagacc cattaatgtt acgaagcagc ccaccaaatc 840
ttgcatgccc aagattcctt tagcaacttc catccacaag ttatgaaaca ctgacatgta 900
tacggacatt ggacatgaca cggacacgta gatatctgta atgttcaaaa tatagaacgt 960
agtataggtg ttgtgtcagt gtcagacact aacatggatg cgtatcagac accgaacacg 1020
gtaagggatt ggagtatccg tgcttcatag tccacaagca aggatgattc aagaacttaa 1080
gaaacttaaa gtaaaattat tttttgacat atattagtat taaaattttt tattgaggta 1140
tattagtact aatttttttt tattaaaatt tatttttaaa cataatttta taataaattt 1200
ttttggagat atattagtac ttaaaagaaa ttagatcttt tttttttggg gtttaaagtc 1260
cttgctgctt ggaccagtca gcatcatcac accaaaagtt aggcccgaat agtttgaaat 1320
tagaaagctc gcaattgagg tctacaggcc aaattcgctc ttagccgtac aatattactc 1380
accggatcct aaccggtgtg atcatgggcc gcgattaaaa atctcaatta tatttggtct 1440
aatttagttt ggtattgagt aaaacaaatt cggcgccatg cccgggcaag cggccgcaca 1500
agtttgtaca aaaaagcagg ctccgcggtg actgactgaa aagcttgtcg acctgcaggt 1560
caacggatca ggatatt 1577
<210> 2
<211> 1687
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 2
gcacatagac acacacatca tctcattgat gcttggtaat aattgtcatt agattgtttt 60
tatgcataga tgcactcgaa atcagccaat tttagacaag tatcaaacgg atgtgacttc 120
agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgatttgcg 180
gtgggcaagg ctctctttca gaaagacagg cggccaaagg aacccaaggt gaggtgggct 240
atggctctca gttccttgtg gaagcgcttg gtctaaggtg cagaggtgtt agcgggatga 300
agcaaaagtg tccgattgca atctggttgc cagtagcttg aatacactag acccatgttg 360
gtggcttgca agtcgtatta tcagtgttcc tgcttccttc aaaagtttga acgatattat 420
tataaagaga aagagtgttg tggataatct aatgaggctg gaccacgtta ttctcaagat 480
ctaagcattc catatacccc attgaaagat atgaagaatt atgtcaccat gctccaagtg 540
cttattaagc tactccagct aactagtatt tgaatcaggc ctcacaacat gtactttcaa 600
ggtgtcccaa acgcgccaaa cattaccaca gtgccaaaaa gatgtgaaag agttcctcat 660
cggcaacccc acaacgatta caattcgcat taggaaggac atgaatcatt ttcatgaaac 720
tcttggtggg aagaacattg tgatctatct gccataagaa aaattcacgt tctcaagaag 780
atgaataaat atataacaaa taaaaatata ataatatcaa gttataaata aaatttctat 840
ccctcatgtt tactcgcaag tggggtaaat gtgaaatttt tgtttttttt ttttacaata 900
ttttttgttt ccttttttaa tcgtcttaaa aagtcagccg gttttcctat atgtaaaaat 960
gaactgatcc aacggctagt ataactctcc cacggttgga catgtgatgg tctctcaccc 1020
tagccaccgt cccgttacat agcccacaat agctgaagtc cgtcagaaaa cttacaaaag 1080
cggtgcgttt caagggatac aagacatgca gcagccgttg ctctaaaccc taaactaaac 1140
taaaacccta gccagttgtc ggtgatcacc atttgtgtaa aaccgtcatg gcgatgaaaa 1200
ctgcagaaga acacgaagtg ggtatctcct gcttcatttc cgaccttcct ggcttccgcg 1260
gaattttaaa gcaaaggtct cttcattttc tacattaaaa atcattatta ccttcctcac 1320
tgcacctcct ttgtttaatg atgaagtgca ttattcaaca gtgtcttgtt agtgctgatt 1380
caattgaata tgattcaggt attctgattt tatcgtgaat gaagtggaca gagatggaac 1440
agttgttcaa ttgtcctcgc ttgatgcccc tcaagaggag ccagaggtct aattatccgt 1500
gatcattgat aaattgattt gtgctgtttt tgttttttag tatctaactt tttttgggct 1560
tatttcagag ttttcaggaa aatggaacca acacatccga caatgttgta agttatgcct 1620
ctcagattga atctttcaag tctcttgctg gggactctga tgctgttctt ttggaagaat 1680
ttattaa 1687
<210> 3
<211> 12381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid sequence of pDAB9582
<400> 3
agtcagcatc atcacaccaa aagttaggcc cgaatagttt gaaattagaa agctcgcaat 60
tgaggtctac aggccaaatt cgctcttagc cgtacaatat tactcaccgg atcctaaccg 120
gtgtgatcat gggccgcgat taaaaatctc aattatattt ggtctaattt agtttggtat 180
tgagtaaaac aaattcggcg ccatgcccgg gcaagcggcc gcacaagttt gtacaaaaaa 240
gcaggctccg cggtgactga ctgaaaagct tgtcgacctg caggtcaacg gatcaggata 300
ttcttgttta agatgttgaa ctctatggag gtttgtatga actgatgatc taggaccgga 360
taagttccct tcttcatagc gaacttattc aaagaatgtt ttgtgtatca ttcttgttac 420
attgttatta atgaaaaaat attattggtc attggactga acacgagtgt taaatatgga 480
ccaggcccca aataagatcc attgatatat gaattaaata acaagaataa atcgagtcac 540
caaaccactt gcctttttta acgagacttg ttcaccaact tgatacaaaa gtcattatcc 600
tatgcaaatc aataatcata caaaaatatc caataacact aaaaaattaa aagaaatgga 660
taatttcaca atatgttata cgataaagaa gttacttttc caagaaattc actgatttta 720
taagcccact tgcattagat aaatggcaaa aaaaaacaaa aaggaaaaga aataaagcac 780
gaagaattct agaaaatacg aaatacgctt caatgcagtg ggacccacgg ttcaattatt 840
gccaattttc agctccaccg tatatttaaa aaataaaacg ataatgctaa aaaaatataa 900
atcgtaacga tcgttaaatc tcaacggctg gatcttatga cgaccgttag aaattgtggt 960
tgtcgacgag tcagtaataa acggcgtcaa agtggttgca gccggcacac acgagtcgtg 1020
tttatcaact caaagcacaa atacttttcc tcaacctaaa aataaggcaa ttagccaaaa 1080
acaactttgc gtgtaaacaa cgctcaatac acgtgtcatt ttattattag ctattgcttc 1140
accgccttag ctttctcgtg acctagtcgt cctcgtcttt tcttcttctt cttctataaa 1200
acaataccca aagcttcttc ttcacaattc agatttcaat ttctcaaaat cttaaaaact 1260
ttctctcaat tctctctacc gtgatcaagg taaatttctg tgttccttat tctctcaaaa 1320
tcttcgattt tgttttcgtt cgatcccaat ttcgtatatg ttctttggtt tagattctgt 1380
taatcttaga tcgaagacga ttttctgggt ttgatcgtta gatatcatct taattctcga 1440
ttagggtttc ataaatatca tccgatttgt tcaaataatt tgagttttgt cgaataatta 1500
ctcttcgatt tgtgatttct atctagatct ggtgttagtt tctagtttgt gcgatcgaat 1560
ttgtcgatta atctgagttt ttctgattaa cagagatctc catggagaac aatatccaga 1620
accagtgtgt cccatacaat tgcctcaaca atcctgaagt tgagatcctc aacgaagaga 1680
ggagcactgg acgccttccc cttgacatct ccctctccct cacaaggttc cttttgtctg 1740
agtttgttcc tggtgtgggt gtggcctttg gcctctttga cctcatctgg ggcttcatca 1800
ccccatctga ttggagcctc ttccttctcc agattgaaca attgattgag cagaggattg 1860
agacccttga aaggaacaga gccatcacca cacttcgtgg ccttgctgac agctatgaaa 1920
tctacattga agcactccgt gagtgggaag ccaatcccaa caatgctcaa ctccgtgaag 1980
atgtgaggat tcgctttgcc aacacagatg acgctttgat cacagccatc aacaatttca 2040
ccctcaccag ctttgagatc cctttgctct cagtctatgt tcaagctgca aacctccact 2100
tgagcttgct tagggatgct gtgtccttcg gacaaggttg gggacttgac atagccactg 2160
tcaacaatca ctacaacaga ctcatcaact tgattcatcg ctacaccaaa cattgcttgg 2220
acacctacaa tcaaggattg gagaacctca gaggcaccaa cactcgccaa tgggcaaggt 2280
tcaaccagtt tagaagggat ctcacactca ctgtgcttga catagttgct ctcttcccca 2340
actatgatgt tcgcacctac ccaattcaaa ccagctccca acttacaagg gaaatctaca 2400
cctcctcagt cattgaggac agcccagttt ctgccaacat acccaatggt ttcaaccgtg 2460
ctgagtttgg tgtcagacca ccccatctca tggacttcat gaactccttg tttgtgactg 2520
ccgagactgt taggtcccaa actgtgtggg gaggccacct tgttagctcc cgcaacaccg 2580
ctggcaaccg catcaacttc ccatcctatg gggttttcaa tcctggtgga gccatctgga 2640
ttgcagatga ggacccaagg cctttctaca gaaccttgtc agatcctgtc tttgtcagag 2700
gaggctttgg caatccacac tatgttcttg gtttgagggg agtggctttt cagcagactg 2760
gcaccaatca cacccgcaca ttcagaaaca gcggcaccat tgacagcctt gatgagatcc 2820
cacctcaaga caacagcgga gcaccctgga acgactactc ccatgtgctc aatcatgtca 2880
cctttgtgcg ctggcctggt gagatcagcg gttcagattc ttggagagca ccaatgttct 2940
catggaccca tcgctctgcc acacccacaa acaccattga tccagagaga atcacccaga 3000
ttcccttggt gaaggcacac acacttcagt ctggaaccac agttgtcaga gggcctgggt 3060
tcactggtgg agacattctc agacgcacct ctggagggcc atttgcttac accattgtca 3120
acatcaatgg gcaacttccc cagcgttacc gtgccagaat ccgctatgct tccaccacta 3180
acttgagaat ctatgtcaca gttgctggtg aaaggatctt tgctggtcag ttcaacaaga 3240
caatggacac tggtgatcca ttgacattcc agtcattctc ctatgccacc atcaacactg 3300
cattcacctt tccaatgagc cagtccagct tcacagtggg tgcagatacc ttcagctccg 3360
gcaatgaggt gtacattgac cgctttgagt tgattccagt gactgccaca cttgaggctg 3420
agtctgactt ggagcgtgct cagaaggccg tgaatgctct cttcacctct tcaaatcaga 3480
ttgggctcaa gacagatgtg actgactacc atatagaccg tgtttccaat cttgttgagt 3540
gcctctctga tgagttctgc ttggatgaga agaaagagtt gtcagagaag gtcaagcacg 3600
ccaagaggct ctctgatgag aggaacttgc ttcaagatcc caacttcaga gggatcaacc 3660
gtcaattgga tcgtggatgg aggggatcaa ctgacataac cattcaagga ggtgacgatg 3720
tgttcaagga gaactatgtc acactcttgg ggacctttga tgagtgctac ccaacatacc 3780
tttaccagaa gatagacgaa agcaagctca aggcctacac aagataccag ttgagaggtt 3840
acattgagga ctctcaagac cttgaaatct acctcatcag atacaacgcc aaacatgaga 3900
cagtcaatgt gcctgggact ggttcactct ggccactttc agccccaagc cccattggca 3960
agtgtgccca tcactcacat cacttctcct tggacataga tgttggctgc actgacttga 4020
atgaggacct tggtgtgtgg gtgatcttca agatcaagac ccaagatggc catgcaaggt 4080
tgggcaatct tgagtttctt gaagagaaac cacttgttgg agaagccctt gccagagtga 4140
agagggctga gaagaaatgg agggacaaga gagagaagtt ggagtgggaa acaaacattg 4200
tgtacaaaga agccaaagaa tcagttgatg ctttgtttgt gaactcccaa tatgataggc 4260
tccaagctga caccaacata gcaatgattc atgctgcaga caaaagggtt cacagcattc 4320
gtgaagcata ccttcctgaa ctctcagtga ttcctggggt caatgctgca atctttgaag 4380
agcttgaagg acgcatcttc actgccttct ccttgtatga tgcaaggaat gtcatcaaga 4440
atggtgactt caacaatggc ctttcctgct ggaatgtgaa agggcacgtg gatgttgaag 4500
agcagaacaa tcaccgctct gtccttgttg tccctgagtg ggaagctgaa gtttcacaag 4560
aagttcgtgt ctgccctggt cgtggctaca ttcttcgtgt gactgcttac aaagaaggct 4620
atggagaagg ttgtgtcacc atccacgaga tagagaacaa tactgatgaa ttgaagttca 4680
gcaactgtgt tgaggaagag gtctacccaa acaatactgt cacttgcaat gactacactg 4740
caactcaaga agagtatgag ggcacttaca cttctcgcaa ccgtggctat gatggagcct 4800
atgagagcaa ctcatctgtg cctgctgact atgcttcagc ctatgaagag aaggcataca 4860
ctgatggaag gcgtgacaat ccttgtgaaa gcaacagagg ctatggggac tacacacccc 4920
tcccagctgg ctatgtgacc aaagagttgg agtactttcc tgaaactgac aaggtttgga 4980
ttgagatagg agaaactgaa ggcacattca tagttgactc tgtggagctt ttgctcatgg 5040
aagagtgagt agttagctta atcacctaga gctcggtcac cagcataatt tttattaatg 5100
tactaaatta ctgttttgtt aaatgcaatt ttgctttctc gggattttaa tatcaaaatc 5160
tatttagaaa tacacaatat tttgttgcag gcttgctgga gaatcgatct gctatcataa 5220
aaattacaaa aaaattttat ttgcctcaat tattttagga ttggtattaa ggacgcttaa 5280
attatttgtc gggtcactac gcatcattgt gattgagaag atcagcgata cgaaatattc 5340
gtagtactat cgataattta tttgaaaatt cataagaaaa gcaaacgtta catgaattga 5400
tgaaacaata caaagacaga taaagccacg cacatttagg atattggccg agattactga 5460
atattgagta agatcacgga atttctgaca ggagcatgtc ttcaattcag cccaaatggc 5520
agttgaaata ctcaaaccgc cccatatgca ggagcggatc attcattgtt tgtttggttg 5580
cctttgccaa catgggagtc caaggttgcg gccgcgcgcc gaaaacaact ttgtatacaa 5640
aagttgccgc ggtgactgac tgaactaaac ccagaaggta attatccaag atgtagcatc 5700
aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg gaagtattat gtaagctcag caagaagcag 5760
atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat 5820
cctatactgc cagaatacga agaagaatac gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa 5880
gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg 5940
gtgattgtga aagagacata gaggacacat gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta 6000
accttatcac aaaggaatct tatcccccac tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat 6060
ttttgccctt gagttttcct atataaggaa ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa 6120
aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa 6180
gtttgtagat ccaacaatgg acaacaatcc caacatcaac gagtgcattc cttacaactg 6240
cctgagcaac cctgaggttg aggtgctggg tggagaacgg attgagactg gttacacacc 6300
tatcgacatc tcgttgtcac ttacccaatt ccttttgtca gagttcgtgc ccggtgctgg 6360
attcgtgctt ggacttgtcg atatcatttg gggaatcttt ggtccctctc aatgggacgc 6420
ctttcttgta cagatagagc agttaattaa ccaaagaata gaagaattcg ctaggaacca 6480
agccatctca aggttagaag gcctcagcaa cctttaccag atttacgcag aatcttttcg 6540
agagtgggaa gcagacccga ccaatcctgc cttaagagag gagatgcgca ttcaattcaa 6600
tgacatgaac agcgcgctga cgaccgcaat tccgctcttc gccgttcaga attaccaagt 6660
tcctctttta tccgtgtacg tgcaggctgc caacctgcac ttgtcggtgc tccgcgatgt 6720
ctccgtgttc ggacaacggt ggggctttga tgccgcaact atcaatagtc gttataatga 6780
tctgactagg cttattggca actataccga ttatgctgtt cgctggtaca acacgggtct 6840
cgaacgtgtc tggggaccgg attctagaga ttgggtcagg tacaaccagt tcaggcgaga 6900
gttgacacta actgtcctag acattgtcgc tctctttccc aactacgact ctaggcgcta 6960
cccaatccgt actgtgtcac aattgacccg ggaaatctac acaaacccag tcctcgagaa 7020
cttcgacggt agctttcgag gctcggctca gggcatagag agaagcatca ggtctccaca 7080
cctgatggac atattgaaca gtatcacgat ctacaccgat gcgcaccgcg gttattacta 7140
ctggtcaggg catcagatca tggcatcacc cgttgggttc tctggaccag aattcacttt 7200
cccactttac gggactatgg gcaatgcagc tccacaacaa cgtattgttg ctcaactcgg 7260
tcagggcgtg tatagaacct tgtccagcac tctatatagg agacctttca acatcggcat 7320
caacaatcaa caattgtctg tgcttgacgg gacagaattt gcctatggaa cctcctcaaa 7380
tctgccatcc gctgtctaca gaaagagcgg aacagttgat agcttggatg agatccctcc 7440
acagaacaac aacgttccac ctaggcaagg gtttagccat cgccttagcc atgtgtccat 7500
gttccgttca ggctttagta atagcagcgt tagtatcatc agagctccga tgttctcttg 7560
gatacatcgt agtgctgagt ttaacaacat aattgcatcc gatagcatta ctcagatccc 7620
agctgtcaag gggaactttc tctttaatgg ttctgtcatt tcaggaccag gattcactgg 7680
aggcgacttg gttaggctga attcttccgg caacaacatc cagaatagag ggtatattga 7740
agtgcccatt cacttcccat cgacatctac cagatatcgt gttcgtgtaa ggtatgcctc 7800
tgttacccct attcacctca acgtcaattg gggtaattcc tccatctttt ccaatacagt 7860
accagcgaca gctacatcct tggataatct ccaatctagc gatttcggtt acttcgaaag 7920
tgccaatgcc ttcacctctt ccctaggtaa catagtaggt gttagaaatt tctccggaac 7980
cgccggagtg ataatcgacc gcttcgaatt cattcccgtt actgcaacgc tcgaggcaga 8040
gtctgacttg gaaagagcac agaaggcggt gaatgctctg ttcacttcgt ccaatcagat 8100
tgggctcaag acagatgtga ctgactatca catcgatcgc gtttccaacc ttgttgagtg 8160
cctctctgat gagttctgtt tggatgagaa gaaggagttg tccgagaagg tcaaacatgc 8220
taagcgactt agtgatgagc ggaacttgct tcaagatccc aactttcgcg ggatcaacag 8280
gcaactagat cgtggatgga ggggaagtac ggacatcacc attcaaggag gtgatgatgt 8340
gttcaaggag aactatgtta cgctcttggg tacctttgat gagtgctatc caacatacct 8400
gtaccagaag atagatgaat cgaaactcaa agcctacaca agataccagt tgagaggtta 8460
catcgaggac agtcaagacc ttgagatcta cctcatcaga tacaacgcca aacatgagac 8520
agtcaatgtg cctgggacgg gttcactctg gccactttca gccccaagtc ccatcggcaa 8580
gtgtgcccat cactcacacc acttctcctt ggacatagac gttggctgta ccgacctgaa 8640
cgaagacctc ggtgtgtggg tgatcttcaa gatcaagact caagatggcc atgccaggct 8700
aggcaatctg gagtttctag aagagaaacc acttgttgga gaagccctcg ctagagtgaa 8760
gagggctgag aagaagtgga gggacaagag agagaagttg gaatgggaaa caaacattgt 8820
gtacaaagaa gccaaagaaa gcgttgacgc tctgtttgtg aactctcagt atgataggct 8880
ccaagctgat accaacatag ctatgattca tgctgcagac aaacgcgttc atagcattcg 8940
ggaagcttac cttcctgaac ttagcgtgat tccgggtgtc aatgctgcta tctttgaaga 9000
gttagaaggg cgcatcttca ctgcattctc cttgtatgat gcgaggaatg tcatcaagaa 9060
tggtgacttc aacaatggcc tatcctgctg gaatgtgaaa gggcacgtag atgtagaaga 9120
acagaacaat caccgctctg tccttgttgt tcctgagtgg gaagcagaag tttcacaaga 9180
agttcgtgtc tgtcctggtc gtggctacat tcttcgtgtt accgcgtaca aagaaggata 9240
cggagaaggt tgcgtcacca tacacgagat tgagaacaac accgacgagc tgaagttcag 9300
caactgcgtc gaggaggaag tctacccaaa caacaccgta acttgcaatg actacactgc 9360
gactcaagag gagtatgagg gtacttacac ttctcgcaat cgaggatacg atggagccta 9420
tgagagcaac tcttctgtac ccgctgacta tgcatcagcc tatgaggaga aggcttacac 9480
cgatggacgt agggacaatc cttgcgaatc taacagaggc tatggggact acacaccgtt 9540
accagccggc tatgtcacca aagagttaga gtactttcca gaaaccgaca aggtttggat 9600
tgagattgga gaaacggaag gaacattcat tgttgatagc gtggagttac ttctgatgga 9660
ggaatgagta gttagcttaa tcacctagag ctcggttacc tatcaaaatc tatttagaaa 9720
tacacaatat tttgttgcag gcttgctgga gaatcgatct gctatcataa aaattacaaa 9780
aaaattttat ttgcctcaat tattttagga ttggtattaa ggacgcttaa attatttgtc 9840
gggtcactac gcatcattgt gattgagaag atcagcgata cgaaatattc gtagtactat 9900
cgataattta tttgaaaatt cataagaaaa gcaaacgtta catgaattga tgaaacaata 9960
caaagacaga taaagccacg cacatttagg atattggccg agattactga atattgagta 10020
agatcacgga atttctgaca ggagcatgtc ttcaattcag cccaaatggc agttgaaata 10080
ctcaaaccgc cccatatgca ggagcggatc attcattgtt tgtttggttg cctttgccaa 10140
catgggagtc caaggttgcg gccgcgcgcc gacccagctt tcttgtacaa agtggttgcg 10200
gccgcttaat taaatttaaa tgcccgggcg tttaaacgcg gccgcttaat taaggccggc 10260
ctgcagcaaa cccagaaggt aattatccaa gatgtagcat caagaatcca atgtttacgg 10320
gaaaaactat ggaagtatta tgtaagctca gcaagaagca gatcaatatg cggcacatat 10380
gcaacctatg ttcaaaaatg aagaatgtac agatacaaga tcctatactg ccagaatacg 10440
aagaagaata cgtagaaatt gaaaaagaag aaccaggcga agaaaagaat cttgaagacg 10500
taagcactga cgacaacaat gaaaagaaga agataaggtc ggtgattgtg aaagagacat 10560
agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag ggcggaaagt aaccttatca caaaggaatc 10620
ttatccccca ctacttatcc ttttatattt ttccgtgtca tttttgccct tgagttttcc 10680
tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa aaatttggtg taagctattt 10740
tctttgaagt actgaggata caacttcaga gaaatttgta agtttgtaga tctccatgtc 10800
tccggagagg agaccagttg agattaggcc agctacagca gctgatatgg ccgcggtttg 10860
tgatatcgtt aaccattaca ttgagacgtc tacagtgaac tttaggacag agccacaaac 10920
accacaagag tggattgatg atctagagag gttgcaagat agataccctt ggttggttgc 10980
tgaggttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg ctaggaacgc 11040
ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa ggttgggcct 11100
aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt ttaagtctgt 11160
ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg ctttgggata 11220
cacagcccgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc atgatgttgg 11280
tttttggcaa agggattttg agttgccagc tcctccaagg ccagttaggc cagttaccca 11340
gatctgaggt accctgagct tgagcttatg agcttatgag cttagagctc ggatccacta 11400
gtaacggccg ccagtgtgct ggaattcgcc cttgactaga taggcgccca gatcggcggc 11460
aatagcttct tagcgccatc ccgggttgat cctatctgtg ttgaaatagt tgcggtgggc 11520
aaggctctct ttcagaaaga caggcggcca aaggaaccca aggtgaggtg ggctatggct 11580
ctcagttcct tgtggaagcg cttggtctaa ggtgcagagg tgttagcggg atgaagcaaa 11640
agtgtccgat tgtaacaaga tatgttgatc ctacgtaagg atattaaagt atgtattcat 11700
cactaatata atcagtgtat tccaatatgt actacgattt ccaatgtctt tattgtcgcc 11760
gtatgtaatc ggcgtcacaa aataatcccc ggtgactttc ttttaatcca ggatgaaata 11820
atatgttatt ataatttttg cgatttggtc cgttatagga attgaagtgt gcttgcggtc 11880
gccaccactc ccatttcata attttacatg tatttgaaaa ataaaaattt atggtattca 11940
atttaaacac gtatacttgt aaagaatgat atcttgaaag aaatatagtt taaatattta 12000
ttgataaaat aacaagtcag gtattatagt ccaagcaaaa acataaattt attgatgcaa 12060
gtttaaattc agaaatattt caataactga ttatatcagc tggtacattg ccgtagatga 12120
aagactgagt gcgatattat ggtgtaatac atagcggccg ggtttctagt caccggttag 12180
gatccgttta aactcgaggc tagcgcatgc acatagacac acacatcatc tcattgatgc 12240
ttggtaataa ttgtcattag attgttttta tgcatagatg cactcgaaat cagccaattt 12300
tagacaagta tcaaacggat gtgacttcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta 12360
agttgtctaa gcgtcaattt g 12381
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 81615_FW2 primer
<400> 4
ttacaccctt aggatcgaga cacttagagc 30
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 81516_RV1 primer
<400> 5
gattcatgtc cttcctaatg cgaattg 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 81516_RV2 primer
<400> 6
aatttcacat ttaccccact tgcga 25
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 81516_RV3 primer
<400> 7
ggaggtgcag tgaggaaggt aataatga 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'IREnd-01 primer
<400> 8
cgagctttct aatttcaaac tattcgggc 29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'IREnd-01 primer
<400> 9
tcctagatca tcagttcata caaacctcca 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AtUbi10RV1 primer
<400> 10
cggtcctaga tcatcagttc atacaaacc 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AtUbi10RV2 primer
<400> 11
cactcgtgtt cagtccaatg accaataa 28
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'PATEnd05 primer
<400> 12
gctcctccaa ggccagttag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'PATEnd06 primer
<400> 13
ccagttaggc cagttaccca 20
<210> 14
<211> 15170
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Expected sequence of soybean event 9582.814.19.1
<400> 14
atatcgatcc cggagggagt gagtagagag gaaatacact aacactggga tcgcacttct 60
actccaggtt ccgataaaca ataagtaaat aaaatactac tactttatca tagtttaatt 120
aacaaaatta tatatactgg tataaaattt aatactttaa ataatcatgt gattttttat 180
tatctaatta gtattttaat agtttcatta tatattggtg aaaaattaaa atatcaaata 240
tttcatttat acgttattat aataatataa tattttaaat atacactata ttaaaaataa 300
atttatacaa cttgataatt attacattta tgtatcttaa ttaaaataat tagtaaaaga 360
ataaatttaa attaaatatt tttaataaat agaaagttgt gtgataactt tttttatagt 420
gtaagaaaaa aggcaaatca aacaaagaag ttacaccctt aggatcgaga cacttagagc 480
atcagtaaca agcaagtcca acgagagacg atcaacccta gaaattatca tgccataatt 540
tagcccaaac ttaacaagat aattagtact cctattgcct tctctcgatg aatgcacaaa 600
ttgaacactc aaatcttcct tcacaaagtc acgaatgctt ttcacaattg tgcataacaa 660
tgatacactt gtggcggatg aattccagac acagaatatt aacatactcc aactcccaag 720
caattcttaa gccatgcaac agtgtcaata actcagcctt aacaatattt gttgaaccaa 780
tatcaccata gaaaccatat atctaagacc cattaatgtt acgaagcagc ccaccaaatc 840
ttgcatgccc aagattcctt tagcaacttc catccacaag ttatgaaaca ctgacatgta 900
tacggacatt ggacatgaca cggacacgta gatatctgta atgttcaaaa tatagaacgt 960
agtataggtg ttgtgtcagt gtcagacact aacatggatg cgtatcagac accgaacacg 1020
gtaagggatt ggagtatccg tgcttcatag tccacaagca aggatgattc aagaacttaa 1080
gaaacttaaa gtaaaattat tttttgacat atattagtat taaaattttt tattgaggta 1140
tattagtact aatttttttt tattaaaatt tatttttaaa cataatttta taataaattt 1200
ttttggagat atattagtac ttaaaagaaa ttagatcttt tttttttggg gtttaaagtc 1260
cttgctgctt ggaccagtca gcatcatcac accaaaagtt aggcccgaat agtttgaaat 1320
tagaaagctc gcaattgagg tctacaggcc aaattcgctc ttagccgtac aatattactc 1380
accggatcct aaccggtgtg atcatgggcc gcgattaaaa atctcaatta tatttggtct 1440
aatttagttt ggtattgagt aaaacaaatt cggcgccatg cccgggcaag cggccgcaca 1500
agtttgtaca aaaaagcagg ctccgcggtg actgactgaa aagcttgtcg acctgcaggt 1560
caacggatca ggatattctt gtttaagatg ttgaactcta tggaggtttg tatgaactga 1620
tgatctagga ccggataagt tcccttcttc atagcgaact tattcaaaga atgttttgtg 1680
tatcattctt gttacattgt tattaatgaa aaaatattat tggtcattgg actgaacacg 1740
agtgttaaat atggaccagg ccccaaataa gatccattga tatatgaatt aaataacaag 1800
aataaatcga gtcaccaaac cacttgcctt ttttaacgag acttgttcac caacttgata 1860
caaaagtcat tatcctatgc aaatcaataa tcatacaaaa atatccaata acactaaaaa 1920
attaaaagaa atggataatt tcacaatatg ttatacgata aagaagttac ttttccaaga 1980
aattcactga ttttataagc ccacttgcat tagataaatg gcaaaaaaaa acaaaaagga 2040
aaagaaataa agcacgaaga attctagaaa atacgaaata cgcttcaatg cagtgggacc 2100
cacggttcaa ttattgccaa ttttcagctc caccgtatat ttaaaaaata aaacgataat 2160
gctaaaaaaa tataaatcgt aacgatcgtt aaatctcaac ggctggatct tatgacgacc 2220
gttagaaatt gtggttgtcg acgagtcagt aataaacggc gtcaaagtgg ttgcagccgg 2280
cacacacgag tcgtgtttat caactcaaag cacaaatact tttcctcaac ctaaaaataa 2340
ggcaattagc caaaaacaac tttgcgtgta aacaacgctc aatacacgtg tcattttatt 2400
attagctatt gcttcaccgc cttagctttc tcgtgaccta gtcgtcctcg tcttttcttc 2460
ttcttcttct ataaaacaat acccaaagct tcttcttcac aattcagatt tcaatttctc 2520
aaaatcttaa aaactttctc tcaattctct ctaccgtgat caaggtaaat ttctgtgttc 2580
cttattctct caaaatcttc gattttgttt tcgttcgatc ccaatttcgt atatgttctt 2640
tggtttagat tctgttaatc ttagatcgaa gacgattttc tgggtttgat cgttagatat 2700
catcttaatt ctcgattagg gtttcataaa tatcatccga tttgttcaaa taatttgagt 2760
tttgtcgaat aattactctt cgatttgtga tttctatcta gatctggtgt tagtttctag 2820
tttgtgcgat cgaatttgtc gattaatctg agtttttctg attaacagag atctccatgg 2880
agaacaatat ccagaaccag tgtgtcccat acaattgcct caacaatcct gaagttgaga 2940
tcctcaacga agagaggagc actggacgcc ttccccttga catctccctc tccctcacaa 3000
ggttcctttt gtctgagttt gttcctggtg tgggtgtggc ctttggcctc tttgacctca 3060
tctggggctt catcacccca tctgattgga gcctcttcct tctccagatt gaacaattga 3120
ttgagcagag gattgagacc cttgaaagga acagagccat caccacactt cgtggccttg 3180
ctgacagcta tgaaatctac attgaagcac tccgtgagtg ggaagccaat cccaacaatg 3240
ctcaactccg tgaagatgtg aggattcgct ttgccaacac agatgacgct ttgatcacag 3300
ccatcaacaa tttcaccctc accagctttg agatcccttt gctctcagtc tatgttcaag 3360
ctgcaaacct ccacttgagc ttgcttaggg atgctgtgtc cttcggacaa ggttggggac 3420
ttgacatagc cactgtcaac aatcactaca acagactcat caacttgatt catcgctaca 3480
ccaaacattg cttggacacc tacaatcaag gattggagaa cctcagaggc accaacactc 3540
gccaatgggc aaggttcaac cagtttagaa gggatctcac actcactgtg cttgacatag 3600
ttgctctctt ccccaactat gatgttcgca cctacccaat tcaaaccagc tcccaactta 3660
caagggaaat ctacacctcc tcagtcattg aggacagccc agtttctgcc aacataccca 3720
atggtttcaa ccgtgctgag tttggtgtca gaccacccca tctcatggac ttcatgaact 3780
ccttgtttgt gactgccgag actgttaggt cccaaactgt gtggggaggc caccttgtta 3840
gctcccgcaa caccgctggc aaccgcatca acttcccatc ctatggggtt ttcaatcctg 3900
gtggagccat ctggattgca gatgaggacc caaggccttt ctacagaacc ttgtcagatc 3960
ctgtctttgt cagaggaggc tttggcaatc cacactatgt tcttggtttg aggggagtgg 4020
cttttcagca gactggcacc aatcacaccc gcacattcag aaacagcggc accattgaca 4080
gccttgatga gatcccacct caagacaaca gcggagcacc ctggaacgac tactcccatg 4140
tgctcaatca tgtcaccttt gtgcgctggc ctggtgagat cagcggttca gattcttgga 4200
gagcaccaat gttctcatgg acccatcgct ctgccacacc cacaaacacc attgatccag 4260
agagaatcac ccagattccc ttggtgaagg cacacacact tcagtctgga accacagttg 4320
tcagagggcc tgggttcact ggtggagaca ttctcagacg cacctctgga gggccatttg 4380
cttacaccat tgtcaacatc aatgggcaac ttccccagcg ttaccgtgcc agaatccgct 4440
atgcttccac cactaacttg agaatctatg tcacagttgc tggtgaaagg atctttgctg 4500
gtcagttcaa caagacaatg gacactggtg atccattgac attccagtca ttctcctatg 4560
ccaccatcaa cactgcattc acctttccaa tgagccagtc cagcttcaca gtgggtgcag 4620
ataccttcag ctccggcaat gaggtgtaca ttgaccgctt tgagttgatt ccagtgactg 4680
ccacacttga ggctgagtct gacttggagc gtgctcagaa ggccgtgaat gctctcttca 4740
cctcttcaaa tcagattggg ctcaagacag atgtgactga ctaccatata gaccgtgttt 4800
ccaatcttgt tgagtgcctc tctgatgagt tctgcttgga tgagaagaaa gagttgtcag 4860
agaaggtcaa gcacgccaag aggctctctg atgagaggaa cttgcttcaa gatcccaact 4920
tcagagggat caaccgtcaa ttggatcgtg gatggagggg atcaactgac ataaccattc 4980
aaggaggtga cgatgtgttc aaggagaact atgtcacact cttggggacc tttgatgagt 5040
gctacccaac atacctttac cagaagatag acgaaagcaa gctcaaggcc tacacaagat 5100
accagttgag aggttacatt gaggactctc aagaccttga aatctacctc atcagataca 5160
acgccaaaca tgagacagtc aatgtgcctg ggactggttc actctggcca ctttcagccc 5220
caagccccat tggcaagtgt gcccatcact cacatcactt ctccttggac atagatgttg 5280
gctgcactga cttgaatgag gaccttggtg tgtgggtgat cttcaagatc aagacccaag 5340
atggccatgc aaggttgggc aatcttgagt ttcttgaaga gaaaccactt gttggagaag 5400
cccttgccag agtgaagagg gctgagaaga aatggaggga caagagagag aagttggagt 5460
gggaaacaaa cattgtgtac aaagaagcca aagaatcagt tgatgctttg tttgtgaact 5520
cccaatatga taggctccaa gctgacacca acatagcaat gattcatgct gcagacaaaa 5580
gggttcacag cattcgtgaa gcataccttc ctgaactctc agtgattcct ggggtcaatg 5640
ctgcaatctt tgaagagctt gaaggacgca tcttcactgc cttctccttg tatgatgcaa 5700
ggaatgtcat caagaatggt gacttcaaca atggcctttc ctgctggaat gtgaaagggc 5760
acgtggatgt tgaagagcag aacaatcacc gctctgtcct tgttgtccct gagtgggaag 5820
ctgaagtttc acaagaagtt cgtgtctgcc ctggtcgtgg ctacattctt cgtgtgactg 5880
cttacaaaga aggctatgga gaaggttgtg tcaccatcca cgagatagag aacaatactg 5940
atgaattgaa gttcagcaac tgtgttgagg aagaggtcta cccaaacaat actgtcactt 6000
gcaatgacta cactgcaact caagaagagt atgagggcac ttacacttct cgcaaccgtg 6060
gctatgatgg agcctatgag agcaactcat ctgtgcctgc tgactatgct tcagcctatg 6120
aagagaaggc atacactgat ggaaggcgtg acaatccttg tgaaagcaac agaggctatg 6180
gggactacac acccctccca gctggctatg tgaccaaaga gttggagtac tttcctgaaa 6240
ctgacaaggt ttggattgag ataggagaaa ctgaaggcac attcatagtt gactctgtgg 6300
agcttttgct catggaagag tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagca 6360
taatttttat taatgtacta aattactgtt ttgttaaatg caattttgct ttctcgggat 6420
tttaatatca aaatctattt agaaatacac aatattttgt tgcaggcttg ctggagaatc 6480
gatctgctat cataaaaatt acaaaaaaat tttatttgcc tcaattattt taggattggt 6540
attaaggacg cttaaattat ttgtcgggtc actacgcatc attgtgattg agaagatcag 6600
cgatacgaaa tattcgtagt actatcgata atttatttga aaattcataa gaaaagcaaa 6660
cgttacatga attgatgaaa caatacaaag acagataaag ccacgcacat ttaggatatt 6720
ggccgagatt actgaatatt gagtaagatc acggaatttc tgacaggagc atgtcttcaa 6780
ttcagcccaa atggcagttg aaatactcaa accgccccat atgcaggagc ggatcattca 6840
ttgtttgttt ggttgccttt gccaacatgg gagtccaagg ttgcggccgc gcgccgaaaa 6900
caactttgta tacaaaagtt gccgcggtga ctgactgaac taaacccaga aggtaattat 6960
ccaagatgta gcatcaagaa tccaatgttt acgggaaaaa ctatggaagt attatgtaag 7020
ctcagcaaga agcagatcaa tatgcggcac atatgcaacc tatgttcaaa aatgaagaat 7080
gtacagatac aagatcctat actgccagaa tacgaagaag aatacgtaga aattgaaaaa 7140
gaagaaccag gcgaagaaaa gaatcttgaa gacgtaagca ctgacgacaa caatgaaaag 7200
aagaagataa ggtcggtgat tgtgaaagag acatagagga cacatgtaag gtggaaaatg 7260
taagggcgga aagtaacctt atcacaaagg aatcttatcc cccactactt atccttttat 7320
atttttccgt gtcatttttg cccttgagtt ttcctatata aggaaccaag ttcggcattt 7380
gtgaaaacaa gaaaaaattt ggtgtaagct attttctttg aagtactgag gatacaactt 7440
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cattccttac aactgcctga gcaaccctga ggttgaggtg ctgggtggag aacggattga 7560
gactggttac acacctatcg acatctcgtt gtcacttacc caattccttt tgtcagagtt 7620
cgtgcccggt gctggattcg tgcttggact tgtcgatatc atttggggaa tctttggtcc 7680
ctctcaatgg gacgcctttc ttgtacagat agagcagtta attaaccaaa gaatagaaga 7740
attcgctagg aaccaagcca tctcaaggtt agaaggcctc agcaaccttt accagattta 7800
cgcagaatct tttcgagagt gggaagcaga cccgaccaat cctgccttaa gagaggagat 7860
gcgcattcaa ttcaatgaca tgaacagcgc gctgacgacc gcaattccgc tcttcgccgt 7920
tcagaattac caagttcctc ttttatccgt gtacgtgcag gctgccaacc tgcacttgtc 7980
ggtgctccgc gatgtctccg tgttcggaca acggtggggc tttgatgccg caactatcaa 8040
tagtcgttat aatgatctga ctaggcttat tggcaactat accgattatg ctgttcgctg 8100
gtacaacacg ggtctcgaac gtgtctgggg accggattct agagattggg tcaggtacaa 8160
ccagttcagg cgagagttga cactaactgt cctagacatt gtcgctctct ttcccaacta 8220
cgactctagg cgctacccaa tccgtactgt gtcacaattg acccgggaaa tctacacaaa 8280
cccagtcctc gagaacttcg acggtagctt tcgaggctcg gctcagggca tagagagaag 8340
catcaggtct ccacacctga tggacatatt gaacagtatc acgatctaca ccgatgcgca 8400
ccgcggttat tactactggt cagggcatca gatcatggca tcacccgttg ggttctctgg 8460
accagaattc actttcccac tttacgggac tatgggcaat gcagctccac aacaacgtat 8520
tgttgctcaa ctcggtcagg gcgtgtatag aaccttgtcc agcactctat ataggagacc 8580
tttcaacatc ggcatcaaca atcaacaatt gtctgtgctt gacgggacag aatttgccta 8640
tggaacctcc tcaaatctgc catccgctgt ctacagaaag agcggaacag ttgatagctt 8700
ggatgagatc cctccacaga acaacaacgt tccacctagg caagggttta gccatcgcct 8760
tagccatgtg tccatgttcc gttcaggctt tagtaatagc agcgttagta tcatcagagc 8820
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Claims (21)
- 곤충을 곤충 저항성 대두 식물에 노출시킴으로써 곤충을 방제하는 것을 포함하며, 상기 대두 식물은 서열 14의 DNA 서열을 포함하는 것인, 곤충을 방제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곤충이 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens) (대두 자벌레)인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곤충이 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) (벨벳콩 모충)인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곤충이 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (가을 거염벌레)인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 곤충이 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens) (담배나방)인 방법.
- 대두 작물에 글루포시네이트 제초제를 적용하는 것을 포함하며, 상기 대두 작물은 서열 14의 DNA 서열을 포함하는 대두 식물을 포함하는 것인, 대두 작물에서 잡초를 방제하는 방법.
- 서열 14를 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배하여 제3 대두 식물을 생산하는 것을 포함하며, 상기 제1 대두 식물은 서열 14의 DNA 서열을 포함하는 것인 단계; 및 서열 14의 DNA 서열의 존재에 대해 상기 제3 대두 식물을 검정하는 단계를 포함하는, 대두 식물을 육종하는 방법.
- 삭제
- 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)에 저항성이며 서열 14의 DNA 서열을 포함하는, 대두 식물.
- 제10항의 식물의 종자.
- 제10항의 대두 식물 또는 그의 부분으로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 대두 조분말, 대두 미분말, 대두 단백질 농축물 및 대두 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물.
- 대두 이벤트 9582.816.15.1로 형질전환된 대두 식물로부터 대두 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말을 수득하는 것을 포함하며, 여기서 상기 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말은 서열 14의 DNA 서열을 포함하는 것인, 대두 곡물, 종자, 조분말 또는 미분말에서 해충을 방제하는 방법.
- 서열 14의 DNA 서열을 대두 종자의 게놈 내에 포함하는 대두 종자.
- 제14항의 대두 종자로부터 성장한 대두 식물.
- 화분, 배주, 꽃, 싹, 뿌리 및 잎으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 대두 이벤트 9582.816.15.1을 포함하는, 제15항의 대두 식물의 부분.
- 제15항의 대두 식물 또는 그의 부분으로부터 유래된 조성물로서, 상기 조성물은 대두 조분말, 대두 미분말 및 대두 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물.
- 서열 14의 DNA 서열을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물.
- 대두 이벤트 9582.816.15.1을 포함하며, 여기서 대두 이벤트 9582.816.15.1을 포함하는 대표적인 대두 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 등록 번호 PTA-12588 하에 기탁된 것인 트랜스제닉 대두 식물.
- 슈도플루시아 인클루덴스 (대두 자벌레)에 저항성이며 서열 14의 DNA 서열을 포함하는, 대두 식물의 부분.
- 대두 이벤트 9582.816.15.1을 포함하며, 여기서 대두 이벤트 9582.816.15.1을 포함하는 대표적인 대두 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 등록 번호 PTA-12588 하에 기탁된 것인 트랜스제닉 대두 식물의 부분.
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